腸内細菌叢に存在するシュウ酸分解菌のシュウ酸トランスポーターOxlTの構造と機構解明

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発行：2023年04月03日
腸内細菌叢に存在するシュウ酸分解菌のシュウ酸トランスポーターOxlTの構造と機構解明

Structure and mechanism of oxalate transporter OxlT in an oxalate-degrading bacterium in the gut microbiota - Nature Communications

ティトゥアン・ジャウネ・ラハリー
島村達郎さん
...
山下敦子

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Nature Communications 14巻、記事番号：1730（2023） この記事を引用する
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腸内細菌叢に存在するシュウ酸分解菌は、食物由来のシュウ酸塩を吸収して炭素源やエネルギー源として利用し、宿主動物の腎臓結石形成のリスクを低減させることができる。シュウ酸トランスポーターOxlTは、他の栄養素のカルボン酸塩と厳密に区別して、シュウ酸塩を腸から細菌細胞へ選択的に取り込みます。本論文では、シュウ酸塩とリガンドを結合したOxlTの結晶構造を、閉塞状態と外向き状態の2つの異なるコンフォメーションで紹介します。リガンド結合ポケットには塩基性残基があり、シュウ酸塩と塩橋を形成する一方、酸性基質がないと閉塞状態へのコンフォメーション転換が起こらない。閉塞ポケットはシュウ酸塩を収容できるが、代謝中間体のような大きなジカルボン酸塩は収容できない。ポケットからの透過経路は、広範なドメイン間相互作用によって完全にブロックされており、基質に隣接する1本の側鎖を反転させることのみで、その透過経路を開くことができる。本研究は、共生を可能にする代謝的相互作用の基礎となる構造的基盤を示すものである。
はじめに
シュウ酸塩は、野菜、豆類、ナッツ類などシュウ酸塩を含む食品1 から毎日の食事を通して摂取される最小のジカルボン酸塩（C2O42-）です2。また、シュウ酸塩は体内の最終代謝産物であり、一部は全身循環を経て腸に分泌される1。しかし、過剰なシュウ酸塩は血液中のカルシウムと不溶性の塩を形成し、腎臓結石症の原因となります（図1a）。オキサロバクター・フォルミゲネスは、腸内のシュウ酸分解菌4であり、腸内のシュウ酸を代謝分解することができるため、ヒトを含む宿主動物のシュウ酸の恒常性に大きく寄与している3,5,6. 実際、嚢胞性線維症7や炎症性腸疾患8、空腸バイパス手術9を受けた患者は、O. formigenesのコロニー形成率が低く、高蓚酸尿症や腎臓結石形成のリスクが高いことが知られています。
図1：OxlTの構造。
a 腸内のシュウ酸分解菌O. formigenesにおけるOxlTの機能の模式図 b, c シュウ酸結合型（PDB ID 8HPK; b）とリガンド非結合型（PDB ID 8HPJ; c）のOxlTの結晶構造 d シュウ酸結合型とリガンド非結合のOxlTを重ね合わせた写真。ペリプラズムから見た図（上）と膜貫通面から見た図（下）を示す。 e, f シュウ酸塩結合型（e）とリガンド非結合型（f）OxlTの表面静電ポテンシャルマップ。表面には±5 kTe-1の静電ポテンシャルがマッピングされている。
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O. formigenesのシュウ酸トランスポーター（OxlT）は、シュウ酸：ギ酸アンチポーター（OFA）10であり、この細菌におけるシュウ酸代謝の鍵分子である。OxlTは、C2ジカルボン酸であるシュウ酸に最適な基質特異性を持ち、電気化学的な勾配に従って細胞膜を通過するカルボン酸の輸送を触媒する。実際、このトランスポーターはシュウ酸塩の自己交換に高い回転速度（>1000/s）を示している11,12。