血清オパシティファクターは、HDL遊離コレステロールのバイオアベイラビリティを低下させることにより、雌のScarb1-/-マウスの生殖能力を回復させる

研究論文集：リポ蛋白生物学|第64巻第2号100327頁、2023年2月発行
血清オパシティファクターは、HDL遊離コレステロールのバイオアベイラビリティを低下させることにより、雌のScarb1-/-マウスの生殖能力を回復させる

https://www.jlr.org/article/S0022-2275(22)00160-2/fulltext

Serum opacity factor rescues fertility among female Scarb1−/− mice by reducing HDL-free cholesterol bioavailability

コリーナ・ロサレス
デディピヤ・イエラマンチリ
バイバ・K・ギラード
ジン・リュウ
アントニオ・M・ゴット・ジュニア（Antonio M. Gotto Jr.
ヘンリー・J・ポウナル

Open AccessDOI:https://doi.org/10.1016/j.jlr.2022.100327
PlumX メトリクス
アブストラクト
ヒトの女性不妊症は、その20％が特発性であり、より良い診断と治療法が必要とされる公衆衛生上の問題である。HDL受容体遺伝子（Scarb1）を欠損させた雌マウスの研究から、不妊症の新しい原因が浮かび上がった。このマウスは不妊症で、血漿中のHDLコレステロール（C）濃度が高く、HDLからすべての組織へ移行するHDL遊離コレステロール（FC）が上昇していることが原因である。これまでの研究で、メスのScarb1-/-マウスにHDL低下薬であるプロブコールを経口投与すると、血漿中のHDL-C濃度が低下し、生殖機能が回復することが示されています。また、細菌の病原因子である血清不透明因子（SOF）はHDL構造を破壊し、SOFをマウスにボーラス投与すると血漿中のHDL-C濃度が低下する。今回我々は、アデノ随伴ウイルス（AAVSOF）を用いて雌のScarb1-/-マウスにSOFを投与すると、SOFの構成的発現が誘導され、HDL-FC濃度が低下し、卵巣形態が正常化するとともに受胎率が回復することを発見した。AAVSOFは卵巣-FC含量を変化させなかったが、卵巣-mol%FCは血漿HDL-mol%FCと妊孕性に依存した形で相関した。したがって、雌のScarb1-/-マウスの高血漿HDL-mol%FCという異常な血漿微小環境を逆転させることで生殖能力を回復させることができる。これらのデータは、HDL-mol% FCと不妊症の間の同様のメカニズム的関連性を検索し、血漿HDL-mol% FCを減少させることによって女性の不妊症を救済する根拠となるものです。
グラフの概要
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補足キーワード
不妊症
高密度リポ蛋白質
血清オパシティファクターデリバリー
コレステロール輸送
遺伝子治療
HDL受容体遺伝子
血漿中HDLコレステロール
卵巣の形態
卵巣のコレステロール含有量
細菌性病原因子
略号
AAV（アデノ随伴ウイルス）、CERM（コレステリルエステルリッチパーティクル）、FC（フリーコレステロール）、HDL-FCBI（HDL-FCバイオアベイラビリティ）、LF（脂質フリー）、PL（リン脂質）、Scarb1（マウス SR-B1 コード遺伝子）、SEC（サイズ排除クロマトグラフィー）、SOF（血清不透明因子）、SR-B1（スカベンジャー受容器クラスB、1型）、TC（全コレステロール）
ヒトの女性不妊症は、その一部（約20％）が特発性（idiopathic）である。
1
,
2
)は、より良い診断と治療が必要とされる公衆衛生上の問題である。リポ蛋白の機能不全が女性不妊に及ぼす影響については、リポ蛋白、特にHDLが関与しているにもかかわらず、比較的未解明な点が多い。妊婦では、胎児の発育はHDL濃度の上昇と、母体循環と胎児の間のHDL遊離コレステロール（FC）移動を媒介する胎盤HDL受容体の発現と関連している (
3
). HDLの初期型、すなわちプレβ-HDLは、妊娠中のヒト胎盤ラクトゲン発現の調節に関与している (
4
). リポ蛋白は、FCやステロイドホルモンなどの生殖機能に不可欠な脂質を、直接あるいはその代謝物を介して組織間で輸送する(
5
,
6
). ヒトでは、卵巣で発育中の卵子を囲む卵胞液に意味のある濃度で存在する唯一のリポタンパク質であるHDL(
7
,
8
,
9
)は、膜合成や卵子成熟に不可欠な複数のプロセスのために、卵胞の卵丘細胞や卵子に脂質を供給すると考えられる。ヒトの血清HDLと卵胞液HDLのサイズと組成は似ていますが、主な違いは、卵胞液HDLと比較して、血清HDLはホスファチジルコリンに富み、リゾホスファチジルコリンと酸性リン脂質（PL）を欠き、プレβ1 HDLとして生じるHDLの割合が小さいことです。(
10
)脂質表面間の自発的で可逆的なFC移動が数分の時間スケールで行われることを考えると(
11
)、HDLはFCフラックスのドナーおよびアクセプターでもある(
12
,
13
,
14
)は、FCのホメオスタシスを維持する。したがって、その構造、存在量、機能に影響を与えるHDL代謝の異常は、女性の生殖能力を損なう可能性がある。Scarb1にコードされるHDL受容体を欠損したマウスは、HDLの機能不全に関連する女性不妊症のモデルである。Scarb1-/-マウスの血漿中HDL-FC濃度は、WTマウスの約7〜10倍である(
15
)が増加し、HDL粒子数(HDL-P)とHDL-mol%FCの積(100×molesFC/[molesFC + molesPL])で表されるHDL-FCバイオアベイラビリティ（HDL-FCBI)が増加します (
16
,
17
). したがって、HDL-FCBI = HDL-P x HDL-mol% FCとなる。注目すべきは、このHDL-FCBIが高い状況下で、雌のScarb1-/-マウスは不妊であることである (
18
).
