【1分で読めるnoteで学ぶ腸内細菌35で紹介した論文が大変面白かったのでGoogle翻訳を載せるの巻】

　こんにちは(o・ω・o)カエルです。
　
　昨日投稿したnote

【1分で読めるnoteで学ぶ腸内細菌35：柑橘類でメタボを回避できるという話】｜虫圭(o・ω・o)カエル｜note

　で紹介した論文

Citrus polymethoxyflavones attenuate metabolic syndrome by regulating gut microbiome and amino acid metabolism

　が専門的で複雑な内容ですが、興味深く面白かったのでGoogle翻訳したものを載せます。
　
　この論文は

 浙江工科大学、杭州、中国の薬学部。
 広東省、中国

　による研究論文です。研究者は

Su-Ling Zeng
Shang-Zhen Li
Ping-Ting Xiao
Yuan-Yuan Cai
Chu Chu
Bai-Zhong
Chen
Ping Li
Jing Li
and View ORCID ProfileE-Hu Liu

　となっています。
　

　図解等をご覧になりたい方は本論文を参照ください。
　また、原文（翻訳）まま記載していますので（）等もそのままにしております。
　予めご了承ください(o・ω・o)
　
　
　以下本文

　
 ■柑橘類のポリメトキシフラボンは、腸内細菌叢とアミノ酸代謝を調節することによってメタボリックシンドロームを軽減します

 

 サイエンスアドバンシス2020年1月3日：
 巻 6、  1、eaax6208
 DOI：10.1126 / sciadv.aax6208
 論文
 
 

概要
 メタボリックシンドローム（MetS）は、腸内細菌叢と宿主メタボロームの調節不全と複雑に関連しています。 ここでは、精製された柑橘類のポリメトキシフラボンに富む抽出物（PMFE）が、高脂肪食（HFD）によって誘発されるMetSを強力に改善し、腸内毒素症を軽減し、16S rDNAアンプリコンシーケンスを使用して分岐鎖アミノ酸（BCAA）代謝を調節することを最初に発見しました。
 メタボロミクスプロファイリング。
  PMFEの代謝保護効果は、抗生物質治療と糞便微生物移植（FMT）によって示されるように、腸内細菌叢に依存します。 腸内細菌叢の調節は、宿主の血清および糞便中のBCAAレベルを変化させました。これは、代謝機能と有意に関連し、PMFEによる治療的介入に積極的に反応しました。 特に、PMFEは共生細菌Bacteroides ovatusを大幅に濃縮し、B。ovatusによる強制経口投与は、HFDマウスのBCAA濃度を低下させ、MetSを軽減しました。  
　
PMFEは、MetSを弱めるためのプレバイオティクス剤として使用される可能性があり、ターゲット固有の微生物種は、代謝性疾患に対して独自の治療上の可能性を秘めている可能性があります。

　

 前書き
 メタボリックシンドローム（MetS）は、肥満、高脂血症、インスリン抵抗性、脂肪肝など、相互に関連する代謝の危険因子の集まりです。 
MetSは、西欧諸国の成人の少なくとも30％に影響を及ぼし、2型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および冠状動脈性心臓病の発生率の増加に関連していることが証明されています（1）。 最近、増大する証拠は、腸内細菌叢とMetSの発生との間の因果関係と、糞便微生物叢移植（FMT）による表現型の伝達可能性を示唆しています（2、3）。 多くの細菌種はBCAAの生合成、輸送、代謝を調節できるため（5）、これらの効果はメタボローム、特に分岐鎖アミノ酸（BCAA）（4）を介して部分的に媒介される可能性があります。  Pedersen etal。  （4）PrevotellacopriとBacteroidesvulgatusが、BCAAの生合成とインスリン抵抗性との関連を促進する主な種であることがわかりました（4）。  Bacteroides thetaiotaomicronによる強制経口投与は、血清BCAA濃度を低下させ、マウスの食餌による体重増加と肥満を軽減しました（6）。 しかし、「微生物叢の薬物投与」がMetSの治療に有効であるかどうか、およびBCAAレベルが薬物介入の有効性と相関する可能性があるかどうかについてはほとんど議論されていません。

 疫学研究は、フラボノイドが豊富な食品の大量摂取とMetSの減少との間に正の関係があることを示しています（7）。 柑橘類の皮から抽出されたポリメトキシフラボン（PMF）は、抗肥満の可能性、良好な薬物動態プロファイル、およびげっ歯類モデルでの識別可能な毒性がないため、非常に興味深いものです（8、9）。 フラボノイドの生理学的効果は、バイオアベイラビリティが低いこととは著しく対照的であり、PMFの代謝保護効果の重要なメカニズムはとらえどころのないままです。 バイオアベイラビリティの低い製品は腸内細菌叢の潜在的な基質になる可能性があるため、PMFは腸内細菌叢のリモデリングを通じてMetSから保護すると仮定します。

