ICU患者における緑膿菌の動態を形成する腸管から肺への移行と抗生物質による選択性
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公開日：2022年11月22日
ICU患者における緑膿菌の動態を形成する腸管から肺への移行と抗生物質による選択性
レイチェル・M・ウィートリー、フリオ・ディアス・カバジェロ、...R. Craig MacLean 著者を表示
Nature Communications 13巻 記事番号：6523 (2022) この記事を引用する
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メトリックの詳細
概要
細菌は人体の部位間を移動する可能性があるが、宿主内細菌移動の動態とその結果についてはまだ十分に理解されていない。我々は、ゲノム解析、分離株の表現型解析、宿主免疫プロファイリング、臨床データを組み合わせて、集中的にサンプリングしたICU患者における腸と肺の緑膿菌集団の関連性を調査した。その結果、ICUにおける肺のコロニー形成は、腸管からの緑膿菌の移行によって促進されることが明らかとなった。尿路感染症に対するメロペネム投与により、腸管と肺の両方で耐性菌が増加した。しかし、耐性は腸と肺の並行進化と臓器特異的な選択圧によってもたらされ、転菌はAMRにわずかな影響しか及ぼさないことが明らかになった。これらの知見は、腸管内のPseudomonasのコロニー形成を抑制することが、重症患者の肺感染症を予防する有効な方法となる可能性を示唆している。
はじめに
細菌はしばしばヒト宿主の複数の解剖学的部位にコロニーを形成するが、宿主内転座の動態や、それが病原性や宿主適応に及ぼす影響については、まだ十分に理解されていない1,2,3。例えば、マイクロバイオームプロファイリング法の進歩により、腸内マイクロバイオームが重症患者の肺に転移していることが明らかになっており4,5、転座は機械的人工呼吸を受けた患者の予後不良と関連しています6。腸から肺への転流はマイクロバイオームレベルで実証されていますが、個々の病原体や抗生物質耐性に対する転流の動態や影響については、十分に理解されていません。
緑膿菌は、世界中の医療関連感染の主な原因となっている日和見病原体であり7,8、特に免疫力が低下した患者において顕著に見られます9,10。緑膿菌は腸内細菌叢の典型的なメンバーではないと考えられており、緑膿菌の腸内コロニー形成は、肺感染症の発症リスク11、12、13および死亡率14の上昇と関連しています。腸のコロニー形成は通常、肺感染に先行し、腸と肺で同じ株が見つかることが多いことから、腸は肺や他の感染部位に感染するシュードモナスのリザーバーとして機能していることが示唆されています15,16,17。しかし、緑膿菌の腸から肺への感染に関する直接的な証拠はなく、腸管内保菌は単に緑膿菌感染に対する生得的な感受性を反映しているか、肺と腸に独立してコロニー形成することができる緑膿菌の供給源に近い可能性がある。
緑膿菌への対処の大きな課題の1つは、抗生物質耐性である。緑膿菌は、抗生物質に対して高いレベルの内在性耐性18,19,20を持ち、入院患者において耐性をde novoで進化させる驚くべき能力を有しています21,22,23。古典的な集団遺伝学モデルでは、移動は、選択が作用する遺伝的多様性を増加させることにより、局所的なスケールで進化的適応を加速させることができる24。この場合、耐性決定因子を細菌のコロニー間で移動させることにより、転座が抗生物質耐性に関与する可能性がある。極端な例では、ある臓器（例えば、腸）の細菌集団が耐性変異体の供給源となり、それが他の臓器（例えば、肺）に伝播する可能性がある。
Pseudomonasのコロニー形成と抗菌薬耐性（AMR）における腸から肺への伝播の重要性を検証するために、我々は30日間にわたって集中的にサンプリングしたICU患者1人について詳細なケーススタディを実施した。系統的なアプローチにより転座を検証し、ゲノムおよび表現型の手法を組み合わせて、AMRと宿主内伝播の関連性を検討した。
結果
臨床経過
対象患者は、スペイン・バダローナのHospital Universitari Germans Trias i PujolのICUに、発作の主診断で入院した。ICU入室時に機械換気が開始され、合計39日間継続された。口腔咽頭または胃内容物の下気道への吸引（気管支吸引）が疑われたため，緑膿菌に無効なアモキシシリン・クラブラン酸塩で直ちに治療された．患者は入院後48時間（以下、1日目）にASPIRE-ICU試験25に登録された。尿路感染症が疑われたため、12日目にメロペネムを開始し、10日間継続投与した。ICU滞在期間中，気管内吸引液（ETA）（n = 12）および肛門周囲スワブ（n = 40）から，ASPIRE-ICU試験のエンドポイントとなる30日まで合計52株の緑膿菌が分離された（図1）。2日目，11日目，21日目の患者血液検体の培養スクリーニングでは，いずれも緑膿菌の増殖は認められなかった。緑膿菌のコロニー形成は1日目に肺で検出された。メロペネム投与後に腸管コロニー形成が検出され、メロペネム耐性緑膿菌が最終的に肺にコロニー形成された。この複雑な臨床経過は、腸と肺の間で転移している可能性を示唆している（図1）が、臨床データと分離株の表現型だけでは、宿主内転移してAMRを引き起こす根本的な要因についての考察は不十分である。
図1: 臨床タイムラインと耐性表現型。
図1
A 患者サンプリングのタイムライン。培養により緑膿菌のコロニー形成が陽性または陰性と判定されたサンプルを示す。分離株が採取されたサンプリングポイントは、緑色のリングで強調されている。患者は登録の2日前から6日目までアモキシシリン・クラブラン酸塩で、12日目から21日目までメロペネムで治療された。B 腸（オレンジ）および肺（緑）の各サンプリング点からの分離株（n＝4〜12、プロット上でラベル付け）のメロペネム最小阻害濃度（MIC）（平均 ± s.e.m μg/mL）。各分離株のメロペネムMICの中央値は、生物学的に独立したn=3個の複製から算出されたものであった。メロペネム耐性は時間とともに増加し、最終肺サンプルからの緑膿菌分離株はメロペネム耐性のEUCAST臨床ブレークポイント（赤い破線）以上であった。アモキシシリン・クラブラン酸耐性は、この抗生物質がP. aeruginosaに対して活性がないため、測定されなかった。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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病原体のコロニー形成と進化に関するゲノムの洞察
