生後1日目の直腸スワブは子宮内細菌叢の組成を反映せず、抗生物質耐性遺伝子の存在も過小評価される

2023年4月26日 10:31

25 2023年4月
生後1日目の直腸スワブは子宮内細菌叢の組成を反映せず、抗生物質耐性遺伝子の存在も過小評価される

https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.05254-22

著者紹介 S. Graspeuntner https://orcid.org/0000-0002-2546-2223 Simon.Graspeuntner@uksh.de, M. Lupatsii, L. Dashdorj, A. Rody, J. Rupp https://orcid.org/0000-0001-8722-1233, V. Bossung, C. HärtelAUTHORS INFO & AFFILIATIONs
DOI: https://doi.org/10.1128/spectrum.05254-22
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スペクトラム
オンラインファースト
ABSTRACT
イントロダクション
結果
ディスカション
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
ABSTRACT
ヒトの腸内細菌叢は、健康と疾病に重要な役割を果たしている。特に、生後数日間は、微生物群集の発達と確立のためのユニークな機会の窓を提供します。現在、腸内細菌叢の研究に最も広く用いられているサンプリング方法は、便サンプルであることが知られています。しかし、特定の時点におけるサンプルの取得の煩雑さ、輸送の難しさ、患者の不快感から、代替サンプリングアプローチの開発の必要性が指摘されています。代替サンプリングの1つは直腸スワブで、成人から採取した場合、腸内細菌叢解析のための信頼できるプロキシであることが示されています。ここでは、生後間もない乳児から採取した直腸スワブとメコニウムのペアサンプルの有用性を比較する。その結果、2つのサンプリングアプローチは、微生物組成やα・β多様性、耐性遺伝子の検出において、有意に異なるパターンを示すことがわかった。さらに、2つの採取方法間の非類似性は、個体間のばらつきよりも大きいことがわかった。したがって、新生児の生後数日に採取した場合、直腸スワブは腸内細菌叢解析のための便サンプルと比較して信頼できる代理人ではないと結論付けた。
重要現在、生後間もない新生児の腸内細菌叢を研究するために、有名なほど複雑でエラーを起こしやすい方法論を緩和する方法について、多くの提案がなされている。特に、メコニウムサンプルは、定期的に意味のあるデータを出力することができないため、成人でも行われているように直腸スワブに置き換えることが提案されている。私たちは、このような簡便な方法の開発が、生後間もない新生児の健康のために考慮すべき真の側面からデータの解釈を歪め、劇的に誤った結果を生み出していることを発見しました。我々は、この重要な側面に関する知識を慎重に検討し、直腸スワブが期産新生児のメコニウム採取に取って代わるものではないことを明らかにした。
はじめに
マイクロバイオーム研究への関心が高まり、健康や病気における腸内細菌叢の重要性が明らかになってきました（1）。出生後、新生児の最初の数日間は、腸内細菌叢の確立のためのユニークな機会の窓となり、乳児の長期的な健康と発達に影響を与えます（2、3）。そのため、例えば、出生前（4、5）、分娩中（6-9）、出生後（10）の抗生物質投与、出産様式（11）、授乳の種類（12、13）、妊娠年齢（14）、母親の垂直感染（15）などの複数の要因が、新生児のマイクロバイオータの形成と安定性に強く影響することが、我々や他の研究者によって示されています。乳児の早期腸内コロニー形成とマイクロバイオームの発達に影響を与える要因に関する現在の知識を深めるには、研究の比較可能性と参加者の募集率を高めるために、標準化された簡単なサンプリング技術が必要です。現在、腸内細菌叢研究においては、便サンプルの採取が「ゴールドスタンダード」であることが知られています（16-18）。便サンプリングは大量の微生物バイオマスを得ることができ、非臨床環境での研究参加者による自己サンプリングに適しているが、いくつかの欠点があるため、代替サンプル収集技術の開発の必要性を強調している(18)。