過敏性腸症候群とその腸内習慣サブタイプにおける腸内細菌叢のマルチオミクスプロファイル

オープンアクセス
公開日：2023年1月10日
過敏性腸症候群とその腸内習慣サブタイプにおける腸内細菌叢のマルチオミクスプロファイル

Multi-omics profiles of the intestinal microbiome in irritable bowel syndrome and its bowel habit subtypes - Microbiome

過敏性腸症候群は腸内細菌叢の異常を特徴とし、その結果、メタボロームも異常を示す。
🦠⬆️Bacteroides dorei, Actinomyces
🧪⬆️チラミン、⬇️ゲンチサテ＆ヒドロシンナメート
🥦⬆️発酵性炭水化物の利用能力向上
💩C🆚Dの違い

Jonathan P. Jacobs, Venu Lagishetty, ...Emeran A. Mayer 著者を表示する
Microbiome 11巻 記事番号：5 (2023) この記事を引用する

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指標詳細

概要
背景
過敏性腸症候群（IBS）は一般的な消化器疾患であり、腸内細菌叢の変化が関与していると考えられているが、強固な微生物シグネチャーを同定することは困難であった。先行研究では主に組成に着目しているため、メタトランススクリプトミクスとメタボロミクスの両方を組み込んだ微生物機能のマルチオミクス評価により、IBSとそのサブタイプの微生物プロファイルをさらに明確にできると仮定した。

研究方法
IBS患者318名と健常対照者177名を含む、人種・民族の異なる495名のコホートから糞便サンプルを採取し、16S rRNA遺伝子配列解析（n = 486）、メタトランススクリプトミクス（n = 327）、アンターゲットメタボロミクス（n = 368）により解析を行った。年齢、性別、人種／民族、BMI、食事、HAD-Anxietyを組み込んだ多変量モデルにより、IBSにおいて有意に豊富な微生物、予測遺伝子、転写産物、代謝産物が同定された。転写産物/遺伝子比と微生物代謝モデリングにより、ゲノム間機能関係を評価した。差分特徴量を用いてランダムフォレスト分類法を構築した。

結果
IBSは、16S rRNAシーケンスおよびメタトランススクリプトミクスによるマイクロバイオーム組成のグローバルな変化と、予測メタゲノミクス、メタトランススクリプトミクス、およびメタボロミクスによるマイクロバイオーム機能の変化と関連していた。年齢、性別、人種／民族、BMI、食事、不安を調整した結果、IBSはBacteroides doreiなどの細菌分類群の存在量の差、チラミンの増加、ゲンチサートとヒドロシンナメートなどの代謝物の減少、フラクトオリゴ糖とポリオール利用に関わる転写物の増加と関連していた。さらにIBSでは、フルクトースやグルカンの代謝に関わる酵素や、糖質発酵のコハク酸経路の転写が上昇することが示された。IBSのマルチオミクス分類法は、個々のデータセットを用いた分類法よりも有意に高い精度（AUC 0.82）を示した。下痢型IBS（IBS-D）は、便秘型IBS（IBS-C）と比較して、胆汁酸、ポリアミン、コハク酸経路中間体（リンゴ酸、フマル酸）、果糖、マンノース、ポリオール代謝に関わる転写物の増加などメタトランスコードームとメタボロームのシフトを示した。代謝物および遺伝子正規化転写産物を組み込んだ分類法は、高い精度（AUC 0.86）でIBS-DとIBS-Cを区別した。

結論
IBSは、発酵性糖質を利用する能力の向上を示すマルチオミクス微生物シグネチャー（このエネルギー源を制限する食事の臨床的有用性と一致）により特徴づけられるが、これにはこれまで認識されていなかった複数の代謝産物および代謝経路も含まれていた。これらの知見は、IBSにおけるマイクロバイオームを調査し、マイクロバイオーム関連の新規治療標的を同定するために、微生物機能の統合的な評価の必要性を支持するものである。

ビデオ アブストラクト

はじめに
過敏性腸症候群（IBS）は、最も一般的な消化器疾患であり、米国人口の10～15％が罹患しています[1]。IBSは現在、解剖学的、炎症性、生化学的病態が検出されない、腸の習慣変化に伴う再発性腹痛などの症状基準によって定義されています[2]。IBSにおける腸内細菌叢の役割には大きな関心が持たれている。これは、一部の患者における消化管感染後のIBS症状の発現、IBS症状と食事との関係、および腸管運動および内臓感受性に対する腸内細菌叢の影響によって裏付けられている[3]。さらに、IBS患者からげっ歯類への微生物叢の移植は、レシピエント動物に腸管通過性および内臓感受性に変化を与えることが報告されている[4, 5]。

強い科学的根拠があり、リファキシミンやFODMAPS食などマイクロバイオームを介して作用すると考えられる介入により胃腸の症状が改善するにもかかわらず、既存のヒトマイクロバイオーム関連研究では様々な結果が示されている。16S rRNA遺伝子配列またはショットガン・メタゲノミクスによるマイクロバイオーム組成の大規模研究では、IBSとの多様性の変化や分類学的関連が最小限の場合もあれば、研究間で一貫性のない多様性の減少や分類学的移動を報告しているものもある [6,7,8,9,10]．最近の研究では、微生物の遺伝子量によって機能的可能性を評価するショットガン・メタゲノミクスや、糞便中に検出される細菌の代謝産物を評価するメタボロミクスによるマイクロバイオームの機能的特徴付けに注目が集まっている[7, 11, 12, 13, 14, 15, 16]。これらの研究では、遺伝子量や代謝産物の有意な変化が報告されていますが、その具体的な特徴は研究間で一貫しているとは言えません。全体として、炎症性腸疾患などの他の消化器疾患とは異なり、IBS診断のための強固な組成的または機能的マイクロバイオームシグネチャーは出現していない[17]。これは、IBSの臨床的定義のばらつき、研究間の人口統計学的不均一性、マイクロバイオームに影響を与える交絡因子、IBSの表現型サブセット間の差異（一部の研究では、特定の腸内習慣サブタイプのみが対照群と比較して違いを示すと主張している）、細菌遺伝子量または便中代謝物測定のみからの細菌代謝の推測の難しさを反映していると思われる。

IBSにおける腸内細菌の機能的特性についてさらなる洞察を得るため、我々は、腸内細菌群のマルチオミクス解析のために、318人のIBS患者と177人の健常対照者からなる多様でよく表現型の横断的コホートを構築した。これは、16S rRNA遺伝子配列決定による組成評価と、メタトランススクリプトミクスと糞便メタボロミクスの組み合わせによる機能評価を包含するものである。我々は、マイクロバイオームに影響を与える複数の共変量を調整した後、細菌の転写物およびマイクロバイオーム関連代謝物の差から得られる機能的シグネチャーによってIBSを健常対照群と強固に区別できること、およびIBS腸癖サブタイプも同様にマルチオミクス機能シグネチャーによって区別できることを見いだした。

研究方法
参加者
IBS患者275名と健常対照者177名をロサンゼルス地域から地域広告で募集し、さらにIBS患者43名をバッファロー地域から認知行動療法に関する研究で募集した[18]。IBS患者は、18歳以上で、Rome III基準 [19]によりIBSと診断された場合に適格とされた。IBS症状を呈する一因となりうる器質的な消化器疾患を伴っている場合、過去5年間に悪性腫瘍がある場合、肥満度（BMI）が35以上の場合、評価前2週間以内に消化管感染症を報告した場合、評価前12週間に腸感受性の抗生物質を使用した場合は参加候補から除外された。参加者は、糞便サンプルの提供、人口統計学的および医学的アンケートに回答するよう求められた。食事パターンは、我々が以前に検証した食事パターンフォームを使用して評価した[20]。心理学的および症状に関する機器には、Hospital Anxiety and Depression（HAD）、State-Trait Anxiety Inventory（STAI）、Visceral Sensitivity Index（VSI）-消化器症状特異的不安の指標、Pennebaker Inventory of Limbic Languidness（PILL）-ストレス過敏性身体的苦情の頻度の評価、が含まれていた。IBS症状重症度評価尺度（IBS-SSS）は、疼痛、膨満感、腸機能障害、QOLを含むIBS症状の重症度を測定するために使用された[21]。本研究は、UCLAとUniversity at BuffaloのInstitutional Review Boardの承認を得ている。