この患者内の遺伝的多様性を特徴付けるために、ロングリードおよびショートリードのシーケンスを使用して、1つの分離株のハイブリッドアセンブリを構築し、5つのコンティグに分散した約 6.3 MbのST782参照ゲノムを得ました。肺分離株（n=12）と腸分離株（n=40）の短鎖配列をこの参照ゲノムにマッピングし、多型SNP（n=17）、インデル（n=7）、190kbのゲノムアイランドの有無の変異を同定した（補足表1、補足図1）。
この患者に見られた遺伝的多様性は、（i）複数のクローンによるコロニー形成/感染の繰り返し、または（ii）単一クローンの宿主内進化、のいずれかを反映している可能性がある。これらの過程を識別するために、ST782ゲノムに近縁な緑膿菌PA1をアウトグループとして分離株の系統樹を再構築した（図2A-D）。すべての分離株は近縁で、分離株あたりの変異体数は分離株収集日と強い相関があり、患者内の多様性は単一の創始クローンのin situ進化の結果として出現したという考えを支持した（図2E；r2 = 0.62, F1,50 = 82, P < 0.0001 ）。この病院のASPIRE-ICUコホートでは、試験中に緑膿菌ST782にコロニー形成された患者はなく、コロニー形成の繰り返しとは対照的に、宿主内の多様化をさらに裏付ける結果となった。
図2：ゲノム解読と系統解析
図2
肺（n = 12）と腸（n = 40）から分離された緑膿菌PA1（呼吸器感染症から採取された別のST782臨床分離株72）をアウトグループとして根付かせた系統的再構成。並行進化を示す遺伝子またはパスウェイにおける推定適応的多型は系統樹上に注釈されている。タンパク質を変化させる変異は黒で、沈黙の変異は薄い灰色で示されている。既知の多剤排出ポンプ制御因子（mexR）の多型も強調表示されている。190kBのゲノムアイランドの有無の変異を示し、ゲノムアイランドの損失が推測される場合は、ツリー中の青い三角形で識別している。B 分離菌名、肺（緑）または腸（オレンジ）由来、収集研究日。C 各単離株のメロペネムに対する感受性は、最小発育阻止濃度（MIC）のlog2スケールで黒丸で示した。D ツリーのトポロジーは、小さな多型の同定に基づいて、5つの異なるグループを示唆した。E 腸（オレンジ）および肺（緑）の各サンプリングポイントからの分離株（n = 4-12、プロット上でラベル付け）の経時的な変異の蓄積（平均±s.e）は、コロニー形成の再発エピソードではなく、クローンの宿主内進化を示唆するものであった。F BactDating73で構築した分離株の年代別系図。腸から肺への伝播とメロペネム耐性変異の獲得が推定され、系図に注釈がつけられている。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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この患者の進化速度は約18 ± 10 SNPs/年26であり、細菌病原体の一般的な進化速度である1～10 SNPs/年3よりも高い値であった。しかし、この高い進化速度は、この試験で報告された別の患者の進化速度23と一致し、重症患者における緑膿菌の生体内突然変異率が高いことを浮き彫りにしている。この系統的アプローチは、宿主の連続的なコロニー形成を強く支持し、培養ベースのアプローチ（図1Aなど）では緑膿菌のコロニー形成を検出する能力に限界があることを示唆している。
並行進化の兆候は、ヒトの宿主という新しい環境への適応を支える推定上の有益な変異を同定する簡単な方法を提供する3,27。カルバペネム系抗生物質に対する耐性（oplD）27、アルギン酸生合成（algW, algL）28、セレノシステイン生合成（selA, selB）29の3つの遺伝子またはオペロンでパラレル進化が起きていた。これらの推定される病的適応変異は24変異のうち7変異を占め、宿主環境への迅速な適応を示す強力な証拠となった。興味深いことに、これら7つの変異のうち3つは同義であり、転写効率が選択の重要なターゲットであった可能性が示唆された30。また、アウトグループと肺分離株（図2、系統5）に可変ゲノムアイランドが存在することから、このアイランドは2回独立して失われ、この要素の喪失が適応的であったことが示唆される。大規模な欠失の選択的優位性を推測することは困難であるが、この島が宿主環境において選択されないピオベルジン生合成遺伝子を保持していることは注目に値する31。ゲノムアイランドを保有する分離株は、ゲノムアイランドを失った同じ系統（系統5）の分離株と同程度のメロペネム耐性（〜0.5 μg/mL MIC）を示し（図2）、この島の消失は抗生物質処理に起因しないことが示唆された。
細菌の系統樹は、特に分離株のサンプリング日と組み合わせた場合、伝播事象を検出するための強力なツールとなる3,32,33。宿主内転座を再構築するために、時間スケールの分離株系統図を用いて転座イベントを推定した(図2F)。二次的な肺のコロニー形成は、重要なカルバペネム感受性決定因子である oprD ポリンと、多剤排出ポンプ MexAB-OprM の発現を制御する mexR に変異を持つクローンの増殖によってもたらされた34 (Fig. 2A - lineage 3). この系統は、より広範な腸内細菌群の中に入れ子状に存在し、腸から肺への感染を強く立証している(図2F)。日付の入った系図は、系統3のMRCAが18日目から24日目の間に存在したことを示唆し（補足図2）26、腸から肺へのトランスロケーションのおおよその時間枠を与えている。しかし、この系図からは、系統3がカルバペネム耐性変異を獲得したのが肺への伝播前なのか後なのかについての知見は得られない。興味深いことに、腸からは1系統の3番株が回収された。この系統が肺と腸に存在するということは、メロペネム耐性が肺に伝播する前に腸で進化したか、あるいは肺でメロペネム耐性が進化した後にこの系統が二次的に肺から腸に伝播したことを示唆する。