シュウ酸自己栄養細菌O. formigenesの生理的条件下では、OxlTのカルボキシレート交換機能により、宿主の腸からシュウ酸を細菌の唯一の炭素源として取り込み、細菌細胞内に蓄積すると有毒なシュウ酸の最終分解物であるギ酸（HCO2-）を放出します11、12、13（図1a）。シュウ酸：ギ酸交換のOxIT触媒の回転は、細胞質でプロトンを消費する脱炭酸酵素によるシュウ酸からギ酸への代謝分解を伴い、結果として細菌細胞膜にプロトン電気化学勾配を生じさせます11。したがって、OxlTは、細菌のATP合成のためのプロトン原動力を作り出す「仮想プロトンポンプ」として機能する11。このように、OxlTが各化学物質のユニポーターではなく、シュウ酸塩とギ酸塩のアンチポーターであるという機能特性は、炭素代謝とエネルギー形成を両立するために不可欠である。注目すべきは、OxlTはクレブスサイクルのジカルボン酸中間体であるオキサロ酢酸（C4H2O52-）やコハク酸（C4H4O42-）を基質として受け付けないことである13．これらの炭素数4のジカルボン酸（C4ジカルボン酸）は、細菌細胞質側では重要な代謝中間体であり、宿主内腔側では腸管トランスポーターを通じてエネルギー源や生合成前駆体として吸収されている14。したがって、OxlTがC2およびC4ジカルボン酸を識別する能力は、宿主動物と腸内細菌との良好な共生に不可欠である。
OxlTは、様々な化学物質を輸送する大型トランスポーターファミリーであるmajor facilitator superfamily (MFS)に属し10、MFSタンパク質は、6つの遺伝子重複TMユニットのN末端とC末端を対称に含む12の膜貫通ヘリックスからなり、分子中央に基質結合部位がある共通の構造を持つ15、16。MFSファミリーや他のトランスポーターファミリーの基質輸送機構は、「交互アクセスモデル」17で説明される。トランスポーター分子は、結合部位から膜の両側に交互に空洞を開き、N-およびC-末端ドメインの「ロッカースイッチ」運動によって外向き、閉塞、内向きのコンフォーメーションを取り、それによって膜を越えて基質を輸送する18, 19, 20. MFSの各メンバーの構造情報は豊富に蓄積されているが、OFAファミリーに関する現在の知識は、電子結晶学によって6.5Åで最初に解かれたOxlT構造に限られている21,22。そのため、OxlTのシュウ酸認識・輸送機構は、より高い解像度の構造で解明されていない。
本研究では、腸内シュウ酸分解菌の共生を支える重要なトランスポーター機能の構造基盤を理解するために、3.0-3.3Åで解いたシュウ酸結合型およびリガンドフリー型のOxlTのX線結晶構造について報告します。
研究成果
2つの異なるコンフォメーションでのOxlT構造
野生型OxlTは、塩化物イオン存在下など様々な条件下で不安定であり12,23、結晶化スクリーニングに利用できる化学的空間が著しく狭くなっている。OxlTの構造研究には、抗体支援結晶化戦略が採用された。一般に、膜タンパク質のコンフォメーションエピトープに特異的に結合するFabまたはFv抗体フラグメントは、硬い結晶格子の形成に利用できる親水性表面積を増やすことができる。さらに、結合した抗体フラグメントは、タンパク質固有の柔軟性とコンフォメーションの不均一性を低減し、膜タンパク質の結晶化を成功させる可能性を高めることができる24,25。OxlTは、2つの異なる抗体断片を結合させることで安定化し、2つの異なる条件下で結晶化させました。結晶化に用いた抗体断片は、シュウ酸塩の存在下でも非存在下でもOxlTに結合することが確認された（補足図1）。したがって、抗体断片が人為的にOxlTを特定のコンフォメーションに閉じ込めている可能性は低いと考えられる。Fabフラグメントと複合体化したシュウ酸塩結合OxlTの結晶構造は3.0Å（PDB ID 8HPK）で、Fvフラグメントと複合体化したリガンドフリーOxlTは3.3Å（PDB ID 8HPJ）で解かれた（補足図2a、b及び補足表1、2）。
