低ω-6/ω-3 PUFA比（n-6:n-3 PUFA）食による肥満青年の脂肪肝疾患の治療

2023年11月2日 11:32

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栄養ジャーナル
150巻、9号、2020年9月、2314-2321ページ
低ω-6/ω-3 PUFA比（n-6:n-3 PUFA）食による肥満青年の脂肪肝疾患の治療

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022316622023057?via%3Dihub

著者リンクオーバーレイパネルを開くヴァンネームミッシェルA 1、サヴォイエメアリー 1、チックジェニファーM 1、ガルッポブリタニーT 1、フェルドスタインアリエルE 2、ピアポントブリジット 1、ジョンソンケイシー 2、シャバノヴァヴェロニカ 1、エコンウデメ 1、バレンチノパメラL 1、キムグレース 3、カプリオソニア 1、サントロニコラ 1 4
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概要
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https://doi.org/10.1093/jn/nxaa183
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要旨
背景
最近の文献によると、欧米食のω-6（n-6）PUFA摂取量が多くω-3（n-3）PUFA摂取量が少ないというアンバランスが、肥満の若者の脂肪肝疾患の一因となっていることが示唆されている。

目的
我々は、12週間の低n-6：低n-3 PUFA比（4：1）の正常カロリー食が脂肪肝を軽減するかどうか、およびパタチン様含有ドメインホスホリパーゼ3（PNPLA3）のrs738409変異体が反応に影響するかどうかを検証した。

方法
単群非盲検試験において、非アルコール性脂肪性肝疾患を有する9～19歳の肥満青少年に12週間、n-6：n-3 PUFA比の低い正常カロリー食を摂取させた。主要アウトカムは、腹部MRIによって測定された肝脂肪率（HFF％）の変化であった。代謝パラメータは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、脂質、インスリン感受性の測定、血漿酸化リノール酸代謝産物（OXLAM）などであった。また、PNPLA3 rs738409の遺伝子型別に転帰を解析した。Wilcoxonの符号順位検定、Mann-Whitney U検定、共分散パターンモデリングが用いられた。

結果
20人の肥満青年（年齢中央値：13.3歳；IQR：10.5-16.4歳）が登録され、17人が研究を完了した。12週間の食事介入後、体重は安定していたにもかかわらず、HFF％は25.8％減少した（P = 0.009）。ALTは34.4％減少（P = 0.001）、トリグリセリドは21.9％減少（P = 0.046）、LDLコレステロールは3.28％減少（P = 0.071）、全身のインスリン感受性は26.3％改善（P = 0.032）した。9-ヒドロキシオクタデカンジエン酸（9-HODE）（P = 0.011）、13-HODE（P = 0.007）、および9-オキソオクタデカジエン酸（9-oxoODE）（P = 0.024）は、12週後に減少した。HFF%は、PNPLA3 rs738409遺伝子型の非リスク群（CC/CG）とリスク群（GG）の両方で低下し、GG群ではHFF%が有意に（P = 0.016）低下した。9-HODE（P＝0.023）、9-oxoODE（P＝0.009）、および13-oxoODE（P＝0.003）の経時的変化は、2つの遺伝子型グループ間で異なっていた。

結論
これらのデータは、体重減少とは無関係に、低n-6：n-3 PUFA食が脂肪性肝疾患を有する青年の代謝表現型を改善すること、およびこの食事に対する反応がPNPLA3 rs738409遺伝子型によって調節されることを示唆している。

この試験はclinicaltrials.govにNCT01556113として登録された。

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キーワード
小児肥満PNPLA3インスリン抵抗性アルコール性脂肪肝疾患メタボリックシンドローム
使用した略語
AAarachidonic acidALAα-linolenic acidALTalanine aminotransferaseCPcovariance patternDPAdocosapentaenoic acidDTPAdiethylenetriamine pentaacetic acidHFF%hepatic fat fractionHODEhydroxyoctadecandienoic acidIGTimpaired glucose toleranceLAlinoleic acidNAFLDnonalcoholic fatty liver diseaseOGTToral- glucose-tolerance test（経口ブドウ糖負荷試験）。耐糖能試験OXLAM酸化リノール酸代謝物ODEオキソオクタデカジエン酸PNPLA3パタチン様ドメイン含有ホスホリパーゼ3WBISI全身インスリン感受性指数
はじめに
非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）は、小児肥満の一般的な合併症であり、メタボリックシンドロームの不吉なマーカーである(1)。実際、NAFLDを有する小児は、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高トリグリセリド血症(1)、心血管疾患(2, 3)を示す。