便のサンプリングはほとんど標準化されておらず、高い汚染リスクによって妨げられ、特定のサンプリング時点を定義することや、重度の健康状態にある患者でのサンプリングは複雑である可能性がある（19）。さらに、輸送や保管の難しさ(20)や参加者の不快感(21)は、便サンプリングの欠点として知られています。直腸スワブの使用は、正確な時点のサンプリングが可能で、サンプルの収集、保管、保存が容易で、標準化が進み、汚染リスクが制限される(22)代替手段の1つである。いくつかの研究では、直腸スワブの採取が成人における便サンプルの信頼できる代用品であることが示されている（18-20, 22, 23）。成人の便からのサンプル採取に比べ、乳児からのサンプル採取はさらに困難である。新生児では排便回数が大きく異なるため（24）、ある時点のサンプル採取が複雑になる。さらに、便秘の有病率は生後数年で高くなる（25）。我々の知る限り、現在、乳児の腸内細菌叢解析において直腸スワブと便サンプルの使用を比較した研究はわずかである（26、27）。Reymanらは、早期発症の敗血症が疑われる定期出生児のグループにおいて、生後2日目に21サンプルペア、生後1週間目に110サンプルペアをスクリーニングした（26）。この研究では、2つの採取方法の間で高い比較可能性が報告されたが、観察された種の数は、6日齢のメコニウムサンプルの方が有意に多かった。別の研究では、3ヶ月から4.4歳までの小児を対象に直腸スワブの使用可能性を評価し、直腸スワブと便サンプルの類似性を観察した（27）。
これまでの研究で取り上げられていない重要な点は、新生児の腸内細菌叢における耐性遺伝子の検出である。腸内レジストームの発達に関する解析を深めることは、抗菌薬耐性の出現と腸内微生物群集の保存を理解する上で不可欠である。本研究では、帝王切開で生まれた生後1〜3日の新生児コホートにおいて、直腸スワブとメコニウムサンプルの採取方法を比較し、直腸スワブが腸内細菌叢を調べるための信頼できる代理として使用できるかどうかを検証した。さらに、新生児のマイクロバイオームにおける選択された耐性遺伝子の対応する存在を比較した。
結果
以前の研究で、我々は抗菌薬予防のタイミングが乳児の腸の発達に与える影響を評価した（9）。今回の研究では、生後1日目に採取した直腸スワブ13本のうち、メコニウムサンプルが一致するものを入手することができました。これにより、生後1日目のサンプリング戦略を比較分析することができた。
アルファ多様性とベータ多様性は、2つのサンプリングタイプで有意に異なるパターンを示している。
直腸スワブサンプルとメコニウムサンプルでは、アルファ多様性の測定値に有意な差があり、シャノンの多様性指数（P < 0.01）、検出種数（P < 0.05）、均等性指数（P < 0.001）は直腸スワブサンプルで高かった（図1AからC）。また、両サンプリング方法のα多様性指標を参加者ごとに一対一でプロットしたところ、便サンプルと直腸スワブサンプルの間に相関がないことが明らかになった（図1G〜I、ピアソンの相関指数、R2 = 0.0006, P = 0.94; R2 = 0.001, P = 0.91; R2 = 0.02, P = 0.64, respectively）。
図1
図1 新生児の腸内細菌叢のアルファ多様性は、2つのサンプル収集アプローチで大きく異なる。メコニウムサンプルと直腸スワブについて、シャノンの多様性指数（A）、検出種数（B）、均等性指数（C）を算出し、アルファ多様性の測定値を比較した。有意性はウィルコクソン順位和検定で評価した（*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001）. (D to I) サンプルごとのα多様性測定値（D to F）、および2つの採集方法におけるα多様性測定値間の相関（G to I）は、採集方法間の類似性の欠如を示した。
主座標分析によるβ多様性の比較では、両サンプルタイプとも、わずかな重複があるものの明確なクラスタリングが見られた（図2A）。距離行列検定による並べ替え多変量分散分析では、2つのグループ間でβ多様性の構成に有意な差があることがわかった（P < 0.01）。個体間変動とサンプリングタイプの影響を比較するために、サンプルのペアリングを描きました（図2B）。その結果、同じ乳児から採取したメコニウムサンプルと直腸スワブはクラスター化しないことがわかった。個人差の影響をさらに明らかにするために、サンプルの種類と参加者の識別子（ID）の両方についてデータセットを制約して、制約付き対応分析を実施した。サンプルの種類に割り当てられたX軸に沿った明確なクラスタリングが観察され（図2C）、サンプリングの種類はデータセットの制約された変動の5.7%を占め、一方個人間の変動は変動の3.8%を説明しました。順列検定のような分散分析では、サンプリングタイプの影響については有意（P < 0.01、999回の順列で）だったが、個体間変動については有意（P > 0.05、999回の順列で）ではなかった。