このように腸から肺への転移という明確なケース以外にも、推定される転移のパターンは、祖先のクローンによる最初のコロニー形成に関する仮定に強く依存している。もしPseudomonasが最初に腸に定着したのであれば、系統樹は系統1による最初の肺への定着が、ICU入室時の気管支吸引に関連した、より早い腸から肺への転座イベントによって引き起こされたことを示唆する。あるいは、祖先のクローンが肺に定着したのかもしれない。このような宿主コロニー形成のモデルの場合、系統図は肺から腸への感染が系統2および5で起こったことを示唆しており、少なくとも1回の転座がICU入室前のある時点で起こったことを示唆している。最後に、祖先のクローンが独立して肺と腸の両方をコロニー化した可能性がある。この宿主コロニー形成モデルによれば、肺と腸の分離株の系統分布を説明するために、（系統3における明確な腸から肺への転座以外に）追加の転座を引き起こす必要はない。残念ながら、ICU入室前の分離株がないため、この患者におけるPseudomonasのコロニー形成の初期史を再構築することができず、これらのモデルを明確に区別することはできない。宿主のコロニー形成に関する3つのモデルはすべて、推定される転座イベントの数が同程度であることから（1-3）、系統学的な観点からは同様に推定しやすいことが示唆されます。患者サンプルの培養により、腸内コロニー形成の前に肺コロニー形成が確認されましたが（図1A）、この培養データからは、ICU入室の20日以上前に発生したと思われる初期の宿主コロニー形成についての知見は限られていると主張します。さらに、培養データを用いて宿主のコロニー形成を推定する際の課題として、異なる組織のサンプルを培養した際の検出限界が不明であることが挙げられる。ETAサンプルと肛門周囲スワブでは、肺と腸におけるPseudomonasの検出感度が異なるだけである可能性がある。
肺のコロニー形成に対する免疫反応
肺のコロニー形成は、緑膿菌が粘膜表面に付着し、上皮バリアを貫通することで感染を確立する機会を与え、ICU患者の非常に高い死亡率に関連する肺炎の発症につながる7. 感染予防における宿主免疫の役割を調べるため、気管内吸引液（ETA；図3）のサンプル中の宿主免疫エフェクターのパネルの存在比を測定した。日付の入った系図は、第3系統による二次的な肺のコロニー形成が18日目から24日目の間に起こったことを示唆している。興味深いことに、17日目と19日目のETAサンプルは、以前に緑膿菌のクリアランスを促進することが示されているIL-33、Fractalkine、IL-435,36の発現の急上昇と関連していた37。IL-22は、粘液産生を増加させ、好中球の流入によって引き起こされる過剰な炎症を抑制することによって、細菌性病原体の付着と排出による感染から保護する38,39。肺からのETAサンプル中のサイトカインレベルを測定することにより、免疫反応を直接測定することができるが、この方法に対する一つの懸念は、例えば患者の脱水の結果として、個々のサンプルがすべてのサイトカインの高濃度を与える可能性があることである。しかし、この場合、IL-8のレベルはサンプル間で基本的に一定であり、保護サイトカインの急上昇がアーチファクトでないことを裏付けている（Fig.3E）。これらのサイトカインデータは、12日目と17日目の間のある時点で二次的な肺コロニー形成が起こったという考えをさらに支持するものであり、宿主免疫応答がコロニー形成から肺炎への進展を防いだ可能性を示唆している。
図3：試験期間中に採取したETAサンプルにおいて、4、9、12、17、19、24日目にサイトカイン濃度を測定した。
図3
以下のサイトカインが測定された。A IL-4、B IL-33、C フラクタルキン、D IL-22、E IL-8。黄色の網掛けは、タイムライン上のメロペネム治療枠（12日目から21日目）を示す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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抗生物質耐性のドライバー
緑膿菌は、高いレベルの抗生物質固有耐性を有し、抗生物質治療下で耐性を向上させる顕著な能力を備えています18,21。腸管と肺の間を移動する可能性があることから、我々は次に、この患者におけるメロペネム耐性の起源と拡散に対する移動、突然変異、選択の相対的寄与を理解することを目指した。系統図は、oprDとmexRの変異により、2回に分けてメロペネム耐性が進化したことを明確に示している（図2、系統3および4）。しかし、配列決定された分離株の数が限られており（n = 52）、分離株のサンプリングにギャップがあるため、分離株だけでメロペネム耐性変異のダイナミクスを追跡することは困難である。この問題を克服しようと、ASPIRE-ICUのプロトコルに従って分離株をスクリーニングしていないETAサンプルや肛門周囲スワブから直接抽出したDNAを用いて、分離株のシーケンスデータとoprDのアンプリコンシーケンスを組み合わせた（図4A, B）。アンプリコンシークエンスにより、Pseudomonasは17日目以降に肺に存在し、これは分離株の系統樹（図2F）とサイトカインプロファイリング（図3）から推測される二次肺コロニー形成の時期と一致した。肛門周囲スワブから分離したDNAからのoprDアンプリコンシークエンスは、理由は不明だがあまり成功せず、23日目と25日目のみのアンプリコンシークエンスデータしか得られなかった。重要なことは、分離株とシュードモナスDNAの両方が得られたサンプルのアンプリコンシークエンスと分離株シークエンスで測定したoprD変異体の頻度は本質的に同一であり（補足図3）、アリル頻度の変化を測定するアンプリコンシークエンスの使用が有効であることであった。