脂肪肝の発症には多くの要因が関与しているが、食事の構成が極めて重要な役割を果たしている。最近の文献によると、欧米食に特徴的なω-6系（n-6）PUFA摂取量の多さとω-3系（n-3）PUFA摂取量の少なさ（平均比15：1）という食事のアンバランスがNAFLDの発症につながることが示唆されている(4)。さらに、食事はn-6およびn-3 PUFAの前駆体である必須脂肪酸リノール酸（LA；18:2n-6）とa-リノレン酸（ALA；18:3n-3）の唯一の供給源である。従って、NAFLD患者は健常対照者よりもn-3系PUFAの食事摂取量が少なく、n-6系PUFAが多いことが示されており、これは肝長鎖脂肪酸にn-6系PUFAが多いことと一致している(5)。n-6 PUFAの過剰な肝への取り込みは、酸化リノール酸代謝産物（OXLAM）の形成と蓄積を促進し、これらは若年者、成人ともに脂肪肝発症の危険因子である(6., 7., 8.)。さらに、我々のグループは最近、食事からのPUFA摂取とNAFLD発症に遺伝が関係していることを明らかにした。実際、patatin-like containing domain phospholipase 3（PNPLA3）遺伝子の共通変異体（rs738409）(9)は、肥満の青年におけるOXLAM濃度と脂肪肝疾患との関連を増強する(10)。

この準実験的研究では、脂肪肝を有する肥満青年において、12週間の低n-6：n-3 PUFA比（4：1）の食事が、MRIで評価した肝内脂肪量に影響を及ぼすかどうかを調べることを目的とした。さらに、PNPLA3 rs738409変異体と食事摂取のn-6:n-3 PUFA比の脂肪肝に対する相互作用が以前観察されたことから(11)、この変異体が食事療法に対する個人の反応に影響するかどうかも検討した。

方法
研究対象者
20名の小児および青年（9～19歳）を募集した。対象者は、BMIが年齢と性別の95パーセンタイル以上、肝MRIで測定した肝脂肪率（HFF％）が5.5％以上であった。NAFLD以外の肝疾患、糖尿病、魚に対する食物アレルギーを有する青年、または脂質、グルコース、肝代謝に影響を及ぼす薬剤を服用している青年は除外された。本研究（NCT01556113）はYale Human Investigation Committeeにより承認され、参加者全員から書面による同意と同意（未成年者）を得た。1983年に改訂されたヘルシンキ宣言（Helsinki Declaration of 1975）に従い、Yale大学人間調査委員会の倫理基準に従った。

研究成果
主要アウトカムは、食事療法のベースライン（0週目）から追跡調査（12週目）までのHFF％の変化であった。副次的アウトカムは、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、脂質（トリグリセリド、LDLコレステロール）、糖代謝指標［グルコース、インスリン、全身インスリン感受性指数（WBISI）］の0週から12週までの変化であった。n-6 PUFA代謝産物［LA由来の酸化化合物（OXLAM）］およびn-3 PUFA［ALA、EPA（20:5n-3）、ドコサペンタエン酸（DPA；22:5n-3）、DHA（22:6n-3）］の血漿中濃度は、線形傾向について評価された。

PNPLA3 rs738409変異体が、0週目から12週目までのHFF％、トリグリセリド、ALTに及ぼす影響、および試験期間中の血漿中OXLAMおよびn-3 PUFA濃度の線形変化に及ぼす影響を検討した。生の試験データは、補足のExcelファイルとして入手可能である。

手続き
参加者は、病歴および食歴に加えて、スクリーニング検査評価、標準的な経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）（12）、腹部MRI、およびYale School of MedicineにおけるPNPLA3 rs738409の遺伝子型判定を受けた。その後、参加者は試験担当者により12週間の食事介入が開始された（以下に記述）。参加者は毎週、管理栄養士およびチームと面談し、試験食を受け取り、毎週の食事記録により遵守状況を確認し、人体計測を行った。生化学的測定により食事療法の遵守状況をモニターするため、4週ごとに血漿からLA、アラキドン酸（AA；20:4n-6）、およびそのOXLAM産物である9-および13-ヒドロキシオクタデカンジエン酸（HODE）と9-および13-オキソオクタデカジエン酸（oxoODE）が測定された（13）。OGTT、MRI、および臨床検査は12週間の介入終了時に繰り返された。

