腸内代謝物と脳微細構造データを用いた機械学習による肥満予測モデル

2023年4月5日 15:29

オープンアクセス
公開日：2023年04月04日
腸内代謝物と脳微細構造データを用いた機械学習による肥満予測モデル

https://www.nature.com/articles/s41598-023-32713-2

ヴァディム・オサドチイ
ロシャン・バル
...
アルパナ・グプタ
作家を表示する
Scientific Reports 13巻、記事番号：5488（2023）この記事を引用する
4 Altmetric（アルトメトリック
メトリックス詳細
アブストラクト
脳-腸-微生物叢の相互作用が肥満の病因に寄与する可能性を示唆する前臨床および臨床文献が増加しています。本研究では、機械学習の手法を用いて、膨大な量の微細構造神経イメージングと糞便メタボロームデータを活用し、過体重と比較した肥満の表現型の主要なドライバーをより良く理解することを目的とする。その結果、肥満と過体重を区別するのは、腸に由来する要因もあるが、主に脳に由来する変化であることが明らかになった。我々のモデルから得られた主要な腸内代謝物のうち、アミノ酸誘導体を含む多くの代謝物は、少なくとも部分的には腸内細菌叢に由来するか影響を受けていると思われる。また、中枢神経系の拡張報酬ネットワーク以外の主要な領域が重要な差別化因子として浮上し、肥満の発症にこれまで未解明だった神経経路が関与していることが示唆されました。
はじめに
肥満の蔓延は、国内外で公衆衛生上の大きな危機として浮上している1,2。医療制度に何千億ドルものコストをかけるだけでなく、がん、内分泌疾患、筋骨格系疾患、心血管疾患による早期死亡の増加など、無数の関連する健康被害が存在する3。さらに、体重超過や体格指数（BMI）と健康上の転帰との間に用量依存的な関係があることが多くの研究で示されていることから、過体重と肥満の区別がますます重要になってきている4,5。
肥満の病態生理は依然として複雑で、特にインスリン感受性と調節の異常という背景のもと、エネルギー恒常性と腸内分泌シグナルの狂いを表し、さらに腸内の好物シグナルと反好物シグナルの絶妙なバランスの乱れを示している6,7。簡単に説明すると、グレリンなどの腸内ホルモンは空腹感や欲求を生み出し8,9、グルカゴン様ペプチド（GLP）-110やペプチドチロシン（PYY）11などのホルモンは満腹感を誘発する。腸内細菌叢などの外的要因は、この慎重に調整された恒常的なエネルギーバランスを崩す可能性があります。例えば、ヒトの腸内細菌叢に存在する芽胞形成微生物は、腸の腸内分泌細胞に影響を与え、微生物叢由来の二次胆汁酸に反応してGLP-1を多く放出したり、少なく放出したりすることがあります12。
しかし、肥満は、脳と同様に内分泌系の障害であり、特に、報酬刺激と食物を求める行動を処理する役割を担う拡張報酬ネットワークに関するものである。拡張報酬ネットワークの主要な領域には、サリエンス、実行制御、中核報酬、感覚運動、感情調節に関連するプロセスが含まれている13,14,15,16,17. 肥満に関する神経科学の研究は盛んであるが、肥満の脳が非肥満の脳とどのように異なるかを理解することにほぼ特化しており、肥満と過体重を区別する中枢神経系（CNS）の変化については研究されていない。特定の脳領域における解剖学的および機能的変化の特定に加え、最近では、脳ネットワーク特性の変化の特定に焦点が当てられている18。脳の連結性を評価するために、グラフ理論を活用して複雑なネットワーク解析が行われている。この方法では、グローバルな全脳ネットワーク19,20,21,22の中で、情報の流れに対する解剖学的および機能的寄与を定量化することができる。これまでの研究では、この方法を用いて、高BMIと正常BMIの脳内結合の間の中枢神経系の変化を調べている23,24。
計算機による厳密なアプローチが可能になったことと、圧倒的なデータ量に起因すると思われるが、過去10年間で、肥満などの複雑なヒトの疾病状態を理解するために、システムベースのアプローチを活用する研究が爆発的に増加した。このような例として、肥満を脳と腸の疾患としてとらえ、腸内細菌叢がこれらの相互作用を調節している可能性が高いと考えられています。このような脳と腸の相互作用の役割を示唆する質の高いエビデンスのほとんどは、前臨床試験や主に横断的な臨床試験によるものである25,26。肥満に対する効果的で長続きする治療法の開発は、限定的な進展にとどまっていることに留意することが重要です27,28。これは、肥満の病態生理が複雑であることに加え、神経画像と腸内代謝物のデータの両方を取り入れたシステム生物学のレンズを通して肥満を捉えることができなかったことが原因であると考えられます。近年の機械学習の進歩により、非常に大量のデータをより少数のインパクトのある特徴に抽出することができる、堅牢な予測モデルを構築することができるようになりました。ここでは、機械学習のアプローチを用いて、膨大な量の神経画像と糞便メタボロームデータを活用し、肥満と過体重の表現型の主要なドライバーをより良く理解することを目指す。
研究方法
研究参加者
サンプルは、右利きの健康な成人（18歳以上）ボランティア117名（男性36名、女性81名）で構成されました。健康診断と、修正Mini-International Neuropsychiatric Interview Plus 5.0 (MINI) (27)を含む臨床評価を実施し、重大な医学的または精神的疾患がないことを確認した。被験者は、妊娠中または授乳中、薬物乱用、腹部手術、タバコ依存（毎日タバコ半箱以上吸っている）、極度の激しい運動（週8時間以上の連続運動）、現在または過去の精神疾患、主要な医学的または神経学的状態のいずれかを理由に研究への参加を除外した。中枢神経系に干渉する薬（SSRI、NSRI、鎮静剤、抗不安剤を含むフルドーズ抗うつ剤）を服用している被験者、鎮痛剤（麻薬、オピオイド、α2-δリガンドを含む）を常用している被験者は除外しました。エストロゲンなどの女性ホルモンは脳の構造と機能に影響を与えることが知られているため、この研究では、閉経前で、月経周期の最終日の自己申告によって決定された月経周期の卵胞期にスキャンされた女性を用いた。