図4：メロペネム耐性の進化と伝播。
図4
A, B 分離菌（丸）およびoprDアンプリコン（菱形）配列データから決定したoprD変異体の動態。アンプリコンと分離株のシーケンシングの両方が実施された2つのサンプリングポイント（腸管23日目と腸管25日目）については、2つの頻度の平均値を示す（星）。分離配列決定とアンプリコン配列決定からのSNP頻度の測定値は強い相関があった（R2 = 0.9963; 補足図3）。黄色の領域はメロペネム処理のウィンドウを示し、赤色の領域はナノポアシーケンスのエラー率に起因するアンプリコンシーケンスからの変異体の保守的な最小検出限界を示す。C, D oprD変異体（Δ oprD）を持つ分離株と野生型oprD背景を持つ分離株との成長比較。嫌気性増殖（C）は、嫌気性ブロスで72時間増殖した後のOD595として測定された。各ポイント（すなわち単離株）についてプロットした値は、n = 3生物学的に独立した複製（Source Data）から計算され、各系統から少なくとも3つの単離株が測定された。好気性増殖（D）は、標準的な培養条件下での指数関数的な増殖速度として測定された。分離株は、Fig. 2で定義したように、系統別に色分けされている。各ポイント（すなわち分離株）についてプロットした値は、n = 7生物学的に独立した複製（Source Data）から算出され、各系統から少なくとも3つの分離株を測定した。oprD変異は、入れ子ANOVAによって判断すると、嫌気性条件での成長障害（P = 0.010）とは関連するが、好気性条件（P = 0.950）とは関連しないことが示された。異なる系統の分離株のデータは、oprD遺伝子型にネストされた系統間で体力測定値に差がなかったため、一緒に表示した（P > 0.5）。この解析の統計的検定はすべて両側である。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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配列決定された分離株で最も一般的なoprD変異（nt1160∆1）は、腸管分離株の主要なクレードで生じ（図2、系統4）、肺サンプルでは決して説得力のある検出はされなかった（図4B）。この分離株とアンプリコンシークエンスの結果の組み合わせは、この突然変異が腸で生じ、メロペネム処理下でほぼ固定化されるまで掃討されたという強い証拠を示している。この変異の頻度は、カルバペネム感受性系統（図2A-5系統）の拡大により、最終的に腸管内で減少した。この系統は、カルバペネム毒性が低い腸内領域に定着するか、またはパーシスター細胞を形成することによって、カルバペネム処理を生き延びたのではないかと推測される。
分離株の配列決定により、oprDの2番目のフレームシフト変異（nt559∆1）が明らかになったが、これはeffuxポンプの転写制御因子mexRの変異と関連していた。分離配列決定により、25日目の腸サンプルと30日目の肺サンプルにoprD nt559∆1/mexRT305C 系統が存在し、この耐性系統がコロニー形成部位間で伝播したことを示す強力な証拠となった。アンプリコンシークエンスにより、この変異は20日目の肺で初めて多型（頻度約20%）として検出され（図4A）、この変異は腸から系統3が伝播した後に肺で生じたことが示唆された。このモデルによれば、25日目に稀なoprD nt559∆1変異体（分離株とアンプリコンに）が存在するのは、肺から腸への二次感染を反映していると考えられる。しかし、oprD nt559∆1が腸で発生し、その後肺に伝播して正選択により急速に広がった可能性を完全に排除することはできないことを強調する。
抗生物質の濃度は宿主の組織によって異なり、病原体集団が抗生物質治療に伴う選択圧の地域差にどの程度適応しているかは不明である。メロペネムは、腸内より肺の組織で高い濃度を達成することから40、肺では腸内よりも耐性への選択が強いことが示唆される。肺に関連するoprD nt559∆1/mexRT305C 系統の分離株は、腸に関連するoprD nt1160∆1 系統の分離株（MIC = 4 μg/mL, s.e. = 0 μg/mL, n = 7）より高いメロペネム耐性（MIC = 16μg/mL, s.e. = 0 μg/mL) を有していた。 e. = 0 μg/mL, n = 19; Fig. 2C）。これは、メロペネム耐性に対する選択が臓器間で異なるという考えと一致する。
AMRの進化学的研究における重要な課題は、抗生物質を使用し続けなかった場合に、病原体集団においてどのように耐性が維持されるかを理解することである41,42。この場合、肺では抗生物質投与後も oprD nt559∆1 耐性が安定していたが、腸では oprD nt1160∆1 の頻度が低下していた。抵抗性の安定性における選択の役割を検証するために、腸と肺の生理的な違いの一つを再現する嫌気性培養液（図4C）と好気性培養液（図4D）で、5つの主要系統の分離株の増殖率を測定した。メロペネム耐性系統（Δ oprD）は好気性条件下での増殖速度の低下と関連しなかったことから、oprDおよびmexR変異は、これらの条件下では、関連コストがあるとしてもほとんどないと考えられる（図4D； F1,12 = 0.0032, P = 0.956 ）。一方、メロペネムの両系統は嫌気性条件下での成長低下に関連しており、oprD変異に関連する体力コストが腸管内の耐性喪失を推進したことが示唆された（Fig. 4C; F1,12 = 9.27, P = 0.010 ）。
考察
このプロジェクトの目的は、一人の患者における腸と肺のPseudomonasコロニー形成の関連性を理解することであった。臨床データとゲノムデータを組み合わせることで、患者がICUに入院している間に腸から肺へ感染した明確な事例を証明することができた。1件の研究で得られた知見を一般化することは困難であるが、これらの知見は、重症患者における緑膿菌の気道コロニー形成の主要因は腸管から肺への伝播であるという考えを裏付けるものである11,12,43。