 本研究では、柑橘類の皮から分離されたPMFリッチ抽出物（PMFE）が、高脂肪食（HFD）を与えられたマウスの体重と脂肪組織の蓄積を強力に減少させることを示します。  16SリボソームDNA（rDNA）ベースのマイクロバイオータ分析とメタボロミクスプロファイリングを使用して、PMFE治療がHFD誘発性腸内毒素症とBCAAの調節不全を用量依存的に軽減することを示します。
 抗生物質治療と水平FMT実験は、腸内細菌叢のリモデリングがPMFEの高い生物活性に必要であることをさらに示しています。 また、BacteroidesovatusがPMFEのターゲットとしてMetSを減衰させるのに十分であることも示しています。 したがって、これらの発見は、PMFEがMetSとその合併症の治療のための潜在的なプレバイオティクス剤であることを示しています。

　

 結果
 柑橘類のPMFEは、mTOR / P70S6K / SREBP経路の阻害を介して潜在的な代謝保護効果を示します
 ここでは、PMFEの抽出および精製プロセスを最適化しました（補足資料および方法を参照）。 新規濃縮柑橘類PMFEのPMFが最大の割合を占め、シネンセチン、ノビレチン、3,5,6,7,8,3 '、4'-ヘプタメトキシフラボン、タンゲレチンが主成分を構成し、純度が1.27から増加しました。  〜60.85％（w / w;図1、AおよびB）。 柑橘類の皮（ECP）の濃縮されていない抽出物と比較して、PMFEは80μg/ ml（図S1B）でもヒト肝臓HL-7702細胞（図S1A）で識別可能な毒性を示しませんでした。 ステロール調節エレメント結合タンパク質（SREBP）は、脂質ホメオスタシスの調節に重要な役割を果たし、代謝性疾患の治療の標的と見なされてきました（10）。 したがって、HL-7702細胞におけるSRE含有プロモーターの阻害によって示されるように、ルシフェラーゼベースのシステムを使用してPMFEの生物活性を検出しました。 特に、PMFEは用量および時間依存的にSRE-ルシフェラーゼ活性を有意に低下させました（図1C）。 ウエスタンブロットにより、PMFEで処理した細胞におけるSREBP-1 / 2の発現を調べた。 両方の成熟SREBP-1 / 2レベルは、PMFEによって用量依存的に減少しました（図1D）。 また、PMFE処理後、コレステロール代謝遺伝子DHCR24、HMGCR、LDLRなどのSREBP標的遺伝子、および脂肪酸代謝遺伝子SREBP-1c、FASN、ACC-1、SCD-1の発現が大幅に低下することも観察されました（図1）。  1E）。 さらに、ナイルレッド染色は、PMFEがHL-7702細胞における脂質蓄積を著しく減少させたことを示した（図1F）。  SREBPのプロセシングと脂質生成は哺乳類のラパマイシン標的（mTOR）活性によって調節されるため（10）、mTORとその下流のキナーゼP70S6Kの活性に対するPMFEの影響をさらに調査しました（10、11）。  PMFEで処理すると、mTORとP70S6Kのリン酸化が減少しました（図1G）。 一緒に、mTOR / P70S6K / SREBP経路をダウンレギュレートする濃縮されたPMFEは、潜在的な脂質低下剤を表しています。


 
 図1柑橘類のPMFEは、mTOR / P70S6K / SREBP経路の阻害を介した潜在的な代謝保護効果を示しています。
 （A）柑橘類の皮の抽出物（ECP）と柑橘類のPMFEの典型的な高速液体クロマトグラフィー（HPLC）クロマトグラム。  mAU、ミリ吸光度単位。  （B）4つの主要なPMFの化学構造。  （C）PMFEは、HL-7702 / SRE-Lucレポーター細胞のSREBPルシフェラーゼ活性を用量および時間依存的に阻害します。  （D）PMFEは、成熟したSREBP-1 / 2レベルを用量依存的に低下させます。  SREBP-1 / 2の代表的なウエスタンブロッティング分析を示します。  SREBP（成熟）タンパク質の発現は、ローディングコントロールとしてβ-アクチンに対して正規化され、ビヒクルグループに対する相対比は以下にラベル付けされました（ImageJソフトウェアを使用して推定）。  （E）PMFEは、SREBP標的遺伝子を減少させることにより、コレステロールと脂肪酸のdenovo合成を阻害します。  HL-7702細胞をジメチルスルホキシド（DMSO）または指示された濃度のPMFEで18時間処理しました。  （F）HL-7702細胞をナイルレッドで染色して脂質含有量を評価した。  （G）PMFEは、mTORとその下流のキナーゼP70S6Kの活性を阻害します。 バンドの相対強度は、総タンパク質に対するリンタンパク質の比率として採用されました（内部コントロールに対して正規化）。 すべての実験を3回繰り返した。 エラーバーはSDを表します。  DMSOグループと比較した有意差は、* P <0.05、** P <0.01、および*** P <0.001（スチューデントのt検定で評価）で示されます。

