Nature:自然免疫の重要性について

公開日:2020年7月15日
COVID-19およびSARSの症例と
非感染者のSARS-CoV-2特異的T細胞免疫について

概要
以前の病原体によって誘導された記憶T細胞は、その後の感染症に対する感受性や臨床的な重症度を形成することがある1。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型(SARS-CoV-2)を認識する可能性のある既存のメモリーT細胞のヒトにおける存在については、ほとんど知られていない。我々は、コロナウイルス感染症2019(COVID-19)の回復期患者(n = 36)を対象に、SARS-CoV-2の構造領域(ヌクレオカプシド(N)タンパク質)および非構造領域(NSP7およびNSP13 of ORF1)に対するT細胞反応について検討した。これらの個体のすべてにおいて、Nタンパク質の複数の領域を認識するCD4およびCD8 T細胞が確認された。次に、SARS(SARS-CoV感染に伴う疾患)から回復した患者(n = 23)は、2003年のSARS発生から17年後にSARS-CoVのNタンパク質に反応する長期記憶T細胞を持っており、これらのT細胞はSARS-CoV-2のNタンパク質に強い交差反応を示すことが示された。また、SARS、COVID-19の既往がなく、SARSやCOVID-19に感染した人と接触していない人(n = 37)にもSARS-CoV-2特異的T細胞が検出された。非感染者のSARS-CoV-2特異的T細胞は、異なる免疫優位パターンを示し、NSP7、NSP13およびN蛋白を標的とすることが多かった。NSP7特異的T細胞のエピトープ解析では、動物のベータコロナウイルスでは保存されているが、ヒトのコロナウイルスでは相同性の低いタンパク質断片を認識することが示された。このように、ベータコロナウイルスの感染は、構造的なNタンパク質に対して多特異的かつ長期的なT細胞免疫を誘導する。一般集団に存在する既存のN-およびORF1特異的T細胞が、SARS-CoV-2感染に対する感受性と病原性にどのように影響するかを理解することは、現在のCOVID-19パンデミックの管理にとって重要である。

主な内容
SARS-CoV-2は、COVID-192の原因です。本疾患は、世界保健機関(WHO)によりパンデミック宣言がなされ、世界各地で個人の生命と経済に深刻な影響を及ぼしています。SARS-CoV-2の感染は、無症状や軽度のインフルエンザ様症状から重症の肺炎や急性呼吸窮迫症候群3まで、幅広い臨床症状を呈することが特徴となっています。

一つのウイルスが、ヒトにおいて大きく異なる病態を引き起こすことはよく観察されることである。これは、ウイルスの接種量、患者の遺伝的背景、併発する病態の存在など、複数の要因に起因している場合が多い。さらに、近縁のウイルス4や他の微生物5に対する適応免疫が確立していると、感受性の低下6や疾患の重症化7を引き起こすことがあります。

SARS-CoV-2は、多くの動物種に感染する大型RNAウイルスであるコロナウイルス科に属します。ヒトに感染するコロナウイルスは、他に6種類知られています。そのうち4つは固有感染8して風邪を引き起こし(OC43、HKU1、229E、NL63)、SARS-CoVと中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)は重症肺炎の流行を引き起こしました9。これらのコロナウイルスは、いずれも感染者に抗体およびT細胞反応を引き起こすが、抗体レベルはT細胞よりも早く減衰するようである。SARS-CoV特異的な抗体は2〜3年で検出限界以下となったが10、SARS-CoV特異的メモリーT細胞はSARSから11年後でも検出されている11。SARS-CoV-2、SARS-CoV、コウモリの仲間であるSL-CoVZXC2112の間では、NSP7とNSP13はそれぞれ100%と99%同一である。SARS-CoVが消失した個体に交差反応性SARS-CoV-2特異的T細胞が存在するかどうかを調べ、SARS-CoV-2感染から回復した個体に存在する反応と比較検討した。また、SARSやCOVID-19の既往がなく、SARS-CoV-2患者との接触歴もない人のT細胞についても調査した。以下、これらの人をまとめて、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2に曝露されていない人(非曝露ドナー)と呼ぶことにする。