OxlTの全体構造は、以前のEM構造21で観察され、後に典型的なMFS構造であることが確認されたように、12本のTMヘリックスからなる（図1b、c）。シュウ酸塩が結合した状態では、OxlTタンパク質は、構造体の中心にシュウ酸塩分子が結合した閉塞型構造をとる（図1b, e）。一方、リガンドを持たないOxlTは、シュウ酸塩結合型とは大きく異なる構造をとる（図1c, d, f）。OxlTタンパク質は、N末端（TM1-6）とC末端（TM7-12）ドメインの間に大きなV字型の空洞を持ち、この空洞は中央のシュウ酸結合部位からペリプラスムに繋がっており、明らかに外向きのコンフォメーションであることが分かる。
閉塞構造と外向き構造の比較では、すべての残基のCαルート平均二乗偏差（RMSD）は2.6-2.7Åだった（図1d）。両者の唯一のN末端またはC末端ドメインでさえ、かなりの構造的差異を示した（Cα RMSDは〜1.5〜1.6Å）。したがって、「ロッカースイッチ」運動による閉塞状態と外向き状態の間の構造変化は、剛体構造ユニットの傾きによって達成されるのではなく、その曲げに付随していることがわかる。実際、外向き構造のTM1, 2, 4, 7, 8, 11では、ペリプラズム部分の顕著な屈曲が観察され、他の周囲のTMヘリックスも傾いている（図1d）。一方、細胞質部分については、2つのコンフォメーション間で目立った違いは見られなかった。GLUT5やNarKなど他のMFSタンパク質では、異なるコンフォメーション状態の間でTMヘリックスのグリシン残基の屈曲が観察されている26,27。OxlTは52個のグリシン残基を持ち、これはアミノ酸量の約8分の1（12.4%）である（図1d、補足図2c、d、3）。このグリシン頻度は、LacY (8.6%)、GLUT5 (7.6%)、NarK (10.4%) などの他のMFSタンパク質や、他の膜タンパク質のTMヘリックス (~8.7%) に比べて高いことが注目されている28。したがって、OxlTの状態間のコンフォメーションスイッチを実現するためには、グリシン残基でのTMヘリの曲げの蓄積がより顕著に現れると考えられる。グリシン残基は、TM5とTM8、TM2とTM11のようにN末端とC末端のドメインの界面にも見られ（補足図2c、d）、既報のようにタイトなヘリカルパッキングを実現していた28,29。OxlTで観察される高いグリシン出現率は、輸送基質としては小さいシュウ酸塩を分子の中心で閉塞するために必要であると考えられる。逆に、グリシンに富んだ構造は、後述するように、OxlTが洗剤ミセル中で不安定であり、抗体断片や機能アッセイがない場合に結晶化を妨げる原因になっていると思われる。グリシン比率が高いことは、他のOFAタンパク質にも見られ（10.2±1.1%、厳密に保存されている位置は15箇所；補足図3に示す11人のファミリーメンバーで観察）、ファミリー特性である可能性がある。
シュウ酸塩結合閉塞構造
結晶構造（PDB ID 8HPK）では、OxlTに結合するシュウ酸分子がねじれた配置として精製されている（図2a、補足図4a）。シュウ酸ジアニオンの2つのカルボキシル基の間の結合は単一で共役でないことが知られており、C-C結合を中心にカルボキシル基が自由に回転することが可能である30。シュウ酸塩が結合したOxlT構造の解像度はシュウ酸塩の二面角を正確に決定するには不十分であるため、エネルギー的に最小のコンフォメーションを調べるために、閉塞したOxlT構造におけるシュウ酸塩結合の量子力学（QM）および量子力学/分子動力学（QM/MM）計算を実施しました。その結果、シュウ酸塩のO-C-C-O二面角は50-68˚以内に収まった（補足図4b、c、補足表3）。これらの値は、元の結晶構造で観測された値（60.1゜）に近く、シュウ酸塩が平面ではなく、結晶構造上でねじれていることが検証された。
図2：シュウ酸塩が結合した閉塞型OxlT構造。
a シュウ酸塩結合型OxlT（PDB ID: 8HPK）の結合部位のクローズアップ。破線は水素結合と塩橋の可能性を示している。また、結合したシュウ酸分子の拡大図（原子ラベル付き）を示す。 b 基質と相互作用するアミノ酸残基の位相的類似性に基づき、OxlT（下線ラベル付き）とNarK（緑、通常ラベル付き；PDB ID: 4U4W）の基板結合部位構造を重ね合わせた。 c GFP-TSによるシュウ酸結合アセス。データは、3回の独立した実験における3mMシュウ酸カリウムの添加による融解温度の上昇の平均±SEMを表す。WT: 野生型。 