 柑橘類のPMFEは、HFDを与えられたマウスで強力な代謝保護効果を示します
 柑橘類のPMFEが代謝保護効果を示すかどうかに対処するために、HFDを与えたマウスをMetSモデルとして使用しました（図S2A）（12）。  HFDを与えられたマウスでは、PMFEの8週間の治療は、HFDグループと比較して体重増加を有意に減少させました（図2Aおよび図S2B）。
  HFDを与えられたグループ間で食物摂取量に有意差は観察されなかった。これは、PMFEの効果が食物消費量の減少によるものではなかったことを示唆している（図2B）。 
 PMFE投与はまた、脂肪沈着、肝臓組織における脂質蓄積、および白色脂肪細胞組織と褐色脂肪細胞組織の両方の細胞サイズを減少させました（図2、CからG、および図S2、CとD）。 一方、耐糖能とインスリン抵抗性は、PMFEで治療したHFDを与えたマウスで著しく改善されました（図2、FからH）。 血清総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、および低密度リポタンパク質コレステロール（LDL-C）は大幅に減少しましたが、高密度リポタンパク質コレステロール（HDL-C）の有意な増加はPMFE処理では観察されませんでした。 マウス（図2I）。  PMFEはまた、HFD誘発性肝障害に対する保護効果を示し、血漿ALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびAST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）レベルが大幅に低下しました（図S2E）。 さらに、炎症性サイトカインおよび単球走化性タンパク質-1（MCP-1）に対するPMFEの影響を評価しました。  PMFEは、分泌された腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、IL-6の血清レベル、および肝組織におけるそれらのmRNA発現を有意に低下させました。 マクロファージレベルとMCP-1mRNA発現は、PMFE処理マウスで減少しました（図S2、FからH）。 インビトロの結果と一致して、免疫組織化学分析は、PMFEがmTORおよびP70S6Kのリン酸化を阻害し、HFDを与えられたグループと比較してSREBP-1 / 2の発現を減少させたことを示した（図S2I）。 
また、PMFEは、長期の高カロリーチャレンジ後、用量依存的にマウスの食餌誘発性肥満、脂肪肝、脂質異常症、およびインスリン抵抗性を強力に改善できることも観察しました（図S3）。
 高用量のPMFEの代謝保護効果は、ロバスタチンのそれとほぼ同等かそれ以上でしたが、PMFEは、固形飼料を与えられたマウスでは明らかな効果を生み出しませんでした（図S4）。 これらの結果は、PMFEがHFDを与えられたマウスのMetSに対して強力な有効性を示すことを意味します。


 
 図2柑橘類のPMFEは、HFDを与えられたマウスで強力な代謝保護を示します。
 マウスはランダムに4つのグループに分けられました（n = 8）。 チョウを与えられたマウスは、0.5％のCMCNa懸濁液（チョウ）で毎日治療されました。  HFDを与えられたマウスは、0.5％CMCNa懸濁液（HFD）、PMFE（PMFE; 120 mg / kg /日）、またはロバスタチン（Lov; 30 mg / kg /日）を経口投与されました。  （A）溶媒（0.5％CMCNa）、PMFE、またはロバスタチンで8週間毎日処理された固形飼料およびHFDを与えられたマウスの体重。  （B）上記の4つのグループのマウスの1日あたりの平均摂餌量。  （C）精巣上体脂肪。  （D）肝臓の重量。  （E）肝臓の脂質含有量は、オイルレッドO染色（スケールバー、100μm）を使用して評価しました。  （F）インスリン負荷試験（ITT）中の初期血糖値のパーセンテージに対するPMFEの影響。 右：曲線下面積（AUC）。  （G）ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色された白色脂肪組織の代表的な写真（スケールバー、100μm）。  （H）経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）によって測定されたブドウ糖負荷に対するPMFEの効果。 右：AUC。  PMFEを強制投与されたマウスは、HFDマウスと比較して有意に低い血清グルコースレベルを示しました[二元配置分散分析（ANOVA）]。  （I）血中の総TC、TG、LDL、およびHDLレベル。 エラーバーは平均±SDとして表されます。 統計的有意性は、複数グループの比較のためのテューキー検定を使用した一元配置分散分析または二元配置分散分析によって決定されました。  * P <0.05、** P <0.01、および*** P <0.001。

 柑橘類のPMFEはHFD誘発性腸内毒素症を軽減します
 植物化学物質と腸内細菌叢の相互作用の新たな調査は、それらのメカニズムの理解に革命をもたらしました（13）。 
腸内細菌叢はMetSの発生に病原性の役割を果たし、微生物叢の調節はMetSを予防するための潜在的な治療アプローチであるため（14、15）、パイロシーケンスベースの分析を実行することにより、腸内細菌叢の組成に対するPMFEの影響を調べました。
 糞便中の細菌16SrDNA。  UniFracベースの主座標分析（PCoA）を使用して、固形飼料、HFD、およびPMFE治療群の微生物叢組成の明確なクラスター化を観察しました（図3A）。 
さまざまなグループの細菌群集の全体的な構成を評価するために、門レベルでの細菌の分類学的類似性の程度を分析しました。 固形飼料を与えられたマウスと比較して、HFDを与えられたマウスは、フィルミクテス門の相対的な存在量の有意な増加と、フィルミクテス門とバクテロイデス門の比率の上昇を示しましたが、PMFE処理は、この影響を大幅に防ぎました（図3、BおよびC）。 一方、HFDマウスは、上皮の破壊と膿瘍の存在、浮腫の増加、粘膜下層への細胞浸潤を示し、PMFE治療後に有意に改善しました（図3D）。  HFDはまた、上皮の完全性に影響を与える可能性があり、したがって腸の透過性の障害、および循環へのリポ多糖の放出につながる可能性があります。  PMFE処理は、密着結合タンパク質zonula occludens-1（ZO-1）およびオクルディンの発現を増加させ、腸透過性の調節における潜在的な役割をサポートします（図S5、AおよびB）。 一緒に、PMFE投与はHFDに応じて腸内細菌叢の改造に実質的な影響を及ぼしました。