メロペネムなどのカルバペネム系抗生物質は、緑膿菌感染症の治療において重要であり23,44,45、カルバペネム耐性緑膿菌は、世界保健機関および疾病管理予防センターによって重要な脅威として認識されている。この患者では、尿路感染症の疑いによるメロペネム投与が耐性化の繰り返しを促し、AMRの「傍観者選択」の重要性を示す痛烈な例となった46。最終的に、この選択は、抗生物質による治療が行われていないにもかかわらず肺に残存する高度耐性菌の集団の出現を招き、呼吸器が他の身体部位や他の患者に感染する可能性のあるカルバペネム耐性Pseudomonasの発生源として機能する可能性を示唆している。分離株の配列決定、アンプリコンシークエンス、免疫学的プロファイリングのすべてが、腸から肺への転流がメロペネム治療と一致するという考えを支持している。この関連性は偶然に生じたものかもしれないが、例えば、Pseudomonasのコロニー形成を防ぐ肺常在菌を排除することによって、抗生物質治療が腸から肺への感染を促進した可能性もある。
移動は遺伝的変異を増加させるため24、宿主内移動は細菌の抗生物質への適応を促進する可能性が示唆される1,2,3,47,48,49,50。この場合、耐性は、抗生物質濃度の局所的な違いに適応した独立した系統が腸と肺に広がることによってもたらされた。耐性系統の移動の証拠も見つかったが、宿主内移動が耐性に与える影響は選択に比べ弱く、高度に構造化されたメロペネム耐性病原体集団の出現につながった1,2,3,49. 我々は、Pseudomonasの高い生体内変異率が、組織間での抗生物質選択に対する局所適応を形成する鍵であり、より小さな空間スケール2、あるいは変異率が低い場合には、宿主内伝播がより重要な耐性源となる可能性が高いと推察している。
緑膿菌のMDR株やXDR株による院内感染は、世界的に深刻な問題となっており19、これらの株による感染症を治療するための新しい抗生物質の開発が急務となっている。同時に、緑膿菌は抗生物質治療に対して耐性を進化させるという驚くべき能力を持っており18,21,23,47、緑膿菌感染症の予防や治療のための新しいアプローチを開発する必要性が強調されている。我々の研究は、腸内コロニー形成や腸から肺への感染を防ぐことが、重症患者におけるPseudomonas感染を予防する効果的な戦略である可能性を示唆している51,52,53,54。
方法
臨床的タイムライン
患者は、スペイン、バダロナのHospital Universitari Germans Trias i Pujolの集中治療室（ICU）に、発作の主診断で入院した。この患者は、観察型の欧州多施設疫学コホート研究（ASPIRE-ICU25）の一部として募集され、ヘルシンキ宣言の原則に従い、人を対象とする医学研究法および参加国の現地ガイドラインに準拠して実施された。研究プロトコルはGermans Trias i Pujol大学病院の研究倫理委員会により承認され、参加者は書面によるインフォームドコンセントを行った。
ICU入室時，患者は肺炎やその他の活動性の緑膿菌感染症にかかっていなかった（APACHE-IIスコア＝22，グラスゴー昏睡スケール＝3）．入院前2週間に抗生物質の使用は報告されていない。ICU入室48時間後にインフォームドコンセントを取得し、ASPIRE-ICU試験（1日目）25に登録した。ICU 入室時に機械換気が開始され、合計 39 日間継続された。気管支喘息（口腔咽頭または胃内容物の下気道への吸入が疑われる）のため、ICU入室時にアモキシシリン/クラブラン酸（1000 mgを8時間ごとに静注）が開始された。12日目に尿路感染症の疑いでメロペネム（1000mg、8時間静注、10日間）の投与を開始。気管内吸引（ETA）および肛門周囲スワブサンプルを採取し，3023日目まで選択的平板化により緑膿菌の分離を検討した。患者ETAサンプルは、まず混合し（30,000 rpm、プローブサイズ8 mm、10秒ステップ、合計最大60秒）、Lysomucil（10％アセチルシステイン溶液）（Zambon S.A、ベルギー）で1：1 v/vに希釈し、37℃で30分間、15分ごとに10秒ボルテックスしてインキュベートされた。CHROMID P. aeruginosa Agar (BioMérieux, France) および血液寒天培地 (BBL®Columbia II Agar Base (BD Diagnostics, USA) supplemented with 5% defibrinated horse blood (TCS Bioscience, UK)) により緑膿菌をスクリーニングする選択的プレーティングを実施した。Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) を用いて、サンプルあたり最大12個のP. aeruginosaコロニーを同定し、さらに使用するまで-80 °Cで保存した。その結果，気管内吸引サンプル（n = 12）および肛門周囲スワブ（n = 40）から合計52の緑膿菌が分離された．さらに，2日目，11日目，21日目の患者の血液培養を地元の検査室でスクリーニングしたところ，いずれも増殖なし（P. aeruginosa陰性）と報告された。患者はICUを退院し，41日目に一般病棟へ転棟した。
耐性表現型
すべての分離株はグリセロールストックからルリアベルタニ（LB）ミラー寒天培地上で37℃、一晩培養した。その後，シングルコロニーをLBミラーブロスに接種し，37℃，225rpmで振盪しながら18～20時間静置培養した．一晩の懸濁液を連続希釈し、5×105 CFU/mLとした。メロペネムに対する耐性表現型は，EUCAST勧告55,56で定義されたブロス微量希釈法による最小阻害濃度（MIC）試験として実施し，培地をLB Miller brothに変更し，基準株としてP. aeruginosa PAO1株を用いた。メロペネムに対する耐性は、0.25～64μg/mLの範囲で2倍希釈系列に沿って測定した。増殖阻害をOD595 < 0.200と定義し、各単離株のMICを生物学的に独立した3つのアッセイからのMICスコア中央値として算出した（出典データ）。
増殖アッセイ