新鮮な冷凍便サンプルの採取
参加者には家庭用採便キットが提供され、採便後24-48時間以内に研究コーディネーターに預けるか宅配便で受け取るまで、採便後すぐに冷凍庫で保管するよう依頼された。その後、研究コーディネーターはサンプルを研究室の冷凍庫に移し、-80℃で長期保存した。凍結した糞便サンプルは、液体窒素下で乳鉢と乳棒で粗粉末にした後、分注した。

糞便中の16S rRNA遺伝子配列の決定
ビーズビートによるDNA抽出と16S rRNA遺伝子のV4超可変領域の増幅は、我々の発表したプロトコルに従って行った[22, 23]。シーケンスライブラリーは、Illumina HiSeq 2500で2×150または2×250のシーケンスを行い、サンプルあたりの平均深度67,801のマージされた配列とした。2つのシーケンスバッチ（292および195サンプル）の各サンプルは、DADA2 Rパッケージを使用して別々に処理し、アンプリコン配列変異（ASV）のテーブルを生成し、それをマージした[24]。SILVA 138.1データベースを使用して、11,429個のASVに分類を割り当てた。最終的なASVテーブルをPICRUSt2に入力し、16S配列に最も近い参照ゲノムに基づいてKEGGオーソログ（KO）として注釈された細菌遺伝子ファミリーの存在量を予測した[25, 26]。

糞便メタトランススクリプトミクス
糞便のアリコートをViome Life Sciences, Inc.に送り、RNA抽出、メタトランスクリプトミクス配列決定、およびアノテーションを、以前に記述したように行った[27]。簡単に言えば、ビーズによるRNA抽出、DNaseによるDNA分解、サブトラクティブハイブリダイゼーションによる16S/23SリボソームRNAの枯渇が行われた。得られたRNAからシーケンスライブラリを調製し、Illumina NovaSeqで150×2ペアエンドシーケンスを行った。バクテリア、菌類、ウイルス、バクテリオファージなど898の分類群が同定された。機能アノテーションは、シーケンシングリードを MetaHIT コンソーシアムの統合遺伝子カタログにアライメントし、これらの遺伝子を KEGG データベースにマッピングすることにより行いました。

糞便メタボロミクス
糞便のアリコートを Metabolon, Inc.に発送し、同社のグローバルな HD4 メタボロミクスプラットフォームで解析しました。サンプルは3つのバッチに分けられ、最も大きなバッチには250サンプルが含まれ、追加のバッチには75サンプルと43サンプルが含まれました。3300以上の標準物質のMS/MSスペクトルデータを含むMetabolon独自のライブラリとスペクトルの特徴を比較することにより、化合物を同定しました。各バッチにおいて、30%以上のサンプルで検出されたフィーチャーが保持されました。欠損データのインプットは、Metabolonデータセットについて以前に説明したように、k-nearest neighborアルゴリズム（kNN、k = 10）を使用して各バッチについて個別に実行されました[29]。その後、Rのsvaパッケージで実装されたリファレンスベースのComBatを使用して、最大のバッチをリファレンスとして使用し、IBS対HCを共変数として3バッチを結合しました。3バッチすべてで30%以上の検出率を持つ601代謝物のみが保持されました[30,31,32]。メタボロミクスデータは、その後、下流の分析に先立ち、Rのvsn2パッケージによってlog2変換と正規化が行われた[33]。

アルファおよびベータ多様性解析
Rのphyloseqパッケージで計算された豊かさと均等性のシャノンインデックスを使用して、微生物のアルファ多様性を未濾過16Sデータ（10,000配列/サンプルに希釈）およびメタトランススクリプトミクス分類データで評価しました[34]。有意性は、Mann-Whitney U検定と、Rのaov関数を用いて、性別、年齢、人種、BMI、食事カテゴリー、HAD-Anxietyを共変量として用いた多変量分散分析によって評価した。ベータ多様性解析は、16S組成、予測メタゲノム、メタトランススクリプトーム分類、メタトランススクリプトームKO、メタボロームの5つのデータセットすべてに対して行われた。メタボローム以外のデータセットにはブレイ・カーティス非類似度を適用し、組成データセットでないためユークリッド距離を用いた。いずれの場合も、10%未満のサンプルにしか存在しない特徴を取り除くためにデータセットをフィルタリングし、228 ASV、5370予測遺伝子、269メタトランススクリプトミクス分類群、3837転写物、601代謝物を残しました。これらの距離行列の制約付き順序付けは、Rのveganのcapscale関数で実装された距離ベースの冗長性分析（dbRDA）を使用して実施されました[35]。dbRDAのモデルは、性別、年齢、人種/民族（アフリカ系アメリカ人、アジア人、ヒスパニック、非ヒスパニック系白人、多民族）、BMI、食事カテゴリー（標準、制限的、その他）、HAD-Anxiety、バッチ（配列決定またはメタボロミクス）、IBSグループから構成されていた。HADおよび食事パターンの欠測データは、RのVIMパッケージを使用してkNNによりインピュテーションし、これらおよび他の多変量モデルにおける共変量として使用した。dbRDAの順序付けの最初の2つの制約軸上のカテゴリおよび連続変数の視覚化は、veganのenvfit関数を使用して実行された。β多様性の違いの有意性は、veganのadonis2機能で実装された順列多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて、10,000回の順列で評価された[36]。一変量モデルには、IBS群または共変量の1つ、およびバッチ（シーケンシングまたはメタボロミクス）を含め、多変量モデルには、性別、年齢、人種、BMI、食事カテゴリー、およびHAD-Anxietyも含めた。Adonis2は、モデル内の他の変数を調整した後、各変数の限界R2を計算する（すなわち、各変数の順序が最後になるように別々のモデルを実行する）「マージン」によって実行された。

豊度差検定
MaAsLin2 [37]で実装された多変量一般線形モデルを用いて、差次的存在量の微生物、遺伝子、転写産物、代謝産物を同定した。シーケンスデータは、モデルフィッティングの前に対数変換された相対的な存在量を生成するために、総和スケーリングを受けました。正規化、対数変換されたメタボロミクスデータは、それ以上の変換は行われませんでした。すべてのデータセットは、10%以上のサンプルに存在する特徴を保持するようにフィルタリングされました。P値は、Benjamini-Hochberg法により多重仮説検定のために調整し、q値を生成した。MaAsLin2[37]で推奨されているように、すべての解析で有意性はq < 0.25に設定された。機能アノテーションは、Metabolonが提供するKEGGパスウェイ割り当てと代謝物カテゴリを使用して行われました。

ゲノム間比較
データセットのグローバルな比較は、R の vegan を使用して Bray-Curtis 非類似度 (メタボロミクスではユークリッド距離) の距離行列に Mantel 検定を適用して行いました。データセット間のグローバルな類似性の視覚化は、veganのProcrustesを使用して、1つのdbRDA ordinationを回転させ、別のものに重ね合わせることによって行われました。

RNAとDNAの分類学的表現の比較は、16S rRNA遺伝子シーケンスによる分類学的解像度の制限を考慮して、メタトランススクリプトームと16Sデータ間の分類群の一致を最大化するために属レベルで行われた。各属について、16Sとメタトランススクリプトームの両データで存在量が0でないサンプルについて相対存在量の比率を計算した。一方のデータセットで属が検出されなかった場合、比率は計算されなかった。同じ方法で、転写産物の相対量と予測される遺伝子の相対量を比較し、RNA/DNA比を算出した。属とKOのRNA/DNA比は、その特徴がDNAとRNAサンプルの両方で25%以上検出された場合のみ、さらに解析された。対数変換された比率はMaAsLin2の多変量一般線形モデルで解析され、共変量で調整した後のRNA/DNA比率におけるIBSとHC間の統計的有意差（q < 0.25）が確認された。このアプローチは、以前にシミュレーションと実際の糞便データセットに適用され、差次的発現解析に適していることが示されている[38]。欠測値はMaAsLin2でのモデルフィッティングのために削除し、ランダムフォレスト分類器への入力のためにkNNによってインピュテーションした。

差次的に発現したKOの経路濃縮分析は、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ソフトウェア[39]を用いて行った。q値は、IBSまたはIBS腸習慣との関連の強さでKOをランク付けするために用いられ、KEGGパスウェイへのKO割り当てが遺伝子セットとして入力された。有意性は、古典的な濃縮統計量、10,000回の並べ替え、およびp < 0.05の閾値を使用して計算された。