  
 図3柑橘類のPMFEは、HFDによって誘発される腸内毒素症を軽減します。
 PMFE（30、60、および120 mg / kg /日）で処理された固形飼料を与えられたマウスおよびHFDマウスの微生物叢組成は、16S rDNAパイロシーケンスによって分析されました（各グループでn = 8）。  （A）チャウ、HFD、およびPMFEグループのOTUデータに基づく腸内細菌叢の加重UniFracPCoA分析。  （B）異なるマウスグループからの腸内細菌の門レベルでの細菌分類学的プロファイリング。  （C）示されたグループにおけるフィルミクテス門とバクテロイデス門の比率。  （D）腸の代表的なH＆E写真（スケールバー、250μm）。  （E）PMFE処理に応答するHFDによって変更された周群の50のOTUのヒートマップ。 左側のパネルのスポットの色は、各グループのOTUの相対的な存在量を表しています。 中央のパネルでは、白い円は、HFDと比較してChowおよびPMFEのOTUの量が少ないことを表しています。 黒のひし形は、HFDと比較してChowおよびPMFEでより豊富なOTUを表しています。  OTUの門、科、属の名前が右側のパネルに表示されます。 分析は、Rソフトウェアバージョン3.3.1を使用して実施されました。

 分散分析をさらに使用して、PMFE処理によって変化した特定の細菌の系統型を特定しました。  HFDを与えられたマウスでは、PMFEの補給により、87の操作分類単位（OTU）が大幅に増加し、用量依存的に50のOTUが減少しました（図S5C）。 家族分析により、これらの改変されたOTUのほとんどは、バクテロイデス門S24-7（34 OTU）、フィルミクテス・ルミノコッカス科（26 OTU）、フィルミクテス・ラクノスピラ科（11 OTU）、およびバクテロイデス門バクテロイデス門（10 OTU）に属することが明らかになりました。 これらの137個のOTUのうち、PMFE処理は50個のOTUを制御し、チャウチャウを与えられたマウスと比較して、HFDを与えたときに変化しました（図3E）。 特に、属レベルの分析は、8つのOTUがバクテロイデスからのものであることを示しました。 さらに、PMFEは、FirmicutesParaprevotellaやFirmicutesStreptococcusなどの日和見病原菌種を減らすことができます。 
これらの結果は、PMFEがHFDを与えられたマウスの腸内細菌叢を調節し、固形飼料を与えられたマウスと同様の微生物叢の組成をもたらすことを示しています。

 柑橘類のPMFEはHFDマウスのMetS関連BCAAレベルを変化させる
 腸内細菌叢が宿主に及ぼす深刻な影響は、一連の宿主微生物代謝軸を含む複雑な相互作用と強く関連しています（6、16）。  PMFEによってリモデリングされた腸内細菌叢に応答する代謝変化を評価するために、超高速液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間型質量分析（UPLC-QTOF / MS）により、血清および糞便サンプルで非標的メタボロームプロファイルを生成しました。 ピークアラインメントと欠落値の除去後、合計1769個の陽イオンと663個の陰イオンが糞便中に検出されました。 主成分分析モデルによると、代謝物の明確なクラスター化は、固形飼料を与えられた、HFDを与えられた、およびPMFEで処理されたHFDグループ間で明らかでした（図4A）。 直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）でも、これらのグループの明確な分離が示されました（図S6）。  HFD給餌は、代謝物の広範な変化を引き起こすのに十分であり、チャウチャウ給餌マウスと比較して、68および23の代謝物がそれぞれ有意に誘導および抑制されました（表S2）。 特に、PMFE処理は、HFD給餌時に変化する代謝物を部分的に調節し、HFDによって誘発される代謝物の変化のうち24を無効にしました（9つは上方制御され、15つは下方制御されました。図4B）。  MetaboAnalyst（www.metaboanalyst.ca）によって生成されたトポロジーマップは、これらの応答性代謝物に対するPMFEの影響を説明し、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの分解、フェニルアラニンチロシン、およびトリプトファン生合成によって影響を受ける最も重要な経路を明らかにしました（図4C）。 血清では、PMFE介入が同様の変動傾向をもたらすこともわかりました（図S7）。 異なるグループの相互比較により、合計73（Chow対HFD）および48（HFD対PMFE）の異なる代謝物が同定されました（表S2）。  PMFEによる治療は、13の異なる代謝物を調節しました（7つは上方調節され、6つは下方調節されました）。 変化した代謝経路は、バリン、ロイシン、およびイソロイシン合成、フェニルアラニンチロシン、およびトリプトファン生合成の重複を示しました。 次に、ガスクロマトグラフィー-MS（GC-MS）により、さまざまなグループの糞便および血清サンプルのアミノ酸レベルのターゲットメタボロミクスプロファイリングを実行しました。 バリン、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンのレベルは、固形飼料を与えられたマウスと比較して、HFDグループの糞便および血清で有意に上昇したが、PMFE処理は固形飼料を与えられたマウスで同じ方向にそれらのレベルを変化させた（図4Dおよび図4Dおよび図。  S7）。 スピアマンの相関分析は、これらのアミノ酸のレベルが、体重増加、血中脂質、インスリン抵抗性などの代謝機能と正の相関があることを示しました（図4Eおよび図S7）。