食事計画
12週間の食事介入では、研究担当者が参加者に必要なすべての食事摂取を提供した（家族全員分ではない）。体重の減少または増加という交絡変数の可能性をコントロールするために、食事計画は、試験管理栄養士によって評価された試験前の食事摂取量に対して標準カロリーであるように設計された。3日間の食事記録（週末1日と平日2日）を用いて試験前の食事摂取量を評価し、Nutrition Data Software for Research（NDS-R 2014、ミネソタ大学）を用いて解析した。このプログラムにより、通常のカロリー摂取量が決定され、その結果、介入食の規定カロリー量が決定された。介入食はn-6系PUFAとn-3系PUFAの比率が4：1と低く、主栄養素の含有量は1日の総カロリーの50～55％が炭水化物、20％が蛋白質、25～30％が脂質で、飽和脂肪酸は1日の総カロリー摂取量の8～10％、一価不飽和脂肪酸と多価不飽和脂肪酸はそれぞれ8～10％であった。

食事にはn-3系PUFAが豊富に含まれており（魚やナッツ類など）、本研究ではサプリメントは使用しなかったが、いくつかの食品（スプレッド、ドレッシング、油）にはn-3系PUFAが豊富に含まれていた。ウドズ・オイル3-6-9ブレンド（フローラ社）が主食油として使用され、n-3系PUFAがn-6系PUFAに比べて2倍摂取できた。食事計画は、冷凍ピザやハンバーガーなどの食品を毎週取り入れた "子供向け "のもので、魚を食べない日が1日あった。このような食事計画は、現実の長期的な食事摂取を表現するためであり、もちろん遵守の可能性を高めるためでもある。参加者はミールプランで提供されたものだけを摂取するように指示された。ミールプランのサンプルは補足図1に示されている。

食事指導には親が同席し、最初の4週間は毎週続けられた。参加者は週2回食事を取りに行った。食品はエール大学臨床研究センターのメタボリック・キッチンによって毎日計量され、包装された。最後の8週間は、参加者は毎週食品を受け取り、市販の食料品配達サービスによって参加者宅に補足的に食品が配達された。コンプライアンスは、参加者が摂取した食品をチェックする簡易な毎日の食事記録で評価され、毎週管理栄養士に返却された（補足図1）。食事記録はそれに応じて点数化され、遵守率が決定され、80％を超えると "遵守している "とみなされた。体重も毎週測定し、参加者が1週間以内に1.6kg（～3ポンド）以上増減した場合、またはベースラインから合計2.3kg（5ポンド）変動した場合はカロリーを修正した。

身体活動
必要に応じてカロリーを調整することにより、体重の減少または増加という潜在的な交絡変数をコントロールすることに加えて、介入中は身体活動レベルを一定に保つようにすべての参加者に指示した。具体的には、子どもが普段運動活動をしていない場合は、不活発な状態を維持するよう求めた。かなり活発な子供であれば、参加者にも同じレベルの活動を続けるように指示した。

喫煙とアルコール
試験栄養士は、12週間の食事介入期間中はアルコールを摂取しないこと、喫煙しないことを参加者に指示した。0週目と12週目のOGTT来院時に、喫煙とアルコールに関する質問票を実施し、小児と保護者が記入した。

腹部MRI
腹部MRIはSiemens Sonata 1.5テスラシステムで実施した。HFF%は、修正ディクソン法(14, 15)を用いて得られた肝臓画像から算出した。内臓脂肪分画および皮下脂肪分画は、既述の方法で評価した（16）。

生化学的分析
血漿グルコース濃度は、YSI 2300 Stat Plus Glucose Analyzer（Yellow Springs Instruments）を用いてベッドサイドで測定した。血漿インスリン濃度はMillipore Sigma社の抗体RIAを用いて測定し、脂質濃度はオートアナライザー（モデル747-200、Roche Diagnostics社製）を用いて測定し、肝酵素は標準的な自動動態酵素測定法を用いて測定した。OGTTに由来するWBISIは、肥満の小児コホートにおけるインスリン感受性を反映するために算出された（17, 18）。

