脂肪と糖の強化に関する別々の腸脳回路が組み合わさって過食を促進する

2024年1月19日 13:52

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論文
脂肪と糖の強化に関する別々の腸脳回路が組み合わさって過食を促進する

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413123004667?via%3Dihub

著者リンクオーバーレイパネルを開くMolly McDougle 1 2 4, Alan de Araujo 1 2, Arashdeep Singh 1 2 3 4, Mingxin Yang 1 2 3 4, Isadora Braga 1 3 4, Vincent Paille 3 4 5, Rebeca Mendez-Hernandez 3 4, Macarena Vergara 1 2, Lauren N. ウッディ 6、アビシェク・グール 7、アビシェク・シャルマ 7、ニヒル・ウルス 8、ブランドン・ウォーレン 1、ギヨーム・ド・ラルティーグ 1 2 3 4 9
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https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.12.014
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ハイライト

腸内の脂肪と糖は、それぞれ異なる迷走神経集団によって感知される

栄養を感知する迷走神経感覚ニューロンは強化に必要かつ十分である

脂肪と糖の両方が、別々の中枢報酬回路に関与することで、ドーパミン放出を引き起こす。

脂肪と糖を超加算的に組み合わせると、ドーパミンの流出と摂食が増加する。

まとめ
食物は摂食決定を導く強力な自然強化因子である。迷走神経は、栄養価に関する腸から脳への内部感覚情報を伝達する。しかし、大栄養素特異的報酬回路の細胞および分子基盤は十分に理解されていない。しかし、大栄養素に特異的な報酬回路の細胞的・分子的基盤は十分に理解されていない。ここでは、in vivoでカルシウム動態をモニターし、食事の脂肪と糖を検出するための独立した迷走神経感知経路の直接的証拠を示す。栄養素の腸注入に応答して活性化される迷走神経ニューロンの活動依存的遺伝子捕捉を用いて、我々は、栄養素特異的強化に必要かつ十分な、脂肪と糖を感知する別々の腸脳回路の存在を証明した。カロリーをコントロールした場合でも、脂肪回路と糖回路の複合的な活性化は、脂肪または糖のみの場合と比較して、黒質線条体ドーパミン放出と過食を増加させる。この研究は、意欲的行動を媒介する複雑な感覚回路に関する新たな洞察を提供し、肥満の原因となる食事（例えば、脂肪と糖の両方が多い食事）を摂取しようとする潜在意識的な内的衝動が、意識的なダイエットの努力を妨げている可能性を示唆している。

グラフィカル抄録

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キーワード
腸-脳栄養素空腹脂肪糖線条体ドーパミン化学感受性疾患食品選択肝門脈
はじめに
世界的な肥満率の急激な上昇は、脂肪や糖分を多く含む、口当たりのよい高カロリー食品の過剰摂取を促進する食環境の変化に起因している1,2。その代わりに、風味の嗜好性は、食後の栄養的な手がかりに対する条件反応として急速に学習される。11 重要なことは、脂肪や糖の胃内注入の強化価値は、関連する風味の全体的な摂取量を増加させるということである12,13,14。このように、脂肪や糖は、食事誘発性体重増加における個々の大栄養素の相対的重要性については依然として熱い議論があるものの、摂食後シグナル伝達が関与するメカニズムを介して過食を引き起こす可能性がある。

大脳基底核の線条体領域は、進化的に保存された脳基質であり、目標指向行動を担っている。口腔内の味覚刺激は腹側線条体でドーパミンを放出する中脳辺縁系回路を興奮させるが、腸に到達する栄養刺激は背側線条体（DS）で黒質ドーパミン放出をもたらす18,19。重要なことは、摂食後刺激による黒質線条体回路の興奮は、味覚とは無関係に起こることである5,18。摂食には、黒質小体部（SNc）から脳脊髄液腺へのドーパミン放出が重要である。ドーパミンの遺伝的欠失は食欲不振を引き起こすが、ドーパミンをDSに選択的に再導入することで、正常な摂食行動を回復させることができる20,21。最近、迷走神経感覚ニューロンが、腸と黒質ドーパミン放出をつなぐ多重シナプス回路の重要な構成要素として同定された22。我々は、脂肪と糖が迷走神経知覚ニューロンを刺激するかどうか、またそれらが重複する回路なのか別々の回路なのかを明らかにすることを目的とする。

しかし、食欲における迷走神経の役割を解明しようとするこれまでの試みでは、さまざまな結果が得られている。迷走神経感覚ニューロンは分子的に異種であり31,32,33、多様な生理学的機能に関与しているため34,35、これまで用いられてきた化学的あるいは外科的病変アプローチでは、全体的な迷走神経活動を阻害するため、栄養強化における迷走神経感覚集団の役割を検証するのに必要な特異性が欠けていると考えられた。この問題を克服するために、FosTRAPマウスの結節神経節（NG）にウイルスを投与した分子ツールを適用し、糖や脂肪の胃注入に反応して活性化する迷走神経の神経細胞集団を操作した。その結果、砂糖と脂肪は迷走神経の個別のニューロンによって感知され、栄養特異的強化を制御するために、平行ではあるが異なる報酬回路に関与することが示された。

結果
脂肪と糖はそれぞれ異なる迷走神経集団によって感知される
脂肪23と糖24はともに神経記録実験において迷走神経発火を増加させるが、迷走神経ニューロンの異なる亜集団が特定の大栄養素を感知するかどうかは依然として不明である。この疑問を解決するために、我々はまず、汎ニューロンプロモーターSnap25によって駆動されるCa2+インジケーターGCaMP6sを発現するマウスを用いて、NGニューロンのin vivoイメージング（図1A）33のための技術を適応させた36,37。我々は、電気的に調整可能なレンズと組み合わせた二光子顕微鏡を用いて、同じ生きた動物において、糖（スクロース）または脂肪（コーン油）の十二指腸注入に反応する結節神経節組織からの記録を行った。十二指腸球にカテーテルを挿入し、幽門から2cmのところに出口ポートを設けて、腸近位部への多量栄養素溶液の送達を制限した（図1A）。個々のニューロンの反応を解析した結果、空間的に定義された迷走神経サブセットが、異なる栄養刺激に反応して活性化されることが示された（図1Bおよび1C）。NGニューロンは脂肪に強く反応するか、糖に強く反応するかのどちらかであり、両方に反応するニューロンはほとんどなかった（図1C-1F）。注目すべきことに、これらの腸栄養刺激に敏感なニューロンは、総個体数のごく一部（約17％、図1F）であり、NG内の細胞機能分担が高いという概念を裏付けている32。

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図1. スクロースと脂肪は結節神経節の迷走神経集団を活性化する。

(A）Snap25-GCaMP6sマウスのスクロースまたは脂肪の十二指腸内注入に対する迷走神経知覚ニューロンの活動パターンのin vivoイメージング。

(B）スクロース反応（マゼンタのバー、5分）または脂肪反応（シアンのバー、5分）として同定された右のNGニューロンの時間分解反応（ΔF/F）を描いたヒートマップ；右側は、スクロース（マゼンタ）、脂肪（シアン）、または両方（グレー）に反応したニューロンにおけるGCaMP6sシグナルの平均ΔF/F。網掛け部分（ピンクと青）は刺激の持続時間を表す。濃い線は平均値を、薄い網掛け部分はSEMを表す。

(C）スクロースよりも脂肪に反応した右NGニューロンのGCaMP6sシグナルの平均ΔF/F；各ドットは、十二指腸内注入中にベースラインを50％以上上回るピーク反応を少なくとも1回示したニューロンを表す；マゼンタのドットはスクロースに反応；シアンのドットは脂肪に反応；グレーのドットは両方の刺激に反応；黒のドットは平均反応が50％未満。

(D）ショ糖（マゼンタ）および脂肪注入（シアン）に対するカルシウム蛍光応答を示すSnap25-GCaMP6sマウスの結節神経節の画像。スケールバー、100μm。N = 3マウス。

(E）（D）の定量化。

(F）スクロースおよび脂肪の十二指腸内注入に反応した結節神経節ニューロンの割合。データは平均値±SEMで示した。

(G) FosTRAPの模式図： Ai14 x Snap25-GCAMP6sトリプルトランスジェニックマウスでは、スクロースに応答するニューロンのtdTomato標識と、等カロリーの砂糖または脂肪の胃内注入に応答するNGニューロンのリアルタイムの神経活動が記録されている。

(H）スクロース注入（マゼンタバー）または脂肪注入（青バー）後のスクロースTRAPニューロンの時間分解応答（ΔF/F）を描いたヒートマップ。

(IおよびJ）スクロースの胃注入または（J）脂肪の等カロリー胃注入に反応して活性化したスクロースTRAP NGニューロンの割合。N = 4-5マウス。

そこで次に、腸が無傷の動物を用いて、スクロース（15％）または脂肪（6.8％、図S1A-S1C）の等カロリー濃度の胃内注入に対する右NGからの迷走神経感覚ニューロン活動を記録した。NGニューロンは、スクロースまたは脂肪に反応して15分以上活性を維持した（図S1AおよびS1B）。予想されたように、左のNGからの記録は右のNGより少ない栄養応答性ニューロンを示した（図S1E）。胃内注入は、十二指腸内注入に比べてNG神経活動のピークを遅らせたが（図S1F-S1I）、これはおそらく胃排出の遅延によるものであろう38,39。これらのデータは、近位腸が消化後の栄養センシングの最初の部位であるという以前の証拠を支持している40。

異なるNG集団が異なる多量栄養素を感知することを確認するために、活性集団における標的組換えを可能にするトランスジェニックマウス系統（TRAP2）41,42を用いた（図1G）。これらのマウスは、活性依存性Fosプロモーターの制御下で誘導性CreリコンビナーゼiCreERT2を発現しており（FosTRAPマウス）、4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）の注射と組み合わせると、定義された時間制限のある刺激に対する活性化に基づいて、神経細胞集団への永続的な遺伝的アクセスが可能になる。 27,43,44我々は、FosTRAPマウスをCre依存性tdTomatoレポーター株Ai14,45と交配させ、sugar-TRAP NGニューロンの大部分がスクロース（15％w/v、図1Hおよび1I）の胃注入に反応してカルシウム蛍光を増加させることを示した。しかし、糖-TRAPニューロンは胃内脂肪の等量注入（6.8％v/v、図1Hおよび1J）にはほとんど反応しなかった。