緑膿菌分離株をグリセロールストックからLBミラー寒天培地プレート上で37℃にて一晩培養した。その後、シングルコロニーをLBミラーブロスに接種し、37℃で18-20時間、225rpmで振盪しながら一晩培養した。一晩の懸濁液は、蓋付きの96ウェルプレートの内側60ウェル内でOD595が〜0.05になるように連続的に希釈された。標準的な好気性条件下での増殖速度を評価するため、分離株をLB Millerブロスで37℃にて培養し、適度な連続振とうに設定したBioTek Synergy 2マイクロプレートリーダーで10分間隔で光学密度（OD595 nm）の測定を実施した。成長率（Vmax; mOD/min）は、連続した10回の測定におけるOD対時間の最大傾斜として計算し、これが対数相成長率を捉えていることを確認するためにプロットを目視で検査した。メロペネム耐性と体力との関係を評価するために、最低7回の生物学的複製を行い、52の腸と肺の分離株すべての増殖速度を測定した（出典データ）。増殖アッセイを通じて、培地コントロール（汚染をコントロールするため）およびPAO1コントロール（プレートの複製をコントロールするため）が含まれた。嫌気性ガス発生サシェ（Thermo Scientific Oxoid™ AnaeroGen™ sachets）と嫌気性ジャー（Thermo Scientific Oxoid™ AnaeroJar™ base jar）システムで嫌気性成長を測定した。嫌気性環境の発生を確認するための指標として、Oxoid Resazurin indicator stripをジャー内に設置した。増殖測定は、96ウェルプレートのウェルにLB Millerブロスにシングルコロニーを接種し、嫌気ジャーに72時間置いた後、プレートを取り出してOD595を測定した。oprD変異体（Δ oprD）分離株と野生型oprDバックグラウンド（WT oprD）分離株との比較のために、各Δ oprDおよびWT oprDグループの平均成長測定値を生成するために、各系統群から代表として選択した最低3つの分離株（および最低3つの生物学的複製）について成長測定値を取得した。oprD変異と成長障害との関連を検定するために、oprDの主効果（すなわちWTまたはΔ oprDのいずれか、1 df）およびoprD内に入れ子になった系統（図2および3 dfに示す5系統）を含む入れ子型ANOVAを使用した。
イルミナシーケンス
すべての分離株はMiSeqまたはNextSeq illuminaプラットフォームで配列決定され、21X～142Xの配列カバレッジを得た。trimmomatic v.0.3957のILLUMINACLIP (2:30:10) およびSLIDINGWINDOW (4:15) によりRawリードを品質管理した。SPAdes v.3.13.158を用い、デフォルトのパラメータで各単離株のquity controlされたリードをアセンブルしました。これらのアセンブリは、pilon v.1.2359を使用して、最小フランク塩基数10、ギャップマージン100,000、kmerサイズ47でさらに研磨されました。得られたコンティグは、緑膿菌UCBPP-PA1460株に基づいてprokka v.1.14.061でアノテーションされた。各単離株はPubMLST (last accessed on 11.06.2021)62 のPseudomonas aeruginosa multi-locus sequence typing (MLST) schemeを用いて型別した。
ロングリードシークエンス
2つの分離株（EP717（1日目の肺）およびEP623（17日目の腸））は、FLO-MIN106フローセルおよびSQK-LSK109配列決定キットを用いて、オックスフォードナノポアMinIONプラットフォームを使用して配列決定された。EP717は141X、EP623は233Xのカバレッジであった。guppy v. 0.0.0 + 7969d57 でベースコールを行い、qcat v. 1.1.0 (https://github.com/nanoporetech/qcat) でデマルチプレックスを行った。得られたリードは、unicycler v. 0.4.863 (SAMtools v. 1.964, pilon v. 1.2359, bowtie2 v. 2.3.5.165, hybrid mode) で、それぞれの illumina reads とアセンブリされました。EP717アセンブリのN50は1,797,327、総塩基数は6,217,789で、11コンティグに分布していた。EP623アセンブリのN50は6,133,283で、5コンティグに分散された6,330,243塩基であった。
変異体検出
感染時の変異や遺伝子の獲得・喪失を同定するために、各単離株の短鎖シーケンスリードをBWA v. 0.7.1766でBWA-MEMアルゴリズムを用いてロングリードde novoアセンブリのそれぞれにマッピングした。SAMtoolsとBCFtools v.1.9で予備的なSNPを同定した。低品質のSNPは、2段階のSNPコーリングパイプラインを使用してフィルタリングされ、最初に以下の基準で潜在的なSNPが特定された。(1）Variant Phred quality scoreが30以上、（2）コンティグエッジまたはインデルから150塩基以上離れている、（3）20本以上のシーケンシングリードがSNP候補の位置をカバーしている。第2段階では、それぞれの予備的SNPについて、参照塩基または変異塩基をサポートする証拠があるかどうかをレビューした。最終的なコールをサポートするには、Phred quality score 25以上のリードが80%以上必要であった。曖昧な判定は、参照塩基またはバリアントのサポートが十分でないものと定義され、系統学的に情報を持たないSNPのうち、曖昧な判定をしたのは1箇所のみでした。GATK v. 4.1.3.067 の HaplotypeCaller と breseq v. 0.34.068 のオーバーラップにより、インデルを同定した。高信頼度SNPをもとに最大級パーシモン系統樹を構築した。分離株の日付付き系統樹を構築するために，まず多座ノードを2座ノードに変換した後，BactDating v1.1.026 (updateRoot = TRUE, minbralen=0.1) のbactdateを用いてこの樹の内部ノードを年代測定した．系統樹は ggtree v3.0.469 でプロットした。