n-6およびn-3 PUFAの測定
脂質の抽出とタンパク質の加水分解は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）ライニングのキャップが付いた使い捨てのネジ付きホウケイ酸ガラス試験管を用いて行った。使用前に、すべてのガラス器具のチューブ、キャップ、ピペットチップを硝酸で洗浄し、微量遷移金属を除去した後、1μMジエチレントリアミン五酢酸（DTPA；H2O中pH7.0）を含むChelex処理水で広範囲にすすぎ、さらに純粋なChelex処理水ですすいだ。プラスチックチップはメタノールでさらにすすぎ、風乾した後、使用した。また、試験管を500℃で一晩焼成し、残留する潜在的有機物を除去した。すべての血漿サンプルは、アルゴンでヘッドスペースを覆った抗酸化カクテル［DTPA（最終2mM）およびブチル化ヒドロキシトルエン（最終500μM）］を含むチューブに分注した。サンプルは、LCオンラインエレクトロスプレーイオン化タンデムMS分析(8)のためのサンプルハンドリングの直前に氷/水浴中で融解した。血漿中の脂肪酸および酸化脂肪酸は、既述の方法で抽出した(8)。簡単に説明すると、血漿（50μL）、内部標準物質［合成15(S)-HETE-d8］、および水酸化カリウムをガラス試験管に加え、アルゴンで覆い、密封した。アルゴン雰囲気下、60℃で2時間脂質を加水分解した後、放出された脂肪酸を液／液抽出によりヘキサン層に2回抽出した。各抽出では、密封してボルテックス/遠心機で混合する前に、アルゴンでチューブのヘッドスペースをパージした。合わせたヘキサン層を窒素ガス下で乾燥させ、200μLの85％メタノール：水（vol：vol）に懸濁した(8)。

ジェノタイピング
ゲノムDNAは、グアニジンHCl DNA抽出プロトコールを用いて全血末梢血白血球から抽出した。PNPLA3 rs738409変異体の遺伝子型決定には、既報のように自動塩基配列決定法を用いた(10)。我々は以前、リスクマイナーアレル（GG）のホモ接合体被験者は、他の2つの遺伝子型（CCとCG）を持つ被験者よりも肝内脂肪含量がはるかに高いことを観察した(19)。12週間の介入後のHFF％の変化に対するPNPLA3 rs738409変異体の影響を分析するために、ホモ接合体メジャーアレルとヘテロ接合体（CC/CG）をグループ分けし、このグループとリスクマイナーアレル（GG）のホモ接合体グループとのHFF％の変化率を比較した。

統計分析
中央値（IQR）やn（％）などの記述統計がコホートの特徴づけに用いられた。サンプルサイズが小さく、文献でよく報告されている非正規分布のアウトカムが多いため、未調整の解析にはノンパラメトリック検定を選択した。介入0週目と12週目のアウトカムの分布の差は、Wilcoxonの符号順位検定を用いて評価した。遺伝子型群間の0週目から12週目までの変化の差は、Mann-Whitney U検定を用いて評価した。有病率の差は、適宜カイ二乗検定またはFisherの正確検定を用いて評価した。対数変換したOXLAMおよびPUFAの経時的な平均軌跡は、共分散パターン（CP）モデリングを用いてモデル化した。CPモデリングは、縦断的観察または個人内反復観察のためのアプローチであり、特定の相関構造を残差に適用する。最適な相関構造は、非構造化、AR1、複合対称、Toeplitzの中から選択され、入れ子モデルについては尤度比検定（制限付き最大尤度から）を用い、非入れ子モデルについては最小の赤池情報量規準（AIC）を用いた。観察された平均値の時間的傾向を用いて、時間に対する線形効果と2次効果を組み込んで、CPモデルで結果の平均値の経時的な軌跡について2次多項式傾向まで検定した。軌跡に対する遺伝子型の効果を検定する際には、時間の効果（線形と線形＋2次）と2値の遺伝子型変数（GG/CGとCC）の関連する線形対比をすべて調べ、Wald検定を用いて最も簡略化されたモデルのP値を報告した。このアプローチは、ある時点の結果がランダムに欠落していると仮定しているため、すべての被験者をCPモデリングに含めた。これは、8週目のOXLAMとn-3 PUFAの測定の欠測が2つしかなく、CPモデルのパラメータの最尤法に基づく推定において、結果について利用可能なすべてのデータを使用できることから、我々のデータでは妥当な仮定である。統計的有意性は0.05のαで確立され、これは小規模の予備研究であったため、0.10のαも潜在的な統計的傾向を示すとみなした。データは、箱ひげ図、観察された平均値および目的の結果の標準偏差の折れ線グラフを用いて要約した。解析はSAS 9.4（SAS Institute）を用いて実施し、図はGraphPad Prismソフトウェア8.2.0を用いて作成した。