FosTRAPを用いた栄養特異的な腸-脳経路の標的化
生理的条件下では食物は経口摂取されるが、我々は口腔をバイパスして胃に直接食物を注入し、味覚とは無関係に消化後の刺激がどのように食物摂取を強化するかに取り組んだ。tdTomato+NGニューロンは、等浸透圧生理食塩水（SalineTRAP）と比較して、砂糖（スクロース、15% w/v、SugarTRAP）または等カロリー脂肪（イントラリピッド、6.8% w/v、FatTRAP）の胃内注入に反応して増加することを確認した（図2A-2D）。栄養素濃度に対する神経活動の比較から、NG（図S1JとS1K）と孤束核（NTS；図S1LとS1M）の両方のレベルで用量依存的な反応があることが示唆された。これらのデータは、脂肪と糖が別々の末梢迷走神経回路を動員し、栄養素の種類とおそらく濃度に関する情報を腸から脳に伝達していることを明確に示している。

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図2. スクロースと脂肪はそれぞれ異なる迷走神経感覚集団を介して強化運動を促進する。

(A）脂肪または糖の胃内注入に反応する迷走神経感覚ニューロンを選択的に切除するFosTRAPアプローチの概略図。

(BおよびC）ウイルス介在カスパーゼアブレーション非存在下（B）または存在下（C）で、生理食塩水、ショ糖、脂肪または生理食塩水を胃内注入したFosTRAPマウスの結節神経節ニューロンの代表画像。

(D) (B)および(C)の定量化により、生理食塩水と比較してスクロースまたは脂肪注入に反応したNGニューロンのtdTomato標識が増加し、tdTomatoニューロンの欠失が確認された n = 4-6。一元配置分散分析とTukeyポストホック分析。

(E）風味-栄養条件付けパラダイムを示す図。

(F)条件付けは、SalineTRAPマウスとFatTRAPマウスではスクロースと対になったフレーバーに対する嗜好性を増加させたが、SugarTRAPマウスでは起こらなかった n = 5-6。二元配置分散分析とHolm-Sidakポストホック分析。

(G)コンディショニングにより、SalineTRAPマウスとSugarTRAPマウスでは、astic内脂肪と対になったフレーバーに対する嗜好性が増加したが、FatTRAPマウスn=5-6では起こらなかった。二元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析）。

(H) FosTRAPマウスのNGに標的化したChR2コンストラクトの代表的画像。

(I)マウスをノーズポーク誘導光遺伝学的自己刺激パラダイムで訓練した。

(J)アクティブな鼻孔で光遺伝学的刺激を誘発し、両方の鼻孔に餌ペレットを入れて3日間訓練した後、FatTRAP群とSugarTRAP群のマウスはアクティブな鼻孔を好むようになった。Dunnettの多重比較検定による一元配置分散分析。

(K-M)個々のマウスデータから、SalineTRAPマウス(K)は自己刺激を学習しなかったが、SugarTRAPマウス(L)とFatTRAPマウス(M)は迷走神経刺激に対して鼻を突くことを学習したことが確認された n = 5. 一元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析）。データは平均値±SEMで示した。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、NSは有意ではない。

迷走神経入力を受けているNTSの神経細胞は、コントロールと比較して脂肪または糖の胃内注入に応答して同様にtdTomato標識が増加し（図S1NおよびS1O）、用量応答的に増加した（図S1KおよびS1L）。これらの所見は、NTSにおける栄養誘導性Fos染色と一致する。46,47,48 大栄養素感知集団を標的とするFosTRAPアプローチの特異性を検証するために、tdTomato標識が4-OHTに依存することを確認し（図S1NおよびS1O）、同じ刺激に応答するFosTRAP標識とFos免疫反応性の間に高い重複があることを証明した（図S1P-S1T）。

強力なGI刺激であるコレシストキニン（CCK、i.p.）を用いたのは、迷走神経感覚ニューロンによって発現されるCCKa受容体（CCKaR）に作用することにより、摂食を強力に阻害することが知られているからである49。また、腹腔内注射は、多くの制御不能な変数（例えば、運動、消化、吸収速度）に依存する胃内注入と比較して、再現性が最大になると推論した。TdTomato+NTSニューロンは、CCKに反応してFos陽性細胞と忠実に重なった（図S1P-S1R）。対照的に、生理食塩水注入後にFos免疫反応性と二重標識されたtdTomato標識CCKTRAP NTSニューロンはほとんどなかった（図S1SおよびS1T）。これらの結果は、FosTRAPアプローチの特異性と選択性を強調し、脂肪または糖のいずれかを感知するNGニューロンへの遺伝的アクセスを効率的かつ確実に得ることができることを示している。

糖と脂肪を感知するNGニューロンは、大栄養素特異的強化に必要かつ十分である。
FosTRAPアプローチを検証した後、食物の強化に大栄養素を感知する迷走神経集団が必要であるかどうかを評価した。栄養強化の指標として、味-栄養条件付け課題を行った。この課題では、動物は実験的に栄養の胃内注入と対になった新しい味を好むように訓練される（図2E）。FosTRAPマウスは、AAV-flex-taCasp3-TEVp50の両側NG注射を受けた（図2Cおよび2D）。これは、TRAPプロトコルの間、脂肪または糖に反応する迷走神経感覚ニューロンの選択的切除を可能にする。捕獲前のNGのウイルス注射だけでは、摂食後の強化に影響を与えないことを確認するために、マウスを訓練して、味を胃内脂肪または糖のいずれかと関連付けた。予想通り13,14、これらのマウスは各大栄養素に対する条件付選好を形成することができた（図S2A-S2C）。次に、TRAPプロトコルを実施して、栄養応答性集団を消失させた。軽度絶食させたFosTRAPマウスを3群に分け、生理食塩水、砂糖（スクロース、15％w/v）、等カロリー脂肪（マイクロリピッド、6.8％v/v）のいずれかを胃内注入（500μLおよび100μL/分）した後、4-OHT（30μg/kg）をi.p.投与した。このプロトコールは、他の感覚・運動ニューロンを無傷のまま、迷走神経感覚ニューロンをその栄養応答性プロファイルに基づいて欠失させた（図2Cおよび2D）。対照のSalineTRAPマウスは、砂糖または脂肪の胃内注入と対になった、新規で非栄養的なフレーバーに対して、依然として強固な嗜好性を形成した。逆に、脂肪を感知するNGニューロンを欠失させたFatTRAPマウスは、砂糖と対になった味には正常な嗜好性を示したが、脂肪と対になった味は強化しなかった。一方、ショ糖を感知するNGニューロンを欠失させたSugarTRAPマウスは、砂糖の強化が選択的に消失した（図2Fおよび2G）。これらの驚くべき所見は、迷走神経感覚ニューロンの互いに排他的な別個の集団が、糖または脂肪の強化に独立して関与していることを示している。

脂肪あるいは糖を感知する迷走神経細胞の刺激がそれぞれ独立に強化に十分であるかどうかを評価するために、マウスは迷走神経感覚端の光遺伝学的刺激が鼻を突くことと対になる、以前に検証された自己刺激行動課題22を受けた（図2I）。FosTRAPマウスは、迷走神経知覚ニューロンで光感受性脱分極チャネルロドプシン-2（ChR2）を選択的に発現させるために、Cre誘導性ウイルス構築物AAV9-EF1a-DIO-hChR2（H134R）-EYFP（ChR2）51の両側NG注射を受けた（図2H）。光ファイバーをNTS内側の迷走神経終末の上方に設置し22,52、胃内脂肪、砂糖、または生理食塩水で捕捉することで、NGニューロンにおけるChR2の発現を可能にした。SugarTRAPマウスの迷走神経終末を光遺伝学的に活性化すると、対照のSalineTRAPマウスと比較して、NTS全体でFos発現が増加した（図S2CおよびS2D）。SalineTRAPマウス（図2K）は迷走神経末端の光遺伝学的刺激を誘発する鼻の穴を好むようにならなかった。対照的に、NGにChR2を発現するSugarTRAPマウス（図2L）とFatTRAPマウス（図2M）はともに、報酬の特徴的な行動である迷走神経末端の自己刺激を学習した53,54。これらの知見を総合すると、大栄養素特異的強化の発現には、別々の迷走神経回路が必要かつ十分であることが明らかになった。

糖と脂肪に反応するNGニューロンは異なる器官を支配する
糖と脂肪は異なる迷走神経集団からシグナル伝達されるという証拠に基づき、我々は次に糖と脂肪の強化部位を決定したいと考えた。我々は、Cre依存性ウイルスAAVPhp.S-Flex-tdTomatoをFosTRAPマウスのNGに両側から注射することにより、糖あるいは脂肪に反応する迷走神経求心性線維の遺伝学的ガイド下解剖学的追跡を行った（図3A）。糖と脂肪を感知する迷走神経集団の間で、末梢神経支配パターンに顕著な違いが観察された。十二指腸では、SugarTRAPマウスとFatTRAPマウスの腸絨毛では粘膜終末の広範な神経支配が観察されたが、SalineTRAPマウスでは観察されなかった（図3B）。さらに、SugarTRAPマウスの門脈には迷走神経由来のtdTomato+線維が豊富に走っていたが（図3C）、FatTRAPマウスやSalineTRAPマウスでは観察されなかった。これらのデータから、十二指腸は糖と脂肪の両方の感知を行う重要な部位であるが、糖の感知は肝門脈（HPV）レベルでも起こることが示唆される。

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図3. スクロースおよび脂肪応答性NGニューロンの末梢投射の解剖学的解離

(A）胃内生理食塩水、スクロース（15％）、脂肪（6.8％）に反応するFosTRAPマウスのNGにAAV-DIO-tdTomatoウイルスを両側から注入し、迷走神経感覚ニューロンの投射をウイルスガイド下でマッピングした模式図。

(B）十二指腸の免疫蛍光法で可視化した末端はFatTRAPマウスで最も多い。

(C）肝門脈はSugarTRAPマウスからのみ神経支配を受けている。

(D）CCK-SAPを用いた腸の迷走神経脱神経のアプローチの模式図。

(E）CCK-SAP投与により、スクロースの胃内注入に対する風味条件付けが消失した。二元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析）。

(F)CCK-SAP処置は、胃内注入脂肪に対する風味条件付けを抑制した。二元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析）。

(G)HPVの迷走神経脱分離のためのコンビナトリアルウイルスアプローチ。

(H)HPVを支配するNGニューロンのサブセットを選択的に切除することができる。

(IおよびJ）NGHPVニューロンを欠損させると、スクロース強化（I）は消失するが、脂肪強化（J）は消失しない。

(K)横隔膜下迷走神経切断術を施したマウス、または肝枝を温存したマウス、または温存しなかったマウスにおいて、胃内スクロース注入（15％）後のNTSにおけるFos発現の代表的画像。