微生物代謝に関連する代謝産物の同定
MIMOSA2を用いて代謝モデリングを行い、メタトランススクリプトームと予測されるメタゲノムから、Community-wide Metabolic Potential (CMP) スコア [40, 41]で要約されるコミュニティ全体の代謝出力を推定した。このスコアは、メタゲノムまたはメタトランススクリプトームが代謝物を生成または枯渇させる相対的な能力を表す代用指標です。MIMOSA2 では、各代謝物の CMP スコアとその代謝物の測定値を回帰し、微生物代謝能と有意な正の相関を持つ代謝物のサブセットを特定します。推奨閾値である p < 0.10 を使用しました。

ランダムフォレスト分類法
データセットを、IBS被験者（またはBHサブタイプ）の割合が等しいトレーニングセットとテストセットに60％/40％分割し、caret Rパッケージ[42]を使用してランダムフォレスト分類器を構築した。この分類器には、差分的に多く含まれる特徴が入力された。各特徴の分類器精度への寄与は、変数重要度スコアで評価され、これは、その変数が並べ替えられたときの分類器精度の減少を表している。学習データを用いた最初のモデル反復で重要度スコア > 2 であった素性は，最終的なモデルに保持された．得られた分類器の精度は，テストデータを用いて，受信者動作特性曲線下面積（AUC）を計算することによって決定された．分類器の性能の違いの有意性は，pROC R パッケージの roc.test のブートストラップ法を用いて評価された．

結果
IBSは、微生物分類群、転写産物、代謝産物のシフトと関連している
IBS患者318名と健常対照者177名を含む495名の被験者が、糞便サンプルの提供と、人口統計学、食事、心理学アンケートに回答した（表1）。IBS患者とHCの年齢差はなかったが（中央値30 vs. 29歳）、IBS患者の方が女性比率が高かった（77 vs. 60％）。コホートは人種的に多様であり、被験者の56％が米国における人種的／民族的マイノリティグループに属していた。IBS群とHC群では人種／民族構成が異なり、IBS群では非ヒスパニック系白人の割合が増え、他の人種／民族の割合がそれに伴って減少した。学歴については両群間に統計的な有意差はなく、被験者の大多数は大学卒業者であった。食事パターンは、我々のグループがIBS研究のために最近確立したパラダイムを用いて、3つのカテゴリーのいずれかに分類した：標準食、制限食（グルテンフリー、ラクトースフリー、FODMAPS食を含む）、その他（排除的と考えられるがIBS関連制限食パターンのいずれでもない食事パターン）[20]. 我々の先行研究結果と一致して、IBS患者は制限食、特にグルテンフリー食とラクトースフリー食の頻度が高く（それぞれ15%対3%、13%対4%）、それに対応して標準食またはモディファイドアメリカン食の頻度が減少していた（追加ファイル1: 表 S1）。参加者はまた、うつ病、現在の不安、特性不安をそれぞれ測定するHADとSTAIを含む心理学的質問票を記入した。3つの質問項目はすべて、HCと比較してIBSで高いスコアを示した。予想されたように、IBS患者は内臓過敏症（VSI）およびストレス過敏性身体愁訴（PILL）のスコアが著しく高いことが示された。IBS患者のほぼ同数が下痢優位（IBS-D、38%）と便秘優位（IBS-C、35%）で、ほとんどが症状の重症度が中程度（IBS-SSS 175-300、49%）または重度（IBS-SSS 301-500、27%）であった。

表1 コホート人口統計データ
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糞便サンプルは、16S rRNA遺伝子配列決定（n = 486）、メタトランススクリプトミクス配列決定（n = 327）、および非標的グローバルメタボロミクス（n = 368）による解析を受けた。微生物組成は、16S rRNA遺伝子量と、転写活性によって重み付けされた組成を反映する、配列決定された転写産物の分類学的割り当てによって評価された。アルファ多様性（すなわち、サンプル内の多様性）は、豊かさと均等性のシャノンインデックスを使用してIBSとHCの間で比較された。両組成データセットとも、ノンパラメトリック検定および多変量線形モデルにより、Shannon指数に有意な差は見られなかった（Fig. 1A）。一方、Bray-Curtis非類似度を用いたβ多様性解析（サンプル間の多様性）では、16S rRNAプロファイルとメタトランススクリプトミクスによる分類法で、IBSとHCの間に統計的に有意な組成の違いが示された（Fig. 1B）。また、年齢、性別、人種、BMI、食事カテゴリー、HAD-Anxiety、HAD-Depressionなど、多くの共変量が1つまたは両方のデータセットで微生物組成と有意に関連していることが分かった。不安とうつ病の間に強い相関があり、HAD-AnxietyではIBSとHCの差が大きいことから、気分とマイクロバイオームの関連性を表す共変量として選択された。これらの共変量を調整した多変量解析においても、年齢や人種を含むいくつかの共変量と同様に、IBSは16S rRNAおよびメタトランススクリプトミクス配列決定による微生物組成と有意に関連していた（図1B, C）。

図1
図1
IBSは、マイクロバイオームの組成と機能のグローバルな変化と関連している。A 16S rRNAシーケンスおよびメタトランススクリプトミクスデータについて、IBS被験者および健常対照者（HC）の糞便サンプルにおける微生物の豊かさと均等性のシャノン指数を示す。B ベータ多様性は、16S rRNA配列データ、予測メタゲノム（PM）、メタトランススクリプトミクス分類法（MT-T）、KEGGオーソロジー転写注釈（MT-KO）についてブレイ・カーティス非類似度によって評価された。正規化メタボロミクスデータ（MET）にはユークリッド距離を使用した。これら5つのデータセットにおける臨床的および人口統計的形質の変動への寄与は、単変量（左）および多変量（右）のPERMANOVAから算出したR2によって決定された。多変量解析モデルのR2は、他の変数を考慮した後の残りの説明される分散を反映している。すべてのPERMANOVA解析は、共変量としてバッチ（シーケンシングまたはメタボロミクス）を含んでいます。差の有意性は並べ替えによって計算され、色で示されている。 C）距離ベースの冗長性分析（dbRDA）は、IBS状態、年齢、性別、人種／民族、BMI、食事カテゴリー、およびHAD-Anxiety（HAD-A）に関連するベータ多様性の変動を可視化するために実行された。IBSグループと統計的に有意なカテゴリ変数は、各カテゴリのセントロイドを示す文字または記号で示す。統計的に有意な連続変数は、すべてのサンプルのセントロイドを起点とする矢印で示し、長さは関連性の強さに比例する。F = 女性、M = 男性、A = アジア人、B = アフリカ系アメリカ人、H = ヒスパニック、W = 非ヒスパニック系白人、R = 多人種

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次に、多変量一般線形モデルを用いて、年齢、性別、人種、BMI、食事、HAD-Anxietyなど、マイクロバイオームに影響を及ぼすとベータ多様性解析で同定された共変量で調整した後、HCと比較してIBSで有意差のある微生物分類群を同定した。IBSでは、Alistipes ihumii、Bacteroides dorei、Actinomyces odontolyticus、およびIntestinibacter bartlettiiやRoumboutsia ilealisなどのFirmicutes門の複数のメンバーの存在量が増加することが特徴であることが分かった（図2A）。IBSでは、Facealibacterium prausnitziiとBacteroides thetaiotamicronが減少していることが示された。メタトランススクリプトームの分類学的プロファイルを評価したところ、B. doreiのみが16S配列決定の結果と一致する変化を示した（Fig. 2B）。IBSで転写量が増加した細菌は、Eggerthella lenta、Bacteroides 2種（B. doreiとB. fluxus）、Phascolarctobacterium succinatutens、Blautia hydrogenotrophica、Plevotella timonsensis、Clostridium hylemonae、Catonella morbi、未確認の Actinomyces一種などであった。IBSでは、Bilophila wadsworthia、Roseburia inulinivorans、Bifidobacterium animals、Bacteroides 2種（B. plebeiusとB. barnesiae）の転写量が減少していた。