d 組換え大腸菌細胞を用いたシュウ酸塩取り込みアッセイ。OxlT36 を発現していない細胞を 0%とし、同じ日に測定した WT OxlT の輸送活性を 100%としたときの変異型 OxlT の相対輸送活性を表示する。棒グラフは、各変異体について、1回の実験で技術的に重複して測定した平均値を示す。R272A、K355Q変異体の結果は、比較のため、以前の研究36から再掲載した。 e Proteoliposomeシュウ酸取り込みアッセイ。その結果、リポソーム溶解液中のシュウ酸濃度を測定し、60分後のWT OxlTのそれに対して正規化した。OxlTを含まないリポソームの結果は "empty "として示した。バーは、3回（空、WT、R272Aの0分と60分のデータ）または2回（その他）の独立した実験における結果の平均を示す。 au：任意単位。パネルcおよびeにおいて、データはWT OxlTを対照としてDunnettの検定による両側一元配置分散分析で分析され、正確なP値は補足表6に記載されている。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 赤い棒は、先行研究31,32,34で活性を失った変異体（または同じ残基の変異）を示す。 f 空洞から細胞質までを閉じるドメイン間相互作用 g OxlTの細胞質側でのイオン相互作用ネットワーク h 空洞からペリプラズムまでを閉じるドメイン間相互作用。
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OxlTの結合部位において、シュウ酸塩は一方のカルボキシル基がTM8のArg272と二座の塩橋を形成し、他方はTM11のLys355とイオン的相互作用を形成してトランスポーターに結合する（図2a）。シュウ酸塩との塩橋に加え、Lys355のε-アミノ基は、N末端ドメインのGln34（TM1）およびGln63（TM2）のカルボキサミド基とドメイン間水素結合ネットワークを形成しています。同様に、Arg272のグアニジノ基は、Ala147の主鎖カルボニル基（TM5）とドメイン間水素結合を形成し、さらにTM8上流のAsn268の側鎖カルボキサミド基および主鎖カルボニル基と相互作用する。Arg272付近はN268GGCR272Pの配列によりTM8の屈曲点となっており、Arg272とAsn268間の水素結合によりシュウ酸結合構造におけるTM8のコンフォメーションと向きが維持されていると考えられる。Arg272とLys355が関与するこれらのドメイン間およびドメイン内の水素結合ネットワークは、これら2つの基本残基がC末端ドメイン内に位置しているにもかかわらず、結合ポケットの構造を整理し、閉塞したコンフォメーションを安定化する上で極めて重要な役割を果たすと考えられる。これら2つの基本残基はOFAファミリー内で保存されており（補足図3）、シュウ酸塩の輸送に必須であり、R272KまたはK355R変異でも輸送活性が低下する31、32、33。これらの結果は、電荷だけでなく、2つの残基の側鎖の化学構造も結合部位の構造構成に重要であるという観察を裏付けるものである。
2つの塩基性残基に加えて、多くの芳香族残基がシュウ酸塩結合に寄与していることが判明した。Tyr35とTyr124の水酸基は、シュウ酸塩のカルボキシル基のいずれかと水素結合を形成する（図2a）。さらに、Tyr150、Trp324、Tyr328、Trp352の芳香族側鎖基は、シュウ酸塩中のカルボキシル基と対面または端から端までのπ-π相互作用を形成し、OxlTによる分子認識においてシュウ酸のπ電子系が重要であることを示しています。これらの芳香族残基はN末端とC末端の両方に分布しているため、シュウ酸塩との相互作用によってドメイン間空洞の閉鎖が安定化し、閉塞したコンフォメーションが達成される。さらに、Trp352（TM11）はGln66（TM2）とドメイン間水素結合を形成している。これらの芳香族残基は、OFAファミリーに属するタンパク質間で保存されている（補足図3）。実際、Tyr150またはTrp352の変異は、これまでの研究で輸送機能の喪失に関連していた31,34。また、硝酸/亜硝酸ポーター（NNP）ファミリーのNarKによる、同じくπ電子系を持つ硝酸塩の認識においても、同様のイオン性とπ-π相互作用の組み合わせが観察されたが、NNPファミリーはOFAファミリー10とは遠く、関わる残基の位置は互いに一致しない（図2b）。