HDLは不安定で、熱やカオトロピックな摂動に応答して脱出する運動トラップに存在し、通常、APOA1はHDL表面から変位し、APOA1の少ない残骸が残る (
19
,
20
). すべての主要なHDL修飾活性-エステル化、(
21
)脂質の移動(
22
,
23
,
24
)、脂肪分解(
22
)、SR-B1を介した選択的な取り込み(
25
)、細菌の血清不透明因子(SOF)による破壊も、HDLの構造を変化させる。(
26
すなわち、neo HDLと呼ばれる小さな残骸、APOEと10万個以上のHDL粒子の中性脂質を含むCERM（cholesterylester-rich particle）、そしてHDLの主要タンパク質であるAPOA1（lipid free, LF）である（補足：図S1）。
26
,
27
,
28
). SOFをマウスに注射すると、HDLコレステロールがCERMとして肝LDL受容体にAPOEを介して取り込まれ、その後血漿中のHDL濃度が約40％減少する(
29
). そこで、アデノ随伴ウイルス（AAVSOF）を用いてSOFを構成的に発現させると、HDL濃度およびHDL-FCBIを低下させ、Scarb1-/-マウス雌の受胎能力を回復させることができるという仮説を検証した。
材料と方法
SOFの発現と分離
完全な不透明化活性を有する80kDaの切断型タンパク質である組換えSOFは、以前に記載されたように、細菌発現系から発現および単離した(
26
,
28
).
In vitro SOFキネティクス
d=1.063および1.21g/mlで順次浮遊させたWTおよびScarb1-/-マウスHDLに対するSOF反応のキネティクスを、不透明化現象の基礎となる大きな光散乱粒子CERMの形成によって引き起こされる濁度の変化に応じて比較しました(
26
). 簡単に言うと、SOF（1μg／ml）およびHDL（1mg／ml）を37℃でプレインキュベートし、同じく37℃のAviv Model ATF 107分光蛍光計の細胞区画内のスターバーを有する温度制御キュベット内で混合し、光散乱（325nm）を時間経過とともに追跡した。光散乱対時間のデータは、SigmaPlot（Systat Software, Inc.）の2パラメータ上昇指数フィットを用いて分析した。速度定数は、平均値±SDで表される。
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、Superose HR6サイズ排除カラムを2本装備したAKTA FPLC液体クロマトグラフ（GE-HealthCare, Inc）で実施した。カラムの流出液は、280nmの吸光度によってモニターした。
AAVSOFの開発および生産
EcoRIおよびHindIII部位で挟まれたSOF遺伝子をコードするpUCIDT-AMPプラスミドをIntegrative DNA Technologies社により合成した。SOFのDNAを制限酵素消化により単離し、pAAV-TBG-mcsプラスミドにクローニングした。pAAV-TBG-mcs-SOFプラスミドは、適切な遺伝子統合および配向を確認するために配列決定され、増幅され、ウイルス生産のためにペンシルバニア大学（UPENN）ベクターラボに提出された。コントロールのpAAV-TBG-mcs-GFPプラスミドもUPENNから購入した。pAAV-TBG-mcs-GFPをHuh7肝細胞にトランスフェクションしたところ、良好な転写効率が確認され、pAAV-TBG-mcs-SOFをトランスフェクションしたところ、SOFタンパク質の発現と分泌が確認されました。
マウス
マウス系統はすべてThe Jackson Laboratory（Bar Harbor, Maine）に由来するものである。対照として、良好な生殖能力を示すWT C57BL/6マウス（産子サイズ6±0.2、不妊率8%）を使用した。(
30
)ヘテロ接合体Scarb1(Scarb1+/-)ブリーダーを使用して、ホモ接合体Scarb1ノックアウト(Scarb1-/-)マウスを派生させた。AAVSOFを投与した雌のScarb1-/-マウスと非処理の雄のScarb1-/-マウスを交配してScarb1-/-の子孫を生成した。マウスは遺伝的忠実性を確認するために定期的に遺伝子型を決定した；標的およびWT Scarb1対立遺伝子の発現は、耳パンチから抽出したDNAのPCR増幅によって確認した（プライマー5′-GAT-GGG-ACA-TGG-GAC-ACG-AAG-CCA-TTCT-3′および5′-TTC-TCC-GTC-TCT-AGG-TCC-TGA-3′）。マウスは、滅菌された通常の実験用飼料（Envigo）で維持された。ウイルス負荷を最適化するために、SOF発現マウスおよびコントロールマウスに、それぞれAAVSOFおよびAAVGFPを、（0.3-2）×1011ゲノムコピー/マウスの割合で腹腔内注射した。AAVSOFは、血漿中の総コレステロール（TC）およびHDL-Cレベルを顕著に低下させた。
生殖能力に関する試験
AAVSOFの開発に関する予備研究の間、我々はScarb1-/-マウスの雌の一部が仔マウスを産むことを観察した。この観察から、8週齢の雌のScarb1-/-マウスのグループで、通常の実験用飼料（Harlan）を与える2つの処置のうちの1つに割り当てて、3連で実施した系統的な制御試験を誘発した。一方のグループ（合計27匹、9匹ずつのサブグループ）には、プロブコールを飼料に添加した（0.5%、wt/wt）。もう1つのグループ（ntotal 32、12、11、9のサブグループ）には、AAVSOF（1.15×1011ゲノムコピー）を投与した。さらに、AAVだけで生殖能力に影響がないことを確認するため、雌マウスの小グループにAAVGFPを投与した。すべてのグループは、8週齢、つまりプロブコールまたはAAVSOFによる治療を開始した直後に、交配のために雄のScarb1-/-マウスとペアにされた。マウスは5ヶ月間追跡され、その間、21日から28日の間に子供が離乳する連続一夫一婦制繁殖方式で維持された。繁殖力の指標は、初産までの日数、産子サイズ、繁殖可能な雌の割合、および離乳まで生存した産子の割合で表されました。