図2
図2
IBSは、フラクトオリゴ糖の利用に関与する遺伝子を含む細菌分類群、代謝産物、転写産物の量の変化によって特徴づけられる。A, B バッチ、年齢、性別、人種/民族、BMI、食事カテゴリー、HAD-Aで調整した多変量モデルで、IBS被験者とHCの間で有意に豊富な細菌分類群（q < 0.25）が同定された。結果は、A 16S rRNA配列データ（n = 486）およびBメタトランススクリプトミクスデータ（n = 327）について示されており、太字は単一の重複する分類群（B. dorei）を示している。効果量はfold change (FC)のlog2として表した。色は動物門を示し、点の大きさはタクソンの存在量に比例する。棒グラフはlog2 fold change推定値の標準誤差を示す。Cグローバルアンターゲットメタボロミクス（n = 368）で検出された糞便代謝物の差次量（多変量モデルでのq < 0.25）を示し、色は機能カテゴリを表しています。太字はMIMOSA2による微生物群集の代謝能と関連した代謝物を示す。D KEGG KO番号、遺伝子記号、遺伝子名でアノテーションされた、差次的に豊富な細菌転写産物。予測されたメタゲノムでも差次的に豊富であった遺伝子の転写産物は太字で表示されている。ドットの大きさは転写産物の相対量に比例し、色は KEGG パスウェイアノテーションを表す（プロットの上に凡例あり）。

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微生物機能は、細菌の転写産物量（KEGGオーソロジー（KO）によるアノテーション）、系統的に最も近い参照ゲノムを用いて16S rRNA組成データから予測した細菌遺伝子量（予測メタゲノム）、および代謝物量によって評価された。IBSの有無は、単変量解析において、3つのデータセットすべてのβ多様性の変動と有意に関連していた（図1B）。共変量のうち、年齢、性別、人種、BMI、食事カテゴリー、HAD-Anxietyはメタトランススクリプトームおよびメタボロームと有意に関連し、年齢、人種、BMIは予測されるメタゲノムとも有意に関連した。これらの6つの共変量で調整した後も、IBSはメタトランススクリプトームおよび予測メタゲノムと有意な関連を示したが、メタボロームとの有意な関連は見られなくなった（図1B、C）。

存在量の差の検定では、IBSで存在量が増加した16の細菌転写物と存在量が減少した3つの細菌転写物が同定された（Fig. 2D）。同様の分析を、予測されたメタゲノムから差動遺伝子を同定するために行ったが、予測された存在量のKOレベルでの潜在的な不正確さを考慮して、これらはメタトランスクリプトミクスデータで見つかった差動KOを強調するためにのみ使用された[25]。D-プロリン還元酵素、1-2-ジアシルグリセロール3-グルコシルトランスフェラーゼ、フラクトオリゴ糖輸送システムの2つのコンポーネント（パーミアーゼと基質結合タンパク質）の存在量の増加など、合計4つの転写物が予測メタゲノムで一致した変化を示しました。このことは、これらの転写産物のレベルの上昇は、メタゲノム中の対応する遺伝子の存在量の違いに起因している可能性を示唆している。メタトランススクリプトームにおけるその他の顕著なシフトは、酪酸キナーゼとマンニトール（発酵性ポリオール）を取り込むためのリン酸転移酵素系の存在量の増加であった。

共変量で調整した後では、IBSはメタボロームの全体的な有意な変化と関連しなかったが、IBSは12種類の代謝物で統計的に有意な増加を示した（図2C）。そのうち、パルミチン酸やマルガリン酸などの遊離脂肪酸、胆汁酸（グリコデオキシコール酸）、N-アセチルスフィンゴシンなど9つが脂質に分類された。その他、L-ウロビリノーゲン（ビリルベンの細菌代謝産物）、3-アミノイソブチレート、チラミンなどの代謝物が上昇した。IBSでは、6種類のアミノ酸誘導体（3-メチルヒスチジン、N-アセチル-1-メチルヒスチジン、ゲンチサート、キサンツレン酸など）、アンセリン（3-メチルヒスチジンを含むジペプチド）、安息香酸および2つの関連代謝物（3-（2-ヒドロキシフェノール）プロピオン酸とヒドロシンナメート）、リボフラビンを含む14種の代謝物のレベルが減少していた。

IBSとHCを区別する、データセット間の一貫した代謝シフトを明らかにする原子間分析
5つのデータセットすべてが、IBSではHCと比較して変化を示していることから、次に、複数のデータタイプにわたって保存された組成および機能のシフトが存在するかどうかを評価した。データセットの全体的な相関はMantel検定で評価した。5つのデータセットのペアワイズ組み合わせはすべて統計的に有意な正の相関を示し、メタトランススクリプトミクスとメタボロームで最大の相関が観測された（追加ファイル1：図S1）。これらのデータセット間の有意な関連はProcrustesによって可視化され、重ね合わせたデータセットにおいてIBSとHCが分離していることが強調された。

さらに、ゲノム間の関連性を3つのカテゴリーに分けて検討した。まず、メタトランススクリプトーム（RNA）と16Sシーケンシング（DNA）から得られた微生物の存在比を評価した。これらの比率は、広く微生物の転写活性を表しています[43]。この解析は、（一貫して種の解像度を達成しない）16Sシーケンスからの分類学的割り当てとメタトランススクリプトームからの割り当てのマッチングを容易にするために、属レベルで実施されました。その結果、メタゲノム中の微生物の存在量と比較して、微生物の転写発現は桁違いに異なり、転写が活発な微生物と静止している微生物を区別することができました（図3A）。最も転写活性が高いのはVeillonella属（RNA/DNAの中央値はHCで89、IBSで114）、最も転写活性が低いのはFaecalibacterium属（RNA/DNAの中央値はHCで0.074、IBSで0.087）であることが明らかになった。IBSとHCを比較すると、2つのグループは属レベルで微生物の転写活性のパターンが類似していることがわかった（図3B）。IBSとHCの間で統計的に有意な差を示した分類群はなかった。

図3
図3
細菌の分類と機能の原子間比較により、炭水化物発酵のコハク酸経路に関与する転写産物がIBSでアップレギュレーションしていることが示された。A 両データが利用可能な322人の被験者について、16S rRNA配列データおよびメタトランススクリプトームにおける属の相対的存在量の中央値を示す散布図。B メタトランススクリプトーム（RNA）対16Sデータ（DNA）の属数比の中央値をIBS被験者とHCについてプロットしたもの。C 予測されたメタゲノムにおける遺伝子存在量の中央値と転写産物存在量の中央値との比較の散布図。D転写物/遺伝子存在比の中央値をIBS被験者とHCについてプロットしたもの。バッチ、年齢、性別、人種／民族、BMI、食事カテゴリー、およびHAD-Aで調整）HCと比較してIBSで有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた転写物を色分けしている。E 差異的に制御された転写産物において有意に濃縮された経路が同定された。これらの経路内の有意な転写物（点の色で表示）を示し、点の大きさはRNA/DNA比に比例する。棒グラフは、log2 fold change推定値の標準誤差を示す。F 炭水化物発酵のコハク酸経路。IBSで転写が増加した酵素を青色で表示。

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次に、遺伝子発現差異解析のために、転写産物量（RNA）と予測遺伝子量（DNA）の比を用いて、遺伝子正規化転写産物量を算出した。この方法は、遺伝子量と転写調節の組み合わせを反映するため、転写産物量だけでは不可能な転写のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを評価することができます。転写産物の遺伝子に対する比率は、0.1未満から1000以上まで幅広いことが分かりました(Fig. 3C)。RNA/DNA比はIBSとHCの間で高い相関があったが、共変量で調整した結果、182のKOがIBSとHCの間で異なる制御を受けていることが分かった（図3D、追加ファイル1: 表S2）。遺伝子正規化転写産物量の間で一貫した機能シフトを同定するために、パスウェイエンリッチメント解析を実施した。その結果、クエン酸サイクル、フルクトース・マンノース代謝、原核生物における炭素固定、およびアミノアシルtRNA生合成の経路が、制御された転写産物において濃縮されていることが示された（図3E）。これらの経路のうち、IBSで発現が上昇した21の転写産物が強調された。これには、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどのクエン酸サイクルの複数の主要酵素が含まれていた。炭素固定経路の転写産物には、アセチル-CoA合成酵素のほか、メチルマロニル-CoAミューターゼとメチルマロニル-CoAエピメラーゼ（短鎖脂肪酸であるプロピオン酸の生成に関与する）などがあった [44]（※1） 。これら2つの経路の転写物を合わせると、プロピオン酸への糖質発酵のためのコハク酸経路のほぼ全ての酵素を包含している（図3F）[45]。また、2-オキソグルタル酸フェレドキシン酸化還元酵素のサブユニットの転写産物も3つあった。これは、還元的トリカルボン酸サイクルにおいて、スクシニル-CoAにCO2を付加して2-オキソグルタル酸を生成し、炭素を固定化する酵素である。フルクトースおよびマンノースに関連する代謝の転写産物としては、フルクタンβ-フルクトシダーゼ（イヌリンなどのフルクタンの分解）、6-ホスホフルクトキナーゼ1（フルクトースの解糖経路への参入）、二リン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ、ホスホマンノムターゼが挙げられた。また、3つのtRNA合成酵素（グルタミニル、システイニル、トリオス）も、他の転写産物と比べて効果の大きさは小さいが、発現が増加した。