図2
図2 β多様性解析の結果、両サンプル採取方法において明確なクラスタリングが確認された。(AおよびB）ベータ多様性は、2つのサンプルグループの明確なクラスターを描く主配置分析（A）（距離行列を用いた並べ替え多変量分散分析、P < 0.01）および一致したサンプルペアの変数の色分けに割り当てる（B）計算によって比較した。(C）制約付きコレスポンデンス分析（CCA）により、サンプリング方法の有意な寄与（P < 0.01）と個体間変動の有意でない影響（P > 0.05）が証明されました。
メコニウムサンプルと直腸スワブの組み合わせは、分類学的組成が異なる。
両試料の最も顕著な種の相対的な存在量を比較すると、各グループで異なるパターンが見られた（図3、補足資料の図S1参照）。メコニウム試料ではStaphylococcus属、Enterococcus属、Escherichia属、Enterobacter属、Streptococcus属、Propionibacterium属が多く、直腸スワブではAnaerococcus属が多く見られた、 Prevotella、Finegoldia、Faecalibacterium、WAL 1855D、Porphyromonas、Lachnospiraceae、Streptococcus anginosus、Enterobacteriaceae、Dialister、Blautia、Coprococcus、Ruminococcus。全体として、26の分類群は2つのグループ間で存在量が有意に異なっていた（P < 0.05、偽発見率で調整）（図4および図S2）。検出された247種の1/10に過ぎないが、その累積存在量はマイクロバイオーム組成の1/3を占め（直腸スワブでは相対存在量の33.5%、メコニウムサンプルでは27.9%）、グループ間の差異を強調するものとなった。
図3
図3 メコニウムサンプルと直腸スワブにおける分類学的組成の比較は、サンプリング戦略間で異なる微生物組成を示す。両サンプリングタイプにおいて、属レベルで最も多く存在する24の分類群の相対的な存在量が示されている。より多く存在する分類群は、キーの最上部に記載されている。
図4
図4 2つのサンプリング方法の間で有意差がある分類群のヒートマップ。有意性は、ペアワイズウィルコクソン順位和検定で計算した（P < 0.05、P値の偽発見率調整による）。色分けは、平均的な分類学的存在量のZスコアを表している。
直腸スワブとメコニウムサンプルでは、抗生物質耐性遺伝子の存在量が異なっている。
2つのサンプリング方法をさらに比較するために、選択した15種類の耐性遺伝子の存在量を、対になったメコニウムサンプルと直腸スワブで評価した。一般的に耐性遺伝子が検出されたのは直腸スワブ2検体、メコニウム2検体のみであった。15個の耐性遺伝子のうち7個が検出され，メコニウム検体では6個が検出されたのに対し，直腸ぬぐい液では2個しか検出されなかった．メコニウムが新生児の耐性遺伝子保有率に近いと仮定すると，直腸ぬぐい液の陽性適中率は0％であるが，直腸ぬぐい液の陰性適中率は81.82％であった（本データセット）。直腸ぬぐい液で検出された抗生物質耐性遺伝子はβ-ラクタマーゼBlaTEMとBlaCMYの2種類であったが、メコニウム検体ではβ-ラクタマーゼBlaTEM、BlaCTX-M、BlaSHV、テトラサイクリン耐性遺伝子としてtet（W）、tet（M）、tetA（B）（図5）等が検出された。また、BlaSHV陽性のマイクロバイオームサンプルからEnterococcus faecalisとEscherichia coliを分離し、分離した大腸菌がBlaSHV遺伝子を持つことが証明され、マイクロバイオームサンプルのデータと一致した。
図5
図5 ヒートマップは、サンプルタイプにおける抗生物質耐性遺伝子の検出能力の違いを表している。クラスタリングはユークリッド距離に基づいて行われた。水色は、収集アプローチの1つからのサンプルに耐性遺伝子がないことを示し、濃い青は、グループのサンプルの少なくとも1つに存在することを示す。