COVID-19患者におけるSARS-CoV-2特異的T細胞
SARS-CoV-2特異的T細胞は、COVID-19の患者について特性評価が始まったばかりであり13,14、その潜在的な保護的役割は、SARS15およびMERS16から回復した患者の研究から推論されている。ウイルスクリアランスに関連するSARS-CoV-2特異的T細胞を研究するために、我々は軽度から重度のCOVID-19から回復した36人の末梢血を採取し(人口統計学、臨床およびウイルス学的情報は拡張データ表1に含まれている)、大きなSARS-CoV-2プロテオームの選択した構造(N)および非構造タンパク質(NSP7とORF1のNSP13)に対するT細胞反応性を調べた(図 1a)。N タンパク質は、より豊富に産生される構造タンパク質17 の一つであり、異なるベータコラナウイルス間で高い相同性を持つことから選択した(Extended Data 図1)。

a, SARS-CoV-2プロテオーム構成;分析されたタンパク質はアスタリスクで示されている。 b, Nタンパク質、NSP7、NSP13からなる10アミノ酸で重複する15merのペプチドは、Nタンパク質(N-1、N-2)、NSP7、NSP13(NSP13-1、NSP13-2、NSP13-3)を含む6種類のプールに分類された。c、COVID-19から回復した患者(n = 36)のPBMCを、ペプチドプールで、またはポジティブコントロールとしてフォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)およびイオノマイシン(iono)で刺激した。IFNγ分泌細胞のスポット形成単位(SFU)の頻度を示す。 d、各個体におけるSARS-CoV-2応答の構成を、検出された全応答に対するパーセンテージで示す。N-1、水色;N-2、濃青;NSP7、オレンジ;NSP13-1、薄赤;NSP13-2、赤;NSP13-3、濃赤。 e、PBMCをNタンパク質を覆うペプチドプールで5時間刺激し、細胞内サイトカイン染色で分析した。ドットプロットは、N-1および/またはN-2ペプチドでの刺激に応答してIFNγおよび/またはTNFを産生したCD4および/またはCD8 T細胞を有する患者(7人中2人)の例を示す。n=7人におけるSARS-CoV-2 N-ペプチド反応性CD4およびCD8 T細胞の割合を示す(各反応について刺激しない対照を差し引いた)。

NSP7とNSP13は、SARS-CoV、SARS-CoV-2およびベータコラナウイルス属に属する他の動物コロナウイルスとの間に完全な相同性があり12 (Extended Data Fig. 2) 、レプリカーゼ・トランスクリプターゼ複合体をコードするORF1a/bポリタンパク質の代表であるため選ばれた19。このポリプロテインはコロナウイルス感染後に最初に翻訳され、構造タンパク質をコードするゲノムおよびサブゲノムRNA種のその後の転写に必須である19。我々は、NSP7(83アミノ酸)、NSP13(601アミノ酸)、N(422アミノ酸)の全長をカバーし、10アミノ酸ずつ重複する216個の15merペプチドを合成し、これらのペプチドをそれぞれ約40個のプール(N-1, N-2, NSP13-1, NSP13-2 and NSP13-3)およびNSP7にわたる15のペプチドからなる単一のプールに分割した(図1b)。アジア人集団では、このようなアルゴリズムの性能が最適でないことが多いため、バイオインフォマティクスによるペプチドの選択の代わりに、ペプチドが重複しているこの不偏の方法を使用した20。

COVID-19から回復した36人の患者の末梢血単核細胞(PBMC)を異なるペプチドプールで18時間刺激し、ウイルス特異的反応をインターフェロン-γ(IFNγ)ELISpotアッセイで分析した。試験したすべての個体(36人中36人)において、Nタンパク質をカバーする合成ペプチドプールで刺激した後、IFNγスポットを検出した(図1c、d)。ほぼ全ての個体において、タンパク質の複数の領域に対してN特異的な反応が確認できた。36人中34人がアミノ酸1〜215からなる領域(N-1)に対して反応性を示し、36人中36人がアミノ酸206〜419からなる領域(N-2)に対して反応性を示している。一方、NSP7とNSP13のペプチドプールに対する反応は、COVID-19発症者36名中12名で非常に低いレベルで検出された。