そこで、シュウ酸の結合と輸送における上記またはその近傍の残基の重要性を検討した。精製した OxlT は不安定であり、特に基質が存在しない場合、様々な機能アッセイを利用した： (1) シュウ酸塩結合能力を評価する GFP 熱シフト (GFP-TS) アッセイ35、宿主 E. coli 細胞の脂質を含む粗洗浄可溶化 OxlT-GFP 融合タンパク質を利用する。(2)OxlTを組換え発現した大腸菌細胞を用いたin cellulo輸送アッセイ36、(3)精製OxlTで再構成されたプロテオリポソームを用いたin vitro輸送アッセイ。GFP-TSアッセイでは、野生型OxlTはシュウ酸塩の結合により熱安定性を示した。一方、変異型OxlTタンパク質Q34A, Y35A, Y124A, Y150A, N268A, R272A, W324A, K355Qでは、シュウ酸依存の熱安定化の程度は減少した（図2c）。これらの変異型OxlTタンパク質の耐熱性は、シュウ酸非存在下において野生型OxlTと大きな差がなかったことから（補足図5）、これらの残基の変異は、シュウ酸の結合親和性の低下や結合構造の安定性の低下をもたらすと考えられた。in cellulo transport assay では、大腸菌細胞内で OxlT によるシュウ酸-ギ酸交換がどの程度行われているのか、負電荷性であるが、共発現したゼノロドプシンによる光駆動の内向きプロトン移動とそれに伴う外液の pH 上昇をカップリングさせて評価している36 (Fig. 2d) 。先行研究36で活性の低下が確認された非機能変異体R272AとK355Q31,32に加えて、Q34A, Y35A, N268A, W324A, Y328A, W352AによるOxlT変異も活性を低下させていた（図2d）。最後に、精製したOxlTをプロテオリポソームに再構成したものを用いたin vitro輸送アッセイを、R272Aおよびこれまでの研究でこの方法による試験が行われていない変異体について行った（図2eおよび補足図6）。プロテオリポソームとin celluloアッセイの間には、2つのシステムの違いによる若干のずれはあるものの、同様の傾向が観察された。興味深いことに、ほとんどの変異体が結合活性と輸送活性の両方を低下させたのに対し、Y124AおよびW324A変異体は、シュウ酸結合能が低下したにもかかわらず、少なくともいずれの輸送アッセイにおいても輸送活性に大きな影響を与えなかった。これらの結果は、親和性の低下は、親和性トレードオフによる正味の取り込みの加速や基質排出の減少をもたらすという事実によって説明されると考えられる37。一方、Y328AとW352Aは、野生型OxlTと比較して、シュウ酸結合力は同等だが、シュウ酸取り込み活性は低下しており、これらの残基が触媒の回転に重要であることが示された。したがって、機能研究の結果、OxlT構造において、結合したシュウ酸の近傍にある残基が、シュウ酸の結合や輸送に重要な役割を果たすことが示唆された。
閉塞型OxlT結晶構造における基質と残基の間の相互作用は、C2ジカルボン酸シュウ酸に対して最適化されている。シュウ酸分子は結合ポケットにぴったりとはまるため、シュウ酸をクレブスサイクル中間体のような大きなジカルボン酸に置き換えると、OxlTの残基と立体衝突を起こし、閉塞したコンフォメーションが不安定になると考えられる（補足図7a）。柔軟なドッキング研究の結果、閉塞型OxlTの結合部位にC3ジカルボン酸であるマロン酸を収容できる位置が見つかったが、これは結合ポケット内のアミノ酸残基の再配置により、シュウ酸の場合と比較して相互作用が少ない（補足図7b）。このことは、マロン酸の Kd 値が 1.2 mM で、シュウ酸の 0.02 mM に比べて親和性や輸送活性が低下していることと一致する13。柔軟なドッキングを行ったとしても、閉塞したOxlTにC4ジカルボン酸が結合するポーズは観察されず、これらの分子はOxlT13による取り込みにおいてシュウ酸塩と大きく競合しないことを示す以前の報告とも一致する。GFP-TSアッセイにより、シュウ酸塩のOxlTに対する特異性が最も高いことが確認された。OxlTの熱安定化は、シュウ酸塩（C2）存在下で顕著に観察されたが、マロン酸（C3）またはコハク酸（C4）存在下では認められなかった（補足図7c）。