 
 図4Citrus PMFEは、HFDマウスのMetS関連BCAAレベルを変化させます。
 チョウを与えられたマウスは、溶媒（0.5％CMCNa）（チョウ）で毎日処理されました。  HFDを与えられたマウスは、溶媒（0.5％CMCNa）（HFD）またはPMFE（120 mg / kg /日）を経口投与されました。  （A）Chow、HFD、およびPMFEグループから糞便メタボロームを区別するための主成分分析（PCA）スコアプロット。  （B）PMFE給餌マウスと比較したHFD給餌によって変化した示差代謝物のヒートマップ。 アスタリスクは、固形飼料を与えられたマウスの存在量がHFDによって変更され、PMFEによって制御された代謝物を表します。  2つのグループ間の代謝物間の存在量分布の違いは、Benjamini-Hochbergの偽発見率補正を使用したMann-WhitneyU検定によって測定されました。  0.05未満の調整済みP値は、統計的に有意であると見なされました。  （C）Chow対HFDおよびHFD対PMFEグループの代謝経路の乱れ。  （D）示されたグループのGC-MSによる糞便中のバリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびフェニルアラニンの循環レベルの比較。  （E）糞便中のアミノ酸とメタボリックシンドロームに関連する指標のピアソン相関のヒートマップ分析。 赤は正の相関を表し、青は負の相関を示します。 エラーバーは平均±SDとして表されます。 統計的有意性は、複数グループの比較のためのテューキー検定を使用した一元配置分散分析によって決定されました。  * P <0.05、** P <0.01、および*** P <0.001。

 柑橘類のPMFEは、腸内細菌叢に依存する方法でHFDマウスのMetSを減衰させます
 PMFEの代謝保護効果が腸内細菌叢の存在に依存するかどうかを調べるために、PMFEを与えたHFDマウスを、バンコマイシン、硫酸ネオマイシン、メトロニダゾール、アンピシリンなどの抗生物質のカクテルで処理しました。
 代謝障害に対する上記の効果と一致して、PMFEは体重増加、脂肪沈着、および脂質異常症を大幅に減少させました。
しかし、腸内細菌叢が抗生物質カクテルによって抑制された場合、PMFEの代謝保護効果は廃止されました。 体重増加のレベルに有意差は検出されませんでした。 総TC、TG、LDL、およびHDLレベル。 抗生物質群と抗生物質+ PMFE群の間のインスリン感受性（図S8、AからE）は、PMFEが腸内細菌叢に依存して食事誘発性のMetSを弱めたことを示しています。 一貫して、血清および糞便アミノ酸の標的メタボロミクスプロファイリングは、PMFE処理によるアミノ酸濃度の低下が抗生物質介入によってブロックされたことを明らかにしました（図S8F）。 これらの発見は、PMFEが腸内細菌叢に依存した方法で食餌誘発性のMetSからマウスを保護し、循環アミノ酸濃度にさらに影響を与えることを示しています。

 柑橘類PMFEの代謝保護は糞便移植によって移すことができます
 腸内細菌叢によって媒介されるPMFEの有益な効果と、宿主循環アミノ酸に対するその効果をさらに説明するために、PMFE処理マウス（PMFE、HFD給餌）からHFDを給餌した従来のレシピエントマウスに微生物叢を移し、  MetS関連の特性（図5A）。 コロニー形成の8週間後、PMFEレシーバー（PMFE→HFD）は、HFDレシーバー（HFD→HFD）と比較してすでに体重の有意な減少を示しました（図5Bおよび図S9A）。  PMFEマウスからの水平糞便移動（PMFE→HFD）は、PMFE治療群で観察されたのと同様の代謝保護効果を示しました。 これらのレシピエントは、脂肪肝、糖尿病症状、体重、および精巣上体脂肪の代謝機能の改善を示しました。 しかし、インスリン感受性は大幅に改善されませんでした（図5、CからF、および図S9、BからH）。 逆に、HFDレシーバー（HFD→HFD）は、MetS関連の特性を改善できませんでした。 また、PMFEレシーバーでBCAA、フェニルアラニン、セリンなどの糞便中アミノ酸の量の減少が検出されました。これは、PMFE処理マウスで示された結果と同様でした（図5Gおよび図S9I）。 糞便移植が腸内細菌叢を調節することを確認するために、腸内細菌の組成を調べるために16SrDNAシーケンシングを実施しました。  PCoAは、微生物群集がPMFEとPMFE→HFD治療群の間でより高い類似性を示したことを明らかにしました（同様の傾向がHFDとHFD→HFD群で観察されました）（図S9J）。
 PMFE治療群からの糞便移動は、フィルミクテス門とバクテロイデス門の比率の相対的な存在量の有意な減少を示しました（図S9K）。
ヒートマップは、PMFEとPMFE→HFDグループの間に大きな重複があることを明らかにしました。  PMFEマウスからの糞便の移動は、特に分類学的単位の減少について、PMFEとほぼ同じ方向にOTUを変化させました（図S9L）。 一緒に、これらの結果は、レシピエントマウスがそれぞれのドナーマウスで観察された微生物および代謝表現型を再現し、腸内細菌叢がPMFEの代謝保護を媒介することを示しています。