血漿および組織FC分析
マウスはCO2吸入により犠牲とし、血漿は心臓穿刺に続いて臓器採取により採取した。全血漿および組織の脂質は、FC、TC、PL、およびトリグリセリドについて酵素ベースのアッセイ（富士フイルム和光ダイアグノスティックス株式会社）を用いて測定した。コレステリルエステル（CE）濃度は、μg CEとして測定し、（μg TC - μg FC）×1.6として計算した。タンパク質は、DC Protein Assay (Bio-Rad, Inc.)により決定した。WTおよびScarb1-/-の血漿、HDL、卵巣の脂質分析は、これまでに報告されている(
17
)、AAVSOF処理マウスのデータとの比較のために、図5および図6に含まれている。組織学的スライドは、ヒューストン・メソジスト研究所の比較医学プログラム部門の病理学コアによって準備された。卵巣は4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。組織ブロックはミクロトームで7μmの連続切片に切断し、スライドにマウントし、分析のためにヘマトキシリン/エオシンで染色した。
統計解析
データは平均値±SDまたはSEMで、図の説明文に示したとおりである。グループの平均値は、Prism 9.2またはMicrosoft Excel（Office 16）のStudent's t testによって比較された。2群以上の比較では、全群の一元配置分散分析を行い、分散分析のpが有意、すなわちP<0.05の場合は平均値をTukey比較した（Prism 9.2）。
研究の承認
すべての動物実験は、施設の動物使用・管理委員会の承認を得ています。
結果
WTおよびScarb1-/-マウスのHDLはSOFに反応する。
WTおよびScarb1-/-マウスのHDLに対するSOFのin vitro効果を速度論的比濁法（図1A）により比較した。1A）、反応生成物をSECで分析し、溶出液をタンパク質（HDL、neo HDL、LF APOA1）の溶出を反映する吸光度（280nm）とCERMの光散乱でモニターし（溶出量＝約15ml；図1B、C）、コレステロールについては回収した画分（1ml）の化学分析によって（図1D、E）。相違点があった。まず、Scarb1-/-マウスのHDLに対するSOFの反応速度は、WT HDLに対する反応速度より約50％遅い（図1A）。次に、これまでの報告(
31
,
32
)、Scarb1-/-マウスのHDLはWTマウスのHDLよりも早く溶出した（図1B、Cの赤枠の曲線）。両群とも、SOFは予想される3つのSOF生成物のすべてを触媒して生成した。CERM、neo HDL、LF APOA1である（図1B, C）。WTマウスのHDLに対するSOF反応は定量的であった。一方、Scarb1-/-マウスのHDLの一部は、3時間以上インキュベートしても反応しなかった（データ示さず）。コレステロールの分布から、SOFはWTマウスHDL-Cの約90%をCERMに転移させたが（図1D）、Scarb1-/-マウスのHDLは30分までに約15%しかCERMに変換されなかった（図1E）。
図1血清混濁因子反応。A：WTおよびScarb1-/-マウスのHDLを標識したものに対する反応のカイネティクス。破線は実験データ、実線は上昇指数にそれぞれフィットさせたデータである。HDL（1mg／ml）およびSOF（1μg／ml）を37℃で混合し、直角光散乱により不透明化をモニターした。B-E：速度論研究の完了後に採取した、SOF反応生成物対HDLのアリコートのSEC分析。WT（B、D）およびScarb1-/-（C、E）マウスのHDLとSOFをインキュベートした。プロファイルは、タンパク質の吸光度（280nm、B、C）およびコレステロール濃度（D、E）で表されます。赤で塗りつぶしたプロファイルは、SOF投与前のHDLのタンパク質吸光度（280nm）プロファイルである。SOFは血清オパシティファクター、SECはサイズ排除クロマトグラフィー。
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AAVSOFはマウスで構成的なSOF活性を誘導する。
AAVSOFをマウスに注入した後のin vivoでのSOF活性について、2つのテストを実施した。まず、低、中、高用量のAAVSOF（[0.3、1.15、2]×1011ゲノムコピー）をWTマウスに注入しました。注射1週間後に血漿を採取し、SOF活性をCERM形成として測定し、SECで解析しました。これらのデータから、CERM形成の用量依存的な増加が明らかになり、それによって、マウスが活性型SOFを発現し、それが血漿区画に入り、HDLと相互作用してCERMを形成したことが確認された（図2A；Neo HDLとLF APOA1のA280nmピークはLF血漿タンパク質によって不明瞭である）。AAVSOFの中用量と高用量で同様の反応が得られたことから、同じマウスの血漿（5μl）をヒトHDL（250μl、1mg/ml；24時間、37℃）とインキュベートしてSECで反応を分析する第2のテストを実施しました。その結果、HDLから期待されるSOF生成物への変換が強固かつ定量的に行われることが明らかになった。CERM、neo HDL、およびLF APOA1である（図2B）。Scarb1-/-マウスにAAVSOFを注射すると、HDL-CがCERMに再分配されることが確認された。WTマウスとScarb1-/-マウスの血漿のコレステロール分析から、AAVSOFが血漿コレステロール濃度の大幅な減少を触媒していることが明らかになった（図2C.） また、複数の組織部位におけるLDLRとSOFの発現を測定した（図2D）。これらのデータから、肝臓と脾臓でLDLRの発現が最も高く、SOFはAAVSOFを投与したマウスの肝臓でのみ発現することが明らかになった；SOF mRNAは卵巣では観察されなかった。最後に、AAVSOFは、APOA1およびAPOEの分布を変更する。補足図S2は、WT、Scarb1-/-、および（Scarb1-/- + AAVSOF）マウスの血漿のSECプロファイルと、画数によるAPOA1およびAPOEの免疫ブロットを示した。AAVSOF送達の効果は、我々が以前に観察したものと同様であった(