シュウ酸結合部位から細胞質またはペリプラズムに至るまで、TM2とTM11、TM5とTM8、TM1とTM7のペリプラズム側半分、TM4とTM10の細胞質側半分といったN末端とC末端のTMヘリックス間に広範な分子内相互作用を観察した（図2f-h）。これらの相互作用は、閉塞構造におけるドメイン間空洞の閉鎖を安定化させる。
シュウ酸結合部位の下の細胞質側では、Met128（TM4）、Pro332（TM10）、Tyr348（TM11）が関わる疎水性相互作用が観察され、次いでAsn129（TM4）とSer344（TM11）、Arg133（TM4）、Thr341とAla342（TM11）の主鎖カルボニルグループ間の極性相互作用が見られた（図2f）。これらの相互作用は、Asp78（TM2）またはAsp280（TM8）とTM11またはTM5のN末端との間に形成される細胞質端での電荷双極子相互作用によってさらに支持されている（図2g）。2つのアスパラギン酸残基は、TM2-3（'G74YFVD78KFGP82R83IP'配列、AL2-3）またはTM8-9（G276FVSD280KIGR284YK、配列、AL8-9）領域の「A様」モチーフに位置しています（補足図3）。モチーフAはMFSタンパク質に共通して保存されているモチーフの一つであり、D( + 5)はドメイン間の電荷-ヘリックス双極子相互作用に関与することが知られている38. 特に、これらのアスパラギン酸残基は、さらに細胞質側で広範なイオン性相互作用ネットワークを構成している（図2g）。具体的には、TM4のAsp78とArg133、およびTM1の下流にあるAsp137とArg16が塩橋を形成している。さらに下流では、TM5のN末端のArg139が、Asp337、Arg284、Asp280と電荷リレーネットワークを形成しています。
シュウ酸結合部位の上のペリプラズム側では、TM1のThr38（側鎖）とTM7のVal240（骨格）の間の水素結合（2.72Å）が閉塞型コンフォメーションで孔トンネルを閉鎖している（図2h）。水素結合の上では、Leu39（TM1）、Leu52（TM2）、Val244とPro245（TM7）、Val261（TM8）が疎水性相互作用を形成しています。
リガンドを含まない外向き構造
シュウ酸塩結合型OxlTでは基質結合部位が閉塞しているのに対し、リガンドを含まないOxlT（PDB ID 8HPJ、図1f）では結合部位からペリプラズム空間までの大きな空洞が開いている。空の結合部位では、電荷反発によりLys355の側鎖がArg272から反転し、シュウ酸結合型に見られる位置からずれる（図3a）。リガンドを含まない状態では、シュウ酸塩結合状態で観察されたドメイン間水素結合のほとんどが保持されている。しかし、C末端ドメインのLys355とN末端ドメインのGln34の間の水素結合は、側鎖間の距離（>~4 Å）から判断して、リガンドフリー状態では破壊されている可能性がある。また、Tyr35、Tyr150、Trp324、Tyr328といった周囲の芳香族残基の位置移動も観察された（図3b）。シュウ酸塩の不在による基質結合部位のこれらの変化は、全体構造の再配列を引き起こし、閉塞状態と外向き状態の間のコンフォメーション変化をもたらすと考えられる。特に、ペリプラズムに開口する空洞は、広範囲に渡って正電荷を帯びた表面を示した（図1fおよび図3c）。この基本的な性質は、主に結合部位のArg272とLys355に由来している。さらに、この空洞に並ぶLys45とArg248の側鎖アミノ基とGln34, Asn42, Gln56, Asn264, Asn265, Asn268のアミド基は、溶媒にさらされることになった。これらの基と、TM1、TM5、TM11の屈曲したヘリックスの正の双極子モーメントも、空洞全体の基本的な性質に寄与している（図3c）。空のリガンド結合部位のArg272とLys355による電荷反発と、キャビティの広範な塩基性表面により、シュウ酸非存在下でポケットが閉塞型に閉じるのを防ぎ、開放状態を安定化させることができると思われる。基質がない状態で開口状態のコンフォメーションが安定し、閉塞状態への移行が妨げられることは、OxlTがアンチポーターとして機能し、触媒作用の過程で基質がない状態でのコンフォメーション転換が許されないことの背景にある22、38。同様の状況は、硝酸塩/亜硝酸塩アンチポーターであるNarK29でも観察され、開いた空洞の正電荷を持つ表面が内向きのコンフォメーションを安定化させていた26。