結果
参加者の特徴
表1は、12週間の研究を完了した17人の青少年の人口統計学的およびベースライン特性を示している。被験者全員が、HFF％＞5.5％で定義される脂肪肝であった。HFF％の中央値は14.7％（IQR：9.10％-22.8％）、血漿ALTの中央値は33.0U/L（IQR：10.0-54.0U/L）であった。試験期間中、平均体重は試験デザインによって安定しており（補足図2）、内臓脂肪、腹部皮下脂肪、内臓脂肪/腹部皮下脂肪比に統計学的に有意な変化はなかった（P＞0.05）（表1）。

表1. 肥満の男女青年17人の0週目のベースラインおよび12週目の追跡特性1

0週目（n=17） 12週目（n=17） P値2
年齢、年 13.3 [10.5-16.4] 13.6 [10.8-16.7] 0.001
性別(M/F) [n(%)] 6/11 (35/65) 6/11 (35/65) 1.000
人種(C/AA/H) [n(%)] 7/2/8 (41/12/47) 7/2/8 (41/12/47) 1.000
体組成
BMI, kg/m2 32.5 [26.8-39.1] 31.6 [26.2-39.0] 0.685
VAT, cm2 73.8 [54.2-98.9] 69.9 [52.5-101.0] 0.323
SAT, cm2 539 [352-713] 504 [348-641] 0.464
VAT/(VAT+SAT)比 0.148 [0.107-0.194] 0.141 [0.101-0.204] 0.900
代謝測定
耐糖能(NGT/IGT/T2D) [n(%)] 13/4/0 (76/24/0) 15/1/1 (88/6/6) 0.344
空腹時グルコース3 mg/dL 87.5 [80.5-93.4] 89.0 [83.9-91.0] 0.773
2時間グルコース,3 mg/dL 118 [102-142] 109 [101-126] 0.323
空腹時インスリン3μU/mL 42.3 [24.0-52.0] 32.1 [15.6-48.1] 0.050
エビジ 1.09 [0.695-1.74] 1.27 [0.820-2.56] 0.032
1
値は中央値[IQR]またはn(%)。AA：アフリカ系アメリカ人；C：白人；H：ヒスパニック；IGT：耐糖能異常；NGT：正常耐糖能；SAT：皮下脂肪組織；T2D：2型糖尿病；VAT：内臓脂肪組織；WBISI：全身インスリン感受性指数。

2
P値は連続変数についてはWilcoxonの符号順位検定，カテゴリー変数についてはカイ二乗検定によるもの。

3
血漿から測定。

食事コンプライアンス
管理栄養士は、各週の遵守率を評価するために、各参加者から記入済みの簡易食事記録を入手した。食事介入を完了した17人の参加者のうち、15人が遵守していた（12週間の介入の遵守率の中央値：92.0％；IQR：87.2％-94.7％）。血漿中OXLAM濃度の測定では、12週間の介入期間中、コホートにおいて9-HODE、13-HODE、および9-oxoODE濃度の有意な漸減が認められた（P < 0.05）（補足図3）。コホートにおけるn-3系PUFAの血漿中濃度には明確な傾向は認められなかったが、DHAには12週間の介入期間中に有意な増加が認められた（P = 0.002）（補足図4）。

身体活動の遵守
運動療法の開始または身体活動の増加を報告した参加者はいなかった。参加者は0週目も介入期間中も座りっぱなしであり、毎日激しい運動を行った参加者はいなかった。

喫煙およびアルコールの遵守
第0週および第12週に収集された喫煙および飲酒に関するアンケートによると、参加者は試験開始時および12週間の介入期間を通じて喫煙および飲酒をしていなかった。

肝臓関連アウトカムの変化
図1Aでは、12週間の食事介入前（0週目）から介入後（12週目）までのHFF％の個々の変化を示している。HFF％の中央値は、0週目の14.7％（IQR：9.10％-22.8％）から12週目の9.70％（IQR：2.80％-22.4％）へと、グループ全体で25.8％減少した（P = 0.009）。食事介入12週目までにHFF％が減少した14人の参加者のうち、0週目のHFF％中央値は12.3％（IQR：9.00％-18.2％）、12週目のHFF％中央値は7.15％（IQR：1.78％-12.1％）であった。このうち、HFF％＜5.5％と定義される正常範囲に戻った被験者は6人で、0週目のHFF％中央値は8.90％（IQR：8.43％-10.6％）、12週目のHFF％中央値は1.56％（IQR：0.00％-3.95％）であった。3人の被験者では、食事療法介入後にHFF％に変化がないか、または増加がみられ、0週目のHFF％中央値は17.8％（IQR：15.9％-30.9％）、12週目のHFF％中央値は24.4％（IQR：20.3％-32.6％）であった。12週間の介入終了時、血漿ALT濃度の中央値の有意な低下（P = 0.001）もコホート全体で観察された（0週目：33.0 IU/L、IQR：10.0-54.0 IU/L、12週目：19.0 IU/L、IQR：5.00-33.0 IU/L）（図1B）。