(L）スクロースに反応するNTS FosはSDVによって鈍化するが、肝枝を温存すると部分的に回復することを示す定量化。一元配置ANOVAとHolm-Sidakポストホック解析。データは平均値±SEMで示した。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、NSは有意ではない。

脂肪シグナル伝達における消化管迷走神経線維の重要性を評価するために、我々は、上部消化管の選択的迷走神経脱神経作用の方法として以前に検証された、CCKに結合した神経毒サポリン（CCK-SAP）を野生型（WT）マウスのNGに両側注射した（図3DおよびS3A）55。ウイルス追跡実験から予測されたように、CCK-SAP処理による上部消化管の迷走神経脱分離は、CCK-SAP脱分離が確認されたマウスにおいて、糖と脂肪の両方の強化（図3Eおよび3F）をブロックした（図S3B）。

CCK-SAPは6.8％脂肪溶液の経口摂取を有意に増加させ（図S3C）、等カロリーのショ糖溶液の摂取には変化がなかった（図S3D）。これらのデータは、腸の迷走神経遮断がラットにおいて脂肪の満腹感を消失させるが、糖の満腹感は消失させないという証拠56と一致する。代わりに、糖は脊髄腸脳回路を介して空腹感を抑制するのかもしれない57。これらの知見と一致して、CckarはSugarTRAP（図S3E-S3G）およびFatTRAP NGニューロン（図S3H-S3J）の約75％で共発現しており、CCKaRがHPVを含む消化管の長さを神経支配する多くの異なる機械感覚および化学感覚迷走神経感覚亜集団32で発現していることを強調している31。従って、CCKaRは脂肪と糖の両方を感知する迷走神経感覚集団の分子マーカーとして有効であるが、NGCCKaRは糖と脂肪の両方の強化を伝えるが、脂肪のみで糖の満腹感は伝えない異種集団である。

我々の結果は、SugarTRAPニューロンによるHPVの迷走神経支配を明らかにした。これらのデータは、HPVが複数の消化器官から栄養豊富な血液を受け取っていること58や、HPV壁の迷走神経感覚支配が食餌性グルコースの感知59や食物の嗜好性に関与していること60,61を示した以前の研究と一致している。まず、Ai14マウスのHPV壁にCre発現逆行性アデノ随伴ウイルス（AAVrg-Cre）をブラッシングすると、左右のNGニューロン58,62のサブセットが標識されることを確認した（図3HおよびS3K-S3M）。次に、NGにCre依存性カスパーゼウイルスを両側注射し、Ai14マウスのHPV壁にAAVrg-Creを塗布することで、HPVに支配されているNGニューロンを選択的に切除した（図3Gおよび3H）。味覚-栄養条件付け実験において、HPVに支配されたNGニューロンの欠失は、脂肪（図3J）ではなく糖（図3I）の強化が消失した。糖強化における迷走神経肝枝の充足性を評価するために、偽マウス、横隔膜下迷走神経切断術（SDV）、または肝枝を温存したSDVを受けたマウスにおいて、スクロース胃内注入に反応するNTSにおけるFos発現を定量した。スクロース誘導性NTS Fos発現はSDVによって消失したが、肝枝を温存したSDVを受けたマウスでは部分的に温存された（図3Kおよび3L）。このように、摂食後の糖強化においてHPVに支配された迷走神経感覚ニューロンが必要な役割を果たすことを支持する解剖学的および行動学的データと、糖に関する情報を脳に伝達するには肝迷走神経枝が部分的に十分であることを示す証拠が得られた。これらのデータを総合すると、糖強化および脂肪強化は、CCKaRを発現する迷走神経知覚集団によって媒介されるが、末梢神経支配パターンに基づいて区別できることが示された。

脂肪強化および糖強化のための別々の中枢回路
迷走神経は、腸とドーパミンを産生するSNcニューロンをつなぐ重要な神経リレーとして働く。この考え方に一致するように、軽度の摂食制限を行った覚醒マウスのDS（図4A）からのマイクロダイアリシスサンプリングでは、脂肪（6.8％v/v）または砂糖（15％w/v、図4B）の胃内注入に反応して、ドーパミンが迅速かつ持続的に流出した。

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図4. 脂肪と糖は平行だが別々の報酬回路を刺激する。

(A）5分間のスクロース（15％）または脂肪（6.8％）の胃内注入に対するドーパミンを、生理食塩水をベースラインとした場合と比較して測定するために行った線条体背部のマイクロダイアリシスの模式図。

(B)脂肪または糖の胃内注入のいずれに対しても、急速かつ持続的なドーパミンレベルが認められた。二元配置分散分析とHolm-Sidakポストホック分析。

(C）腸-報酬回路に沿ったスクロースIGと脂肪IGに対する神経細胞活動を比較した模式図。

(D）スクロース（TRAP、マゼンタ）に反応したNTSの代表的な画像と、同じ動物で2週間後にスクロース（Fos、シアン、上）または脂肪（Fos、シアン、下）を注入した後の共局在。右は高倍率画像。

(E)NTS、PBN、SNcにおいて、別々の多量栄養素と比較して、スクロースの反復注入間でより高いオーバーラップを示す定量化。二元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析）。

(F) 栄養素の胃内注入に反応して、カスパーゼを介したNGニューロンのアブレーションを受けたマウスを模式的に表し、脂肪または糖特異的な腸の報酬回路のリクルートにおけるこれらのニューロンの必要性を検証した。

(G)脂肪に対する脳活動の代表的な画像を、同じマウスで、NGニューロンの栄養誘導性アブレーション前（TRAP）と後（Fos）で比較した。

(H)脂肪を感知するNGニューロンのアブレーションは、腸-報酬回路の各レベルにおいて、その後の脂肪に対する反応を鈍らせる。二元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析付き）。

(I)スクロースに対する脳活動の代表画像を、スクロース感知NGニューロンのアブレーション前（TRAP）と後（Fos）で同じマウスで比較した。

(J）糖を感知するNGニューロンのアブレーションは、腸-報酬回路の全長にわたって、その後の糖に対する反応を鈍らせる。二元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析）。データは平均値±SEMで示した。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、NSは有意ではない。

脂肪と糖がそれぞれ黒質線条体ドーパミン回路を活性化する可能性があることを証明した後、NTS→背外側傍上腕核（dlPBN）→SNc→DS経路を構成するよく定義された腸-報酬回路22に沿って、消化後のシグナルが細胞レベルで分岐するかどうかを調べた（図4C）。われわれはFosTRAPマウスを用いて、同じマウスの複数の脳領域で異なる時点の複数の刺激に対する神経細胞活動を比較するという課題に取り組んだ。tdTomatoで標識されたFosTRAPニューロンと免疫蛍光（IF）で標識されたFos発現ニューロンを、同じ動物で14日間隔で同じ刺激または異なる刺激に曝露した後に比較できることを検証した（図4DおよびS4A-S4C）。これらの所見は、解離可能なニューロンアンサンブルが大栄養素特異的な消化後強化をコードするという概念を支持するものである。先行研究27に基づき、NTSのレベルでプロエンケファリン（Penk）が糖と脂肪に反応するニューロンを区別できるかどうかを検証した。In situハイブリダイゼーションにより、PenkはSugarTRAPの約3分の1、FatTRAPの4分の1のNTSニューロンで発現していることが明らかになった（図S4L-S4Q）。

スクロースTRAPとスクロースFos標識の重なりを分析すると、NTS、PBN、SNcで高い重なりが見られた（図4E）。しかしながら、スクロースTRAPと脂肪Fos標識とを比較すると、2つの別々の栄養刺激中に標識されたニューロンの重複は限られていた（図4E）。興味深いことに、重複は腸-報酬回路のより遠位のノードで減少し、各シナプスで失われる情報もあるが、特異性は保たれていることが示唆された（図4Dと4E）。注目すべきことに、DSではSugarTRAPと糖Fosの重なりは少なかったが、これは後に詳述するように、ドーパミンシグナル伝達の性質を反映しているのかもしれない。これらのデータを総合すると、脂肪と糖は、腸の報酬回路の各ノードにおいて、平行かつほとんど別々の神経細胞集団をリクルートすることが示され、脂肪と糖の強化には区別可能な回路が存在することが支持された。

次に、黒質系をリクルートする際に、栄養に敏感な迷走神経感覚ニューロンが必要であるかどうかを検討した。同じ動物内で、迷走神経感覚ニューロンを欠失させる前と後で、栄養素に反応する腸-黒質回路に沿ったニューロン活動を比較した（図4F）。Cre依存性カスパーゼウイルスをFosTRAPマウスのNGに両側から注入し、4-OHTを加えた砂糖または脂肪の胃内注入に反応してニューロンを捕捉した。このアプローチにより、反応するすべてのニューロンでtdTomatoによるTRAP標識が得られたが（図S4D-S4K）、カスパーゼウイルスは刺激に反応する迷走神経感覚ニューロンを選択的に切除した（図S4D-S4K）。糖（図S4D-S4G）と脂肪注入（図S4H-S4K）の両方に反応して、頑健なtdTomato標識が脳全体に観察され、カスパーゼウイルスが最初の消化後シグナルの中枢処理にほとんど影響を与えなかったことを示している。しかしながら、Fos IFは、NTS（図4G-4JおよびS4D-S4K）、PBN（図4H、4JおよびS4D-S4K）、SNc（図4H、4JおよびS4D-S4K）およびDS（図4H、4JおよびS4D-S4K）において、個々の大栄養素に反応して有意に鈍化した。これらのデータから、栄養素のインターオセプションは、脂肪と糖の両方に対する摂食後の強化を中枢のドーパミン回路に中継する化学感覚迷走神経を必要とすることが示唆される。