図3：リガンドを含まない外向き型OxlT構造。
a リガンドを含まないOxlT（PDB ID: 8HPJ）の結合部位を図2aの同じ方向から見たクローズアップ写真。ドメインの色分けは図1cと同様である。破線は潜在的な水素結合を示す。 b シュウ酸結合型とリガンド非結合型のOxlTの基質結合部位構造の重ね合わせ。 c ペリプラズムに開いたキャビティのクローズアップ。空洞に露出した極性残基のモデルと、±5 kTe-1の静電ポテンシャルマップで着色した表面も示している。パネルa-cでは、鎖Aとして定義された分子を代表として示している。
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一方、リガンドを持たないOxlT構造の細胞質部分は、シュウ酸塩を結合させた構造と大きな変化は見られなかった（図1d）。
OxlTの基質結合とコンフォメーションダイナミクス
輸送サイクルに必要なコンフォメーション転換を可能にする OxlT の構造ダイナミクスを明らかにするため、シュウ酸塩が結合した閉塞型およびリガンドを含まない外向き型 OxlT の結晶構造に基づいて分子動力学（MD）シミュレーション39 を実施した。
まず、リガンドを含まない外向き構造（PDB ID 8HPJ）に対するシュウ酸塩の結合を、シュウ酸塩をタンパク質の外側に配置してシミュレーションした（図4a-cおよび補足図8）。Gln34、Tyr35、Arg272、Tyr328、Lys355では、OxlTの結合部位にシュウ酸イオンが結合することが確認された（図4b）。シュウ酸イオンの幾何学的中心と結合部位残基との距離を、カットオフ距離5Åとして、結合を決定した（図4c）。シュウ酸イオンとLys355の相互作用は、リガンドを持たない状態でのArg272との電荷反発を解消し、側鎖の配置を反転した状態から回復させた。負に帯電したシュウ酸イオンの迅速な結合は、正に帯電した広い表面によって促進される（図1fと3c）。結合したコンフォメーションの安定性は、Lys355のプロトン化状態（pKaの計算については方法を参照）に依存し、これは地域によって5から8に変化する腸の内腔pH40と結合部位の疎水性環境41の影響を受け得る。プロトン化したLys355では、1回の結合イベントが観察され、結合したシュウ酸イオンはシミュレーションの残りの時間、結合部位にほとんど留まった（図4cの上段の灰色の線）。一方、中性のLys355では、異なるシュウ酸イオンの複数の結合・非結合イベントが観察された（図4cの下パネルの色線）。この結果、プロトン化Lys355の占有率は98.6%となり、シュウ酸イオンと結合部位の距離を用いた上記の結合状態の定義で計算した中性Lys355の占有率77.0%よりも高くなる。したがって、プロトン化したLys355の方がシュウ酸解離定数が低いことが予想される。1.7μsのシミュレーション中、OxlTの外向きコンフォメーションは、外向き結晶構造からのバックボーン原子のRMSDのプロット（図4a）に示すように、安定していた。この結果は、シミュレーションで観察されたシュウ酸塩の結合は初期段階の結合様式であり、その後、結合部位の構造再配列と脱溶媒が起こり、閉塞型コンフォメーションに移行して完全に結合したコンフォメーションに適応するはずであることを示唆しています。
図4：OxlTの基質結合とコンフォメーションダイナミクス。