29
つまり、SOFボーラス注射後、APOEはCERMが溶出するボイドボリュームと、Scarb1-/-および（Scarb1-/- + AAVSOF）マウスの両方の大きなHDLサブフラクションで出現した。予想通り、neo HDLが溶出するフラクション21で観察されたAPOA1陽性バンドは、（Scarb1-/- + AAVSOF）マウスの血漿からのものだけでした。したがって、AAVSOFを受けたマウスの血漿は、血漿コレステロールを減少させる触媒的に活性な濃度のSOFを含んでいます。
図2低用量（L-）、中用量（M-）、高用量（H-）のAAVSOF投与時の（A）マウス血漿のSECを示す。B：L-、M-、H-用量のAAVSOFを投与したマウスの血漿（5μl）とインキュベートした後の250μlのHDL（1mg/ml）のSEC。灰色塗りつぶし、HDL。C：M-AAVSOF投与14日後の血漿総コレステロール。∗P < 0.05. D: WTマウス、AAVSOFで処理しないScarb1-/-マウス（NT SKO）、AAVSOFで処理したScarb1-/-マウス（SOF SKO）についてラベル化したSOF、LDLR、GAPDHのプライマーを用いた複数組織のPCR解析。SEC、サイズ排除クロマトグラフィー、SOF、血清オパシティファクター。
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AAVSOFによるScarb1-/-マウスの妊孕性の回復と卵巣形態の復元
Scarb1-/-マウスの雌にプロブコールを経口投与した場合とAAVSOFを単回投与した場合の繁殖力を比較しました。初産までの時間、子マウスサイズ、および受胎可能なマウスの割合という複数の基準によると、AAVSOFとプロブコール処理による受胎能力の救済は同程度でした（図3）。さらに、子犬の生存率にも差はありませんでした。また、3群すべてのマウスの卵巣を採取し、組織学的解析に供した。Scarb1切除が形態に及ぼす影響は深遠であった。WTマウスの卵巣は、正常な卵巣機能に関連する期待される特徴を備えていた。主な機能的構成要素は、原始卵胞、一次卵胞、二次卵胞、そして際立って大きい黄体であることが明確に確認できた（図4A）。これらの特徴はScarb1-/-マウスの卵巣でも再現されていたが、これらのマウスでは、より多くの卵子/始原卵胞、より少ない成熟中の卵胞、そして正常な卵巣の形態、機能、生殖機能に不可欠な黄体（図4B）が全くないことが確認された。さらに、WTと比較して、Scarb1-/-マウスの卵巣は、卵巣間質が少なく、より線維化しているように見え、卵巣機能不全の一因になっていると考えられる。AAVSOFを投与したScarb1-/-マウスの卵巣を同様に調べたところ、受胎能力の回復は、排卵成功の指標である黄体を含む正常な卵巣形態の回復と関連していることが明らかになりました（図4C）。
図3プロブコールまたはAAVSOFを投与した雌のScarb1-/-マウスの稔性。繁殖力の4つのマーカーは、3つの別々の研究で測定され、1つの治療につき10匹以上のマウスが、（A）治療後に最初の子種が生まれるまでの日数、（B）子種あたりの子種数、（C）繁殖可能な雌の割合、（D）生き残った子種割合に従って追跡された。データは平均±SDである。その他の詳細は、「材料と方法」のセクションに記載されている。
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図4AAVSOFは卵巣の形態を正常化する。A）WTマウス、（B）Scarb1-/-マウス、（C）AAVSOFを投与したScarb1-/-マウスの卵巣の代表的な組織像を示すパネルである。原始卵胞、PF（黒）、一次卵胞、P1F（青）、二次卵胞、S2F（緑）、黄体、CL（赤）。注目すべきは、Scarb1-/-マウスの卵巣では形成されない黄体が、AAVSOFによって回復していることである。研究対象となったマウスの年齢は12週から20週で、卵巣にグループ内の有意差は見られなかった。
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AAVSOFは血漿およびHDL脂質組成を変化させる
WTマウスとScarb1-/-マウスの血漿とHDLの脂質組成、mol% FC、FC/TC比を比較した。後者は、未処理のScarb1-/-マウス、AAVSOFを投与した受胎可能なマウス、AAVSOFを投与した不妊マウスの3群である。既報の通り、(
17
Scarb1を欠損させると、すべての主要な脂質の血漿濃度、mol% FC、およびFC/TC比が上昇した（図5A-C）。Scarb1-/-マウスにAAVSOFを投与すると、不妊のままAAVSOFを投与したマウスでは減少しなかったが、受胎可能なマウスではすべての脂質の血漿濃度、mol%FC、およびFC/TC比が減少した。HDLコレステロール濃度に対するAAVSOFの影響も同様でした。AAVSOFは、Scarb1-/-マウスのHDL-TC、FC、コレステリルエステル（CE）をWTレベルまで減少させ、FCのmol％およびFC/TC比も、不妊のままである肥沃なマウスの間で減少した（図5D-F）。