脂肪と糖の組み合わせは快楽のための過食を促進する。
上記のデータから示唆されるのは、糖と脂肪による腸の報酬回路の複合的活性化は、どちらか一方の栄養素単独よりも強化的で食欲をそそる可能性があるということである。この仮説を検証するため、我々は接触式舐度計を用いて、WTマウスが脂肪、スクロース、またはこれら2つの大栄養素の混合物の等カロリー溶液を自発的に舐めたときの30分間の自由摂取量を定量化した（図5A）。マウスは同量の脂肪または糖溶液を容易に摂取したが、驚くべきことに、脂肪と糖の組み合わせ溶液を舐めたマウスは、脂肪または糖単独溶液を舐めたマウスの約2倍であった（図5B）。次に、溶液の栄養面を経口成分から分離しても、マウスが同じ摂取パターンを示すかどうかを評価した。外科的に胃カテーテルを留置した摂食制限WTマウスは、糖、脂肪、またはその組み合わせの等カロリー溶液の胃内注入と対になった非栄養風味溶液を舐めた（図5C）。訓練後、マウスはこの実験パラダイムで混合溶液を舐めるパターンが増加した（図5D）。このことは、脂肪と糖の組み合わせに対する嗜好性の増加は味とは無関係であり、消化後のシグナル伝達の結果であることを示唆している。さらに、脂肪と糖を含む溶液を胃内に注入すると、NTS、PBN、SNc、DSにおいて、脂肪または糖のみの等カロリー溶液を注入した動物と比較して、TRAP標識ニューロンの数が超増加した（図5E、5F、およびS5）。脂肪と糖の組み合わせが、単一栄養素の等カロリー輸液と比較してより高レベルのドーパミン放出を引き起こすかどうかを決定するために、胃内注入に反応してDSでマイクロダイアリシスを行った（図5G）。その結果、脂肪とコンボの両方を胃内に注入すると、ベースラインと比較してドーパミンが増加することがわかった（図5H）。しかし、最初の30分間では、コンボ溶液の胃内注入は、等カロリーの脂肪注入と比較して、DSにおいてより高いドーパミン放出をもたらした（図5H）。これらのデータは、脂肪と糖の強化には分離可能な回路が存在することをさらに支持し、脂肪と糖の両方が豊富な食物は、糖と脂肪の両方の報酬回路を相加的にリクルートし、肥満食摂取へのより高いレベルの動機を促進することを示唆している。

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図5. 脂肪と糖の組み合わせは、摂取量とドーパミンシグナル伝達を相加的に増加させる。

(A）接触式舐度計を用いて、脂肪、砂糖、または脂肪と砂糖を含む混合物の等カロリー溶液のマウスの自発的摂取量を測定した。

(B)マウスは、等カロリー溶液を1瓶舐める試験で、脂肪または砂糖単独よりも大量に摂取した。一元配置分散分析とTukeyポストホック分析。

(C）胃内カテーテルを留置したマウスは、砂糖、脂肪、または脂肪と砂糖の両方を含む溶液の等カロリー溶液の胃内注入に対して、非栄養風味溶液を舐めた。

(D)マウスは、脂肪または糖のみの等カロリー溶液と比較して、脂肪と糖の組み合わせを含む溶液の胃内注入をより多く舐めた。一元配置分散分析とTukeyポストホック分析。

(E）NTSの代表画像。

(F）脂肪と糖の組み合わせを含む溶液に対するNTS、PBN、SNc、DSのTRAP標識ニューロンの数が、糖または脂肪のみの等カロリー溶液と比較して多いことを示す定量化。二元配置分散分析（Tukeyポストホック分析）。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

(G)5分間の胃内脂肪（6.8％）または等カロリー食（ショ糖7.5％および脂肪3.4％）に対するドーパミンの測定を、生理食塩水ベースラインと比較して行うために行った線条体背部のマイクロダイアリシスの模式図。

(H)脂肪と比較して、コンボ溶液の胃内投与により高いドーパミンレベルが認められた。二元配置分散分析（Holm-Sidakポストホック分析）。∗pは生理食塩水のベースラインからのp＜0.05、#はコンボと脂肪の間のp＜0.05を表す。1時間にわたるドーパミンの曲線下面積（AUC）は、脂肪と比較してコンボ溶液に対する反応で有意に高かった。n = 6 AUCデータがノンパラメトリックであることを確認した後のウィルコクソンの符号順位検定。∗p < 0.05. データは平均値±SEMで示した。

考察
我々の知見から、糖強化と脂肪強化には分離可能な回路が存在することが明らかになった。NGのin vivoカルシウムイメージングを用いて、我々はまず、消化後の脂肪または糖に別々に反応する2つの迷走神経感覚集団を同定した。次に、FosTRAP法を用いて、これらのニューロンの解剖学的構造と機能を明らかにした。これらの2つの異なる迷走神経集団は、(1)別々の末梢器官を支配していること、(2)栄養特異的強化に必要であること、(3)細胞レベルで分離可能な並行した腸-脳報酬回路を開始することを明らかにした。脂肪または糖の別々の回路が活性化すると、意欲的な摂食行動が増加するが、驚くべきことに、脂肪と糖の組み合わせは相乗的に、腸-報酬回路に沿ったニューロンの活性を超相加的に増加させ、ドーパミン放出を増加させ、カロリーとは無関係に過食を促進する。このように、肥満の原因となる食物を摂取しようとする内的衝動を伝達するために、食物報酬回路が並行して活性化されるという新しいメカニズムについて述べた。

化学感覚NGニューロンの機能の特定
我々のデータは、栄養強化のシグナル伝達における化学感覚NG集団の新たな役割を明らかにした。NGは、様々な感覚様式に反応する迷走神経細胞の異種集団から構成されている。張力に敏感な機械感覚性NGニューロンの2つの集団が同定されており、筋層内の筋内アレイまたは腸管神経叢の神経節内層終末を形成している。これらの化学感覚性NGニューロンは、腸絨毛に明瞭な粘膜終末を形成していることがトレース実験によって裏付けられた31。このことは、NGニューロンが、腸上皮から吸収された栄養素やホルモン産物に反応する理想的な位置にあることを示唆している。その後、NGニューロンのトランスクリプトーム解析により、化学感覚ニューロンは機械感覚ニューロンとは遺伝的に異なることが確認された31。遺伝的に定義された機械受容体を光遺伝学的に刺激すると、急性食物摂取が強力に抑制されたが、化学感覚ニューロンを刺激すると抑制されなかった31。ここでは、FosTRAP法を用いて、栄養に敏感なNGニューロンの集団を機能的に標的とし、これらのニューロンが化学感覚ニューロンの特徴である腸絨毛の粘膜末端を形成していることを示した。ウイルスを介したアブレーションと光遺伝学的刺激アプローチを用いて、これらの化学感覚ニューロンが腸-脳の報酬回路に関与し、栄養特異的な強化や食欲を引き起こすことを実証した。肝枝を温存したまま横隔膜下の迷走神経を切除するなど、あまり精密でない手段を用いた先行研究では、1時間嗜好性試験で炭水化物のポリコースに対する嗜好性を完全に消失させるものから、同じ動物の24時間嗜好性試験で効果がないものまで、さまざまな結果が得られている67。ここでわれわれは、完全なSDVは糖質の胃内注入に反応するNTSのFos活性を消失させるが、迷走神経の肝分岐を温存することで部分的に救済されることを発見し、これは切除部位が重要な因子であることを示唆している。注目すべきは、腸の機能を制御する迷走神経運動シグナルの欠失による交絡のため、この種の実験の解釈が難しいことである。しかし、カプサイシンはTRPV1チャネルに作用して細胞死を引き起こすが、TRPV1チャネルはトランスクリプトーム解析に基づく化学感覚集団であると推定される多くのNGニューロンでは発現していない32。このことは、カプサイシン処理によって、脂肪と糖の強化に必要な重要な迷走神経感覚ニューロンが回避される可能性を示唆している。重要なことは、腸機能の運動制御を損なわないより選択的なアプローチが、食物報酬の中継における腸-脳軸の役割を支持していることである22,27,69。

これまでで最も栄養特異的な迷走神経遮断を可能にするFosTRAP戦略を用いて、我々は、別々の迷走神経回路が糖または脂肪の強化を伝達することを実証した。われわれは、FosTRAPが、遺伝的に定義された細胞タイプに偏ることなく、定義された感覚刺激に対する反応に基づいて迷走神経感覚ニューロン集団に永続的な遺伝的アクセスを提供する効果的な戦略であることを示す複数の証拠を提供する。第一に、カルシウムイメージングを用いて、SugarTRAP NGニューロンが、脂肪ではなく糖の十二指腸内注入に反応して活性化されることを確認した。第二に、栄養に反応するNGニューロンのカスパーゼを介したアブレーションによって、栄養特異的強化が阻止されることを示した。第三に、栄養特異的迷走神経回路を切除すると、黒質ドーパミン経路の下流の神経活動が障害されることを示した。さらに、FatTRAPとSugarTRAPからトレースすると、GI神経支配パターンが異なることがわかった。最後に、食後の糖強化には、HPVを神経支配する迷走神経感覚ニューロンが必要であることを確認した。これらのデータは、感覚モダリティに基づく遺伝的不均一性を予測した先行研究32を支持するものであるが、個々の管腔栄養刺激に対する感受性に応じて、これまで予想されていなかった量の細胞の多様化があることを示唆している。このように、我々は、化学感覚ニューロンが食物の選択において重要な役割を果たし、栄養価の高い食物の消費を確実にするという直接的な証拠を提供している。

脂肪および糖を感知する迷走神経ニューロンは、HPVの神経支配に基づいて区別することができる。門脈は腸から食事の糖分を受け取ることが知られており、摂食時と絶食時でグルコース濃度が大きく変動する70。門脈が糖分を感知すると、食事摂取量が減少し71,72,73,74、血糖値の維持に重要な役割を果たす75,76,77。HPVは脊髄求心性経路と迷走神経求心性経路の両方を介して脳にシグナルを送るが58、視床下部の空腹ニューロン（ARCAgRP）57の活性および低血糖に対する調節反応を抑制することにより、HPVが介在する糖の満腹感78に必要なのは脊髄経路のみである59,79。したがって、糖のHPV注入に反応する迷走神経80の生理学的役割は、まだ十分に定義されていない。本研究では、HPVの迷走神経支配が、胃内糖シグナルの少なくとも一部をNTSに伝達するのに十分であり、ショ糖強化に必要であることを報告する。