第三に、メタトランススクリプトミクスと予測メタゲノミクスから微生物代謝能をモデル化し、微生物代謝の影響を受けていると思われる糞便代謝物を同定しました。この戦略を用いて、5つの差分代謝物がマイクロバイオームと関連していた（Additional file 1: Figure S2）。このうち、IBSでレベルが上昇した代謝物は1つだけで、これはメタトランススクリプトームからの代謝ポテンシャルと関連した。減少した4つの代謝物のうち、ヒドロシンナメートについては、メタトランススクリプトームと予測メタゲノミクスの両方から、微生物の代謝ポテンシャルと有意に関連することがわかった。安息香酸塩とゲンティス酸塩は予測メタゲノムと、キサンチュレン酸塩はメタトランススクリプトームと関連した。

これら3つのゲノム間解析の結果、2つのデータセットを用いた解析により、IBSに関連する一群の特徴が明らかになった。これには、エンリッチ経路において遺伝子正規化した転写産物が異なる頻度で存在すること、メタトランススクリプトームと予測メタゲノム両方で異なる頻度で存在する転写産物、および微生物の代謝能と関連する代謝産物が異なる頻度で存在することが含まれました。これらのマルチオミクス的特徴を用いて、IBSとHCを区別するためにランダムフォレスト分類器をトレーニングしたところ、AUCが0.82となった。この性能は、単一データセットの微生物特徴を用いて構築された分類器のAUCが0.67～0.70であったことと比較して、統計的に有意に優れていました（図4）。この分類器に最も貢献した微生物特徴は、代謝物であるゲンチサテ、ヒドロシンナメート、チラミンの3つであった。その他の10個の特徴は、フラクトオリゴ糖代謝に関連する3つの転写産物（二リン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ、6-ホスホフルクトキナーゼ1、フラクトオリゴ糖輸送パーミアーゼタンパク質）であった。クエン酸サイクルに関わる3つの転写産物（ピルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸ヒドラターゼ）、グルタミニルtRNA合成酵素、D-プロリン還元酵素、1，2-ジアシルグリセロール3-グルコシルトランスフェラーゼ、メチルマロニルCoAエピメラーゼが挙げられる。

図4
図4
IBSのマルチオミクスマイクロバイオーム分類法は、単一データセットを用いた分類法と比較して、高い精度を示した。5つのデータセットで異なる量の特徴から構築したランダムフォレスト分類器のROC曲線（赤で色付け）と、マルチオミクス分類器のROC曲線（青で色付け）を比較。マルチオミクス分類器は、メタトランススクリプトームと予測されたメタゲノムの両方で差次的に豊富な転写産物、エンリッチなパスウェイで著しくアップレギュレートされた転写産物、微生物コミュニティの代謝の可能性に関連する差次的に豊富な代謝産物から構築されました。すべての分類法は、データセットの60%でトレーニングし、残りの40%のサンプルでテストしました（3つのデータタイプすべてでn = 230）。色のついた部分は ROC 曲線の 95%信頼区間を示している。マルチオミックス分類器と比較した単一データセット分類器の AUC の P 値は，ブートストラップにより算出した．B マルチオミクス分類器に含まれる特徴量について、重要度スコアを特徴量タイプ別に色分けして表示した。棒グラフの色は、HCと比較して、IBS被験者で各特徴が濃縮されているか枯渇しているかを示している。

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細菌の転写産物と代謝産物がIBSの腸内習慣のサブタイプを区別する
IBSとHCを区別する強固な微生物プロファイルを同定した後、IBSの表現型と微生物組成および機能の関係を評価した。腸内環境のサブタイプは、メタトランススクリプトミクスKOおよびメタボロミクスと有意に関連していたが、マイクロバイオーム組成や予測されるメタゲノムとは関連がなかった（図5）。内臓過敏症（VSI）、一般身体症状知覚（PILL）、IBS特異的症状重症度（IBS-SSS）は、転写物、予測遺伝子、メタボロームによるグローバルなマイクロバイオーム組成または機能のいずれとも有意な関連はなかった。

図5
図5
IBS腸管習性（BH）サブタイプはメタトランススクリプトミクスとメタボロミクスによって異なる機能プロファイルを有することがわかった。A多変量PERMONOVAモデルを用いて、バッチ、年齢、性別、人種／民族、BMI、食事カテゴリー、HAD-Aを調整し、BHサブタイプ、内臓感度（VSI）、一般身体症状知覚（PILL）、IBS重症度（IBS-SS）などIBS内の表現型の関連を5つのデータセットで評価しました。B 5つのデータセットのDbRDAプロットは、BHサブタイプおよび有意なカテゴリーまたは連続共変量に関連するベータ多様性の違いを視覚化している。F = 女性、M = 男性、A = アジア人、B = アフリカ系アメリカ人、H = ヒスパニック、W = 非ヒスパニック系白人、R = 多民族。

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IBS腸管習慣サブタイプに関連する微生物機能的特徴をさらに明確にするため、下痢優勢（IBS-D）および便秘優勢（IBS-C）サブタイプの比較に焦点を当てた。この2つのサブタイプはBHの数が最も多く、残りの2つのサブタイプ（IBS-mixed, IBS-M; IBS-unspecified, IBS-U）と比較して、より一貫したBHパターンを示している。さらに、Differential abundanceテストでは、16Sシーケンスで2つの分類群のみが、メタトランススクリプトミクスで4つの分類群が有意に異なり、2つのデータセット間で重複がなかったことから、IBS-D vs. IBS-Cの明確な分類上の特徴がないことが裏付けられた（追加ファイル1：図 S3A）。一方、メタトランススクリプトミクスによる機能評価では、多様なパスウェイに属する54の転写産物が示され、そのうち51がIBS-Dで増加した（Additional file 1: Figure S3B）。このうち、L-イジトール2-デヒドロゲナーゼ（ポリオールデヒドロゲナーゼ）、マンノース特異的リン酸化酵素系の3成分、L-フコース／アラビノースイソメラーゼ（リブロースを生成する）など、フルクトースおよびマンノース代謝経路に関わるものが多く見られました。また、D-グルタミン酸合成（グルタミン酸合成酵素とグルタミン酸ラセマーゼ）とエタノールアミン利用に関与する転写産物も濃縮されていた。これらはいずれも予測される遺伝子量の差と重ならない。

次に、IBS-DとIBS-Cにおける転写調節パターンを評価するために、遺伝子正規化転写物量の原子間解析が行われた。IBS-Dは140の転写産物のRNA/DNA比の有意なシフトと関連しており、そのうち128はIBS-Dで発現が増加した（図6、追加ファイル1: 表S3）。パスウェイ解析の結果、フルクトース・マンノース代謝、プロパン酸代謝、アミノアシルtRNA生合成、テルペノイド生合成、ペントース・グルクロン酸相互変換を含む10のパスウェイが豊富に存在することが明らかとなった。最も顕著に発現が増加した転写産物は、2-メチルシトレート合成酵素、プロパンジオールデヒドラターゼの3つのサブユニット、グリセロールデヒドロゲナーゼなどのプロピオン酸代謝に関与するものであった。フルクトースとマンノース代謝に関連する転写産物は、遺伝子量を考慮せずにメタトランススクリプトームで濃縮されたもの（マンノースホスホトランスフェラーゼ、L-イジトール2-デヒドロゲナーゼ、L-フコース／アラビノースイソメラーゼ）と、二リン酸依存性ホスホフルトキナーゼ、GDP-L-フコース合成酵素、ブタノール脱水素酵素などのその他のもので、アップレギュレートされている。