また、高血圧、糖尿病、メタボリックシンドロームを持つ被験者は、調査結果からの交絡効果を最小化するために、研究から除外された。同じ理由で、神経性食欲不振症や過食症などの摂食障害を持つ被験者も除外されました。解析のために、BMIカットオフ値を用いてグループを定義した：太り気味の人はBMIが25以上30未満、肥満の人はBMIが30以上である。BMIが正常な人、または低体重とみなされるBMIの人は、分析から除外した（BMI < 25）。MRIスキャンの重量制限により、400ポンドを超える被験者はいなかった。
すべての手順はヘルシンキ宣言の原則に準拠し、UCLAの研究対象者保護局の施設審査委員会の承認を得た（承認番号11-000069および12-001802）。すべての被験者が書面によるインフォームドコンセントを行った。
MRI撮影
3.0TシーメンスTrioスキャナーを使用し、全脳構造、拡散テンソル（DTI）磁気共鳴イメージングを実施した。ノイズ低減ヘッドホンが使用された。構造および拡散テンソル画像データの自動データ処理および計算ワークフローは、南カリフォルニア大学神経画像研究所（LONI）パイプライン（pipeline.loni.usc.edu）と共同で設計および実装されました。
構造的グレイマター
レジストレーションのために、各被験者から高解像度の構造画像を、磁化準備型高速取得グラディエントエコーシーケンス、繰り返し時間＝2200ms、エコー時間＝3.26ms、構造取得時間＝5m12s、スライス厚＝1mm、176スライス、256*256ボクセルマトリクス、ボクセルサイズ1mmで取得しました。
解剖学的結合性（DTI)
拡散強調MRI（DWI）は、2つの比較可能な取得プロトコルにしたがって取得された。具体的には、DWIは61または64の非直線方向で、それぞれb = 1000 s/mm2、8または1のb = 0 s/mm2画像で取得された。両プロトコルとも、TR＝9400ms、TE＝83ms、視野（FOV）＝256mm、取得マトリックスは128×128、スライス厚は2mmで、2×2×2mm3の等方性ボクセルを生成した。
MRIの前処理と品質管理
構造的グレーマター
構造的なT1画像のセグメンテーションと領域分割は、Destrieuxら31の命名法に従ってFreeSurfer 29,30を使用して行われた。この分割により、165の領域、74の両側皮質構造、7の皮質下構造、中脳、小脳のラベリングが行われた32。
解剖学的連結性（DTI)
拡散強調画像（DWI）は動きに対して補正され、各ボクセルで回転的に再配向された拡散テンソルを計算するために使用された。拡散テンソル画像は、Chiangら33に記載されているように、対数変換されたテンソルのトリリニア補間に基づいて再整列され、等方性ボクセル解像度（2×2×2mm3）に再サンプルされた。各被験者の白質結合は、TrackVis（http://trackvis.org）を用いてFiber Assignment by Continuous Tracking（FACT）アルゴリズム34により実行されたDTI繊維トラクトグラフィ32を用いて、165脳領域間で推定した。
解剖学的MRIネットワーク構築
接続マトリックス
領域分割とトラクトグラフィーの結果を組み合わせて、重み付けされた単方向の結合性マトリックスを作成した。各脳領域間の白質結合の最終的な推定値は、各領域を横断する線維路の数に基づいて決定された。そして、接続の重みは、絶対的な繊維数を、相互接続された2つの領域の個々の体積で割ったものとして表された21。
ネットワークメトリクスの計算
Graph Theory GLM toolbox (GTG) (www.nitrc.org/projects/metalab_gtg) と社内の matlab スクリプトを被験者固有の解剖学的脳ネットワークに適用し、中心性を指標とする3つの局所加重ネットワークメトリクスを算出した。ネットワークメトリクスについては、以下の通りである22,35,36,37。
中心性の指標は、大規模な脳内ネットワークにおける通信や情報の流れに対する領域の影響力の重要性を定量化する。これらの指標には、強度、betweenness centrality、eigenvector centralityが含まれる。強度は、ある脳領域が持つ接続（線維路）の数を表し、各接続の「重み」を加味して、ネットワークにおける脳領域の影響力の総量を反映する。Betweenness中心性とは、ある脳領域が他の2つの領域間の最短経路上にある度合いを表す。中継地点として機能するbetweenness centralityの高い領域は、他の領域間のコミュニケーションをコントロールするようなトポロジー的なプライミングがある38。固有ベクトル中心性は、ある脳領域が、中心性の高い（繊維路の数が多い）他の脳領域とどれだけつながっているかを反映し、ネットワークに対するその領域の全体的な影響力を示す指標である39。
便の採取と処理
糞便サンプルは液体窒素下で分注し、Metabolon社に輸送し、同社のグローバルメタボロミクスおよびバイオインフォマティクスプラットフォームで単一バッチとして処理および解析した。データは、以前に説明したように、確立されたプロトコルとソフトウェアを使用して、質量分析によってキュレーションされた40。便のサンプルは、すべて被験者のMRIから1週間以内に採取された。
機械学習モデル
各参加者の体重に関する臨床情報を用いて、バランスのとれた2値分類ラベルを定義した。
代謝物データセットと脳DTIネットワークメトリックデータセットの両方について、変数の数（それぞれ987と2156）は、サンプルサイズ117を大きく上回った。これだけの特徴量を持ち、サンプルサイズが比較的小さい機械学習モデルでは、情報量の少ない変数が含まれることが多く、モデルの分類精度が低下します。そこで、優れた分類を実現するために、RFE（Recursive Feature Elimination）と呼ばれる特徴選択技法とクロスバリデーションが利用されました。これまでの研究で、サポートベクターマシン推定器（SVM-RFE）を用いたRFEは、サンプルサイズが小さく、高次元のデータモデリングに有効であることが示されている41。