考察
生後早期の腸内細菌コロニー形成と宿主-マイクロバイオーム相互作用に関する知識の向上は、脆弱な新生児の健康を維持するための新規治療・予防戦略を明らかにするための鍵となります。この観点から、正確に検証され、適用が容易なサンプリングアプローチは、科学的研究の比較可能性と高い募集率の鍵である(23)。今回の解析では、生後数日の帝王切開による正期産児のコホートにおいて、便サンプリングに代わる方法として直腸スワビングを比較検討した。同じ臨床環境にいる医療従事者が両方の方法でサンプリングを行い、標準化されたサンプリングと保管条件で同じ乳児から両方のサンプルを得ることができたため、比較分析の機会を得ることができました。
その結果、直腸スワブとメコニウムサンプルの間には、マイクロバイオーム組成の明確なパターンと、アルファ多様性測定における有意な差があり、高い非類似性があることが明らかになった。ここでは、生後1日目に採取された直腸スワブについて、シャノンの多様性指数、種数、均等性が有意に高いことを報告する。本結果と同様に、直腸スワブと便サンプルのシャノン多様性指数が有意に異なることが、成人参加者のサンプリングから報告されている（28）。また、直腸ぬぐい液の観察種数（26）やシャノン多様性指数（18、23、29）が高いことも、いくつかの研究で明らかにされている。しかし、我々の研究とは異なり、その差は有意ではなかったため、2つのサンプリング方法が同様の結果をもたらすという疑問のある結論に至った著者もいる。興味深いことに、Turnerらは、便サンプルと臨床的に採取されたスワブの間でα多様性が有意に異なることを指摘している。しかし、スワブが自己採取された場合、その差は有意にはならなかった(22)。本研究では、直腸スワブはすべて病院内で医師が採取したものであり、汚染率を下げるだけでなく、サンプル取得の質を高めることができ、スワブと便サンプルを比較するとより明確な違いを明らかにすることができるかもしれない。今回の研究では、サンプルの採取方法によって、乳児の腸内細菌叢のパターンが異なることが明らかになりました。帝王切開で生まれた乳児の腸内細菌叢は、コリネバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ブドウ球菌属などの皮膚関連細菌が多い傾向があることが知られている(11)。これらの属は今回のデータセットでも非常に多く、メコニウムサンプルでは相対存在量の28.4％、直腸スワブでは22.9％を占めた。メコン検体ではEscherichia、Enterobacter、Enterococcusなどの腸内細菌（30）が高濃度で検出されたのに対し、直腸スワブではFinegoldia、Prevotella、Anaerococcusが高濃度で検出され、これらは乳児のお尻の皮膚に関連することが知られている（31、32）。検出された247の分類群のうち、全微生物組成の約3分の1を占める26の分類群は、2つのサンプリング手法で有意に相対存在量が異なることが判明した。直腸スワブでは、Finegoldia、Porphyromonas、Lachnospiraceae、WAL 1855D（未分類の芽胞菌）の存在が高いことは、先行研究（18、19、33）と一致する。一方、先行研究（19）とは対照的に、Ruminococcus属の存在量は便サンプルでより低かった。このような2つのサンプリング方法の違いは、直腸スワブは粘膜微生物群に近い表現であるのに対し、便サンプルは内腔の微生物群を反映することが知られているという事実で説明されてきた（28、34）。しかし、我々のケースで考慮すべき、より重要な点は、乳児のメコニウム通過のタイミングは様々であり、出生後72時間以内に起こる可能性があるということです（35、36）。このことは、メコニウム通過前に直腸スワブを採取した場合、腸内細菌コンソーシアムではなく、皮膚マイクロバイオームの代表として機能する可能性があるということを示しています。Reymanらの結果（出生後の直接サンプリングではなく、サンプルの種類間の時間の近さに焦点が設定された）（26）を考慮すると、誤解を招く結果を避けるために、適切なサンプリング計画による正確な研究デザインの重要性が強調される。