脂肪を感知する迷走神経と糖を感知する迷走神経を区別する分子マーカーはまだ十分に定義されていない。どちらのタイプのニューロン集団もCCK受容体を発現しており、これらのNGCckarニューロンは糖と脂肪の強化の両方に必要である。迷走神経感覚ニューロンによる糖または脂肪感知のマーカーとしてCCK受容体に特異性がないことは、ここで示されたようにNGにCCKaRを発現するニューロンが多く存在することを考えれば驚くべきことではない81。これらのNGCckarニューロンの有病率を考えると、NGCckarニューロンが、さまざまな摂食行動を引き起こす可能性のある、食事に関する多様な情報を伝達する異種集団を構成していても不思議ではない。上述したように、脂肪および糖に感受性のある迷走神経ニューロン集団は、HPVへの神経支配に基づいてさらに細かく分類することができる。Vip、Htr3a、Ust2bの共発現を特徴とする化学感覚クラスターt631またはG32、およびOxtr、Car8、Ctnx2を共発現する別のポリモーダルクラスターt3/t131またはI32を含む。これらのクラスターはいずれも、内腔へのグルコース注入に反応し32、これらのクラスターに含まれるニューロンの一部は、HPVと十二指腸を支配している。Gpr65の発現によって特徴づけられる化学感覚ニューロンのもう1つの大規模な集団が、クラスターt9-1231およびFで同定された32。NGGpr65ニューロンの脂肪および／または糖センサーとしての役割は、（1）Cckarを共発現していないようであること、（2）先行研究が、ポリモーダル浸透圧センサーとしての役割と一致する、腸刺激に対する広範な反応を示すことを示唆していること33から、依然として不明である83。しかし、NGTrpa1ニューロンは機械的感覚刺激に敏感である32。従って、脂肪に対する TRPA1ニューロンの神経活動が、脂肪による腸の伸張ではなく、脂肪の感知それ自体の結果であるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要である。もう1つの問題は、TRPA1ニューロンは肺を支配していることである32。このことは、このマーカーが腸由来の脂肪強化に関与する迷走神経集団に特異的なものではないことを示唆している。このように、脂肪と糖のNGニューロンは遺伝的に異質な集団で構成されている可能性があり、単一の遺伝子マーカーに基づいてそれらを区別できるかどうかは依然として不明である。FosTRAPアプローチの利点は、遺伝子マーカーと神経支配パターンに関する先験的知識の必要性を回避できることである。このアプローチを用いると、別々のNG集団が腸の栄養素を感知し、栄養素特異的な強化を促すことが実証された。従って、この戦略は、将来、健康状態や疾患状態における生理的プロセスや意欲的行動の腸脳制御において、栄養素、ホルモン、微生物代謝産物、炎症シグナルに反応するニューロンを包括的に理解するために採用される可能性がある。

脳脊髄黒質回路による消化後強化の統合
意欲的行動は、行動の結果から価値を見出す能力によって引き起こされる。SNcニューロンがドーパミンを DSニューロンに放出する黒質線条体回路は、食欲を含む意欲的行動の獲得と更新を調節するのに不可欠である84,85。重要なことに、ドーパミンの流出量はカロリー負荷と相関しており18,86、DSにおけるドーパミンシグナル伝達の阻害は食物摂取を増加させることから、ドーパミン放出の増加が摂食意欲を駆動していることが示唆される22。ヒトの神経画像研究においても、食物画像に反応して線条体活動が同様に増加した87。fMRIおよびポジトロン断層撮影法を用いることで、食物摂取に対する遅発性食後反応が黒質線条体回路内のドーパミンシグナル伝達を調節することが実証された19。注目すべきことに、ドーパミン作動性緊張を低下させる薬理学的介入は、げっ歯類22,88およびヒトの両方において、努力消費および意欲の低下を示す証拠を提供している。重要なことは、脂肪と糖分を組み合わせた食品は、これら2つの分離可能な腸脳回路に同時に関与してドーパミンの放出を増加させ、これらの肥満誘発性の食品を選択して摂取する選択を強化することである。

興味深いことに、同じ栄養素の反復注入に対する反応の重なりのレベルは、腸-報酬回路の長さに沿って減少し、DSでは重なりが非常に少ないことが観察された。この発見は、栄養素に関係なく、動物間で一貫していた。このメカニズムは不明であるが、繰り返し同じ刺激に対するニューロンの反応が変化することを反映しているのかもしれない91。腸における栄養感知などの生理的刺激に対して、ニューロンが発火する確率は感覚ニューロンで最も高く、回路のより遠位のノードで低下する。さらに、DS活動の重複が極端に少ないのは、ドーパミン・シグナル伝達に特異的である可能性がある。ドーパミンのような神経調節物質は通常、体積伝達によって放出され、拡散して多数の標的細胞上の受容体を活性化し、広範囲に作用する。というのも、ドパミン受容体は標的となるニューロン（SPN）だけでなく、興奮性求心性神経、SPNの抑制性側副神経、線条体の介在ニューロンなど、脳回路の他の構成要素にも存在するからである。これらの様々な要素が総体的に線条体の出力を形成している93。行動マウスの線条体から得られた最近のin vivoカルシウムイメージング研究は、以前に報告されたDSにおける感覚運動コードの疎密と一致している94,95。特に、DSの全活性群のわずか10％が、それぞれのin vivo刺激に反応して活性化された。また、個々のdSPNとiSPNは、行動の異なるインスタンスにおいて一貫した活動を示さないことが観察された。さらに、活性化されたグループの大きさは、イメージングが数日後であろうと1ヵ月後であろうと、時間の経過とともに同程度であった96。したがって、今回の研究で、同じ栄養素の反復注入に反応してFosの共局在化が限定的であったのは、このドーパミン作動性回路の本質的な特性を反映しているのかもしれない。

97,98。従って、最近のように工業化された農業が発達する以前は、異なるエネルギー源を持つ食品を探す能力が、ドーパミンを介した学習と動機づけのための大栄養素別回路を進化させる競争上の優位性をもたらしたであろう。現代の食環境は、高レベルの脂肪と糖質を組み込んだ加工食品の開発につながった。99 ヒトの被験者が、脂肪または糖質のみを含む食品よりも脂肪と糖質を組み合わせた食品をより欲することは以前に実証されており、これは上相加線条体反応と相関していた。私たちは、マウスが自発的にカロリーを一致させた溶液の経口摂取または胃内摂取を増加させ、脂肪と糖の両方の組み合わせに反応してドーパミン放出を増加させることを発見した。このことは、意欲的な摂食行動が経口刺激とは無関係に消化後のシグナルによって起こることを示唆している。これらのデータは、経口刺激（風味、食感、味など）に対する嗜好性が、摂食後の報酬を予測する条件付き反応であることと一致している。このメカニズムは、齧歯類とヒトで進化した、エネルギー源に関する個別の相互受容情報を脳に伝達する保存されたシステムを反映している可能性が高く、脂肪と糖の強化に関する「ラベル付けされた線」またはハードワイヤード経路の存在を示唆している可能性がある。現在の食環境では、脂肪と糖の両方を豊富に含む食品が容易に入手できるため、肥満の原因となる食事の評価と食欲が高まり、肥満の素因が高まる可能性がある。

結論
我々のデータは、欧米食によるカロリー摂取の増加は、脂肪と糖分を別々に強化する間受容回路をハイジャックすることから生じるという考えを支持している。つまり、意識的なダイエット努力は、脂肪と糖質の両方を多く含む食品を摂取したいという潜在意識下の内的衝動に打ち負かされている可能性がある。したがって、間受容的な腸と報酬の回路を操作することで、肥満の原因となる食事の自発的な摂取の減少を促し、肥満を治療するための有効な治療目標が得られる可能性がある。

研究の限界
本研究では、TRAP2遺伝モデルマウスを用いて、糖および脂肪強化に関する腸脳回路を調べた。このアプローチの限界は、Fosプロモーターに依存していることである。したがって、刺激に反応して活性化されるニューロンのみが標的とされた。この点を考慮すると、構成的活性が高いニューロンやFosを発現していないニューロンが、脂肪と糖の強化にどの程度関与しているかを決定することは、依然として困難である。これは、ほとんどグルタミン酸作動性のみである迷走神経感覚ニューロンを研究する上では大きな問題ではないが、異なる栄養素の強化に関する中枢神経回路の複雑さを完全に解明するためには、さらに1細胞解像度のin vivoアプローチを採用する必要があるだろう。

STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースソースの識別子
抗体
ウサギ抗c-Fos Cell Signalling Technologies Cat #2250 ; RRID: AB_2247211
ロバ抗ウサギ AlexaFluor647 ThermoFisher Cat #A32795 , RRID: AB_2762835
細菌およびウイルス株
AAVPHP.S-FLEX-tdTomato Addgene Addgene ウイルス前処理 #28306 -PHP.S; http://n2t.net/addgene:28306; RRID:Addgene_28306
AAV5-FLEX-taCasp3-TEVp Addgene Addgene viral prep # 45580-AAV5; http://n2t.net/addgene:45580; RRID:Addgene_45580
AAV9-EF1a-DIO-hCHR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA51 Addgene Addgene ウイルス前処理 #20298 -AAV9; http://n2t.net/addgene:20298; RRID:Addgene_20298
AAVrg-EF1a-mCherry-IRES-Cre Addgene Addgene viral prep #55632 ; http://n2t.net/addgene:55632; RRID:Addgene_55632
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
4-hydroxytamoxifen Sigma Aldrich Cat #H6278 -50MG
CCK-サポリンおよびサポリン Advanced Targeting Systems Cat #IT -31 (CCK-SAP)
Cat番号IT-21（SAP）
CCK オクタペプチド、硫酸化 Tocris Cat #1166
クロザピン N-オキシド（CNO）エンゾ・ライフ・サイエンシズ Cat #BML -NS105-0025
微小脂質 Nestle Health Science 社の Cat #9519922
スクロース Sigma Aldrich Cat #S7903 )
0.9% 塩化ナトリウム Baxter Healthcare Corporation Cat #2B1322
重要な市販アッセイ
RNAscope® Multiplex Fluorescent Detection Kit v2 Advanced Cell Diagnostics Cat #323110
実験モデル生物／系統
マウス C57BL/6J ジャクソン研究所 JAX: 000664
マウス B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J The Jackson Laboratory JAX: 021882
マウスマウス: B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Laboratory JAX: 007914
マウス B6.Cg-Snap25tm3.1Hze/J The Jackson Laboratory JAX: 025111
オリゴヌクレオチド
Cckar-c3 RNAscope プローブ Advanced Cell Diagnostics Cat #313751 -C3
Penk-C2 RNAscope プローブ Advanced Cell Diagnostics Cat #318768 -C2
ソフトウェアとアルゴリズム
PRISM 10 グラフパッド https://www.graphpad.com/features
Clarity Chromatography Software DataApex https://www.dataapex.com/product/clarity-std
Prairie View Imaging Bruker https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
MassLynx ウォーターズ https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software/masslynx-quantitation-applications.html
その他
2018 Teklad Global 18% Rodent Diet Inotiv Cat #2018
ピンポート、22Ga Instech Labs Cat #PNP3F22
2mm CMA-7 マイクロダイアリシスプローブ CMA Microdialysis Cat #P000083
リックメーターボックスおよび遮音キュービクル MedAssociates N/A
HTEC-510 HPLCユニット Eicom https://www.eicom.co.jp/en/htec-510
ACQUITY UPLC HSS T3 VanGuard プレカラム Waters Cat #186003539

リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるGuillaume de Lartigue (gdelartigue@monell.org)までご連絡ください。

材料の入手可能性
本試験では新規の試薬は使用していない。

データおよびコードの利用可能性
本論文はオリジナルのコードを報告していない。本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要望に応じて主担当者から入手可能である。

実験モデルの詳細
動物
すべての動物処置は倫理的ガイドラインに従い、すべてのプロトコルはフロリダ大学（プロトコル番号201810305）およびMonell Chemical Senses Center（プロトコル番号1190）のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）により承認された。成体マウス（6～20週齢、雄雌とも）を使用し、特に断らない限り、標準げっ歯類チャウ（3.1 kcal/g、Teklad 2018、Envigo、Sommerset、NJ）をアドリビタムにアクセスできる22℃で飼育しながら、逆12時間明暗サイクルで維持した。本実験では雄マウスと雌マウスの間に有意な性差は認められなかった。すべてのマウスはC57BL/6Jバックグラウンドであり、トランスジェニック遺伝子型はPCRによって検証された。系統の詳細と各群の匹数は以下の通りである： C57BL/6J野生型：n=62：雄31匹、雌31匹；自家繁殖、FosTRAP n=70：雄35匹、雌35匹；Jax B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J (JAXストックNo.021882 )、Fos Cre x tdTomato：n=116：雄58、雌58；Jackson Laboratory B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J(JAXストックNo.021882)およびAi14(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, JAXストックNo.007914)から自家繁殖。 )、Fos Cre x tdTomato x Snap25GCAMP6s: n=20、雄10、雌10；Jackson Laboratory B6.129(Cg)- Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J (JAXストックNo.021882)から自家繁殖 )、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J(JAXストックNo.007914)、およびSnap25-2A-GCaMP6s-D(B6.Cg-Snap25tm3.1Hze/J、JAXストックNo.025111)から繁殖させた。実験に先立ち、マウスの取り扱い、注射、胃カテーテル注入ポンプの装着、行動チャンバー、オプトジェネティクス用パッチコードの装着などの実験条件に2～3日間慣れさせた。

方法の詳細
TRAPプロトコル
TRAPプロトコルでは、胃内注入の6時間前にマウスを絶食させた。暗くなる30分前に、マウスはホームケージ内で500μLの胃内注入液を100μL/分で投与された。刺激の3時間後、マウスに4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT；30mg/kg、i.p.；MilliporeSigma社、マサチューセッツ州バーリントン）を注射し、4-OHT注射の3時間後に通常の餌に戻した。胃内注入液は、生理食塩水、スクロース溶液（75％、30％、15％ w/v）、等カロリー脂肪溶液（33.3％、13.4％、6.8％ v/v；スイス、ヴェヴェイのネスレ社製マイクロリピッド）、またはカロリー含量で脂肪50％と糖50％の等カロリー複合溶液とした。生理食塩水の浸透圧は、異なる濃度のショ糖に合わせた。微小脂質とスクロースの粘度にはほとんど差がなかった。我々の研究室での先行研究は、脂肪とスクロースの嗜好性は、迷走神経を介した脂肪と糖の摂取の原動力にはならないことを示している56。

外科手術
結節神経節（NG）注射
手術の10分前に、マウスにカルプロフェン（5mg/kg；Henry Schein社製）を皮下注射した。マウスは1.5～2.5％のイソフルランで麻酔され、頸部腹側の皮膚に2cmの正中切開を加え、その下の筋肉、唾液腺、リンパ節を引っ込め、先端の細い鉗子を用いた鈍的剥離によって迷走神経を頸動脈から切り離した。迷走神経を頭部に向かってたどり、周囲の筋肉を引っ込め、結合組織を鈍的剥離によって露出させることで、NGの位置を確認した。ガラス製マイクロピペット（先端直径30μm、45度の角度で面取り）にウイルス構築物（pAAV9-Ef1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA（Addgene 20298）、pAAV5-flex-taCasp3-TEVp（Addgene 45580）、pAAV. Php.S-FLEX-tdTomato（Addgene28306）、Addgene、Watertown、MA）、CCK-saporin（ATS Bio、Carlsbad、CA）、またはsaporin（ATS Bio、Carlsbad、CA）をマイクロマニピュレーターに取り付けて、NGの位置決めと穿刺に使用した。Picospritzer III注入器（Parker Hannifin, Pine Brook, NJ）を用いて、注入速度と注入量を制御し、直接NGに注入した（総量0.5μl）。切開部は5-0吸収性縫合糸でランニングステッチで閉鎖し、術後24時間目に鎮痛剤を投与した。pAAV5-flex-taCasp3-TEVpはNirao ShahとJim Wellsから贈られた（Addgene viral prep # 45580-AAV5; http://n2t.net/addgene:45580; RRID:Addgene_45580）。pAAV-FLEX-tdTomatoはEdward Boydenから贈られた（Addgene viral prep # 28306-PHP. S; http://n2t.net/addgene:28306; RRID:Addgene_28306) pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA は Karl Deisseroth (Addgene viral prep # 20298-AAV9; http://n2t. net/addgene:20298;RRID:Addgene_20298)、AAV-Ef1a-mCherry-IRES-CreはKarl Deisserothから贈られた(Addgene plasmid # 55632-AAVrg; http://n2t.net/addgene:55632; RRID:Addgene_55632)。

レトロCre HPVの適用
1.5-2%イソフルランで麻酔したマウスに、鎮痛剤ブプレノルフィンXR 1 mg/kgとカルプロフェン5 mg/kgを手術20分前に皮下投与した。通常1.5cmの開腹が行われた。肝臓を後退させてHPVを露出させ、ウイルスベクターの拡散を防ぐため、滅菌パラフィルムをHPVの上に柵状にあててその部位を覆った。ウイルス逆行性ベクター（pAAVrg-Ef1a-mCherry-IRES-Cre、Addgene 55632；マウス1匹あたり1μL）を、小さな滅菌ペイントブラシでHPVに塗布し、ウイルスが確実に浸透するように激しくブラッシングした。切開部位を腹膜は5-0縫合糸、皮膚は創傷クリップで閉鎖し、術後24時間に鎮痛剤（カルプロフェン）を投与した。マウスには湿らせた餌を与え、実験前に回復とウイルス発現のために少なくとも2週間与えた。

胃内（IG）カテーテル留置
IGカテーテルは、6cmのシリコンチューブ（外径.047" x 内径.025"、SIL047、Braintree Scientific、マサチューセッツ州Braintree）に、遠位端から1mm、3mm、13mm、15mm、および近位端から10mmと12mmの位置に6ビーズのシリコン接着剤（#31003、Marineland、バージニア州Blacksburg）を塗布したものと、慢性間欠アクセス用のPinport（Instech Labs、ペンシルベニア州Plymouth Meeting）から構成された。麻酔マウスでは、1.5cmの開腹を行い、鈍鉗子と滅菌綿棒を用いて胃を外挿した。大弯と眼底の接合部に5-0吸収性縫合糸を用いて、主要血管を避けて4mmのパースストリング縫合を行った。パースストリングの中央を18ゲージの針で穿刺し、シリコーン接着剤の1つ目のビードが胃の内側に、2つ目のビードが外側にくるまでカテーテルを押し込む。その後、パースストリングの縫合糸を締めて結び、シリコン接着剤の2つのビーズの間に胃壁を固定した。次に、左側腹壁に穴を開け、先端の細い鉗子で腹膜壁がシリコン接着剤の3番目と4番目のビーズの間に来るまでカテーテルを引き抜いた。カテーテル周囲の腹膜を巾着糸で縫合し、締め付けて結び、接着剤の2つのビーズの間でカテーテルを腹膜に固定した。腹膜開腹部は5-0吸収性縫合糸で閉鎖した。2mmの正中線背側皮膚切開を肩甲骨間部尾側で行い、1mm×14cmの滅菌ブラントプローブを挿入し、左前肢尾側の皮膚下、腹部切開部までトンネルを掘った。カテーテルをブラントプローブの先端に通し、近位端の最初のビーズが外部に出るまで引っ張り、近位端の2番目のビーズを皮下に挿入した。チューブの端を外側のビードのすぐ上で切断し、22ゲージのピンポートをチューブ内に瞬間接着剤で固定した。カテーテルの周囲を縫合し、2つのシリコンビーズの間の皮膚に固定した。腹部の切開は縫合クリップで閉じた。鎮痛剤ブプレノルフィンXR（1mg/kg）とカルプロフェン（5mg/kg）を手術の20分前に皮下投与し、カルプロフェンは術後24時間に再度投与した。マウスには湿らせた餌を与え、実験前に少なくとも1週間の回復期間を与えた。手術前の体重が回復するまで、毎日の体重をモニターした。

膣切開
手術は、げっ歯類の生存手術に関するIACUCガイドラインに従って無菌的に行われた。マウスは1.5～2.5%のイソフルランを連続吸入して麻酔した。各マウスが適切な麻酔レベルに達していることを確認するため、手術前にペダル反射テストを行った。マウスはヒーティングパッドで温めた滅菌ドレープ上に置かれた。EtOHとベタジンで3回洗浄する前に腹部の毛を剃った。滅菌した手術器具を用いて2-4cmの正中開腹を行った。小腸と結腸を外挿し、滅菌0.9%NaCl生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼ上に置いた。横隔膜下の迷走神経は、肝臓と胃を緩やかに後退させることで可視化した。迷走神経の左右の頸枝をスプリングシザーを用いて横隔膜の尾側で直接切断し、迷走神経を完全に切断した。肝温存迷走神経切断は、横隔膜下の右頸迷走神経を横隔膜の尾側で直接切断し、横隔膜下の左頸迷走神経を総肝枝の尾側で下部食道括約筋の吻側で切断して行った。偽動物は横隔膜下迷走神経を可視化し、分離したが、切断はしなかった。内臓の位置を変え、切開部位を0.9％生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼで覆った。

迷走神経切開後、シリコンチューブを胃壁の小さな開口部から十二指腸内腔の近位部に挿入した。十二指腸には200μLのスクロース（15％v/w）が2分間注入された。刺激後、切開部を縫合し、マウスが自発的にケージの非加熱部に移動するまで、加熱パッド上で回復させた。90分後、マウスを灌流し、脳を摘出し、4％PFAで24時間後固定した。