可変ゲノムは、ショートリードde novoアセンブリのprokkaアノテーションに基づき、GenAPI v.1.09870を使用して調査した。BWA v.0.7.1766でシーケンシングリードをそれぞれの遺伝子にマッピングし、潜在的可変ゲノムにおける遺伝子の有無を検討した。
oprDのアンプリコンシークエンス
oprD遺伝子のアンプリコンシークエンシングは、この患者の肺と腸から入手できた全gDNAサンプルの分離配列決定で観察された2つの重要なoprD変異の存在を定量するために実施された。ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit（Zymo Research, CA USA）を用いて、ETAおよび肛門周囲スワブサンプルからDNAを抽出した。
これらの抽出されたgDNAサンプルについて、oprD遺伝子（産物長1489bp）を増幅し、サンプル固有のDNAバーコードを付加するバーコード付きプライマーを用いたPCR増幅戦略がとられた71。これは、Q5 High-Fidelity Master Mix (New England BioLabs) を用い、補足表271に示す12 ntのバーコードを含むユニバーサルリバースプライマーとサンプル特異的フォワードプライマーを用いたPCRで行った。温度プロファイルは、98 ℃ 30秒、98 ℃ 10秒、70 ℃ 30秒、72 ℃ 40秒を30サイクル、その後72 ℃ 2分の最終伸長とした。バーコード付きのoprD PCR産物をプールし、FLO-MIN106フローセルとSQK-LSK109 Ligation Sequencing Kitを用いてOxford nanopore MinIONプラットフォームでシークエンシングを行った。アンプリコンシーケンスのraw readをguppy v. 0.0.0 + 7969d57でベースコールした。この結果、163,766リードが得られ、推定リード長N50は2.64kbであった。バーコード配列の2/12シーケンスエラー、下流および上流4-merの最大1エラーを許容してデータをデマルチプレックスした。各リードの遺伝子型を同定するために、変異塩基とその下流および上流5塩基を含む11-merの配列を検索した。この保守的なアプローチにより、32-43%のリードを回収することができた（補足表3）。
サイトカイン測定
ETAをブレンドした後、0.5 gのサンプルをSputolysin (Merck, Overijse, Belgium) で1：1に希釈し、ボルテックスし、室温で15分間インキュベートした。その後、サンプルを2000×gで5分間、室温で遠心分離した。上清は、さらに処理するまで-80℃で保存した。インターロイキン（IL-）4、IL-33、IL-22、IL-8およびフラクタルカインのレベルは、Mesoscale Discoveryプラットフォーム（Rockville、MD、USA）を用いて、製造者の説明書に従って測定された。簡単に言うと、プレートに捕捉抗体をコーティングし、室温で振とう培養を1時間行い、その後プレートを洗い流した。サンプルをロードし、1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、検出抗体でインキュベートした。最終洗浄を行い、MSDリーディングバッファー2xを適用した後、QuickPlex SQ 120 (Rockville, MD, USA) でプレートを読み取った。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryでご覧いただけます。
データの利用可能性
本研究の一環としてこの患者について分析されたすべての臨床データは、この論文に含まれている。分離菌は、ASPIRE研究委員会の許可を得て、研究用として対応する著者からMTAで入手することができる。ソースデータは本論文とともに提供され、Oxford Research Archive for Dataに寄託された（"DOI: 10.5287/bodleian:r1ekRa9wE" [https://doi.org/10.5287/bodleian:r1ekRa9wE] ）。
本研究で生成されたすべての配列決定データは、NCBI short-read archive ("PRJNA802704") に寄託されており、分離株に関するすべてのデータは以下で見ることができる。「SRR17868883」、「SRR17868884」、「SRR17868885」、「SRR17868886」、「SRR17868887」、「SRR17868888」、「SRR17868889」。"srr17868890"、"srr17868891"、"srr17868892"、"srr17868893"、"srr17868894"、"srr17868895"、 "srr17868896", "srr17868897", "srr17868898", "srr17868899", "srr17868900", "srr17868901", "srr17868902", "srr17868903", "srr17868904", "srr17868905", "srr17868906", "srr17868907", "srr17868908", "srr17868909",, "SRR17868910"、"SRR17868911"、"SRR17868912"、"SRR17868913"、"SRR17868914"、"SRR17868915"、"SRR17868916", "SRR17868917"、"SRR17868918"、"SRR17868919"、"SRR17868920"、"SRR17868921"、"SRR17868922"、"SRR17868923" 「SRR17868924", "SRR17868925", "SRR17868926", "SRR17868927", "SRR17868928", "SRR17868929", "SRR17868930", "SRR17868931", "SRR17868932", "SRR17868933", "SRR17868934" ソースデータは本紙で提供されるものです。