RFEはラッパー特徴選択技法であり、本質的に予測因子の逆選択を行う。最初に特徴量全体に対して線形モデルを学習させ、保持すべき特徴量のある目標値を満たすまで、繰り返し、最も重みの低い特徴量を削除する。我々は、RFEに対するモデルとして、線形カーネルを持つサポートベクターマシン（SVM）を使用しました。
本研究では、2つの異なるタイプのクロスバリデーションを使用した。K-foldクロスバリデーションは、限られたデータセットで機械学習モデルの性能を評価するために使用できる再サンプリング手順である。このプロセスでは、データセットをk個の異なる等しい大きさのサブセットに分割し、これをフォールドと呼ぶ。このk個のフォールドのうち、1個をテストデータセットとして分離し、残りのデータはトレーニング用に指定される。このプロセスをk回繰り返し、各回で異なるフォールドをテストデータとして指定する。ここでは、10倍クロスバリデーションと、1つのサンプルをテストデータとして分離し、残りをトレーニングデータとして使用することを繰り返すLOO（leave-one-out）クロスバリデーションを用いている42。
RFEで保持する特徴数の最適な目標値を決定するために、1特徴から特徴空間全体までを候補として検討した。RFEは、各候補についてLOOクロスバリデーションで実施した。テストデータの平均精度が最も高くなる特徴量を、残すべき最適な特徴量とした。
この最適な数を用いて、10 回のクロス検証で RFE を再度行い、最終的な特徴量サブセットを決定するために、投票戦略を使用した43。各フォールドで、RFEによって異なる特徴のサブセットが選択された。ある特徴がRFEで選択されるたびに、その特徴はカウント、つまり "投票 "を受けた。もし「n」が保持すべき最適な特徴数の場合、選択された特徴の最終的なサブセットは、フォールド間で投票数上位「n」個の特徴であると判断された43。
このプロセスを代謝物データセットと脳DTIデータセットの両方で実施し、精度を最大化する最小限の特徴セットを導き出した。
これらの選択された変数が肥満を分類する能力をさらに評価するために、線形カーネルを持つSVM、リッジ分類器、およびロジスティック回帰モデルを作成し、これらの特徴だけで訓練した。孤立変数に加え、患者の年齢と性別もモデル予測因子として含めた。代謝物モデルには、患者の食事も含まれた。ロジスティック回帰とリッジ分類器は、RFE の推定に使用したものとは別のモデルであり、データの頑健性と線形分離性を確保するために使用された。これらの最終モデルの予測能力は、LOOクロスバリデーションを用いて評価された。
最後に、脳モデルと代謝物モデルのそれぞれから、モデル重量の絶対値で上位90パーセントの特徴を統合して、統合モデルを作成した。このモデルも、leave one out cross validation を用いて評価した。
各モデルについて、総合的な精度に加えて、精度と再現性も計算した。精度は、真陽性数＋偽陽性数に対する真陽性数として定義される。リコールは、真の陽性の数に偽の陰性の数を加えたもので、真の陽性の数で定義される。言い換えれば、精度は予測された真のうち実際に真であったものの割合であり、回収はモデルによって真であると正しく予測された実際の真の割合である。精度と想起は、超肥満クラスと肥満クラスの両方について計算した。
オーバーフィッティングが起きていないことを確認する追加的な方法として、ラベルをランダムにシャッフルし、3つのモデル（脳、代謝物、複合）すべてを再トレーニングすることで順列検定を実施した44。元のモデルのテスト精度と、ラベルをシャッフルした後のテスト精度に差がないという帰無仮説のもと、このテストでは、モデルが実際に特徴とラベルの間の特定の関係に基づいて学習したか、そうでなければ、サンプルサイズが小さい高次元の特徴データに非常に近くフィットしただけなのかを説明します。もし後者であれば、モデルは平均以上のテスト精度を持つか、あるいはオーバーフィットしてこのランダムなデータから何かを学習したことがわかります。
図1は、この方法論のハイレベルな概要を示しています。
図1
研究の概要本研究では、3千を超えるユニークな脳微細構造および腸内代謝物データを、76の脳および50の代謝物特徴に抽出します。そして、これらの特徴を用いて、患者が過体重か肥満かを90%以上の精度で予測できる機械学習モデルを作成した。
フルサイズ画像
結果
サンプルの特徴
全サンプル（N = 117）には、64人の肥満者（女性 = 47、男性 = 17）、平均年齢 = 33.203125, 標準偏差 10.2457, 53人の過体重者（女性 = 34、男性 = 19）平均年齢 = 31.4528, 標準偏差 = 10.964 が含まれています。臨床的な特徴を表1にまとめた。
表1 臨床的な特徴
フルサイズ表
再帰的特徴除去の結果
私たちの特徴選択法は、脳モデルの全変数2156個のうち、83個のDTI特徴を特定しました（図2A、SuppTable 1）。
図2
脳内ネットワークメトリクス（A）および代謝物（B）の再帰的特徴除去グラフ。最初にすべての特徴を組み込んだ線形モデルを作成し、繰り返し、最も重みの低い特徴を削除している。これらのグラフは、モデルの精度と保持する特徴の数との関係を示しています。
フルサイズ画像
全代謝物987個のうち、特徴選択法により代謝物モデル用の57個の変数が同定されました（図2B、SuppTable 2）。
脳内分類器
RFE法で特定したこのDTI特徴のサブセットで学習させたSVMモデルは、超肥満患者と肥満患者の識別で90.25%の精度を達成しました（図3A）。肥満クラス（0クラス）の精度は0.90、想起は0.88であった。極度の肥満者（1クラス）の精度は0.91、想起は0.92であった。
図3
脳特徴量のみ（A）、代謝物特徴量のみ（B）を用いたサポートベクターマシンモデルの受信動作特性曲線。
フルサイズ画像