図5WTおよびScarb1-/-マウスの血漿（A-C）およびHDL（D-F）の脂質組成。ラベルの通り、マウスをWT、Scarb1-/-未処理、Scarb1-/-をAAVSOFで処理し受胎可能、Scarb1-/-をAAVSOFで処理し不妊としてグループ分けした。(A）血漿脂質組成、（B）血漿-mol%FC、（C）血漿-FC/TC重量比、（D）HDL脂質組成、（E）HDL-mol%FC、（F）HDL-FC/TC重量比．血漿中モル％FC＝100×モルFC／（モルFC＋モルPL）。それぞれの平均年齢±SDおよび年齢範囲（週）は以下の通りである。WT-20.4±2.5および16-23；Scarb1-/--19.5±3.7および14-23；AAVSOF Scarb1-/- Fertile-39.5±4.5 および27-43；AAVSOF Scarb1-/- Infertile-42.8±1.4 および41-45．1群あたりのマウスのそれぞれの数は、12、11、12、および13であった。FC、遊離コレステロール、TC、総コレステロール。
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AAVSOFは卵巣の脂質組成を変化させる
複数のマウスの卵巣を採取し、解析した。卵巣の質量の代用として、卵巣タンパク質を測定したところ、Scarb1-/-マウスの卵巣タンパク質はWTの半分以下であったが、肥沃なScarb1-/-マウスと不妊なScarb1-/-マウスの両方へのAAVSOF送達によりWT値近くまで回復することが確認された（図6A）。卵巣の脂質組成に対するScarb1欠失およびAAVSOF処理の影響は、血漿およびHDLに対する影響とは異なるものであった。卵巣のPLはScarb1-/-マウスで低く、この効果はAAVSOF処理では回復しなかった。卵巣FCは4群とも同程度であったが、Scarb1-/-マウスの卵巣CEはWTのそれよりも低値であった。AAVSOFはさらに卵巣-CEを有意に減少させた。卵巣-mol% FCは、Scarb1-/-マウスではWTよりも高く、AAVSOF処理マウスでは上昇したままであった（図6C）。卵巣のFC/TC比はScarb1切除により有意に増加し、AAVSOFによりさらに増加した（図6D）。WT、Scarb1-/-、Scarb1-/- + AAVSOF（受胎可能）、Scarb1-/- + AAVSOF（不妊）マウスの卵巣対HDL脂質を比較した（図6E-G）。比較の結果、卵巣-CEとHDL-CEには負の相関があり、卵巣-FCとHDL-FCには相関がないことがわかった。一方、卵巣-mol%FCとHDL-mol%FCは正の相関を示した。したがって、AAVSOF処理による生殖能力の回復は、HDL-および卵巣-mol% FCの減少に相関し、卵巣-FCやCE含量には相関しないことが示された。
図6WTおよびScarb1-/-マウスの卵巣の脂質組成。ラベルの通り、マウスをWT、Scarb1-/-、AAVSOFを投与し受胎可能なScarb1-/-、AAVSOFを投与し受胎不能なScarb1-/-としてグループ分けした。(A）卵巣あたりの総タンパク質、（B）卵巣脂質組成、（C）卵巣mol％FC、（D）卵巣FC／TC重量比率。(E）卵巣CE含有量対HDL-CE（m = -19 + 11; r2 = >0.05; P = 0.09）、（F）卵巣FC含有量対HDL-FC（m = 0.22 + 2.4; r2 = 0.33; P = 0.37）、（G）卵巣mol% FC対HDL mol% FC（m = 0.51 + 0.11; r2 = 0.33; P < 0.0001）. 卵巣mol%-FC = 100 × molesFC/(molesFC + molesPL)。1群あたりのマウスの年齢および数は、図5の凡例と同じである。FC、遊離コレステロール、TC、総コレステロール。
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ディスカッション
HDL-FCBI
膜やリポタンパク質内では、PLとFCは共通の区画に閉じ込められており、PLはFCの必須溶媒である。FCBIは、これらのコンパートメントにおけるFCとPLの相対量によって決定され、「アクセス可能」（accessible）として表現されてきた。
33
,
34
,
35
)、「アクティブ」FC(
36
,
37
)、物理化学用語では「フガシティ」(
37
). HDL-FCBIの指標として、HDL粒子数と粒子内のFCのmol%の積として計算されるものを定式化した(
16
)、すなわち、mol% FC = 100 × XFC/(XFC + XPL)、ここでXFCとXPLはそれぞれHDL-FCとPLのモル数である。その後の試験で、Scarb1-/-マウスとWTマウスの血漿中のmol% HDL-FCが高いことは、すべての組織ではなく、いくつかの組織でmol% FCが高いことと関連していることが報告された (
17
). 特に、不妊症であるScarb1-/-マウスの卵巣-mol%FCは、WTマウスの2倍であった (
17
). Scarb1-/-マウスの生殖能力は、主要なHDLタンパク質であるAPOA1の遺伝子を不活性化し、HDL低下薬であるprobucolを投与することで回復する(
18
). 細菌性SOFの静脈内注入がマウスにおいて血漿HDL-FCを一過性に減少させることを考えると(
26