図1
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図1 肥満の青年17人における12週間の低n-6：n-3 PUFA比食事介入前（0週目）と介入後（12週目）のHFF％（A）、血漿ALT（B）、血漿トリグリセリド（C）および血漿LDLコレステロール（D）。ALTはアラニンアミノトランスフェラーゼ、HFF％は肝脂肪分率。

グルコースおよび脂質代謝関連アウトカムの変化
介入後、血漿トリグリセリド濃度の中央値は21.9％減少した（第0週：130mg/dL；IQR：89.5-236mg/dL；第12週：104mg/dL；IQR：76.0-155mg/dL；P = 0. 046）（図1C）、LDLコレステロールの血漿中濃度の低下（0週目：80.0mg/dL；IQR：75.5-96.5mg/dL；12週目：83.0mg/dL；IQR：68.4-90.0mg/dL；P＝0.071）（図1D）という統計的傾向がみられた。介入0週目と12週目のOGTT血糖応答はほぼ重なり合った（P = 0.207）（図2A）；しかし、OGTT血漿インスリン濃度は、介入終了時のコホートで有意に低下した（P = 0.045）（図2B）。補足図5は、各被験者の0週目と12週目のOGTT血漿グルコースとインスリン濃度の合計AUCを示している。試験開始時に耐糖能異常（IGT）を呈した4人の被験者のうち、2人は正常耐糖能に戻り、1人はIGTのままであり、1人は食事介入終了時までに2型糖尿病に進行した（0週目のHFF％：15.9％；12週目のHFF％：20.3％）（図2C、D）。

図2
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図2. 図はコホート全体におけるOGTT中のグルコースとインスリンの変化（AとB）、およびIGTを有する4人の被験者における2時間グルコースとHFF％の変化（CとD）。(A）経口ブドウ糖負荷試験中の血漿グルコースおよび（B）血漿インスリン濃度。12週間の低n-6：n-3 PUFA比の食事介入前（0週目）および介入後（12週目）。データは観察された平均値±SEM、n＝17。0週目にIGTを呈した4人の被験者について、12週間の低n-6:n-3 PUFA比の食事介入前（0週目）と介入後（12週目）の（C）2時間血糖値および（D）HFF％の個々の変化。0週目にIGTを呈した4人の被験者のうち、3人は食事介入12週目までに2時間グルコース値とHFF％の減少を示した。開いている円は、介入12週目までにT2Dに進行し、HFF％が上昇した唯一の被験者を示す。(A)血漿グルコースと(B)血漿インスリンの0週目と12週目の合計AUCをWilcoxonの符号付き順位検定で比較。HFF%は肝脂肪率、IGTは耐糖能異常、T2Dは2型糖尿病。

n-3 PUFAおよびLA由来酸化脂肪酸（OXLAM）の変化
LAおよびAAの血漿中濃度には全体的な変化は認められなかった（P＞0.05）が（補足図6）、9-HODE、13-HODE、および9-oxoODEの血漿中濃度には有意な漸減がみられ（P＜0.05）、13-oxoODEの血漿中濃度には12週間の介入期間中に減少傾向がみられた（P＝0.053）（補足図3）。n-3 PUFAについては、DHAの血漿中濃度は12週間の食事介入期間中に有意に上昇し（P = 0.002）、EPAの血漿中濃度には上昇傾向がみられた（P = 0.052）（補足図4）。