β多様性の比較では、直腸スワブを出生後に直接サンプリングした場合、個人間変動よりも異なるサンプルタイプ間の非類似性が高くなることが明らかになった。同様の観察はSunらによってなされ、40歳から85歳の大腸ポリープの既往のある参加者から採取したマッチした直腸スワブと便サンプルの間でベータダイバーシティに有意差があることが明らかにされた(28)。さらに、ペプチドグリカン、核酸、糖、アミノ酸合成に関連するメタゲノム機能経路においても、2つのサンプリング方法の違いが存在することが明らかにされた（28）。Buddingらの研究では、粘膜生検検体と直腸スワブおよび便検体を比較し、大腸内視鏡検査を受けた患者から採取した直腸スワブおよび便検体の間で明確な微生物相プロファイルを確認したが、粘膜検体との違いはより明確であった（20）。他の研究者が矛盾する結果を発表しているが(22)、今回のデータは、サンプリングの種類によって、同じ個人から採取されたかどうかよりも、β多様性のばらつきが説明できることをさらに示唆している。特に、帝王切開で生まれた乳児のマイクロバイオームは臨床環境に大きく影響されることを考慮すると（37）、本研究ではすべての乳児が同じ病院で生まれたため、周囲の環境が似ていることが個人間のばらつきを減少させたと思われる。私たちの研究では、生後数日間のみ比較サンプルを入手することができました。この意味で、新生児のマイクロバイオームは発達の過程で急速に変化しており（38）、サンプリングタイプの影響が人生の異なる段階で異なる可能性があることを示唆していることに留意することも重要である。全体として、直腸スワブは便サンプリングの信頼できる代用品であるとする研究がいくつかある一方で（19、22、26、27、39、40）、我々の結果は、生後数日間は直腸スワブは早期腸内細菌叢解析の信頼できる代用品ではないことを示した。このことは、新生児における直腸スワブの使用を否定するものであるが、成人においては直腸スワブを代替手段として考慮することができるであろう。この点をさらに明確にするために、時間の経過とともにマイクロバイオーム内の変化が遅くなることが、直腸スワブと便サンプルの比較にどのような影響を及ぼすか、現在、密接な縦断的比較サンプリングが不足しています。したがって、母親のマイクロバイオームシグネチャーを含めて、全面的な比較分析を行うことも有用であるが、ここではそれを行うことはできない。さらに、便サンプルは、腸の異なる領域からの微生物の混合物を表していることも注目すべき点である。したがって、特に粘膜の微生物が重要な意味を持つ状況（例：粘膜炎）では、他の考慮事項とは無関係に、綿棒が便サンプルに代わるより良い選択肢となる可能性があります。
サンプリングタイプの品質評価においてほとんど無視されているのが、抗生物質耐性遺伝子の多さであり、便サンプルと直腸スワブの違いを扱ったデータは今のところ存在しない。乳幼児の腸内には様々な抗菌薬耐性遺伝子が存在することが以前に示されている(41)。さらに、乳児の腸は、マイクロバイオームが確立していないため、耐性菌が発達しておらず、薬剤耐性菌のコロニー形成の影響を受けやすいとされています(42)。そのため、新生児に発現する耐性遺伝子の構成や発現状況について理解を深めることは、抗生物質スチュワードシップ対策の向上に重要である。現在の解析では、直腸スワブでの耐性遺伝子の検出率は、メコニウムよりも低い。新生児腸内の微生物バイオマスが後期高齢者に比べて少ないことを考慮することが重要かもしれない。メコニアルサンプル内の細菌量は大きく変化し、微生物組成の分析に影響を与えるか、あるいはできなくなる可能性があるという事実には、特に注意が必要である（43）。したがって、結果は、特に直腸スワブにおける耐性遺伝子の陰性試験に関して慎重に解釈する必要があり、皮膚微生物の存在は、実際の腸内微生物から存在するDNA物質を単に置き換えるかもしれない。このように、抗菌薬耐性遺伝子の典型的なキャリアー（例えば、EnterobacterやEscherichia種）の総量がすでに少ないことが、直腸スワブにおける我々のアッセイで耐性遺伝子が検出限界以下であることにつながっているのかもしれない。
我々の研究で興味深いのは、アンピシリン耐性の主要なキャリアであることが知られているBlaSHV遺伝子の存在である（44）。興味深いことに、分類されていない腸内細菌科と大腸菌の両方が、メコニウムサンプルにおいて有意に高い頻度で存在していた。大腸菌はそれぞれのサンプルで培養によりBlaSHV遺伝子のキャリアであることが確認され、これは本データセットのメコニウム微生物群におけるBlaSHV遺伝子の検出と一致する。このように、直腸スワブを用いて耐性遺伝子の存在量を解析したデータは、メコニウムサンプルのスクリーニングで収集したデータとは大きく異なる結果をもたらすことが示唆された。このことは、生後間もない時期に2つのサンプリング方法を同じように使用することはできず、直腸スワブではマイクロバイオームに存在する重要な耐性メカニズムを特定できない可能性があることを強調している。この知識は、新生児の発達中のマイクロバイオーム内で抗生物質耐性が広がるのを防ぐために有用であると考えられる（47）。