a）雌のScarb1-/-マウスの不妊は、高いHDL-mol%FCによって引き起こされる高い卵巣mol%-FCによるものである、b）AAVによる構成的SOF発現は、HDL-mol%FC減少によって引き起こされる卵巣mol%FCを減少させて不妊を救済する、という仮説であった。我々の仮説は部分的にしか検証されなかった。
Scarb1-/-とWTのHDLに対するSOFの反応
Scarb1-/-マウスのHDLに対するSOF反応速度は、WT HDLに対する反応速度よりも遅く（図1A）、しかも反応完了まで至らない（図2）ことから、WTとScarb1-/-のHDLは構造的に異なり、機能的にも異なっている可能性がある。Scarb1-/- HDLがWT HDLに比べて不透明化に対する抵抗性が高いことの根本的な原因は、両者の構造の違いにあると考えられる。Scarb1-/- HDLはWT HDLより大きく、それぞれ12.5nmと10.2nmである。(
15
)しかし、SOFは様々なサイズのヒトHDLを、期待される3つの生成物に定量的に変換する(
26
). WTとScarb1-/- HDLのそれぞれの表面脂質組成も異なっており、それぞれ17 mol% FCと58 mol% FCである (
15
). アポリポタンパク質A1、A2と同様に(
38
,
39
)、WT HDLに対してScarb1-/- HDLではFCのモル％が高いため、SOFによる浸透に抵抗性があると考えられる。Scarb1-/-マウスの一部のHDLはin vitroでSOFによる破壊に抵抗性があるにもかかわらず（図2）、不妊は構成的SOF活性を誘導するAAVSOFによって強固に救済される。SOF反応の自発性は、WTおよびScarb1-/- HDLの両方が運動学的な罠に存在するという概念を支持する(
19
)から、エネルギー投入なしに脱出することができる。
肥沃度
雌のScarb1-/-マウスは、早期の活性化とMII停止からの脱出を誘導する過剰な卵子FCが一因で不妊症となる(
40
). これらのマウスの卵巣は、異常な形態をしていることが観察された（図4）。Scarb1-/-マウスの卵巣は、タンパク質含有量から見て小さく、排卵が成功したことを示す黄体は存在しなかった（図4および図6A）。Scarb1-/-マウスとWTマウスの比較では、卵巣間質（卵胞を含む卵巣構造を結合する結合組織）の量が少ないことが不妊の原因になっている可能性があります。卵巣間質細胞は、卵胞の発育、ホルモン産生と反応、排卵に重要であり、卵巣間質細胞の量が少ないことは、Scarb1-/-の卵巣に成熟卵胞がないことを説明できる可能性があります。また、Scarb1-/-の卵巣では、WTの卵巣よりも線維芽細胞や細胞外マトリックスが多いという特徴を持つ線維化が大きいことから、卵巣機能や生殖能力が低下している可能性もあります。
AAVSOFとプロブコールの繁殖力に対する効果は、初産までの期間、子ガメのサイズ、繁殖率、子犬の生存率など同様であった（図3）(
18
). さらに、AAVSOFは、器官の大きさや黄体の出現など、卵巣の形態を正常化した（図4および図6A）。Scarb1の切除は、卵巣のPLとCEを減少させ、卵巣-mol%FCとFC/TC比を増加させた。これらの変化が不妊症とメカニズム的に関連しているとすれば、稔性が回復すれば、これらのうちの1つ以上がWT値に近づくと予想されるが、これは観察されなかった（図6B-D）。卵巣の脂質組成は不妊症およびその救済と相関しない。
次に、卵巣の微小環境を構成する血漿の脂質組成が生殖能力を決定するかどうかを検討した。マウスでは、HDLが支配的なリポ蛋白質種である(
41
)のため、HDL脂質と卵巣脂質の比較に着目しました（図5、図6）。我々の研究では、卵巣-FCとHDL-FCの濃度には相関がないことがわかった（図6F、P = 0.37）。CEがWT群とScarb1-/-群の間で6倍も変化したにもかかわらず、卵巣のFC濃度が試験した4群すべてで一定だったことは驚くべきことであり（図6B）、卵巣におけるFCホメオスタシスの維持が重要であることを示しています。さらに、卵巣-CEとHDL-CE濃度は弱い逆相関を示し（図6E、P = 0.09）、マウスではCEは代謝的に沈黙しているため、細胞に影響を与えるとは考えられなかった。第一に、CEはHDLのコアに閉じ込められているため、細胞との相互作用はHDL表面のPLとタンパク質の単層によって阻害される。第二に、CEをAPOB含有リポタンパク質に移動させ、肝臓で抽出するコレステリル・エステル転移タンパク質をマウスは発現していない。最後に、HDL受容体であるSR-B1を持たないため、Scarb1-/-マウスでは卵巣へのCE取り込みが制限される。一方、卵巣-mol% FCとHDL-mol% FCは正の相関を示した（P = 0.0001）。HDLのバイオアベイラビリティは、FCの正味の移動がなくても、卵巣との相互作用によって不妊に寄与する可能性がある。(
11
mol%HDL-FCの変化は大きいが、微小環境の変化が卵巣の生物学にこのような重大な変化を引き起こすメカニズムは、すぐには明らかにならない。
生殖能力におけるmol% FCの重要性は、PDZK1-/-マウスの研究によって示されている(
42
)は、肝臓と腸でWTマウスよりもSR-B1タンパク質の発現量が少ないが、卵巣、副腎、精巣ではそうではない。さらに、PDZK1-/-マウスは、血漿リポタンパク質プロファイルがScarb1-/-マウスと同様であるにもかかわらず、受胎可能である。Scarb1-/-マウスと同様に、血漿中のコレステロール濃度はWTマウスの約2倍であり、HDLは大きく、APOEに富む。しかし、血漿中のmol% FCはWTマウス（34mol%）、Scarb1-/-マウス（57mol%）よりも低い（26mol%）。マウスの血漿コレステロールはほぼすべてHDLによって運ばれることから、血漿mol% FCの差はHDL mol% FCの差に起因していると考えられる。血漿リポ蛋白質プロファイルが類似しているにもかかわらず、PDZK1-/-マウスとScarb1-/-マウスではHDL-mol%FCが低いことが正常な生殖能力と関連しているというこれらのデータは、HDL-mol%FCが高い血漿微小環境が不妊に寄与しているという仮説に独自の支持を得ている。過剰なHDL-FCがすべての組織のFC含量を増加させるわけではないが、(