興味深いことに、83個の孤立したDTIネットワークメトリックの特徴は、すべて脳の様々な部位のノード間中心性または平均経路長測定値であった。83個の孤立した特徴のうち、9個を除き、対応する脳領域はすべてユニークであった。前頭回の左三角部（L_InfFGTrip）、左前頭辺縁回（Wernickeの）と溝（L_FMarG_S）、右後頭極（R_OcPo）、右頭頂内（頭頂間溝）と横頭頂溝（R_IntPS_TrPS）、右横前頭極回と溝（R_TrFPoG_S）である、左島皮質溝（L_InfCirIns）、右下側頭溝（R_InfTS）、前頭極横回と溝（L_TrFPoG_S）、左尾状核（L_CaN）はそれぞれ、ノード間中央度と平均経路長の測定値が特徴量に含まれていた。
最も正のウェイトが大きく、極度肥満の分類に最も影響する3つの特徴量は、左肋骨周囲溝の平均経路長（AvPathLength__L_PerCaS）、下後頭回と溝の平均経路長（AvPathLength__L_InfOcG_S）、左側頭極のノード間中心性（NodeBWCent__L_Tpo）。一方、負のウェイトが最も大きく、肥満の分類に影響する3つの特徴量は、右長島回と中央島溝の平均経路長（AvPathLength__RLoInG_CInS）である、帯状回と溝の左中後方部（AvPathLength__L_MPosCgG_S）、帯状回後背部（AvPathLength__PosDCgG）の平均パス長（補足図1）。
代謝物分類器
RFE法で特定したこの代謝物特徴のサブセットで学習させたSVMモデルは、超肥満患者と肥満患者の識別で79.84%の精度を達成しました（図3B）。肥満者（0クラス）の精度は0.79、想起は0.76であった。極度の肥満（1クラス）の精度は0.81、想起は0.83であった。
最も正のウェイトが大きく、極度の肥満の分類に影響する3つの特徴は、アセスルファム、N-アセチルイソロイシン、1,2-ジリノレオイル-GPC（18：2/18：2）だった。一方、肥満の分類に影響する負のウェイトが最も大きかったのは、1-オレオイル-GPC（18:1）、プレグネンジオール硫酸、グリコレートであった（SuppFigure 2）。
複合型分類器
上記の2つのモデルから重みの絶対値で上位90%の特徴を組み合わせると、126個の変数（代謝物変数50個、脳dti nm変数76個）からなる新しい特徴のサブセットが得られた（表2）。この特徴量サブセットで学習したSVMモデルは、脳分類器をわずかに上回った。これは、超肥満患者と肥満患者の識別において90.49%の精度を達成しました（図4）。肥満クラス（0クラス）の精度は0.90、想起は0.89、超肥満クラス（1クラス）の精度は0.91、想起は0.92であった。
表2 肥満の複合サポートベクターマシンモデルに含まれる脳と代謝物の特徴量
フルサイズ表
図4
脳と代謝物の特徴を組み合わせたサポートベクターマシンモデルの受信動作特性曲線。
フルサイズ画像
このモデルでは、脳 DTI データセットからの特徴量は、代謝物データセットからの特徴量よりも有意に大きなウェイトを持つことがわかった。極度の肥満であるとの分類に影響する、正の重みが最も大きい3つの特徴量は、左頭蓋周囲溝の平均経路長（AvPathLength__L_PerCaS）、下後頭回と溝の平均経路長（AvPathLength__L_InfOcG_S）、上後頭回のノード間中心性（SupOcG）だった。
負の重みが最も大きい3つの特徴量は、右長島回と中央島溝の平均経路長（AvPathLength__RLoInG_CInS）、左中後部の帯状回と溝の平均経路長（AvPathLength__L_MPosCgG_S）、帯状回の後背部（AvPathLength__PosDCgG）だった（図5A）。
図5
肥満のサポートベクター複合マシンモデルにおける脳（A）および代謝物（B）の上位特徴量。X軸は、機械学習モデルに最も寄与した脳と代謝物の特徴を表し、寄与の大きさはY軸に概略を示し、負の重みは肥満の表現型に、正の重みは過体重の表現型に関連する。
フルサイズ画像
複合モデルで最もネガティブな代謝物の特徴は、硫酸プレゲンジオール、1-オレオイルGPC（18：1）、およびR-サルソリノールであった。最後に、このモデルで最もポジティブな代謝物の特徴は、I-ウロビリノーゲン、1-オレオイルグリセロール（18：1）、およびゲニステインでした（図5B）。
パーミュテーションテスト
3つのモデルすべてにおいて、この帰無仮説は棄却された。ラベルをシャッフルすることで、10重クロスバリデーションによるテスト精度は、ランダムよりも悪い値（46%）に低下しました。これは、モデルが特徴量（代謝物、脳DTI）とラベル（肥満度）の間に意味のある関係を学習したという我々の主張を支持するものである。
考察
本研究では、糞便中の代謝物データと神経画像データを用いて、太り過ぎと肥満の区別を単独で行うことができる機械学習アプローチを実証しました。しかし、これら2つのデータパラメータを組み合わせることで、より正確な分類が可能となります。この結果は、肥満の文脈でこれまで研究されてきた代謝物や脳領域の役割を明らかにし、さらに、この文脈でこれまで研究されてこなかった代謝物や領域の役割も示唆しています。因果関係については不明ですが、肥満と過体重の区別における脳と腸の相互作用を初めて明らかにしたことから、今回の知見は今後のメカニズム研究にとって重要です。
肥満と過体重の鑑別には、拡張報酬ネットワーク、主に感情制御ネットワークと体性感覚ネットワークの相当数の脳領域が重要であることが判明した。これらの脳領域、特に下前頭回、帯状回、直列回（感情制御）、さらに後中心回、後島、傍中心小葉（体性感覚）は、正常体重者と過体重者を高い精度で区別できる多変量解析パターン分類器として、これまでに報告されている23．報酬核ネットワークの1つの領域である尾状核のみが、我々のモデルにおいて、比較的小さいとはいえ、重要な差別化要因として浮上した。コアリワードネットワークの障害は、正常と過体重の区別に特に重要であることが示されているが23、今回の結果は、これらの障害は過体重と肥満の区別に最も重要な要因ではない可能性があることを示唆している。意外なことに、拡張報酬ネットワーク以外の領域、主にデフォルトモードネットワークも、肥満と過体重の鑑別に重要であることが明らかになった。デフォルトモードネットワークの活動は、自発的な自己反省45、内部刺激への注意45に加えて、ベースラインの脳機能を反映し、脳のエネルギー消費の最大80％を占める46。肥満の文脈におけるデフォルトモードネットワークに関する研究は限られているが、今回の結果は、痩せ型ではなく太り型のマウスでデフォルトモードネットワークの活動が増加していることを示した前臨床マウスモデルと一致している47。しかし、この結果は、痩せすぎのマウスではなく、太りすぎのマウスでデフォルトモードネットワークの活性が上昇している前臨床マウスモデルと一致している47。