 
 図5柑橘類PMFEの糞便移植は、HFDマウスで代謝保護を示します。
 マウスはランダムに4つのグループに分けられました（n = 8）。  HFDを与えられたマウスは、溶媒（0.5％CMCNa）（HFD）またはPMFE（120 mg / kg /日）を経口投与されました。 溶媒（0.5％CMCNa）で処理されたHFDマウスからの水平方向の糞便移動は、HFDレシーバー（HFD→HFD）と呼ばれます。  PMFEで治療したマウスからの水平方向の糞便移動は、PMFEレシーバー（PMFE→HFD）と呼ばれます。  （A）糞便移植実験の研究計画。  （B）上記の4群のマウスの体重。  （C）精巣上体脂肪。  （D）肝臓の重量。  （E）ITTによって測定されたインスリン耐性。 右：AUC。  （F）血中の総TC、TG、LDL、およびHDLレベル。  （G）示されたグループのGC-MSによる糞便中のイソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、セリン、およびチロシンの相対的な存在量。 エラーバーは平均±SDとして表されます。 統計的有意性は、複数グループの比較のためのテューキー検定を使用した一元配置分散分析または二元配置分散分析によって決定されました。

 柑橘類のPMFEを介したB.ovatusの濃縮は、HFDマウスのMetSを弱める
 腸内細菌叢、循環アミノ酸の変化、およびPMFEの代謝保護の間の関連は上記で調査されています。 図3Eに示すように、バクテロイデス属はPMFE処理に応答する主要な属として同定されました。
　
 バクテロイデス種に対するPMFEの影響を直接評価するために、嫌気性条件下でPMFEと培養した後、in vitroでの糞便バッチ培養発酵により10株のバクテロイデス株​​の存在量を測定しました（図6A）。  24時間の発酵後、PMFEがB. ovatus、B。thetaiotaomicron、B。vulgatus、B。dorei、B。caccae、B。stercoris、およびB. Uniformisの存在量を大幅に増加させ、Bの存在量を減少させる可能性があることを観察しました。 定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって決定された.fragilis、B。finegoldii、およびB. coprophilus（図6B）。 アミノ酸の濃度は、GC-MSメタボロミクスによる発酵中、0、12、24、および48時間の嫌気性条件下でもモニターされました。 結果は、PMFEがinvitroでのバッチ培養でアミノ酸レベルを大幅に低下させる可能性があることを明らかにしています（図6C）。


 
 図6柑橘類のPMFEを介したB.ovatusの濃縮は、HFDマウスのMetSを減衰させます。
 チョウを与えられたマウスは、溶媒（0.5％CMCNa）（チョウ）で毎日処理されました。  HFDを与えられたマウスは、高用量PMFE（120 mg / kg /日、HFDおよびPMFE）、B。ovatus（BOライブ）、B。ovatusおよび高用量PMFE（BOおよびPMFE）を経口投与されるか、Bを殺されました。  .ovatus（BOが殺された）。  （A）invitroバッチ培養発酵およびinvivo検証実験の研究計画。  （B）PMFEとのインキュベーション後のバクテロイデス種の相対的な存在量（初期レベルのパーセントで表される）。  （C）異なる濃度のPMFEとのインキュベーション後0、12、24、および48時間でのアミノ酸濃度の変化。  （D）qPCRによって測定された示されたグループにおけるB.ovatusの相対的な存在量。  （E）上記の4群のマウスの体重。  （F）血中の総TC、TG、LDL、およびHDLレベル。  （G）示されたグループのGC-MSによる糞便中のイソロイシン、ロイシン、バリン、セリン、チロシン、およびフェニルアラニンの相対的な存在量。 エラーバーは平均±SDとして表されます。 統計的有意性は、複数グループの比較のためのテューキー検定を使用した一元配置分散分析または二元配置分散分析によって決定されました。