In vivo 2光子イメージング
ガルバノメーターとピエゾ対物レンズを装着した2光子顕微鏡（Bruker社製）を使用し、29フレーム/秒のフレームレートで画像を取得できるガルボ/レゾナントスキャナーを組み合わせた。顕微鏡は、Somnosuite（イソフルラン）麻酔器と恒温制御温パッド（Kent Scientific社製）、および腸内に栄養を注入するためのProgrammable Syringe pump（Harvard apparatus PHD 2000、Cat no.70-2002）を用いて、in vivoイメージング用にセットアップした。

暗くなってから少なくとも2時間絶食させたマウスを、持続麻酔（1.5％イソフルオラン）下に置き、処置の間中体温を維持するために加温パッド上に置いた。胸骨の上と顎の下を約2cm切開し、唾液腺を切り離した後、頸動脈と迷走神経を露出させた。胸鎖乳突筋、舌骨筋、二腹筋の後腹を横に引き、NGが見えるようにするため、レトラクサーを使用した。迷走神経をNGのすぐ上で切断し、舌下神経と隣接する小枝から注意深く分離した。次に迷走神経を頸動脈と周囲の軟部組織から剥離し、右のNGを、マグネットベースに固定された金属アームに取り付けられた直径8mmのカバースリップからなる安定したイメージングプラットフォーム上に静かに置いた。迷走神経がカバースリップに固定されるように外科用シリコン接着剤（Kwik-Sil、WPI）を迷走神経に塗布し、DMEM（Corning）培地1滴に浸したNGを2枚目のカバースリップで覆った。20倍の水浸正立対物レンズを用い、画像化を行った。

注入は、シリンジをシリコンチューブに取り付け、スクロース、コーン油（Mazola）または生理食塩水のいずれかを満たした精密ポンプを用いて行った。NGを露出させる手術の前に、麻酔をかけたマウスの腹部を小さく切開し、胃を露出させた。次に、シリコンチューブを胃壁の小さな切開創から十二指腸管腔の近位部に挿入した。動物によっては、十二指腸を切開して幽門から2cmほど遠位に出口ポートを作った。チューブが腸から滑り出すのを防ぐため、胃壁に瞬間接着剤を塗布した。NGに異なる栄養素反応性サブポピュレーションが存在することを明らかにするため、同一マウス内で異なる刺激に反応する神経細胞活動をモニターした。ベースラインの神経細胞活動信号の記録は、生理食塩水を1分間連続注入（100μl/分）した後、75％w/vスクロースを5分間注入（100μl/分）し、さらに生理食塩水を10分間フラッシュ（100μl/分）して、出口ポートからスクロース残渣を除去することから開始した。続いて、生理食塩水を1分間（100μl/分）注入した後、コーン油（100%）を5分間（100μl/分）注入し、同じ動物内で2回目のベースラインを記録した。FosTRAP:Ai14×SNAP25GCaMP6sマウスの別のコホートでは、スクロース（15％w/v）の胃内注入に反応して捕捉した。マウスの右NGは上記のように曝露され、ベースラインとして生理食塩水の胃内注入中、および出口ポートなしのスクロース（15％）または等価微量脂質（6.8％）の5分間の胃内注入に反応して15分間記録された。後者の実験デザインは、TRAP法で用いられたものと一致しており、循環グルコースレベルの変化をもたらす提示順序に関連する潜在的な問題を克服し、より自然な摂食条件を模倣している。

GCaMP6sの蛍光変化は、関心領域（ROI）で概説され、各ROIはイメージングセッションを通して1つの細胞を定義した。ROIのピクセル強度（ピクセル間の平均）は、フレームごとに計算され（ImageJ）、手動解析のためにエクセルにエクスポートされた。ベースライン信号は、刺激導入前の5分間（脂肪、スクロース、生理食塩水）の平均GCaMP6s蛍光として定義した。以下の基準を満たした場合、細胞は栄養に反応したとみなされた： 1）GCaMP6s蛍光のピークがベースライン平均より2標準偏差上であった、2）GCaMP6s蛍光の平均がピークの周囲20秒のウィンドウでベースライン平均より70％以上上であった。ニューロンがベースライン活性を示さなかったNGは、研究から除外された。

定位移植とウイルス注射
マウスは1.5-2.5％イソフルランで麻酔し、脳定位固定装置（World Precision Instruments社、フロリダ州サラソタ）に入れ、ヒーティングパッドの上で休ませた。皮膚切開（1-1.5cm）および頭蓋表面からすべての軟部組織を除去した後、鈍的解剖により骨膜を除去した。歯科用ドリルを用いて標的部位の頭蓋を貫通させた。皮膚は5-0吸収性縫合糸で閉鎖した。

オプトジェネティックポストの埋め込みには、近くに穴を開け（0.6-1mm）、ステンレス製のネジを固定した。オプトジェネティックポストは、光ファイバー（FT200UMT、Thorlabs、Newton、NJ）をセラミックフェルール（LCジルコニアフェルールFZI-LC-230、Kientec、Stuart、FL）にUV硬化接着剤（RapidFix、St.）ポストはNTSの迷走神経終末（AP：-7.5mm、ML：±0.3mm、DV：-5.0mm）に埋め込み、歯科用セメント（GCフジセム2、GCアメリカ、東京、日本）で固定した。歯科用セメントでスクリューを含む露出した頭蓋を覆い、マウスを回復エリアに移動させる前に完全に硬化させた。

微小透析インプラントについては、微小透析ガイドカニューレ（Amuza, San Diego, CA）を、以前に検証された22（AP:+1.5、ML:±1.5、DV:-3.0）のようにDSに移植した以外は、上記と同じプロトコルで行った。オブチュレーターまたはダミーカニューレは、ガイドカニューレの特許を保つために使用され、腹側に少なくとも1mm突出し、背側はガイドカニューレの糸にねじ込まれた。

行動試験
食物制限
すべての行動実験中、マウスは食物へのアクセスを制限することにより体重の85～90％に維持された。簡単に説明すると、体重維持のために、行動課題終了2時間後に約2～3gの餌（体重の10％）をマウスに与えた。このパラダイムは、消化管内の未消化の餌によって関連付けが混乱することなく、マウスが試験溶液と対になった栄養素を識別できるようにするものである。すべての場合において、体重は24時間ごとに、再給餌の直前に評価した。体重が開始体重の85％未満になったマウスには、2.5gに過剰体重減少分（g）を加えたものを、再び開始体重の85％になるまで与えた。水へのアクセスはホームケージ内で自由とした。

行動実験装置
すべての行動実験は、光遺伝学的刺激および／またはCNO注入と連動して、換気および音響減衰キュービクル（Med Associates Inc.）各チャンバーには、リッキング検出用の10ms分解能の接触式リッキングメーター（Med Associates Inc.）ノーズポーク・オペラント課題には、赤外線ビーム検出器付き5穴ノーズポークウォールを備えた別個のチャンバーを使用した（Med Associates Inc）。これらのチャンバーは、光遺伝学的刺激および/または胃カテーテルを介したポンプ制御注入とともに使用された。

風味-栄養条件付け課題
食餌制限マウスを防音型オペラントリッキングメーターボックス(Med Associates社製)に入れ、0.2% w/vサッカリン1本で1日1時間、少なくとも連続3日間、またはマウスが1時間あたり少なくとも1,000回舐めるまで、訓練と馴化を行った。マウスはシッパーから舐めるように訓練された後、事前テストを受けた。事前テストでは、2種類の人工甘味料(0.025% w/vサッカリン)入りのクールエイド(0.05% w/v)フレーバーを、Med Associatesのリックメーターボックスで10分間、右と左に1本ずつ舐めた。5分間の時点で、個人の嗜好性の影響を最小限にするため、フレーバーの位置を入れ替えた。各フレーバーの総舐め回数をセッション全体で集計し、栄養素（正の条件刺激）を嗜好性の低いフレーバーに、生理食塩水を嗜好性の高いフレーバーにペアリングして、栄養素とペアリングしたフレーバーに対する嗜好性の天井効果を回避した。フレーバーと栄養素の組み合わせは群内でカウンターバランスさせた。プレテストの後、マウスは6日連続で1時間の条件付けセッションを受け、交互に生理食塩水または栄養剤の胃内溶液とフレーバーとの接触を受けた。条件付けの際に左右の嗜好性が形成されるのを避けるため、マウスは2日ごとに交互に、それぞれのフレーバーを箱の左右で同じ時間ずつ摂取した。条件づけの6日後、試験後の日に、胃内注入のない状態で、10分間の2瓶嗜好性試験を予備試験時とまったく同じように繰り返した。結果は、各被験者が後試験中に栄養と対になった味を嗜好した割合で測定された。

鼻突き自己刺激
マウスは、我々が以前に発表したプロトコールに従って、2つのノーズポーク（1つはアクティブ、もう1つはアクティブ）を備えたMed Associatesのノーズポークチャンバー内で、光遺伝学的刺激のためにノーズポークをするように訓練された22。マウスは無作為に右または左のアクティブノーズポークをカウンターバランスで割り当てられ、30分間のノーズポーク訓練を3日間受けた。すべてのセッション中、マウスはレーザーに取り付けられたスイベル付き光ファイバーケーブルにつながれ、アクティブノーズポークは、以前検証されたように、5mWの強度（ファイバー先端で測定）で1秒間の間、周波数1Hzの光遺伝学的刺激を受けた。

マイクロダイアリシス実験
すべてのマウスを実験日の3～4日前から微小透析室に4時間馴化させ、ハンドリングストレスと新奇恐怖症を軽減させた。微量透析実験初日、ガイドカニューレのキャップを外し、透析プローブをガイドカニューレに挿入した。プローブ挿入後、各マウスを微量透析チャンバーに入れ、アドリブで水を飲ませながら2時間馴化させた。その後、動物がケージ内を自由に動き回れるようにして、微量透析液を4時間採取した。透析プローブは、液体スイベルに取り付けられた柔軟なスプリングテザーで囲まれた柔軟なタイゴンチューブで輸液ポンプに接続され、実験中は1μl/分の流速で人工脳脊髄液（aCSF）が灌流された。テザーは、マウスがテザーにつながれている間、快適に眠ったり飲んだりできるように、動物が邪魔されずにテストボックスのすべての部分に到達できる長さであった。サンプル採取は、栄養剤の胃内注入中およびその後1～2時間継続した。各動物は最大3種類の刺激（生理食塩水、脂肪、砂糖またはコンボのいずれか）を受け、これにより動物内での比較が可能になった。3日間にわたって生理食塩水と刺激の間に1時間の間隔をあけながら、1日に2～3種類の刺激を注入し、試験と試験の間に3日間の回復期間を設けた。