いくつかのアミノ酸誘導体（N-メチルプロリン［プロリンから］、イミダゾールプロピオン酸［ヒスチジン］、アグマチン［アルギニン］、N-アセチルイソロイシン［イソロイシン］、N-ブチリルロイシン［ロイシン］）が肥満と太り過ぎを区別するために重要であると浮上した。これまでの研究で、特にアミノ酸と分岐鎖アミノ酸が、ヒトと前臨床モデルの両方において、肥満と関連するインスリン抵抗性に関連していることが明らかになっているが、これらの研究は主に糞便サンプルではなく、血清を使って行われてきた48,49,50,51。ある研究では、肥満の不一致があるヒトの双子のペアのマイクロバイオームを移植したマウスでは、体組成に違いが見られ、肥満マウスの微生物群では分岐鎖アミノ酸の代謝が増加していることが示されています52。さらに、我々のデータセットで肥満と過体重の強い差別化要因として現れた代謝物のサブセットは、イミダゾールプロピオン酸など、腸内細菌によってのみ産生されるものであった53。また、ビリルビンを細菌が還元することによって腸内で生成される代謝物であるL-ウロビリノーゲンも、重要な差別化要因であった54。先行研究では、血中濃度に関して高ビリルビン血症と肥満の役割が示唆されている54。
セロトニン作動性神経伝達物質とグルタミン作動性神経伝達物質に対する活性を持つアグマチンは、神経調節物質としての役割に関して広く研究されている、今回の結果で注目された一握りの代謝物の1つである55。また、アグマチンは、ストレスや炎症に対応する代償的な保護メカニズムとして、末梢神経系の内因性ニューロンや中枢神経系のアストロサイトから放出されます56。腸管アグマチンは迷走神経と相互作用し、肥満や過体重の表現型に特有の脳と腸の特徴に寄与している可能性があります。他の重要な代謝物の多くは、脳腸相関の文脈で研究されていないため、これらの化合物が何らかの形で中枢神経系と相互作用するかどうかを結論づけることはできない。
本研究では、脳領域と糞便代謝物の構造的結合に焦点を当てました。今後、太り過ぎと肥満の間の重要な違いを明らかにするために、脳領域の機能的結合、あるいはペアワイズ結合を取り入れるとよいかもしれません。本研究では、腸内細菌叢の文脈で注目すべき代謝物を議論したが、腸内細菌叢のシグネチャー（16S rRNA遺伝子配列データ）については明示的に検証しなかった。将来、より複雑な機械学習モデルが、肥満のシステムベースの理解を深め、肥満が過体重の表現型とどのように異なるかを理解するために、異なるデータセットを追加することで恩恵を受けるかもしれません。本研究では、便中代謝物と肥満に関する脳結合の変化との間の方向性と因果関係を定義することはできません。しかし、過去の研究では、肥満における脳-腸-マイクロバイオームのコミュニケーションに関する双方向モデルが示唆されています57。機械学習は、様々な結果を説明するために、特徴のばらつきに着目する傾向がある。その結果、機械学習は分散の少ない特徴を排除することができる。小さな変動がシステムの大きな変化を引き起こす可能性もあるため、すべての状況においてこれが正しいとは限りません。このバイアスは、構築・使用するモデルが専門家によって検証されていることを確認することで、ある程度は排除することができます。このモデルに含まれる糞便代謝物の多くは、それ自体では過体重と肥満の表現型を区別することができませんでしたが、独自のメタボロームシグネチャーは、2つのグループを有意に区別することができました。これは、機械学習アプローチが肥満のシステム理解に与える影響を強調しています。機械学習アルゴリズムは、データを分類する際の予測精度が高いにもかかわらず、常に真の基礎となるプロセスを完全に説明することはできず、同時に精度を最適化するための最適な特徴セットを持つ最終予測モデルに到達することはできない。本研究では、BMIによって2つのグループを区別しました。BMIは身長と体重の関係を表すもので、肥満の指標として最も広く使用されています。今後の研究では、今回の研究を検証するために、ウエスト・ヒップ比や内臓脂肪率など、他の肥満の指標を検討する可能性があります。
我々の知る限り、本研究は、機械学習モデルを用いて微細構造神経画像と糞便代謝物データを統合し、肥満者と過体重者の主要な差別化要因と潜在的なドライバーを理解する初めての研究である。脳と腸の相互作用が、標準体重から過体重への移行を促進する上で重要であることを示唆するエビデンスが増えてきています。この結果は、肥満の病態生理と太り過ぎの病態生理を比較した場合、脳主導のシグナル伝達がより重要である可能性を示唆しています。この探索的解析は、これまでの前臨床試験や臨床試験を裏付けるものであると同時に、肥満における脳-腸-マイクロバイオーム相互作用の未解明の道を探る上で不可欠な、新しい知見を明らかにしました。
データの入手方法
本研究で作成・分析されたデータセットは、現在進行中の研究の一部であるため一般には公開されていませんが、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能です。
参考文献
CDC, C. f. D. C. a. P. Overweight and Obesity. http://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2014).
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/. 肥満と過体重。ファクトシート（2016年）。
Reilly, J. J. & Kelly, J. 小児期および青年期の過体重と肥満が成人期の罹患率と早期死亡率に与える長期的影響：システマティックレビュー。Int. J. Obes. (Lond.) 35, 891-898。https://doi.org/10.1038/ijo.2010.222 (2011).