17
)すべての組織が高濃度のHDL-FCと接触し、正体不明のシグナル伝達経路を初期化する可能性があり、これは「卵巣と卵巣外環境（すなわち、視床下部-下垂体卵巣軸）の複雑な相互作用」と表現されています) 。
18
).
プロブコールとAAVSOFによってScarb1-/-マウスの稔性が回復したことから、卵巣のSR-B1発現は稔性に必要ないことが確認された (
18
). ProbucolとAAVSOFは、血漿中の脂質濃度を同様に低下させるが、その根本的な効果は異なる。ProbucolはScarb1-/-マウスで形成された大きなHDL粒子の濃度を低下させる(
18
). 一方、AAVSOFは小さなHDL粒子の濃度をより大きく低下させることを誘導する。このように、高濃度のHDLによる卵巣毒性作用は、HDL粒子サイズに依存しない。また、そのメカニズムも異なる。Probucolは、HDL合成の減少によって、部分的には血漿HDL濃度を減少させる(
43
). SOFはHDLの構造を破壊する(
28
)により、ほぼ全てのHDL-Cを含む大型のAPOE含有粒子であるCERMを介して、HDL-Cを肝の低密度リポタンパク質受容体に迂回させる(
26
,
29
). ProbucolとAAVSOFのコレステロール低下作用は類似しているが、前者は毎日経口投与する必要があるのに対し、AAVSOFは1回の投与で30週間以上持続する構成的コレステロール低下作用を示し、Scarb1-/-マウスの繁殖力を回復させた。
SCARB1のヒトの遺伝子変化の中には、卵巣のコレステロール代謝に悪影響を与え、生殖能力を低下させるものがあり、SCARB1の一塩基多型はヒトの女性不妊症と関連しているが、根本的なメカニズムはわかっていない (
44
,
45
). 報告されたヒトの機能喪失型SCARB1変異は、2人の子供を持つ女性だけであった(
46
). したがって、SCARB1-妊孕性軸は、他の遺伝子からの寄与がある可能性が高い。
結論
TCはFCとCEから構成され、それぞれの代謝経路が異なるため、HDL-FCと不妊症を含む様々な病態との関連は、ほぼすべての臨床検査機関で検出されない。この結果は、血漿中のHDL-FC濃度が非常に高いことが、ある種の女性不妊症の原因になっているという仮説を提唱するものである。この仮説は、上記のような日常的な脂質検査を用いて、体外受精のためにクリニックを訪れた女性のHDL-FC濃度と、対照となる妊娠可能な女性のHDL-FC濃度を比較することにより、容易に検証できる。世界では、年間約200万サイクルの体外受精が行われている(
47
)のコストは、控えめに見積もっても1周期あたり10,000ドルである。このように、HDLに関連した不妊症の女性のごく一部にしかメリットがないとしても、安価な医療ソリューションの選択肢は魅力的である。高HDL-FC濃度と不妊症の関係を示す我々の仮説が検証されれば、血漿中のHDL-FCが高い不妊症の女性において、プロブコールやSOFなどのHDL-FC低下療法を不妊治療薬として試験することが可能になる。
データの入手方法
すべてのデータは論文中に含まれています。
補足データ
本記事には補足データが含まれています。
利益相反
著者らは、本論文の内容に関して、利益相反がないことを宣言する。
謝辞
この研究は、米国国立衛生研究所（HL149804）およびBass Endowmentの支援を受けています。
著者の貢献
C. R.は実験の設計と実施、組織検査を行い、D.Y.はマウス実験を行い、B.K.G.は組織分析のプロトコルを作成し、統計的サポートを行い、J.L.は組織分析を行い、A. M.G. は脂質およびリポタンパク質代謝に関するアドバイスを行い、 H. J.P. は研究を監修し論文のドラフトと修正を行いました。
資金提供および追加情報
内容はあくまで著者の責任であり、必ずしもNational Institutes of Healthの公式見解を示すものではありません。
補足データ
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補足図1
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補足図2
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図1血清混濁因子反応。A：WTおよびScarb1-/-マウスのHDLをラベルにしたものに対する反応のカイネティクス。破線は実験データ、実線は上昇指数にフィットさせたデータである。HDL（1mg／ml）およびSOF（1μg／ml）を37℃で混合し、直角光散乱によって不透明化をモニターした。B-E：速度論研究の終了後に採取した、SOF反応生成物対HDLのアリコートのSEC分析。WT（B、D）およびScarb1-/-（C、E）マウスのHDLとSOFをインキュベートした。プロファイルは、タンパク質の吸光度（280nm、B、C）およびコレステロール濃度（D、E）で表されます。赤で塗りつぶしたプロファイルは、SOF投与前のHDLのタンパク質吸光度（280nm）プロファイルである。SOF, serum opacity factor; SEC, size-exclusion chromatography.