N特異的IFNγ ELISpot反応を確認し、定義するために、直接ex vivo細胞内サイトカイン染色(ICS)を実施した。しかし、IFNγやTNFを産生するCD4やCD8 T細胞の集団は、9人中7人で検出可能であった(図1eおよび拡張データ図3、4)。さらに、サンプル数が少ないにもかかわらず、SARS-CoV-2特異的IFNγスポットの頻度を、ウイルス中和抗体の存在、感染期間および疾患の重症度と比較することができ、相関は認められなかった(Extended Data 図5)。COVID-19から回復した患者の生体外で検出されたN特異的応答の多特異性を確認し、さらに明確にするために、9人の患者のIFNγ応答を活性化することができるNタンパク質の正確な領域をマップ化した。Nタンパク質全体を覆う82個の重複ペプチドを小さなペプチドプール(7-8個のペプチド)に整理し、ex vivoで直接、または以前B型肝炎ウイルス21やSARS22の患者に用いられたin vitro拡張プロトコル後に、PBMCを刺激するために使用しました。ペプチドプールの模式図を図2aに示す。COVID-19で回復した9人の患者のうち8人は、SARS-CoV-2のNタンパクの複数の領域を認識するPBMCを持っていることがわかった(図2a)。次に注目すべきは、7人の患者においてT細胞を活性化することができる単一ペプチドを定義したことである。ペプチドマトリックス法22を用いて、まずIFNγ ELISpotで検出された反応の原因である個々のペプチドを分解した。その後、CD4またはCD8T細胞を活性化する能力をICSを用いてテストすることにより、単一ペプチドの同一性を確認した(表1および図2b)。表1は、COVID-19から回復した7人のELISpotとICSの両方で確認された異なるT細胞エピトープをまとめたものである。注目すべきは、COVID-19回復者が、SARS回復者のT細胞によっても標的とされる領域に特異的なT細胞を発達させていることが観察されたことである。例えば、SARS-CoV感染者のCD4 T細胞エピトープとして以前報告されたNタンパク質のアミノ酸101-120の領域は、COVID-19感染者2人のCD4 T細胞も刺激した。同様に、N蛋白質のアミノ酸321-340の領域は、COVID-19またはSARS22のいずれかに回復した患者においてCD4およびCD8 T細胞を誘発するエピトープを含んでいた。COVID-19およびSARSに感染した患者が、共通のウイルス決定基に対してT細胞応答を起こすことができるということは、SARS-CoVの過去の感染が、SARS-CoV-2に対して交差反応するT細胞を誘導することができることを示唆している。

a, COVID-19から回復した9人のPBMCを、7-8種類のNペプチドからなる12種類のプールで刺激した。個々のNペプチドプールに対するIFNγ ELISpot応答を示す表である。アスタリスクは、インビトロ拡張後に検出された応答を示す。 b、インビトロ細胞拡張後、ペプチドプールマトリックス戦略を使用した。異なるペプチドに反応したT細胞は、IFNγ ELISpotによって同定され、ICSによって確認された。7人中3人の代表的なドットプロットを示す。

SARS患者におけるSARS-CoV-2特異的T細胞
現在のパンデミックの管理およびSARS-CoV-2に対するワクチン開発にとって、獲得した免疫が長期にわたって持続するかどうかを理解することは重要である。我々は以前、SARSから回復した患者は、異なるSARS-CoVタンパク質内のエピトープに特異的なT細胞を持っており、それが感染後11年間持続することを明らかにした11。ここでは、SARS-CoV感染から17年後のPBMCを採取し、SARS-CoVに対して反応する細胞がまだ存在するか、またそれらがSARS-CoV-2ペプチドに対して交差反応性を有するかどうかを検証した。SARS-CoV感染を解決した人(n = 15)のPBMCを、SARS-CoVのNタンパク質(N-1とN-2)、NSP7およびNSP13をカバーするペプチドプールで直接ex vivo刺激した(図3a)。この結果、感染後17年経ってもSARS-CoVペプチドに対するIFNγ応答は存在し、NSPペプチドプールではなく、ほぼNタンパク質にのみ集中していた(図3b)。次に、SARS-CoV-2のNペプチド(アミノ酸の同一性、94%)が、SARS-CoV感染を解消した人のPBMCでIFNγ反応を誘発するかどうかを調べた。実際、試験した23人全員のPBMCがSARS-CoV-2のNペプチドに反応した(Fig. 3c, d)。SARSから回復した個体におけるこれらの低頻度の応答が、SARS-CoV-2のNタンパク質に出会った後に拡大するかどうかを調べるために、SARS-CoV-2のN、NSP7、NSP13タンパク質に応答するIFNγ産生細胞の量を、関連ペプチド存在下で10日間細胞培養した後に分析した。試験した8人中7人がN反応性細胞の明確で強固な拡大を示し(Fig. 3e)、SARSから回復した個人がSARS-CoV N反応性CD4およびCD8メモリーT細胞を持つことがICSによって確認された11(Extended Data Fig.6)。Nペプチドに対する反応とは対照的に、NSP13をカバーするペプチドプールに反応する細胞は検出できず、NSP7に反応したのは8人中1人の細胞のみであった(Fig. 3e)。