記事CAS PubMed Google Scholar
Jiang, M. et al. ボディマス指数と高齢者の全死亡および身体障害のリスクとの間の用量反応関係：システマティックレビューとメタアナリシス。Clin. Nutr.38, 1511-1523。https://doi.org/10.1016/j.clnu.2018.07.021 (2019).
記事 PubMed Google Scholar
Yu, J. et al. 中国北東部におけるBMIと一般的な慢性疾患との間の用量反応分析。Sci. Rep. 8, 4228. https://doi.org/10.1038/s41598-018-22551-y (2018).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Schwartz, M. W. et al. Obesity pathogenesis：内分泌学会の科学的声明。Endocr. Rev. 38, 267-296. https://doi.org/10.1210/er.2017-00111 (2017).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Gupta, A., Osadchiy, V. & Mayer, E. A. 肥満と食中毒における脳-腸-マイクロバイオームの相互作用. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. https://doi.org/10.1038/s41575-020-0341-5 (2020).
論文 PubMed PubMed Central Google Scholar
Nakazato, M. et al. A role for ghrelin in central regulation of feeding. Nature 409, 194-198. https://doi.org/10.1038/35051587 (2001).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Wren, A. M. et al. Ghrelin causes hyperphagia and obesity in rats. Diabetes 50, 2540-2547. https://doi.org/10.2337/diabetes.50.11.2540 (2001).
記事CAS PubMed Google Scholar
Shah, M. & Vella, A. 食欲と体重に対するGLP-1の影響。Rev. Endocr. Metab. Disord. 15, 181-187. https://doi.org/10.1007/s11154-014-9289-5 (2014).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Karra, E., Chandarana, K. & Batterham, R. L. The role of peptide YY in appetite regulation and obesity. J. Physiol. 587, 19-25. https://doi.org/10.1113/jphysiol.2008.164269 (2009).
記事CAS PubMed Google Scholar
Yano, J. M. et al. 腸内細菌叢の常在菌が宿主のセロトニン生合成を制御する. Cell 161, 264-276. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.02.047 (2015).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kullmann, S. et al. 肥満の脳：肥満脳：肥満度、インスリン感受性と安静時ネットワーク機能接続の関連性。Hum. Brain Mapp. 33, 1052-1061. https://doi.org/10.1002/hbm.21268 (2012).
記事 PubMed Google Scholar
Raji, C. A. et al. 脳の構造と肥満。Hum. Brain Mapp. 31, 353-364. https://doi.org/10.1002/hbm.20870 (2010).
記事 PubMed Google Scholar
Connolly, L. et al. 甘酒に対する痩せ型と肥満型女性の脳反応の違い。Neurogastroenterol. Motil. 25, 579-e460. https://doi.org/10.1111/nmo.12125 (2013).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Garcia-Garcia, I. et al. Alterations of salience network in obesity：安静時fMRI研究。Hum. Brain Mapp. 34, 2786-2797. https://doi.org/10.1002/hbm.22104 (2013).
記事 PubMed Google Scholar
Kilpatrick, L. A. et al. Influence of sucrose ingestion on brainstem and hypothalamic intrinsic oscillations in lean and obese women. Gastroenterology 146, 1212-1221. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2014.01.023 (2014).
記事CAS PubMed Google Scholar
Crossley, N. A. et al. ヒトのコネクトームのハブは、一般的に脳障害の解剖学に関与している。Brain 137, 2382-2395。https://doi.org/10.1093/brain/awu132 (2014).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Sporns, O. シンプルなグラフからコネクトームへ：ニューロイメージングにおけるネットワーク Neuroimage 62, 881-886. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2011.08.085 (2012).
記事 PubMed Google Scholar
Bullmore, E. & Sporns, O. 複雑な脳のネットワーク：構造系と機能系のグラフ理論的解析。Nat. Rev. Neurosci. 10, 186-198. https://doi.org/10.1038/nrn2575 (2009).
記事CAS PubMed Google Scholar
Irimia, A., Chambers, M. C., Torgerson, C. M. & Van Horn, J. D. 被験者および集団レベルのコネクトミックス視覚化のためのヒト皮質ネットワークの円形表現。Neuroimage 60, 1340-1351. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2012.01.107 (2012).
記事 PubMed Google Scholar
Rubinov, M. & Sporns, O. 複雑なネットワークによる脳結合の測定法：使用法と解釈。Neuroimage 52, 1059-1069. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2009.10.003 (2010).
記事 PubMed Google Scholar
Gupta, A. et al. 脳構造結合のパターンは、正常体重と過体重の被験者を区別する。ニューロイメージ・クリン。7, 506-517。https://doi.org/10.1016/j.nicl.2015.01.005 (2015).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Osadchiy, V. et al. 幼少期の逆境の歴史は、肥満における食物中毒の増加および報酬ネットワーク接続の性特異的変化と関連している。肥満。Sci. Pract. 5, 416-436。https://doi.org/10.1002/osp4.362 (2019).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Osadchiy, V., Martin, C. R. & Mayer, E. A. The gut-brain axis and the microbiome：メカニズムおよび臨床的意味合い。Clin. Gastroenterol. Hepatol. 17, 322-332. https://doi.org/10.1016/j.cgh.2018.10.002 (2019).
記事CAS PubMed Google Scholar
Osadchiy, V. et al. Correlation of triptophan metabolites with connectivity of extended central reward network in healthy subjects. PLoS ONE 13, e0201772. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201772 (2018).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Zhang, Y. et al. 肥満：病態生理と介入。Nutrients 6, 5153-5183. https://doi.org/10.3390/nu6115153 (2014).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Heymsfield, S. B. & Wadden, T. A. Mechanisms, pathophysiology, and management of obesity. N. Engl. J. Med. 376, 254-266。https://doi.org/10.1056/NEJMra1514009 (2017).
記事CAS PubMed Google Scholar
Fischl, B. et al. Whole Brain Segmentation：ヒトの脳における神経解剖学的構造の自動ラベリング。Neuron 33, 341-355. https://doi.org/10.1016/S0896-6273(02)00569-X (2002).