 B. ovatusの増加は、PMFE処理によってBacteroides種で最も顕著な変化を示したため、次に、B。ovatusとMetSの間の考えられる因果関係を調べました。  HFDを与えられたマウスは、B。ovatusの市販の系統で8週間毎日強制飼養され、その後MetS関連の形質が検査されました。 糞便DNAでは、B。ovatusで処理したHFD給餌マウスでコロニー形成が観察されました。 一方、PMFEの投与は、B。ovatusの存在量も大幅に増加させました（図6D）。 生きているが熱殺されていないB.ovatusの強制経口投与は、HFDマウスの体重増加と脂肪蓄積を有意に低下させました（図6Eおよび図S10、AからC）。  B. ovatusの投与は、熱殺菌したB. ovatusを強制飼養したHFDマウスと比較して、血清LDL-CおよびTG濃度を大幅に低下させました（図6F）。 生きたB.ovatusによる治療も、血漿ALTおよびASTを有意に改善しました（図S10D）。  B. ovatusの強制経口投与後、耐糖能とインスリン抵抗性の有意な改善は観察されませんでした（図S10E）。 特に、熱殺菌したB. ovatusで強制飼養したHFDマウスと比較して、生きたB. ovatusで強制飼養したHFDマウスでは糞便BCAAの存在量が有意に少ないことが検出されました（図6G）。 同様の結果が血清サンプルでも測定されました（図S10F）。 一緒に、これらの調査結果は、PMFEが食事誘発性肥満と代謝障害を軽減し、循環アミノ酸濃度を調節する共生細菌B.ovatusを濃縮できることを示しています。

 議論
 MetSは、世界で最も健康を脅かす病気の1つとして浮上しています（1）。 したがって、効果的で安全な治療薬の開発が緊急に必要とされています。 柑橘類のPMFは、MetSに対する強力な保護効果と、げっ歯類の実験モデルでの安全性により、魅力的な候補です（17、18）。 ここでは、最適化および標準化された方法を使用して、マクロポーラス樹脂クロマトグラフィーに基づいて柑橘類の皮からPMFを精製しました。 濃縮された柑橘類のPMFEは定性的および定量的に特徴付けられ、含まれる化合物は明確に解明されています（19）。  
PMFEは、in vitro実験で高濃度でも識別可能な毒性がないため、ECPよりも優れていることがわかりました。
さらに、PMFEの効果を、潜在的な副作用にもかかわらずMetSの好ましい治療法である陽性対照スタチンと比較しました（1）。  8週間の治療で、高用量のPMFEは、ロバスタチンと同等またはそれ以上の代謝保護効果を示します。 固形飼料およびHFDを与えられたマウスでは、高用量のPMFEの明らかな副作用は観察されませんでした。 これらのデータは、柑橘類のPMFEが、その有効性と安全性の観点から、代謝障害の有望な治療薬である可能性があることを示しています。

 PMFは吸収が不十分なフェノール性植物化学物質のグループであるため、PMFEの有益な効果は主に、MetSに関連する複数の表現型で極めて重要な腸内細菌叢のリモデリングによるものと考えられます（2、3）。 この考えを強く支持する証拠は、抗生物質を使用した腸内細菌叢の抑制による保護効果の減少と、FMTによる伝達可能な代謝保護によって示されています。  PMFEが腸内細菌叢を介して代謝保護を発揮できるという我々の発見は、バイオアベイラビリティの低いフラボノイドの新しいメカニズムの理解を提供し、植物化学物質の治療評価に革命をもたらす可能性があります。

 FirmicutesとBacteroidetesが優勢な腸内細菌叢は、肥満関連のMetSに関連しています（20）。 フィルミクテス門とバクテロイデス門の比率の増加へのシフトは、肥満マウス（20、21）とヒト（6、22）で確認されましたが、減量介入にはバクテロイデス門の数が多くなりました。  16S rDNAシーケンシングによるHFDマウスとPMFE処理HFDマウスの腸内微生物組成の比較により、フィルミクテス門とバクテロイデス門の比率が低下するという同様の傾向が明らかになりました。これは、PMFEの代謝保護機能に寄与すると考えられます。 家族レベルでは、PMFE治療により、特定の炭水化物（植物糖鎖、宿主糖鎖、およびα-グルカン）の分解に積極的に関与するバクテロイデス門S 24-7の存在量が豊富になり、摂食したマウスでの存在量の増加が報告されています。 低脂肪食（23）。
PMFEはまた、代謝障害および糖尿病と負の相関があると報告されているルミノコッカスの存在量を増加させました（24）。 
バクテロイデスは、PMFE治療に反応する重要な属です。
 in vitroでの糞便バッチ培養発酵の評価により、PMFEは、B。ovatus、B。Uniformis、およびB.thetaiotaomicronを含む6つの種の濃縮を有意に誘導できることがわかりました。 グルタミン酸発酵共生B.thetaiotaomicronは、マウスを脂肪症から保護することが報告されており、ヒトの減量介入における減量に関連しています（6）。  B.ユニフォームはHFD誘発性肥満を軽減することも知られています（25）。  PMFEの潜伏期間は、特にB. fragilisの大幅な減少を伴い、3種のレベルの低下にもつながりました。これにより、体重増加が増加し、耐糖能が低下し、インスリン感受性が低下することが報告されています（26）。  B.フラジリスがTβMCAとTUDCAのレベルを低下させ、マウスの腸ファルネソイドX受容体（FXR）シグナル伝達を活性化したことを考えると、PMFEはB.フラジリス-GUDCA（グリコウルソデオキシコール酸）-腸FXR軸を部分的に調節することによって代謝機能障害を改善する可能性があります（  26）。 また、PMFEは、上皮の損傷や密着結合タンパク質の調節不全によって引き起こされるバリア機能の障害を改善できることを観察しました。 一緒に、PMFE治療はより健康的なプロファイルに向けて腸内細菌叢を調節することができます。