a, 17年前にSARSから回復した15人から分離したPBMCをSARS-CoV N, NSP7, NSP13ペプチドプールで刺激した。 b, 示したペプチドプールで一晩刺激した後のIFNγ分泌細胞のスポット形成単位を示した。c、SARSから回復した15人のPBMCを、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2のNタンパク質をカバーするペプチドプールで並行して刺激し、IFNγ産生細胞の頻度を示す。 d、SARSから回復した各人(n=23)におけるSARS-CoV-2の反応の構成を、検出された全反応に対するパーセンテージとして示す。N-1、水色;N-2、紺色;NSP7、オレンジ色;NSP13-1、薄赤色;NSP13-2、赤色;NSP13-3、濃赤色。 e、SARSから回復した8人のPBMCをSARS-CoV-2のN、NSP7およびNSP13を覆う全てのペプチドで刺激して交差反応応答を検出した。異なるペプチドプールに直接ex vivoおよびin vitroで膨張させた後に反応する細胞の数を示している。

このように、SARS-CoV-2 N特異的T細胞は、SARS-CoV感染歴のある人のT細胞レパートリーの一部であり、これらのT細胞はSARS-CoV-2のNペプチドと出会った後に強固に増殖することが可能である。これらの結果は、ベータコロナウイルスの感染によって誘導されたウイルス特異的T細胞が長期にわたって持続することを示しており、COVID-19患者が長期にわたってT細胞免疫を獲得するという考え方を支持するものである。また、関連ウイルスに感染して生成された長期持続性T細胞が、SARS-CoV-2感染から身を守る、あるいはSARS-CoV-2の感染による病態を修飾する可能性が示された。

未被曝ドナーのSARS-CoV-2特異的T細胞
この可能性を探るため、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2に曝露していない37人のドナーを対象に、N-、NSP7-およびNSP13-ペプチド反応性IFNγ反応を検査した。ドナーは、2019年7月以前に採取されたもの(n = 26)、またはSARS-CoV-2中和抗体とSARS-CoV-2 N抗体23の両方について血清学的に陰性であった(n = 11)。OC43、HKU1、NL63、229Eなど、ヒトの一般的な風邪の原因として知られる異なるコロナウイルスは、SARS-CoV-2と異なるアミノ酸相同性を示し(拡張データ図1および2)、最近のデータにより、SARS-CoV-2に曝露されていないドナーに、SARS-CoV-2交差反応CD4 T細胞の存在(主にスパイクタンパク質に特異的)が示されています114。注目すべきは、37人の非曝露ドナーのうち19人でSARS-CoV-2特異的なIFNγ反応を検出したことである(図4a, b)。Nタンパク質、ORF1にコードされるNSP7およびNSP13タンパク質をカバーするペプチドに反応した全調査対象者の累積割合を図4bに示す。COVID-19とSARSに感染した人はNペプチドプールに優先的に反応したのに対し(COVID-19感染者の66%、SARS感染者の91%がNペプチドプールのみに反応)、非感染者はNタンパク質あるいはNSP7とNSP13に混合反応を示した(図4a-c)。また、COVID-19やSARSを発症した59人中1人だけがNSPペプチドに優位な反応を示したのに対し、SARS-CoV-2反応性細胞を持つ未被曝ドナー19人中9人でこれらのペプチドに優位な反応を示した(図4cおよび拡張データ図7)。これらの未被曝ドナー由来のSARS-CoV-2反応性細胞は、SARS-CoV-2特異的ペプチドで刺激すると増殖する能力を有していた(Fig. 4d)。次に、非被曝ドナーで検出されたSARS-CoV-2特異的反応について、より詳細に説明した。あるドナー(H-2)におけるN-特異的反応の特徴を調べると、Nタンパク質のアミノ酸101-120の領域内のエピトープに反応するCD4 T細胞が同定された。このエピトープは、COVID-19やSARS8,22の回復者にも検出された(図2b)。この領域は、MERS-CoV、OC43、HKU1のNタンパク質の配列と高い相同性を有している(Fig. 4e)。同じドナーにおいて、複数の時点で収集したPBMCを分析し、Nタンパク質の101-120アミノ酸領域に対する反応が1年以上持続することを示した(Extended Data 図8a)。SARS-CoVまたはSARS-CoV-2に曝露されていない他の3人のドナーでは、NSP7のアミノ酸26-40の領域に特異的なCD4 T細胞(SKLWAQCVQLHNDIL;ドナーH-7)およびNSP7のアミノ酸36-50の領域からなるエピトープに特異的なCD8 T細胞(HNDILLAKDTTEAFE;H-3、H-21;図4eおよび拡張データ図8b)が同定されている。