コードの公開
解析に使用したコードはGithubで公開されています["https://github.com/juliofdiaz/Wheatley_DiazCaballero_etal"]。
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謝辞
本研究は、Wellcome Trust Grant (106918/Z/15/Z) および Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking による COMBACTE-MAGNET (Combatting Bacterial Resistance in Europe-Molecules against Gram-negative Infections, grant agreement no. 115737) と COMBACTE-NET (Combatting Bacterial Resistance in Europe-Networks, grant agreement no. 115523) をリソースとして、欧州連合第7次枠組みプログラム (FP7/2007-2013) からの資金援助と EFPIA 企業からの現物出資で構成されています。イルミナ配列データの作成と初期処理については、Oxford Genomics Center（Wellcome Trust Grant 203141/Z/16/Zの助成による）に感謝します。Hospital Universitari Germans Trias i Pujolでこのプロジェクトに貢献した地元のASPIRE ICU研究チームと、プロジェクトに協力したWP3Aワーキンググループに感謝します。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Rachel M. Wheatley, Julio Diaz Caballero.
著者と所属
オックスフォード大学生物学部、英国、オックスフォード
Rachel M. Wheatley、Julio Diaz Caballero、Liam P. Shaw、Natalia Kapel & R. Craig MacLean
アントワープ大学医学部・ワクチン・感染症研究所・医療微生物学研究室（ベルギー・ウィルリク
Thomas E. van der Schalk、Leen Timbermont、Samir Kumar-Singh、Surbhi Malhotra-Kumar
アントワープ大学医学部細胞生物学・組織学研究室分子病理学グループ、Wilrijk、ベルギー
Fien H. R. De Winter & Samir Kumar-Singh
ユトレヒト大学ユトレヒト医療センター・健康科学・プライマリーケアセンター（オランダ・ユトレヒト
クラウディア・レカナティーニ、ヤン・クルイトマンス、クリスティーナ・プラット-アイメリッヒ
アストラゼネカ社バイオ医薬品研究開発部微生物科学課（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ市
マーク・エッサー
微生物学部門、大学病院、大学病院トリアス・イ・プジョル研究所、CIBER呼吸器疾患研究所、バルセロナ自治大学、バダロナ、スペイン
アリシア・ラコマ＆クリスティーナ・プラット-アイメリッヒ
スペイン・パルマ・デ・マヨルカ、イレス・バレアス衛生研究所（IdISBa）、大学病院、微生物学研究室
アントニオ・オリバー
寄稿
R.M.W., J.D.C., T.E.vdS., F.H.R.D.W., L.P.S., N.K., C.R., L.T. and A.L. がデータの取得と解析に貢献した。J.K., M.E., C.P.A., A.O., S.K.S., S.M.K. and R.C.M. はプロジェクトの構想および試験デザインに貢献した。R.M.W., J.D.C., S.K.S., S.M.K. and R.C.M. wrote and revised the manuscript.R.M.W.は原稿を執筆した。
連絡先
R. Craig MacLeanに連絡する。
倫理的宣言
競合する利益
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
査読
査読情報
Nature Communicationsは、Camilo Barbosaと他の匿名査読者の査読に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。
補足情報
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この記事の引用
Wheatley, R.M., Caballero, J.D., van der Schalk, T.E. et al. Gut to lung translocation and antibiotic mediated selection shape the dynamics of Pseudomonas aeruginosa in an ICU patient.腸から肺への移行と抗生物質による選択がICU患者における緑膿菌の動態を形成している。Nat Commun 13, 6523 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41467-022-34101-2。
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受付終了
2022年1月17日
受理済
2022年10月13日
掲載
2022年11月22日
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