 ミクロビオームへの薬物投与は非常に魅力的な治療法として浮上しており、興味深い問題は、ミクロビオームの変化が病気と相関関係があるのか​​、それとも原因となるのかということです。 本研究では、PMFEで変更されたマイクロバイオームが抗生物質治療とFMTによる宿主代謝の保護に因果的役割を持っていることを示しています。 さらに、強力な微生物叢の創薬ターゲットを特定しました。 糞便バッチ培養発酵では、B。ovatusはPMFE処理後に顕著な増加を示しました。 宿主代謝におけるB.ovatusの役割の直接的な証拠がないため、ここでは、B。ovatusと代謝恒常性との因果関係を初めて確立しました。 私たちのデータは、B。ovatusによる腸の生態系への介入が、体重増加を大幅に低下させ、血清LDL-CおよびTG濃度を低下させる可能性があることを示しました。 これらの結果は、PMFEが潜在的に有益な腸内細菌であるB.ovatusの濃縮を含む代謝機能障害を改善することをさらに確認しています。

 増え続ける証拠は、腸内細菌叢の組成が宿主のメタボロームの変化を通じて全身の代謝に影響を与えることを明らかにしています（27）。
腸内細菌叢を操作すると、病的状態に関連する微生物宿主の共代謝の調節不全を逆転させることができます（28）。 
ここでは、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリポファン生合成が関与する代謝経路が脂質異常症と強く関連しており、PMFEの治療的介入に積極的に反応することを発見しました。 これらの発見は、座りがちなMetS被験者の横断研究の結果と一致しています（29）。 ターゲットメタボロミクスプロファイルは、PMFEで処理されたマウスの糞便と血清中のBCAAのレベルの顕著な変化を明らかにしました。 それにもかかわらず、肥満との関連、バクテロイデス種の豊富さ、および宿主のアミノ酸代謝との相互作用についてはあまり合意がありません（30）。 さらに、PMFEの介入によって有意に濃縮されたB. ovatusが、体重減少とBCAAの循環レベルの低下との間に正の関連があることを示しました。 これらのデータは、代謝障害におけるBCAAの生合成の媒介におけるB.ovatusの潜在的な因果的役割を示しています。 以前の研究では、循環BCAAのレベルを上昇させる主な要因としてP.copriとB.vulgatusが特定されました。  PMFE処理がB.vulgatusの豊富さを豊かにし、BCAAを減少させたという私たちの発見とは物議を醸しているようです。 代謝障害におけるB.vulgatusの役割は、ヒトのMetSとの正の相関にもかかわらず（4）、低脂肪食マウスモデル（31、32）でのMetSの発生に対する保護によって示されるように複雑に見えます。  BCAAレベルと代謝障害の調節におけるPMFE治療後のB.vulgatusの状況特異的な役割については、さらに調査する必要があります。 また、宿主のアミノ酸代謝における他のバクテロイデス種の役割を調査するには、さらなる研究が必要です。

 現在、アミノ酸由来の代謝物がどのように病気に寄与するかについての機構的な洞察はほとんどありません。 最近の研究では、微生物によって生成されたアミノ酸由来の代謝物であるプロピオン酸イミダゾールが、mTOR複合体1（mTORC1）の活性化を通じてインスリンシグナル伝達を損なうことが確認されました（33）。  BCAAによって誘発されるインスリン抵抗性は、mTORとP70S6Kの慢性的な活性化を伴いました（34）。 私たちの結果は、PMFEが糞便と血清中のBCAAのレベルを低下させる可能性があることを示しました。 さらに、PMFEがmTORとP70S6Kのリン酸化を抑制し、細胞とHFDを与えられたマウスのSREBPの発現を減少させることを示しました。 したがって、PMFE処理によるBCAAの減少は、mTOR / P70S6K / SREBP経路の阻害を通じてMetSの改善に寄与すると推測されます。 詳細な作用機序はさらに調査する必要があります。

　

結論として、我々の結果は、柑橘類のPMFEが腸内細菌叢の調節を介してアミノ酸代謝を調節することによりMetSを弱めることができることを示しています。
  PMFEは、潜在的に有益な腸内細菌であるB.ovatusの濃縮を伴う代謝機能障害を改善します。 
私たちの発見は、微生物叢の薬物投与を植物化学物質の新しいメカニズムの理解として検討する上で価値があるはずです。

　
　
　本文以上。

　
　正直、細かい成分や生理反応などはカエルも理解できていませんが、PMFE（ポリメトキシフラボン）と腸内細菌叢の反応による代謝機能の改善、作用する範囲の広さなど、「とても面白いなぁ。PMFEは今後注目される成分なんだろうなぁ」と感じました。

　
　今回のnoteはこんな内容なのでここまで目を通してくださった方が何人いらっしゃるかは分かりませんが笑、知識の１つとして何かの役に立てていただければと思います(o・ω・o)

　
　論文って面白いですね〜。

　最後に良かったら♡スキをお願いします。
　それではまた〜(o・ω・o)ﾉｼ