図6
図6
IBS-Dは、プロポノエート代謝、テルペノイド生合成、フルクトース・マンノース代謝、解糖に関わる遺伝子の転写がIBS-Cと比較して増加することが特徴である。A IBS-DとIBS-Cで制御が異なる転写産物に有意に濃縮された経路が特定された。これらの経路内の有意な転写物（バッチ、年齢、性別、人種/民族、BMI、食事カテゴリー、HAD-Aで調整したq < 0.25）を示し、色は経路を、点のサイズはRNA/DNA比に比例していることを示す。棒グラフはlog2 fold change推定値の標準誤差を示す。IBS-DとIBS-Cの両データを持つ205人の転写産物/遺伝子存在比をプロットした。IBS-Cと比較してIBS-Dで有意に発現が増加または減少した転写産物は色分けされている。

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IBS-DとIBS-Cにおけるマイクロバイオームの機能的なシフトと一致して、46種類の代謝物が異なっていた（Additional file 1: Figure S3C）。これには、2種類の胆汁酸（コール酸およびイソイソデオキシコール酸）、アミノ酸発酵のポリアミン生成物（カダベリン、N-アセチルカダベリン、N-アセチルプトレスシン）、糖質（マンノース、グルコース、リブロース、グルクロン酸、リボース）、クエン酸サイクルの中間体（リンゴ酸、フマル酸）およびヌクレオチド（ヒポキサンチン、チミジン、2'-デオキシシチジン）レベルが上昇していた。IBS-Dでは、脂肪酸（ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸）、食品成分（カロテンジオール、フィタン酸、ジガラクチュロン酸）、フェニル酢酸、細菌代謝物P-クレゾールおよびエンテロラクトンが減少していた。これらの代謝物のうち、フマル酸とヒポキサンチンはメタトランススクリプトームと予測メタゲノムの両方によって微生物の代謝能と有意に関連し、グルコースとニコチン酸はメタトランススクリプトームと、コラート、カダベリン、グルクロン酸、チミジン、フェニルアセテートは予測メタゲノムと関連しました（追加ファイル1：図 S2）。

次に、差分転写物、代謝物、およびマルチオミクス特徴（微生物代謝能と有意に関連する遺伝子正規化転写物量と差分代謝物）のIBS-DとIBS-Cの鑑別能力を評価した。マルチオミクス分類器はAUC 0.86と最も高い性能を示し、AUC 0.65にとどまった予測メタゲノムよりも有意に高い性能を示した（図7A）。メタトランススクリプトミクスのKOと代謝物から構築した分類器はそれぞれAUC 0.79で、マルチオミクス分類器と有意差はなかった。ランダムフォレスト分類器は、豊富な分類群がないため、微生物組成（16Sまたはメタトランススクリプトミクス分類法）を用いて構築されなかった。メタトランススクリプトミクス分類法では、エタノールアミン利用タンパク質、プロパンジオールデヒドラターゼ、ナトリウム/プロリンシンポーター、N-アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼなどの転写産物が含まれていました（図7B）。メタボロミクス分類器には、アミノ酸発酵の3つの差分生成物（カダベリン、N-アセチルカダベリン、N-アセチルプトレスシン）、リンゴ酸、脂肪酸（ミトリス酸、2-パルミトイルグリセロール）、ジガラクチュロン酸（ペクチン分解の生成物）すべてが組み込まれていました（Fig. 7C）。マルチオミクス分類器に寄与する機能としては、フマル酸およびフルクトースとマンノースの代謝経路（二リン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ、GDP-L-フコース合成酵素）、テルペノイド生合成（イソペンテニル二リン酸δ-アイソメラーゼ。4-ヒドロキシ-3-メチルブト-2-エン-1-イル二リン酸還元酵素、4-ジホスホシチジル-2-c-メチル-d-エリスリトールキナーゼ）、ペントース・グルクロン酸相互変換（L-アラビノースイソメラーゼ）、プロピオン酸代謝（2-メチルシトレートシンターゼ、グリセロール脱水素酵素）(Fig. 7D)。7D).

図7
図7
代謝物、転写産物、転写産物/遺伝子比は、IBS-DとIBS-Cを高い精度で区別することができる。赤色で示したランダムフォレスト分類法と青色で示したマルチオミックス分類法のROC曲線を比較した。マルチオミクス分類器は、微生物コミュニティの代謝ポテンシャルに関連するエンリッチなパスウェイおよび差次代謝産物で有意に上昇した転写産物（RNA/DNA比による）から構築されたものである。すべての分類器は、データセットの60%でトレーニングされ、残りの40%のサンプルでテストされました（3つのデータタイプすべてでn = 126）。色のついた部分は ROC 曲線の 95%信頼区間を示している。P 値はブートストラップにより算出した。B-D メタトランススクリプトミクス、C メタボロミクス、D マルチオミクス分類器に含まれる特徴量の重要度スコアを示し、棒の色はIBS-Dで濃縮または枯渇した特徴量を示す。

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考察
本研究では、表現型が明確なIBSコホートにおける初の大規模メタトランススクリプトミクス解析と、これまでに行われた2つの大規模なIBS横断的グローバルメタボロミクス研究の1つの結果を紹介する[15]。16S rRNAシーケンスデータおよび予測されるメタゲノム解析と組み合わせて、5つのデータセットを解析し、微生物組成および機能の包括的なマルチオミクス評価を行いました。各データセットには、IBS 状態と有意に関連する微生物特徴が含まれていましたが、分類アルゴリズムではわずかな精度しか達成できませんでした。2つの関連データセットからの情報（例えば、メタトランススクリプトームKOと予測KO遺伝子量、代謝物、メタトランススクリプトーム代謝能）を組み込んだマルチオミクス特徴を使用すると、IBS対HCの正確な分類器を実現することができました。これは、米国の人種／民族の多様性を代表する大規模コホートにおいて、IBSが明確な微生物機能状態によって特徴づけられることを裏付けている。

IBSのマイクロバイオームでは、HCと比較して、16S相対存在量と転写表現の両方に基づいて、組成のシフトが観察された。16Sおよびメタトランススクリプトミクスの両データで一貫した所見は、IBSではこれまで報告されていないBacteroides doreiの増加であった。これは、A. odontolyticusを含む複数のActinomyces属の濃縮を記述した大規模なショットガン・メタゲノミクス研究[7]と一致するものである。16S配列解析やメタトランススクリプトミクスによって検出されたその他の種レベルの微生物シフトは、以前に大規模なショットガンメタゲノミクス研究で指摘された、Streptococcus species (S. parasanguinis), Eggerthella lenta, Blautia hydrogenotrophicaの増加、ならびにFaecalibacterium prausnitzii, Bacteroides thetaiotaomicron, およびBilophila wadsworthiaの減少が含まれている [11, 16, 23]．本研究で観察された他の分類学的シフトはこれまで報告されておらず、先行研究で報告された多くの分類群も本研究では有意ではなかった。また、いくつかの先行研究で報告されているが、他の研究では報告されていないIBSにおけるアルファ多様性の減少も観察されなかった[6,7,8,9]。これらの違いは、人種／民族構成、専門クリニックではなくコミュニティからの被験者の募集、分析手法の違いなど、我々の研究を差別化する複数の要因を反映している可能性がある。重要なことは、本研究は、IBSとHCの間で異なる、解析を混乱させる可能性のある広範な共変量を調整するために多変量解析戦略を用いた点で、多くの先行研究と異なっていたことである [7, 11, 13, 14, 15, 16]。