PNPLA3 rs738409遺伝子型による肝臓関連転帰の変化
17人の参加者のうち、8人はPNPLA3 rs738409のリスク対立遺伝子がホモ接合体（GG）、4人はヘテロ接合体（CG）、5人は主要対立遺伝子がホモ接合体（CC）であった。CC/CG群（男性3名、女性6名）とGG群（男性3名、女性5名）では、0週目における年齢、BMI、HFF％はほぼ同じであった（P＞0.05）。注目すべきは、CC/CG群とは対照的に、G対立遺伝子のホモ接合体の被験者は、介入終了時にHFF%（P = 0.016）（図3A）および血漿トリグリセリド（P = 0.016）（図3B）において有意な変化を示し、血漿ALT（P = 0.055）（図3C）濃度において減少傾向を示したことである。補足図7に、各遺伝子型（CC、CG、GG）で層別化した0週目と12週目のHFF％を示す。12週間の介入期間中、OXLAMは両遺伝子型群で減少した。遺伝子型による有意な減少は、OXLAMの9-HODE（P = 0.023）、9-oxoODE（P = 0.009）、および13-oxoODE（P = 0.003）で認められた（補足図8）。ALA、EPA、DPAおよびDHA（n-3 PUFAs）の血漿濃度は、介入期間中、明確なパターンで変化せず、遺伝子型間で有意差はなかった（P＞0.05）（補足図9）。補足表1Aでは、遺伝子型群別に0週目と12週目の特徴および試験結果を示し、補足表1Bでは、遺伝子型群別に特徴および試験結果の0週目から12週目までの平均変化率を示した。

図3
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図3.12週間の低n-6：n-3 PUFA比の食事介入前（0週目）と介入後（12週目）のHFF％（A）、血漿トリグリセリド（B）、血漿ALT（C）のパタチン様含有ドメインホスホリパーゼ3（PNPLA3）rs738409変異遺伝子型による箱ひげ図分布。データは中央値とIQR、n＝17（CC/CG：n＝9、GG：n＝8）。ALTはアラニンアミノトランスフェラーゼ、HFF％は肝脂肪率。

考察
この研究により、n-3系PUFAを多く、n-6系PUFAを少なく摂取する非薬理学的な食品ベースの食事介入が、肥満の青年における脂肪肝疾患を改善し、体重減少を伴わないにもかかわらず、参加者の3分の1で肝脂肪含量を正常値に回復させることが、我々の知る限り初めて示された。試験終了時に観察された脂質、リポ蛋白濃度、インスリン感受性の改善は、n-6：n-3 PUFA比の低い食事が糖尿病と心血管疾患の危険因子の両方に有益な影響を与えることを示している。さらに、PNPLA3 rs738409リスク遺伝子型を有する患者は、食事介入に対してより強固な反応を示す傾向があり、PNPLA3 rs738409リスク対立遺伝子ホモ接合体の若年者において特に有効である可能性が示唆された。この研究は、栄養学的介入がNAFLDを有する青少年の代謝表現型を改善する上で最も効果的であり（20）、NAFLDを治療するためのいくつかの薬剤（21、22）にはない脂質異常症およびインスリン抵抗性への付加的な利益をもたらすかもしれないという概念を支持するものである。

先行研究では、NAFLDの成人および小児の血漿中OXLAM濃度が高いことが明らかにされている(8, 23)。しかし、n-6:n-3 PUFA比の低い食事とNAFLDを関連付ける病態生理学は、若年者では不明である。観察されたOXLAMの減少は、患者が摂取した基質（例えば、n-6 PUFA）の補充量が少なかった結果、あるいは酸化的ストレス因子が減少した結果である可能性がある。実際、n-3系PUFAはフリーラジカルの緩衝剤として働くため（24）、高濃度のn-3系PUFAはn-6系PUFAから下流の代謝産物への変換を制限し、酸化ストレスが肝組織に与えるダメージを軽減することができる（25）。

さらに、インスリン感受性の向上は、脂肪組織から末梢循環、そして肝臓への遊離脂肪酸のフラックスを減少させるため、肝内脂肪蓄積をさらに予防する可能性があることが、先行研究で示唆されている(26)。HFF％とインスリン感受性の複数回の測定は、脂肪肝の改善とインスリン感受性の間の因果関係を、特に食物に基づく介入に反応してさらに解明するのに役立つであろう。

リスク遺伝子型がrs738409（GG）の若者におけるHFF％とトリグリセリドの低下の大きさから、肝脂質蓄積の病態生理学のさらなる手がかりが得られるかもしれない。PNPLA3 rs738409遺伝子型とn-6:n-3 PUFAの食事摂取量との相互作用が、肥満の青少年におけるHFF％とALT濃度に影響することが示されている(6, 11)。