a, SARS-CoVおよびSARS-CoV-2に曝露されていない人(n = 37)、SARSから回復した人(n = 23)またはCOVID-19(n = 36)のPBMCを、SARS-CoV-2のN(N-1、N-2)、NSP7およびNSP13(NSP13-1、NSP13-2、NSP13-3)を覆うペプチドプールで刺激してELISpotによって分析した。ペプチド反応性細胞の頻度は、各ドナー(点または四角)について示され、バーは頻度の中央値を表す。四角は2019年7月以前に採取されたPBMC試料を示す。 b、N特異的、NSP7およびNSP13特異的反応、またはN-、NSP7およびNSP13特異的反応を有する個人のコホートにおける割合。 c、各応答非曝露ドナー(n=19)におけるSARS-CoV-2反応の構成は検出した全反応に対する割合として示される。N-1、水色;N-2、濃青;NSP7、オレンジ;NSP13-1、薄赤;NSP13-2、赤;NSP13-3、濃赤。 d、示されたペプチドプールに直接ex vivoおよび10日間の拡張後の11人の非暴露ドナーのSARS-CoV-2反応細胞の周波数。e、ペプチドプールマトリクス戦略をSARS-CoVおよびSARS-CoV-2に曝露されていない3人のために使用した。同定されたT細胞エピトープはICSによって確認され、その配列はヒトに感染することが知られているすべてのコロナウイルスの対応する配列とアラインメントされた。

SARS-CoV、SARS-CoV-2と他の感冒性コロナウイルス(OC43、HKU1 NL63、229E)の2つのタンパク質領域間の相同性は最小で、特にCD8 T細胞エピトープに関しては、これら後者の2つのT細胞特異性は特に興味深いものである(図4e)。実際、感冒コロナウイルスの配列をカバーする低相同性ペプチドは、NSP7のアミノ酸36-50に反応するT細胞を持つ個体のPBMCを刺激できなかった(Extended Data Fig.8c)。SARS-CoV-2反応性T細胞の中には、ナイーブなものや全く無関係の病原体によって誘導されたものもある可能性を排除できないが5、この所見は、動物由来の未知のコロナウイルスが、一般集団において交差反応性SARS-CoV-2 T細胞を誘導している可能性を示唆している。

我々はさらに、3人の未被曝者に存在したNSP7特異的CD4およびCD8 T細胞の特徴を明らかにした。反応性T細胞はin vitroで効率的に増殖し、主にIFNγとTNFの両方(CD8 T細胞)またはIFNγのみ(CD4 T細胞)を産生した(Extended Data Fig.9a)。また、NSP7のアミノ酸36-50に特異的なCD8 T細胞は、HLA-B35拘束性で、エフェクターメモリー/末端分化型表現型(CCR7-CD45RA+/-)であることも明らかにした(Extended Data Fig.9b, c)。