IBSに関連する機能的な微生物の特徴の中で、マルチオミクスIBSシグネチャーに最も貢献したのは、3つの微生物関連糞便代謝物：ゲンチサテ、ヒドロシンナメート、およびチラミンであった。これらの代謝物や、IBSとHCで異なる量の代謝物は、これまでIBSとの関連は指摘されていませんでしたが、これはおそらく、研究によってメタボロミクスのパイプラインが異なり、検出および検証される特定の代謝物に影響があるためと考えられます[13,14,15]。最も強く予測される代謝物であるゲンティセートは、ヒドロキシ安息香酸塩を含む芳香族化合物の細菌の好気性代謝における中間体です[46]。無菌マウスの血清中では検出されないが、細菌のコロニー形成により強く誘導されることが報告されている[47]。ゲンティサートは線維芽細胞増殖因子シグナルを阻害し、腫瘍の成長とそれに伴う血管新生を抑制する[48]。IBSにおけるレベル低下が、上皮のホメオスタシスと胆汁酸の調節に重要な役割を果たす腸の線維芽細胞成長因子シグナルに機能的な影響を与えるかどうかは不明である[49]。ヒドロシンナメート（3-フェニルプロピオネート）は、ポリフェノールの微生物代謝によって生成され、ヒドロシンナメートの血清レベルは、微生物のアルファ多様性と正の相関がある[50,51,52]。IBSの糞便はまた、安息香酸塩および安息香酸塩クラスの別のメンバーである3-（2-ヒドロキシフェノール）プロピオン酸のレベルの低下を示したが、これもポリフェノールの細菌代謝に由来しうる [53, 54]。これらの変化は、グローバルな食事パターンの評価では捉えられなかった、IBS患者による微生物代謝活動の変化またはポリフェノール摂取量の減少を反映している可能性がある。チラミンは、微量アミン関連受容体を介してシグナルを発する生体アミンである。細菌はチロシンからチラミンを合成することができ、無菌マウスの微生物コロニー化によって糞便中のチラミンレベルが大幅に増加し、食事によって調節される[55,56,57]。チラミンは腸管収縮、腸間膜血管拡張、腸クロム親和細胞によるセロトニン放出、腸管上皮細胞およびマクロファージによる炎症反応を誘導し、IBSの症状を促進する可能性のあるメカニズムである [58,59,60]．その他の代謝物のうち、IBSでは、以前にIBSで上昇すると報告された胆汁酸のglycodeoxycholateや複数の遊離脂肪酸を含む多くの脂質のレベルが上昇することが顕著に特徴的であった[61]。興味深いことに、IBS-DはIBS-Cと比較して遊離脂肪酸が減少していた。特にIBS-Cにおける遊離脂肪酸の増加は、食事からの大腸への輸送の増加、腸管上皮の脂質代謝の変化、または細菌の脂肪酸代謝を反映していると考えられる。腸内細菌は、脂肪酸をエネルギー獲得に利用することはできないが、遊離脂肪酸を合成する能力はあり、リン脂質の生合成に外来脂肪酸を利用すると考えられている [62, 63]。

IBSと多くの代謝物が関連し、3つの代謝物がマルチオミクス分類器に強く寄与したにもかかわらず、メタボロミクスのみの分類器のAUCは0.7と、これまでに発表された2つの大規模な糞便メタボロミクス研究 [15, 16] で報告されたものと同程度の控えめなものであった。これは、IBSにおける微生物代謝状態を正確に特徴付けるためには、代謝最終産物の測定を細菌の転写プロファイルの文脈で考慮する必要があることを裏付けている。我々は、IBSがフラクトオリゴ糖、ポリオール、グルカンの細菌の取り込みと分解に関与する転写産物のアップレギュレーションによって特徴づけられることを発見した。さらに、プロピオン酸の生産を頂点とする炭水化物発酵のコハク酸経路に関与する細菌酵素のアップレギュレーションを確認した[45]。IBSの微生物相によるこの炭水化物利用能力の増加は、IBSにおける炭水化物分解および発酵経路の増加を報告した以前の大規模ショットガンメタゲノミクス研究 [7] と一致する。さらに、最近のショットガンメタゲノミクスでは、炭水化物代謝関連遺伝子（CAZy）がIBSの症状の重症度と関連していることが報告され、IBSの病態生理における細菌の炭水化物代謝の役割をさらに裏付けている[64]。IBSにおいてコハク酸経路が炭水化物発酵に優先的に利用されることは、IBSにおける糞便中短鎖脂肪酸（SCFAs）のメタアナリシスで、他のSCFAsに比べてプロピオン酸の割合が増加していることからも支持されている [65]．これらの知見を総合すると、IBS患者の腸内細菌は、特定の発酵性炭水化物を利用する能力が増大していることが裏付けられる。IBS関連細菌がこのエネルギー源に依存していることは、発酵性炭水化物とIBS症状との臨床的関連、および発酵性オリゴ糖、二糖、単糖、ポリオールの食事摂取を制限するFODMAPSダイエットによる臨床的改善を説明しうる [66]。我々のIBSコホートではFODMAPS食の有病率は低く（2％）、FODMAPS食の有病率が高いIBS集団は同じ転写プロファイルを示さない可能性があることに留意することが重要である。

IBSの代謝的特徴の特定に加えて、我々はさらに、IBS BHサブタイプが機能的微生物プロファイルによって強固に区別されることを見いだした。IBS-Dは、コール酸およびイソイソデオキシコール酸の増加を特徴とし、これは、IBS-Cと比較してIBS-Dでコール酸レベルが増加し、IBS-Dで胆汁酸が吸収されるという先行研究報告と一致する［14, 16］。胆汁酸は大腸の塩化物分泌を誘発することで下痢を引き起こすことが知られており、IBS-Dの腸内環境の表現型に直接関与していることを裏付けている[67]。これらの胆汁酸のシフトに加えて、IBS-Dは、フルクトース、マンノース、およびポリオール代謝に関与する転写物を含む細菌のエネルギー収穫のための複数の代謝経路のアップレギュレーションによって特徴づけられた。この炭水化物利用のための装置の増加は、マンノース、グルコース、リブロース、リボースを含む複数の単糖のレベルの上昇に対応した。IBS-Dでは、フマル酸やリンゴ酸など糖質発酵のコハク酸経路の中間体も増加しており（コハク酸は有意な増加を示さず、他の中間体は検出されなかった）、IBS-Cと比較してこの経路を通るフラックスが増加していることが示唆された。IBS-Dは、1,2-プロパンジオール経路を経由してプロピオン酸を生成する代替発酵経路の構成要素の転写上昇も示した。これには、単糖からプロパンジオールの生成に関与するグリセロールデヒドロゲナーゼと同様にプロパンジオールデヒドラターゼの3つの構成要素のアップレギュレーションが含まれていた[45]。炭水化物代謝のほかに、IBS-Dは、カダベリン、N-アセチルカダベリン、N-アセチルプトレスシンを含むいくつかのポリアミンの高濃度に基づくアミノ酸異化作用の増加の証拠も示している。カダベリンとプトレスシンは、それぞれアルギニンとリジンの発酵産物であり、腸内細菌によってさらにN-アシル化を受けることができる[68, 69]。我々の知見は、IBS-Cと比較してIBS-Dでプトレスシンが上昇したと報告した先行研究と一致する[13]。さらに、IBS-Dでは、3つのエタノールアミン利用タンパク質のレベルが上昇していることが示された。エタノールアミンは、膜リン脂質であるホスファチジルエタノールアミンの分解によって放出され、主に病原性を有する腸内細菌によって代謝されることが報告されている[70]。全体として、IBS-Dにおける腸内細菌は、複数のエネルギー源の利用の増加と一致するプロフィールを示している。これらの代謝シフトがIBS-Dの症状を促進するのか、IBS-DにおけるGI運動および分泌の変化に対する腸内細菌の適応を反映しているのかは不明である [71]．注目すべきは、トリプタミンのようなIBS腸管習性のサブタイプを区別するために他の研究で報告された代謝物が、本研究では差次的に豊富ではなかったことで、前に述べた研究集団と分析戦略の違いを反映していると考えられる [14]。