まとめると、今回の研究では、直腸スワブ採取は、新生児の生後数日の便採取と比較して、信頼できる代用品ではないことが示されました。αおよびβ多様性、多様な分類学的構成、および抗生物質耐性遺伝子の存在プロファイルに有意な差があることから、これら2つのサンプリング方法は、出生後早期の腸内細菌叢およびレジストーム組成が異なる可能性を示している。したがって、我々は、新生児においては直腸スワブの代わりにメコニウムサンプルを使用することを勧める。一方、これまでの研究から、直腸スワブは成人の腸内細菌叢研究において十分に正確な方法であることが示されている。
材料と方法
研究対象者とサンプル収集
すべてのサンプルは、2019年1月から2020年6月まで実施されたシュレスヴィヒ・ホルシュタイン大学病院（Campus Lübeck）で、期産の乳児における抗菌薬予防投与のタイミングが腸内細菌叢の発達に与える影響を評価することを目的とした探索的ランダム化比較試験（9）、ドイツ臨床研究登録（DRKS）における登録番号DRKS00025305で得られた。すべての親は、書面によるインフォームドコンセントに署名した。倫理的承認は、2018年10月9日にリューベック大学のヒトを対象とした研究に関する倫理委員会から、参照番号18-264で与えられた。本研究では、配列決定後に生後1日目の最初のメコニウム通過サンプルと直腸スワブの両方が入手できた13人の研究参加者のサブセットを使用しました。
直腸スワブは、訓練を受けた医師または助産師が、生後1日目に滅菌乾燥した臨床サンプル採取用コパンFLOQSwabs（コパン・イタリア、イタリア）を使用して採取した。綿棒の先端はエッペンドルフチューブに入れられ、-80℃で冷凍保存された。メコニウムサンプルは、メコニウムが通過するとすぐに採取し、さらに実験室で処理するまで同様に-80℃で凍結した。
DNAの分離と配列決定。
サンプルを解凍し、500μLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を直腸スワブのある各チューブに加え、さらなる処理に先立ち5分間ボルテックスさせた。200ミリグラムのメコニウムサンプルは、短いボルテックス後に採取された。すべてのサンプルは、DNeasy PowerSoil DNA分離キット（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて処理した。分離の各ラウンドには、汚染をコントロールするためにネガティブコントロールが含まれていた。分離されたDNAは、さらに処理するまで-20℃で保存された。16S rRNA遺伝子の部分配列を増幅するために、V3/V4超可変領域を標的とするプライマーを用いたPCRを、他の場所(9)に記載されているように行った。等モル量の増幅サンプルをプールし、MinEluteゲル抽出キット（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。精製したライブラリーをMiSeqプラットフォーム（Illumina, San Diego, CA, USA）とMiSeq試薬キットV3を用いて600サイクルで配列決定した。PhiXライブラリーおよびDNA分離コントロールは、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含まれた。
バイオインフォマティクス処理および統計解析。