結論
NSP7およびNSP13特異的T細胞は、SARSやCOVID-19から回復した人では少数派である一方、非被曝ドナーでは検出され、しばしば優勢である理由は不明である。しかし、SARS-CoV-2に感染していないドナーではORF1特異的なT細胞が優先的に検出され、COVID-19に感染した人では構造タンパク質を優先的に認識するという以前の研究結果11と矛盾はない。SARS-CoV-2に感染していない人が、ウイルス特異的T細胞を誘導することは、他のウイルス感染症でも証明されている24,25,26.理論的には、コロナウイルスに感染した人は、ORF1特異的T細胞を誘導することができる。なぜなら、コロナウイルスに感染した細胞では、ORF1がコードするタンパク質が最初に生成され、その後のウイルスゲノムの転写に必須なウイルス複製酵素-転写酵素複合体の形成に必要となり、その結果、様々なRNA種が発現されるからである18。したがって、ORF1特異的T細胞は、成熟ビリオンが形成される前にSARS-CoV-2感染細胞を溶解することによって、ウイルス産生を中止させることができると仮定できる。一方、COVID-19やSARSの患者では、成熟ビリオンを分泌する細胞で豊富に産生されるNタンパク質17により、N特異的T細胞が優先的に増殖することが予想される。

特に、ORF1領域は、多くの異なるコロナウイルス間で高度に保存されているドメインを含んでいる9。これらのウイルスが異なる動物種に分布することで、SARS-CoV-2に対する交差反応性を持つORF1特異的T細胞が定期的にヒトと接触することになるのかもしれない。既存の構造または非構造タンパク質に関連するSARS-CoV-2交差反応性T細胞の分布、頻度および防御能力を理解することは、このパンデミック時に観察された感染率または病態のいくつかの違いを説明するために重要であると考えられる。ウイルスタンパク質に特異的なT細胞は、気道感染の動物モデルにおいて保護的であるが27,28、SARS-CoV-2感染の差異調節に対する既存のN-および/またはORF1特異的T細胞の影響の可能性は、慎重に評価されなければならないだろう。

方法
データ報告
サンプル数を決定するための統計的手法は用いていない。実験は無作為化されておらず、研究者は実験中および結果評価中の割り付けについて盲検化されていない。

倫理に関する声明
すべてのドナーは書面で同意した。本研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、NUS Institutional Review Board(H-20-006)およびSingHealth Centralised Institutional Review Board(参照CIRB/F/2018/2387)により承認された。

ヒトサンプル
ドナーは、SARS-CoVまたはSARS-CoV-2感染の臨床歴に基づき募集された。COVID-19から回復した患者(n = 36)の血液サンプルは、PCR陰性から2-28日後に、SARSから回復した患者(n = 23)は感染から17年後に入手した。健康なドナーのサンプルは、ウイルス性疾患におけるT細胞機能の研究のために2019年6月以前に採取されたもの(n = 26)、または2020年3月から4月にかけて採取されたものである。健康なドナーのサンプルはすべて、RBD中和抗体陰性、N IgGのELISAで陰性でした(n = 11)19。

PBMCの分離
PBMCはFicoll-Paqueを用いた密度勾配遠心分離により単離した。分離されたPBMCは、直接研究するか、アッセイに使用するまで液体窒素で凍結保存されるかのいずれかであった。

ペプチドプール
SARS-CoV-2のN、NSP7、NSP13タンパク質とSARS-CoVのNタンパク質のタンパク質配列全体にまたがる、10アミノ酸ずつ重なった15merのペプチドを合成した(GL Biochem Shanghai;補足表1、2参照)。PBMCを刺激するために、N (N-1, N-2)とNSP13をカバーする約40個のペプチドからなる5つのプール (NSP13-1, NSP13-2, NSP13-3) とNSP7をカバーする15個のペプチドからなる1つのプールに分けて、ペプチドを収集した。単一ペプチドの同定には、Nについては12個の数字と7個のアルファベットからなるプール、NSP7については4個の数字と4個のアルファベットからなるプールのマトリックスにペプチドを整理した。

ELISpotアッセイ
ELISpotプレート(Millipore)にヒトIFNγ抗体(1-D1K, Mabtech; 5μg/ml)を4℃で一晩コートした。次に、ウェル当たり400,000個のPBMCを播種し、SARS-CoVまたはSARS-CoV-2ペプチド(2μg/ml)のプールで18時間刺激した。ペプチドマトリックスプールまたは単一ペプチドでの刺激には、5μg/mlの濃度を使用した。その後、ヒトビオチン化IFNγ検出抗体(7-B6-1、Mabtech;1:2,000)でプレートを展開し、ストレプトアビジン-AP(Mabtech)およびKPL BCIP/NBT Phosphatase Substrate(SeraCare)でインキュベートした。スポット形成単位(SFU)はImmunoSpotで定量した。ペプチド特異的な陽性反応を定量するために、ペプチド刺激ウェルから刺激していないウェルの2×平均スポットを差し引き、結果をSFU/106 PBMCとして表した。陰性コントロールのウェルが30 SFU/106 PBMCを超える場合、または陽性コントロールのウェル(phorbol 12-myristate 13-acetate/ionomycin) が陰性であった場合は、結果を除外した。