実験期間中、自由に動くマウスから微量透析液を採取し、電気化学検出法（HPLC-ECD）を用いて分離・定量した。簡単に説明すると、マイクロダイアリシスプローブ（2 mm CMA-7、カットオフ6 kDa、CMA Microdialysis、ストックホルム、スウェーデン）をガイドカニューレ（対応するCMA-7モデル）を通して線条体に挿入した。挿入後、プローブをシリンジポンプに接続し、透析液を回収した。ドーパミンは、図4に示すHTEC-510 HPLCユニット（Eicom、カリフォルニア州サンディエゴ）または図5に示すUPLC結合スペクトロメトリーを用いて検出した。

図4のデータでは、DSを人工CSF（Harvard Apparatus）で1.2μl/分で灌流した。2時間の洗浄期間の後、透析液サンプルを7分ごとに採取し、凍結した。オートサンプラーを使用して陽イオン交換カラム（CAX、Eicom）にサンプルを注入して分析物を分離し、電気化学検出器（+450mV、250ul/min）で検出した結果得られたクロマトグラムをソフトウェアClarity（DataApex）を使用して分析した。実際のサンプル濃度は、0.5 pg/μl DA標準物質（Sigma）から得られたピーク面積に基づいて計算され、ベースライン・サンプルに関連する平均DA濃度に対する変化率として表された。

図5のデータでは、生理食塩水の注入（100μl/minの速度で500μl）後1時間、栄養剤の最初の刺激（3.4%の脂肪と7.5%の糖のコンボまたは6.8%の脂肪のアイソカロリーのいずれか；100μl/minの速度で500μl）の注入後1時間、さらに生理食塩水の注入と2回目の刺激をその後2時間行い、マイクロダイアリセートを15分間隔で収集した（1μl/minの速度でaCSF）。微量透析液は、aCSF中のEDTA（50μg/mL）、L-アスコルビン酸（45μg/mL）、および酢酸（0.05％v/v）の15μLカクテルで回収し、ドライアイスで凍結した101。サンプル処理のため、マイクロダイアリセート（20μL）サンプルを、内部標準物質（ドーパミン-d4；25ng/mL）を含むメタノール（0.05％酢酸；20μL）で希釈し、ボルテックス混合し、マルチスクリーンSolvinert（Millipore, St. Louis、MO）96ウェルフィルタープレート（0.45μm）でろ過し、遠心分離（2000g、5分、4℃）し、Xevo® TQ-Sマイクロトリプル四重極質量分析計と結合したWaters Acquity UPLCに注入した。Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100×2.1、1.8μm）と同等のケミストリーのVanGuardプレカラム（Waters Co, Milford, MA）を用いて、グラジエントモードでクロマトグラフィー分離を行った。最適化された直線グラジエントプログラムは、水（移動相A）およびメタノール（移動相B）中の0.1％ギ酸を含み、以下の通りであった： EDTA（50μg/mL）、L-アスコルビン酸（45μg/mL）、および酢酸（0.05％、v/v）を含むブランクaCSFに既知量のドーパミンをスパイクし、検量線および品質管理標準液を調製した。実際のサンプル濃度は、0.1 pg/μl DA標準物質（Sigma）から得られたピーク面積に基づいて計算し、ベースラインサンプルに関連する平均DA濃度に対する変化率として表した。

灌流
Leica Perfusion One System (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)を用いて、麻酔した動物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですべての血液がなくなるまで経心的に灌流した後、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を2分間低温灌流した。その後、脳、NG、胃、腸、HPVなどの組織を採取し、PBS中4％PFAで24時間後固定した後、0.1％アジ化ナトリウムを含む30％スクロースに移し、最低72時間処理した。

組織の処理と保存
スライス
全脳をOCTに包埋し、-20℃に保ったLeica凍結ミクロトーム（CM 3050 S, Leica Biosystems）で35μmの厚さで3回に1回の割合でスライスした。スライスは、さらに染色またはイメージングを行うまで、-80℃の凍結保護剤中で保存した。結節神経節はOCT（Sakura, Torrance, CA）に包埋し、15μMでスライスし、Fisherbrand Superfrost Plusスライド（Fisher Scientific）に3回に1回の割合でフロストマウントし、さらに処理するまで-20℃で保存した。

免疫組織化学 - Fos
組織を凍結保護剤から取り出し、6ウェルプレート中、室温のPBSで10分間ずつ3回リンスした後、非特異的抗体結合を防ぐため、透過化剤（244.5mL PBS、5mL血清、0.5mL Triton-X100、0.25g Bovine Serum Albumin）と20％正常ロバ血清からなるブロッキング溶液中で30分間インキュベートした。その後、組織を透過化剤中、1:1000 cFos抗体（Cell Signaling Technologies, rabbit-anti-cFos #2250 ）と共に室温で一晩インキュベートした。翌日、未結合の抗体を除去するため、組織をPBSで20分ずつ3回リンスした後、1:1000の二次抗体（Donkey-anti-rabbit Alexafluor 647; AbCam, Cambridge, UK）を含む透過化剤中で2時間インキュベートした。その後、組織をPBSで2時間ずつ3回洗浄し、プラススライドにマウントし、Prolong Diamond Antifade Mountant（Invitrogen, Waltham, MA）でカバースリップし、イメージングと解析まで-20℃で保存した。

組織清拭
末梢組織の迷走神経末端を画像化するため、画像化前に腸管とHPVをTDE（2,2′-thiodiethanol、MilliporeSigma）中で最低2時間インキュベートして清澄化した。

RNAscope NTSおよびNG
NG切片とNTS切片（それぞれ厚さ15μmと20μm）において、蛍光マルチプレックスキット（Advanced Cell Diagnostics社製）を用いたSingle-Molecule蛍光in-situハイブリダイゼーションにRNAscopeを用いた。具体的には、特異的遺伝子Penk-C2およびCckar-C3のC2およびC3 DNAオリゴヌクレオチドプローブを用いた。実験手順は以下の通りである：組織切片を4％パラホルムアルデヒド溶液で15分間ポスト固定し、エタノール洗浄を順次行った（5分間50％、70％、100％、さらに100％）。切片は5分間風乾し、過酸化水素で10分間洗浄した。NTS切片については、さらにターゲット回収ステップを行った。タンパク質消化（脳切片はプロテアーゼIII、NG切片はプロテアーゼIV）を40℃で30分間行い、蒸留水で2回洗浄した。その後、Penk-C2（NTS用）またはCckar-C3（NG用）プローブをスライドに塗布し、40℃の加湿インキュベーターで2時間保存した。スライドをRNAscope洗浄バッファーで2回洗浄し、その後の比色反応はキット（OPAL- Akoya Biosciences, Marlborough, USA）に付属の標準プロトコールに従って行った。最後の洗浄バッファーステップの後、DAPI（4′,6-diamidino-2-phenylindole）含有Prolong Diamond Antifade mountant（Invitrogen, Waltham, MA）を用いてスライドを速やかにカバースリップした。

イメージング
Fos発現またはmRNAプローブで標識した組織切片を、Keyence BZ-X800を用い、10倍でオートフォーカスキャプチャーによるシングルプレーンで、またはLeica TCS SP8共焦点顕微鏡を用い、20倍で画像化した。Fos発現とコロカライゼーションの定量は、最低3切片/領域/動物の蛍光画像をマージして行った。データは各群の切片あたりの陽性細胞数の平均値で表した。in situ ハイブリダイゼーション用に処理した切片の画像化には、ポジティブおよびネガティブコントロールプローブを使用し、mRNA シグナルを最適に可視化するための露光時間と画像処理パラメーターを決定し、可能性のあるフォトブリーチングを制御した。明るさとコントラストの調整、およびFos発現とコロカライゼーションの自動定量は、Nikon NIS ElementsまたはImage Jソフトウェアを用いて行った。

定量化と統計解析
データは平均値±SEMで示し、Student's t-test、Wilcoxon signed rank test、一元配置の被験者内分析、または二元配置の被験者内/混合モデル分散分析（ANOVA）（必要に応じてGreenhouse-Geisser補正を適用）を用いて、図の凡例に記載されているように統計的有意性を分析した。データの正規性をチェックした後、統計的有意性を評価するために適切なパラメトリック検定またはノンパラメトリック検定を行った。有意な一元配置分散分析（one-way ANOVA）検定に続いて、多重比較の補正を伴う一対比較が行われた。二元配置分散分析では，単純な主効果が報告されるか，有意な交互作用が報告され，多重比較補正を伴う一対比較が続いた．統計的有意性の閾値はp<0.05であり、有意な比較はすべての図で＊p < 0.05、＊p < 0.01、＊＊p < 0.001、＊＊＊p < 0.0001として報告されている。p < 0.1（ただし0.05以上）の比較は正確なp値で報告されている。統計解析はGraphPad Prismで行った。実験の統計的詳細は図中の凡例にあり、内訳はData S1 Source data fileにある。

謝辞
本研究は、NIH助成金R01 DK116004（G.d.L.）、R01 DK094871（G.d.L.）、F31 DK1311773（M.M.）、スタートアップ資金（G.d.L.およびA.Sharma）、AHAポスドクフェローシップ23POST1026084（A.Singh）、F32 DK128984（L.N.W.）、およびSanteDige財団とPhillip財団からの助成金（V.P.）の支援を受けた。図1A、図1G、図2A、図2E、図2I、図3A、図3D、図3G、図4A、図4C、図4F、図5A、図5C、図S3A、図S3KはBioRender.comを用いて作成した。フロリダ大学のM. Afaghaniにはパイロットデータ収集の技術的支援をいただき、A. Alhadeff、M.A. Lazar、J. de Lartigueには原稿に対する建設的なコメントをいただいた。

著者の貢献
構想、G.d.L.およびM.M.、方法論、G.d.L.、M.M.、N.U.およびA.Sharma、調査、M.M.、A.d.A.、A.Singh、M.Y.、I.B.、V.P.、R.M.-H.、M.V.、L.N.W、およびA.G.；執筆-原案、G.d.L.；執筆-総説および編集、全著者；資金獲得、G.d.L.、M.M.、A.SinghおよびA.Sharma；リソース、G.L.、A.Sharma、N.U.およびB.W.；プロジェクト管理、G.L.；および監督、G.L.およびA.Sharma。

利益申告
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

インクルージョンと多様性
私たちは、包括的で多様性のある、公平な研究実施を支持する。

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