PNPLA3遺伝子産物であるアディポヌトリンの初期の生化学的特徴は、n-6系PUFAに対する親和性を示さなかったが(27)、最近の動物実験データは、アディポヌトリンの生理学的役割は、脂質滴中のトリグリセリドとリン脂質のリモデリングであることを示唆している。アディポヌトリンは、肝細胞の脂質滴上の脂肪分解酵素アディポース・トリグリセリド・リパーゼ（ATLG）を阻害し（28）、摂食に応じた脂質滴の大きさに対応する（29）。これらの所見を総合すると、変異タンパク質は肝細胞の脂質滴リモデリングに影響を与えることによって、間接的にn-6系PUFA誘導体の蓄積を促進する可能性があるという仮説が支持される。このことは、臨床研究で観察されたPNPLA3 rs738409変異体とn-6系PUFAとの相互作用を説明しうる。

しかしながら、本研究にはいくつかの限界があることは認める；実際、サンプルサイズが小さいことと対照介入がないことは重要な欠点である。サンプル数が少ないため、遺伝子型による層別化はデータの過度の解釈につながる可能性がある。さらに、多くの代謝パラメータが評価されたため、統計学的I型エラーを起こす危険性がある。身体活動レベルの正式な測定は行わなかったが、参加者は介入前はかなり座りがちであり、運動開始の影響の可能性をコントロールするために、活動レベルを一定に保つよう求めた。なぜなら、運動は体重減少がなくても、脂肪酸酸化を増加させ、肝臓での脂肪酸合成を減少させる可能性があるからである(30)。

この栄養改善がより多くの集団に一般化できるかどうか、また欧米型食生活からのパラダイムシフトが可能かどうかは、まだ確定されていない。私たちは、管理栄養士が対面またはウェビナーで指導する標準化された教材を使用することにより、実世界の設定で成功することを想定している。青少年に対するこの栄養介入の実現可能性を向上させることは、家庭環境によっては可能であろう。しかし、その他の家庭では、最適な種類の食品を購入および/または調理するための支援が必要であり、また家庭や学校環境において包装食品に過度にさらされるのを制限する必要があるかもしれない。

もう一つの重要な限界は、脂質が赤血球膜ではなく血漿で測定されたという事実である。実際、赤血球の寿命は3ヵ月程度であるため、赤血球脂質の変化は食事脂肪組成のより安定した指標となる可能性がある。

これらの限界にもかかわらず、この研究にはいくつかの長所がある。肝内脂肪を減少させる機序としての体重減少の交絡因子を避けるため、体重を綿密にコントロールし、実際にコホートの平均BMIは介入0週目から12週目まで有意な変化はなかった。また、グルコース代謝を評価するためのOGTT、脂肪分布を評価するためのMRI、食事コンプライアンスを評価するためのn-6およびn-3 PUFAを測定するためのLC-タンデムMSを用いて、参加者の表現型を徹底的に調べた。さらに、この研究で得られた知識は、将来の合併症のリスクが高い若年脂肪肝患者の健康改善を進める上で重要な意味を持つ。

本研究は、我々の知る限り初めて、食品をベースとした低n-6および高n-3 PUFA摂取の食事介入による肝脂肪症および糖代謝の改善を示した。この介入は、少数の肥満青年グループにおいて実行可能性を示したが、より大規模な研究が必要であり、脂肪肝疾患およびそれに関連する表現型に対するn-6とn-3 PUFAの比率が4：1の食事の短期および長期の有効性を評価するための対照臨床試験を実施することが重要であろう。さらに、OXLAM、肝脂肪、インスリン抵抗性を結びつける機序はまだ解明されていないが、我々のデータはこの経路に関する継続的研究の重要性を示している。

謝辞
イェール大学およびイェールニューヘブン病院で実施された本研究への参加に同意してくれた患者とその家族、およびメタボリックキッチンを含むイェール大学臨床研究センター、イェール大学ゲノム解析センター、イェール大学コアラボ、イェールニューヘブン病院研究ユニットのスタッフに感謝する。著者の責任は以下の通りである-NSとSC：研究の計画、MS：食事の設計と食事指導、BP、JMC、AEF、CJ：研究の実施、AEFとCJ：必須材料の提供、VS、NS、BTG：データの分析と統計解析の実施、UE、PLV、GK、MAVN、SC：被験者の提供、MAVNとNS：論文の執筆、BTG：最終的な内容の第一責任者、全著者：最終原稿を読み承認。

補足情報
補足表1および補足図1-9は、論文オンライン掲載の「補足データ」リンクおよびhttps://academic.oup.com/jn/、オンライン目次の同じリンクから入手できる。
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著者の開示著者らは利益相反はないと報告している。

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