フローサイトメトリー
PBMCまたは拡大T細胞株を、10μg/mlのブレフェルディンA(シグマ・アルドリッチ)の存在下、SARS-CoVまたはSARS-CoV-2ペプチドプール(2μg/ml)ありまたはなしで37℃において5時間刺激した。細胞を、黄色LIVE/DEAD固定化死細胞染色キット(Invitrogen)および抗CD3(クローンSK7;3:50)、抗CD4(クローンSK3;3:50)および抗CD8(クローンSK1;3:50)抗体により染色した。T細胞の分化状態を解析するために、細胞をさらに抗CCR7(クローン150503;1:10)および抗CD45RA(クローンHI100;1:10)抗体で染色した。その後、Cytofix/Cytoperm kit(BD Biosciences-Pharmingen)を用いて細胞を固定・透過化し、抗IFNγ(クローン25723、R&D Systems;1:25)抗体および抗TNF(クローン MAb11;1:25)抗体で染色し、BD-LSR II FACS Scanで分析した。データはFlowJo(Tree Star)で解析した。抗体は特に明記しない限り、BD Biosciences-Pharmingenから購入した。

拡大T細胞株
T細胞株は以下のように作製した。20%のPBMCを、10μg/mlの重複するSARS-CoV-2ペプチド(すべてのプールを合わせたもの)または単一ペプチドで37℃、1時間パルスし、洗浄後、2%のABヒト血清(ギブコ;サーモフィッシャーサイエンティフィック)添加のAIM-V培地で残りの細胞と共培養させた。T細胞株は、20U/mlの組換えIL-2(R&D Systems社)の存在下で10日間培養した。

HLA-制限アッセイ
健常者ドナーH-3のHLA型を決定し、ペプチドNSP7(36-50)の提示のために、それぞれ1つの共通アレルを持つ異なるEpstein-Barrウイルス(EBV)化B細胞株を選択した(下記を参照)。B細胞を10μg/mlのペプチドで37℃で1時間パルスし、3回洗浄し、10μg/mlのブレフェルジンA(シグマ-アルドリッチ)の存在下で1:1の割合で拡張T細胞ラインと共培養した。パルスしていないB細胞株は、潜在的な同種反応を検出するための陰性対照として機能し、自己のペプチドパルスした細胞は陽性対照として機能した。異なるB細胞株のHLAクラスIハプロタイプ。CM780, A*24:02, A*33:03, B*58:01, B*55:02, Cw*07:02, Cw*03:02; WGP48, A*02:07, A*11:01, B*15:25, B*46:01, Cw*01:02, Cw*04.02:03; NP378, A*11:01, A*33:03, B*51:51, B*35:03, Cw*07:02, Cw*14:02; NgaBH, A*02:01, A*33:03, B*58:01, B*13:01, Cw*03:02です。

塩基配列のアラインメント
ORF1abの参照タンパク質配列(アクセッション番号。QHD43415.1、NP_828849.2、YP_009047202.1、YP_009555238.1、YP_173236.1、YP_003766.2、NP_073549.1)およびN蛋白(アクセッション番号:YP_009724397.2, AAP33707.1, YP_009047211.1, YP_009555245.1, YP_173242.1, YP_003771.1 and NP_073556.1)は NCBI データベースからダウンロードした (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/).配列はMUSCLEアルゴリズムを用いてデフォルトパラメータで整列し、Geneious Prime 2020.1.2 (https://www.geneious.com)で同一性パーセントを算出した。アライメント図はSnapgene 5.1 (GSL Biotech)で作成した。

サロゲートウイルス中和アッセイ
サロゲートウイルス中和試験を使用した。具体的には、スパイクタンパク質の受容体結合ドメインとヒトACE2受容体のタンパク質間相互作用を阻害する抗スパイク抗体の量を、ELISAベースのアッセイを用いて測定する試験である29。

統計解析
統計解析はすべてPrism(GraphPad Software)で行った。詳細は図の説明文に記載されている。

報告書の概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryをご覧ください。

以下略

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