記事CAS PubMed Google Scholar
Dale, A. M., Fischl, B. & Sereno, M. I. 皮質表面ベース解析-I. セグメンテーションと表面再構成。Neuroimage 9, 179-194. https://doi.org/10.1006/Nimg.1998.0395 (1999).
記事CAS PubMed Google Scholar
Destrieux, C., Fischl, B., Dale, A. & Halgren, E. Automatic parcellation of human cortical gyri and sulci using standard anatomical nomenclature. Neuroimage 53, 1-15. https://doi.org/10.1016/J.Neuroimage.2010.06.010 (2010).
記事 PubMed Google Scholar
Irimia, A. & Van Horn, J. D. The structural, connectomic and network covariance of the human brain. Neuroimage 66C, 489-499. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2012.10.066 (2012).
論文 Google Scholar
Chiang, M. C. et al. BDNF 遺伝子の脳回路への影響は 455 名の双子で再現された。Neuroimage 55, 448-454. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2010.12.053 (2011).
論文CAS PubMed Google Scholar
大動脈弁逆流を定量化するためのカラードプラ画像による大静脈の3次元再構成．慢性動物モデルにおける研究。Circulation 99, 1611-1617 (1999).
記事CAS PubMed Google Scholar
Sporns, O. 複雑な脳内ネットワークの構造と機能。Dialog. Clin. ニューロサイエンス. 15, 247-262 (2013).
記事グーグルスカラ
Opsahl, T., Colizza, V., Panzarasa, P. & Ramasco, J. Prominence and Control：重み付けされたリッチクラブ効果。Phys. Rev. Lett. 101, 168702. https://doi.org/10.1103/PhysRevLett.101.168702 (2008).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Opsahl, T., Agneessens, F. & Skortez, J. 重み付きネットワークにおけるノード中心性(Node Centrality)：学位と最短経路を一般化する。Soc. Netw. 32, 245-251 (2010).
論文 Google Scholar
Gupta, A. et al. 神経性食欲不振症における複雑な機能的脳ネットワーク特性. J. Eat Disord. 10, 13. https://doi.org/10.1186/s40337-022-00534-9 (2022).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Gupta, A. et al. Sex differences in influence of body mass index on anatomical architecture of brain networks. Int. J. Obes. (Lond.) 41, 1185-1195。https://doi.org/10.1038/ijo.2017.86 (2017).
記事CAS PubMed Google Scholar
Dong, T. S. et al. A distinct brain-gut-microbiome profile exists for female with obesity and food addiction. Obes. (Silver Spring) 28, 1477-1486. https://doi.org/10.1002/oby.22870 (2020).
記事CAS Googleスカラー
Qui, X., Fu, D. & Fu, Z. An efficient dimensionality reduction approach for small-sample size and high-dimensional data modeling. J. Comput. 9, 576-580 (2014).
グーグル・スカラー
Wong, T. k-foldとleave-one-out cross validationによる分類アルゴリズムの性能評価。Pattern Recogn. 48, 2839-2846. https://doi.org/10.1016/j.patcog.2015.03.009 (2016).
記事ADS MATH Google Scholar
Chen, Q., Meng, Z., Liu, X., Jin, Q. & Su, R. Decision variants for the automatic determination of optimal feature subset in RF-RFE. Genes Basel 9, 253. https://doi.org/10.3390/genes9060301 (2018).
記事CAS Googleスカラー
Golland, P. & Fischl, B. Permutation tests for classification：画像ベースの研究における統計的有意性を目指して。Inf. Process Med. Imaging 18, 330-341. https://doi.org/10.1007/978-3-540-45087-0_28 (2003).
記事 PubMed Google Scholar
Buckner, R. L., Andrews-Hanna, J. R. & Schacter, D. L. The brain's default network：解剖学、機能、および疾患との関連性。Ann. N. Y. Acad. Sci. 1124, 1-38. https://doi.org/10.1196/annals.1440.011 (2008).
記事ADS PubMed Google Scholar
Raichle, M. E. A paradigm shift in functional brain imaging. J. Neurosci. 29, 12729-12734. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4366-09.2009 (2009).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Tregellas, J. R. et al. Altered default network activity in obesity. Obes. (Silver Spring) 19, 2316-2321. https://doi.org/10.1038/oby.2011.119 (2011).
記事 Google Scholar
Siddik, M. A. B. & Shin, A. C. Recent progress on branched-chain amino acids in obesity, diabetes, and beyond. Endocrinol. Metab. (Seoul) 34, 234-246. https://doi.org/10.3803/EnM.2019.34.3.234 (2019).
論文 PubMed Google Scholar
Newgard, C. B. et al. 肥満のヒトと痩せたヒトを区別し、インスリン抵抗性に寄与する分岐鎖アミノ酸関連の代謝シグネチャー。Cell Metab. 9, 311-326. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2009.02.002 (2009).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Breum, L., Rasmussen, M. H., Hilsted, J. & Fernstrom, J. D. 24時間血漿トリプトファン濃度および比率は肥満被験者では正常値を下回り、大幅な体重減少では正常化しない。Am. J. Clin. Nutr. 77, 1112-1118. https://doi.org/10.1093/ajcn/77.5.1112 (2003).
記事CAS PubMed Google Scholar
Layman, D. K. & Walker, D. A. Potential importance of leucine in treatment of obesity and the metabolic syndrome. J. Nutr. 136, 319S-323S. https://doi.org/10.1093/jn/136.1.319S (2006).
記事CAS PubMed Google Scholar
Ridaura, V. K. et al. Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 341, 1241214. https://doi.org/10.1126/science.1241214 (2013).
記事CAS PubMed Google Scholar
Koh, A. et al. 微生物産のイミダゾールプロピオン酸はmTORC1を通じてインスリンシグナルを障害する。Cell 175, 947-961. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.09.055 (2018).