図2低用量（L-）、中用量（M-）、高用量（H-）のAAVSOF投与時の（A）マウス血漿のSECを示す。B：L-、M-、H-用量のAAVSOFを受けたマウスの血漿（5μl）とインキュベートした後の250μlのHDL（1mg/ml）のSEC。灰色塗りつぶし、HDL。C：M-AAVSOF投与14日後の血漿総コレステロール。∗P < 0.05. D: WTマウス、AAVSOFで処理しないScarb1-/-マウス（NT SKO）、AAVSOFで処理したScarb1-/-マウス（SOF SKO）についてラベル化したSOF、LDLR、GAPDHのプライマーを用いた複数組織のPCR解析。SEC、サイズ排除クロマトグラフィー、SOF、血清混濁因子。
図3プロブコールまたはAAVSOFを投与した雌のScarb1-/-マウスの繁殖力。繁殖力の4つのマーカーは、3つの別々の研究で測定され、1つの治療につき10匹以上のマウスが、（A）治療後に最初の子種が生まれるまでの日数、（B）子種あたりの子種数、（C）繁殖可能な雌の割合、（D）生存した子種割合に従って追跡された。データは平均±SDである。その他の詳細は、「材料と方法」のセクションに記載されている。
図4AAVSOFは卵巣の形態を正常化する。パネルは、（A）WTマウス、（B）Scarb1-/-マウス、（C）AAVSOFを投与したScarb1-/-マウスの卵巣の代表的な組織像を示しています。原始卵胞、PF（黒）、一次卵胞、P1F（青）、二次卵胞、S2F（緑）、黄体、CL（赤）。注目すべきは、Scarb1-/-マウスの卵巣では形成されない黄体が、AAVSOFによって回復していることである。調査したマウスの年齢は12週から20週で、卵巣に意味のあるグループ内差はなかった。
図5WTおよびScarb1-/-マウスの血漿（A-C）およびHDL（D-F）の脂質組成。ラベルの通り、マウスをWT、Scarb1-/-未処理、Scarb1-/-をAAVSOFで処理し受胎可能、Scarb1-/-をAAVSOFで処理し不妊としてグループ分けした。(A）血漿脂質組成、（B）血漿-mol%FC、（C）血漿-FC/TC重量比、（D）HDL脂質組成、（E）HDL-mol%FC、（F）HDL-FC/TC重量比．血漿中モル％FC＝100×モルFC／（モルFC＋モルPL）。それぞれの平均年齢±SDおよび年齢範囲（週）は以下の通りである。WT-20.4±2.5および16-23；Scarb1-/--19.5±3.7および14-23；AAVSOF Scarb1-/- Fertile-39.5±4.5 および27-43；AAVSOF Scarb1-/- Infertile-42.8±1.4 および41-45．1群あたりのマウスのそれぞれの数は、12、11、12、および13であった。FC、遊離コレステロール、TC、総コレステロール。
図6WTおよびScarb1-/-マウスの卵巣の脂質組成。ラベルの通り、マウスをWT、Scarb1-/-、AAVSOFを投与し受胎可能なScarb1-/-、AAVSOFを投与し受胎不能なScarb1-/-としてグループ分けした。(A）卵巣あたりの総タンパク質、（B）卵巣脂質組成、（C）卵巣mol％FC、（D）卵巣FC／TC重量比率。(E）卵巣CE含有量対HDL-CE（m = -19 + 11; r2 = >0.05; P = 0.09）、（F）卵巣FC含有量対HDL-FC（m = 0.22 + 2.4; r2 = 0.33; P = 0.37）、（G）卵巣mol% FC対HDL mol% FC（m = 0.51 + 0.11; r2 = 0.33; P < 0.0001）. 卵巣mol%-FC = 100 × molesFC/(molesFC + molesPL)。1群あたりのマウスの年齢および数は、図5の凡例と同じである。FC、遊離コレステロール、TC、総コレステロール。
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