本研究の強みは、大規模なコホートサイズ、多様な人種／民族グループの組み込み、IBSおよび対照被験者の広範な臨床表現型、すべての解析における関連共変量の調整、およびIBSの機能プロファイルを評価するために初めてメタトランススクリプトミクスとメタボロミクスを統合したことです。しかし、我々はいくつかの限界を認識している。対照群は、性別、BMI、人種・民族、食事などの重要なパラメータにおいて、IBS対象者と異なっていた。これらの共変数を考慮するためにかなりの努力がなされたが、交絡の残存効果を除外することはできない。この研究は横断的なデザインであり、縦断的な研究と比較して、複雑な微生物組成と機能的関係の正確な評価ができない可能性がある[14]。食事は食事パターンのアンケートで評価したが、観察された微生物プロファイルの根底にある可能性のあるポリフェノール摂取量などの栄養素の違いを捉えられない可能性がある。さらに、細菌の遺伝子量は、ショットガン・メタゲノミクスで直接評価するのではなく、16S rRNA遺伝子配列から予測した。個々の遺伝子の予測された量は、IBS またはその BH サブタイプの差異特徴として直接使用されなかったが、遺伝子正規化転写分析に組み込まれた。PICRUSt2による予測は、ショットガンメタゲノミクスデータとのスピアマン相関が0.79から0.88と報告されており、全体として頑健であることが支持されている[25]。しかし、遺伝子発現量予測の精度が低い可能性があるため、遺伝子正規化転写解析の知見を確認するためには、ショットガンメタゲノミクスを取り入れたさらなる研究が必要である。最後に、本研究で使用したグローバルメタボロミクスパイプラインはSCFAを検出しないため、転写パターンがSCFAの糞便レベルの変化と関連しているかどうかを評価することはできなかった。

結論
IBSは、細菌の転写パターンと糞便中の代謝物レベルのマルチオミクス統合から明らかになった微生物機能の組成変化と強固なシフトの両方によって特徴付けられる。IBSの代謝的特徴は、コハク酸経路を介した複数の発酵性炭水化物の利用を支持している。このことは、FODMAPS食のような、そのようなエネルギー源を排除する介入の有効性と一致する。また、チラミンなどの新規代謝経路や代謝物も同定された。これらの経路をさらに詳しく調べることで、腸内細菌がIBSの病態生理に寄与するメカニズムが明らかになり、現在のIBSの微生物指向の治療戦略の理解につながる可能性がある。さらに、IBSのBHサブタイプは強い機能分化を示し、IBSで見られる腸内習慣の変化を規定する上で微生物の代謝活性が重要な役割を果たすことが示唆された。IBSのマイクロバイオーム研究では、メタボロミクスとメタトランススクリプトミクスの両方を用いて微生物機能を統合的に評価する必要があり、症状の発生に影響を与える関連経路を特定し、マイクロバイオーム指向の介入のための新しいメカニズム上のターゲットとなり得ることが、今回の結果から支持される。

データおよび資料の利用可能性
本論文の結論を裏付ける16S rRNA遺伝子配列およびメタトランススクリプトミクスデータは、NCBI Bioprojectリポジトリ、PRJNA812699 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/812699) で入手可能である。アンターゲットメタボロミクスデータは、本論文の補足データファイルとして含まれています。

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論文

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参考文献のダウンロード

謝辞
本研究の様々な面をサポートしてくれたCathy LiuとShamir Kingに感謝します。

資金提供
JPJはVA CDA2 IK2CX001717の支援を受けた。JMLは、R01 DK096606, U01 DK077738, Office of UB Vice Provost of Research and Genomic Environment and Microbiome Researchの支援を受けた。AGはNIH補助金K23 DK106528とR03 DK121025の援助を受けた。EAMはNIHグラントR01 DK048351およびR01 DK064539の支援を受けている。この研究は、P30 DK041301およびP50 DK082370の支援も受けた。

著者情報
著者名および所属
Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

Jonathan P. Jacobs, Venu Lagishetty, Megan C. Hauer, Jennifer S. Labus, Tien S. Dong, Bruce D. Naliboff, Arpana Gupta, Kirsten Tillisch & Emeran A. Mayer, カリフォルニア大学ロサンゼルス校G.

G. Oppenheimer Center for Neurobiology of Stress and Resilience, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, Los Angeles, CA, USA

Jonathan P. Jacobs, Jennifer S. Labus, Bruce D. Naliboff, Arpana Gupta, Kirsten Tillisch & Emeran A. Mayer（ジョナサン・P・ジェイコブス、ジェニファー・S・ラバス、キルステン・ティリッシュ、エメラン・メイヤー

消化器・肝臓・非経口栄養部門、VA Greater Los Angeles Healthcare System、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

ジョナサン・P・ジェイコブス、ティエン・S・ドン

ヴィオーム・ライフサイエンス社（米国ワシントン州ベルビュー市

ライアン・トマ＆モムチロ・ヴイジッチ

米国ニューヨーク州バッファローのバッファロー大学医学部行動医学部

ジェフリー・M・ラックナー

統合医療、VAグレーターロサンゼルスヘルスケアシステム、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

Kirsten Tillisch

貢献
コンセプトとデザイン：JPJ, EAM、データ収集：VL, MH, JSL, TSD, RT, MV, BDN, JML, AG, KT、データ解析と解釈：JPJ, EAM、原稿作成：JPJ, EAM、重要な改訂：全員、統計解析：JPJ、資金入手：JSL, JML, AG, KT, EAM、試験監修：EAM。最終原稿は全著者が読み、承認した。

対応する著者
Jonathan P. JacobsまたはEmeran A. Mayerに連絡すること。

倫理的宣言
倫理的承認と参加への同意
2施設の施設審査委員会は、参加者を管理するプロトコルを承認した。UCLA (IRB#11-000069, IRB#11-002818, IRB#12-001802, IRB#14-000333, IRB#15-001591, IRB#16-000187) と University at Buffalo (IRB#030-745083) の各施設の審査委員会が、被験者に関するプロトコルを承認した。すべての被験者が参加に際してインフォームドコンセントを提供した。

論文発表の同意
該当なし。

利害関係
EAMは、Danone、Axial Biotherapeutics、Amare、Mahana Therapeutics、Pendulum、Bloom Biosciences、Seed、APC Microbiome Irelandの科学諮問委員会のメンバーである。RTとMVはViome Life Sciencesの従業員です。JPJ、VL、MH、JSL、TSD、BDN、JML、AG、KTは、開示情報を有していない。

追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、公開された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場を維持しています。

補足情報
追加ファイル1: 図S1.
データセットのすべてのペアワイズの組み合わせで有意な関連性が見られた。(A）プロクラステス分析を用いて、示されたデータセットのペアのdbRDA順序を重ね合わせた。IBSとHCのサンプルは色で示されている。 B）データセットのすべてのペアワイズの組み合わせについて、関連性のマンテル検定が行われた。すべて有意であり、色は有意水準を示す。図S2. IBS vs. HCまたはIBS-D vs. IBS-Cで差次的に豊富に存在し、代謝モデリングによって腸内細菌叢と関連付けられた代謝物。(A）予測された細菌遺伝子量から得られたコミュニティ代謝ポテンシャル（CMP）スコアと関連した代謝物を示している。361人の被験者についてメタボロミクスデータと予測メタボロミクスデータが利用可能であった。各サンプルは、そのCMPスコアと正規化された代謝物レベルのlog2によってプロットされている。破線は代謝物レベルとCMPスコアの線形回帰を表し、各プロットの右上の数値はR2を示す。(B）メタトランススクリプトームから得られたCMPスコアと関連した代謝物。メタボロミクスとメタトランススクリプトミクスのデータは234人の被験者について利用可能であった。図S3. IBS-Dは、ポリアミン、胆汁酸、グルタミン酸合成、エタノールアミン利用などの多様な機能シフトにより、IBS-Cと区別される。(A）バッチ、年齢、性別、人種/民族、BMI、食事カテゴリー、およびHAD-Aを調整した16Sシーケンス（n=312）およびメタトランススクリプトミクス（n=208）データセットにおける差次的豊富な分類群（q<0.25）。効果量は、IBS-Cと比較したIBS-Dのlog2 fold change (FC) として示されている。ドットの大きさは存在量に比例し、色は動物門を表す。棒グラフはlog2 fold change推定値の標準誤差を示す。(B) IBS-DとIBS-Cの差分転写産物。ドットの大きさは存在量に比例し、パスウェイで色分けされている。(C) グローバルメタボロミクスによりIBS-DとIBS-Cで有意に差があった代謝物（n=229）。表S1. 食事パターン。表S2. IBS vs. HCで制御された転写産物の差分。表S3. IBS-D vs. IBS-Cにおける制御された転写産物の差分。

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追加ファイル2.

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権利と許可
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Jacobs, J.P., Lagishetty, V., Hauer, M.C. et al. 過敏性腸症候群とその腸内習慣サブタイプにおける腸内マイクロバイオームのマルチオミクスプロファイル. Microbiome 11, 5 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-022-01450-5

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受付終了
2022年3月23日

受理済
2022年12月14日

公開日
2023年1月10日発行

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-022-01450-5