記事CAS PubMed Google Scholar
Hamoud, A. R., Weaver, L., Stec, D. E. & Hinds, T. D. Jr. 肝-腸シグナル伝達軸におけるビリルビン(Bilirubin). Trends Endocrinol. Metab. 29, 140-150。https://doi.org/10.1016/j.tem.2018.01.002 (2018).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Piletz, J. E. et al. Agmatine：翻訳されてから100年後の臨床応用。Drug Discov. Today 18, 880-893. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2013.05.017 (2013).
記事CAS PubMed Google Scholar
Halaris, A. & Plietz, J. Agmatine : Metabolic pathway and spectrum of activity in brain. CNS Drugs 21, 885-900. https://doi.org/10.2165/00023210-200721110-00002 (2007).
記事CAS PubMed Google Scholar
Bliss, E. S. & Whiteside, E. The gut-brain axis, the human gut microbiota and their integration in development of obesity. Front. Physiol. 9, 900. https://doi.org/10.3389/fphys.2018.00900 (2018).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
リファレンスのダウンロード
ファンディング
本研究は、K23 DK106528（AG）、ULTR001881/DK041301（UCLA CURE/CTSI Pilot and Feasibility Study; AG）、R01 DK048351（EAM）など米国国立衛生研究所からの助成金の支援を受け、パイロット資金としてアーマンソン-ラブレス脳マッピングセンターによる脳スキャンが提供された。
著者情報
著者と所属
Vatche and Tamar Manoukian 消化器疾患部門（米国、ロサンゼルス
Vadim Osadchiy, Roshan Bal, Emeran A. Mayer, Rama Kunapuli, Tien Dong, Priten Vora, Cathy Liu, Jean Stains & Arpana Gupta
UCLAマイクロバイオームセンター（アメリカ・ロサンゼルス
ヴァディム・オサドチイ、エメラン・A・メイヤー、ティエン・ドン、アルパナ・グプタ
G. Oppenheimer Center for Neurobiology of Stress and Resilience（米国、ロサンゼルス）。
Vadim Osadchiy, Emeran A. Mayer, Priten Vora, Cathy Liu, Jean Stains & Arpana Gupta
デイビッド・ゲフェン医学部泌尿器科（米国、ロサンゼルス
ヴァディム・オサドチイ
消化器・肝臓・非経口栄養部門、VA Greater Los Angeles Healthcare System、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国
プリテン・ヴォラ＆ジーン・ステインズ
カリフォルニア工科大学パサデナ校数学科、米国
ダニー・ペトラセック
G. Oppenheimer Family Center for Neurobiology of Stress and Resilience, Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, David Geffen School of Medicine at UCLA, CHS 42-210 MC737818,10833 Le Conte Avenue,Los Angeles,CA, USA
アルパナ・グプタ
貢献度
A.G.は、資金調達、研究のコンセプトとデザイン、データの分析と解釈、重要な知的内容のための原稿の重要な改訂、研究監督に貢献した。R.B.は、データの解析と解釈、原稿の作成、重要な知的内容のための原稿の重要な改訂に貢献した。E.A.M.は、資金調達、研究のコンセプトとデザイン、重要な知的内容に関する原稿の重要な改訂に貢献した。R.K.は、研究のコンセプトとデザイン、データの分析と解釈、原稿の作成、および重要な知的内容に関する原稿の重要な改訂に貢献した。T.D.は、重要な知的内容に関する原稿の改訂に貢献した。P.V.とJ.S.は、技術サポートとデータの分析・解釈に貢献した。D.P.は、研究のコンセプトとデザインに貢献した。C.L.は、技術サポート、データの分析・解釈、図の作成に貢献した。V.O.は、研究のコンセプトとデザイン、原稿の作成、重要な知的内容のための原稿の重要な修正、および研究の監督に貢献した。最終原稿はすべての著者が読み、承認した。
責任著者
アルパナ・グプタに対応しています。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
追加情報
奥付
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や所属機関の管轄権主張に関して、中立を保っています。
補足情報
補足表1.
補足表2.
権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更があった場合にそれを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布および複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
この記事を引用する
Osadchiy, V., Bal, R., Mayer, E.A. et al. 腸内代謝物および脳微細構造データを用いた機械学習による肥満予測モデル. Sci Rep 13, 5488 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32713-2
引用元：ダウンロード
2022年9月3日受領
2023年3月31日受理
2023年4月4日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41598-023-32713-2
この記事を共有する
以下のリンクを共有した人は、このコンテンツを読むことができるようになります：
共有リンクを取得する
コンテンツ共有イニシアティブ「Springer Nature SharedIt」により提供されます。
対象者
疾患別
システム生物学
コメント
コメントを投稿することで、私たちの規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。もし、罵詈雑言や規約・ガイドラインに沿わないものを見つけた場合は、不適切なものとしてフラグを立ててください。
サイエンティフィック・リポーツ（Sci Rep） ISSN 2045-2322（オンライン版）
ネイチャーズドットコムサイトマップ
ネイチャーポートフォリオについて
私たちについて
プレスリリース
報道関係者
お問い合わせ
ディスカバーコンテンツ
ジャーナルA-Z
テーマ別記事
ナノ
プロトコル交換
ネイチャーインデックス
パブリッシングポリシー
ネイチャー・ポートフォリオ・ポリシー
オープンアクセス
著者・研究者向けサービス
転載・許可
研究データ
言語編集
科学編集
ネイチャーマスタークラス
ネイチャーリサーチアカデミー
リサーチソリューション
図書館・施設
ライブラリアンサービス＆ツール
図書館員用ポータルサイト
オープンリサーチ
図書館に推薦する
広告・パートナーシップ
広告
パートナーシップとサービス
メディアキット
ブランデッドコンテンツ
キャリア開発
ネイチャーキャリア
ネイチャーコンファレンス
ネイチャーイベント
地域別ウェブサイト
ネイチャーアフリカ
ネイチャーチャイナ
ネイチャーインディア
自然イタリア
ネイチャージャパン
ネイチャーコリア
自然中東
個人情報保護方針

クッキー（Cookie）の使用

Cookieを管理する/私のデータを販売しない
法的注意事項

アクセシビリティ宣言

ご利用条件

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？