リードは、mothur（48）、バージョン1.44.1を使用して、以下のパイプラインを介して処理した：12未満のホモポリマーおよび500bpより短いサイズを有する配列は、SILVA参照データベース（49）に対してアラインし、非アライン配列はさらなる分析から除去した。キメラ配列（VSEARCH [50]）を除去し、残りの配列はRibosomal Data Base（51）を用いて分類学的に割り当て、1,800 reads/sampleで希釈化した。統計解析とグラフの可視化は、vegan (52), labdsv (53), BoutrosLab.plotting.general (54), OTUtable (55), RColorBrewer (56), and psych (57) パッケージを用いて、R (version 4.0.1) により組み立てた。アルファ多様性測定は、シャノンの多様性指数と均等性指数を用いて評価し、各サンプルタイプにおける検出種数を算出した。グループ間の差、および相対的存在量の差は、ペアワイズウィルコクソン順位和検定を用いて計算した。P値の誤検出率調整が適用された（58）。2つのサンプリング方法間で存在量が有意に異なる（P < 0.05）種を描写するために、分類学的平均存在量のZスコアを視覚化したヒートマップが作成された。α多様性パラメータと個体間変動の相関は、ピアソンの相関行列で計算し、P値とR2値を導き出した。β多様性は、Bray-Curtis非類似度を用いた主配列分析で解析した。サンプリング方法と個体間変動の影響を比較するために、制約付き対応分析を使用した。グループ間の差は、距離行列を用いた並べ替え多変量分散分析により算出した。
直腸スワブおよびメコニウムサンプルにおける抗生物質耐性遺伝子の検出。
両方のサンプルタイプにおける様々な以前に探索された（9）耐性遺伝子の存在量を検出するために、13個の対になったメコニウムサンプルと直腸スワブのサブセットは、特定のプライマー（補足資料の表S1参照）を用いたPCRを用いてスクリーニングした（59-62）。増幅は、以前に記述したように行った(9)。両方のサンプルタイプにおける耐性遺伝子検出の描写は、ユークリッド距離推定クラスタリングに基づくヒートマップによって行われた。BlaSHV耐性遺伝子を有する単一細菌分離株の存在を確認するために、100mgのメコニウム試料を500μLのPBSに再懸濁した。その後、懸濁液の1：100および1：1,000希釈液100μLを3つの培養培地（コロンビア寒天＋5％羊血、チョコレート寒天PolyViteX、MacConkey寒天）（bioMérieux, Marcy-l'Etoile, France）にプレートし、好気および嫌気的条件下37℃で24時間培養を行った。形態的に異なるコロニーを純粋培養として分離し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析計（Bruker Corporation, Billerica, MA, USA）を用いて同定した。その後、検出された各菌種について、QIAamp DNA minikit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて、10〜12個のコロニーからDNA分離を行った。単一細菌単離株におけるBlaSHV遺伝子の存在の確認は、メコニウムサンプルについて上記したように実施された。
データの入手
本研究の結果を裏付けるデータは、European Nucleotide Archive（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home）のアクセッション番号PRJEB47587でオープンに利用可能です。
謝辞
参加された女性とそのお子さんに感謝します。また、ご協力いただいた分娩室、手術室の先生方、助産師さんにも感謝いたします。Siegrid Pätzmann、Melanie Albrecht、Erik Winzheimの継続的な支援に感謝します。
本プロジェクトは、V.B.にリューベック大学ジュニア研究助成（J25-2018）、S.G.にドイツ感染研究センター（BMBF/DZIF TTU08.826）、DFG-リサーチユニット FOR5042 "miTarget - The Microbiome as a Target in Inflammatory Bowel Disease" (J.R.) によって支援されました。
研究のコンセプトとデザイン M.L.、S.G.、A.R.、V.B.、C.H.、J.R.、データの取得：データ取得：V.B.、M.L.、L.D.、S.G.、配列決定およびバイオインフォマティクス： M.L.およびS.G.、データの解析：データ解析：M.L.、S.G.、原稿作成：M.L.、S.G.：原稿作成：M.L.、S.G.、重要な知的内容に関する原稿の重要な修正：全著者。
補足資料
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