a-c リガンドを含まない外向きOxlT結晶構造（PDB ID 8HPJ）から開始したMDシミュレーション。 a Lys355のプロトン化状態が異なる2つの軌道について、最初の外向き結晶構造からのRMSDを異なる色で示す。 b Lys355がプロトン化したOxlTへのシュウ酸の結合のスナップショット。拡大スナップショットでは、シュウ酸イオンから15Å以内の水分子はCPK色で、15～25Åの距離の水分子は青色で示されている。c プロトン化したLys355（上）または脱プロトン化したLys355（下）の単一軌道における結合部位からのシュウ酸イオンの距離を示している。距離の算出には、シュウ酸イオンと結合部位残基の幾何学的中心を使用した。d-fシュウ酸塩と結合した閉塞型OxlT結晶構造（PDB ID 8HPK）から開始したMDシミュレーション。d閉塞型結晶構造からのRMSDを3つの独立した軌道で異なる色で示している。上段では、結合したシュウ酸イオンから15Å、8Å、4Åの距離にある水分子の数をそれぞれ茶、黄、赤でプロットしている。下のパネルでは、1000 nsのスナップショットを拡大表示とクローズアップ表示で示している。水分子の色はパネルbと同じ。補足動画1も参照。 f Gln34の反転をきっかけに、閉じた状態から外向きのコンフォメーションに移行する様子が観察された。シュウ酸イオンと結合部位残基を棒グラフで示す。Gln34は赤丸でハイライトされている。水分子はvdW表現で示した。Thr38側鎖とVal240主鎖の間の黒と赤の破線は、それぞれH結合の内と外にある距離を示している。補足動画2も参照。
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次に、シュウ酸結合状態における閉塞状態（PDB ID 8HPK）のコンフォメーションダイナミクスを調べました。1μsのシミュレーションでは、3つの独立した軌道のうち2つが閉塞状態のままであった（図4d）。閉塞状態では、シミュレーション中、ほとんどの水分子はトランスポーターのペリプラズム側と細胞質側の特定の位置でブロックされたが、一部はOxlTに入った（図4eおよび補足動画1）。水密度解析の結果、シミュレーション中にシュウ酸結合部位への水の侵入を阻む構造層が特定された（補足図9）。その一つは、ペリプラズム側のTM1のThr38とLeu39、TM7のVal244、TM8のVal261からなる疎水性層である（図4eの左下パネル）。この層は、TM7のThr38とVal240の間の水素結合（図4eの左下パネルに破線で示す）と合わせて、リガンドの細胞外側への出口を塞ぎ、したがってペリプラズムゲートの役割を果たす。もう一つの層は、細胞質側のTM4のMet128、TM10のPro332、TM11のTyr348からなる（図4eの右下パネル）。これらのペリプラズムおよび細胞質側の疎水性ゲートは、TM1-TM7の水素結合とともに、アラインメント構造（補足図10）においてOxlTと同様の位置にある残基から、既報のNarKトランスポーター42と類似性を持つことがわかった。この結果は、疎水性ゲート39が2つのトランスポーター間で保存された機構であることを示唆している。
一方、閉塞型コンフォメーションからのある軌道では、ペリプラズムゲートの開放が観察された（図4dの青線）。この遷移では、Gln34側鎖の結合部位からの反転が最初に起こった（図4f、補足図11a、補足動画2）。このGln34のフリップにより、外向き結晶構造（図3a）で観察されたように、Lys355との水素結合が破壊された。さらに、Gln34はTM1のThr38の1回転上流に位置しているため、フリップ前にも熱揺らぎによって結合がオンオフされていたThr38とVal240の間の水素結合も常に破壊された（図4fと補足図11bの破線で示す）。Gln34のフリップから約280ナノ秒後、OxlTは外部に開き始め、多くの水分子がトランスポーターに入り込んだ（図4fおよび補足動画2）。Gln34フリップは一過性のコンフォメーションであり、シミュレーションの最後の部分で外向き状態になった後、側鎖が元の位置に戻ったことは、外向き結晶構造での観察結果と一致している（補足図11a、c）。また、Gln34の反転は、ギ酸を結合部位にモデル化した閉塞状態から出発する軌道でも観察された（補足図12）。この軌道では、Gln34フリップの後、Thr38とVal240の間の水素結合が再び完全に切断され、その後、O. formigenesのペリプラズムへのギ酸放出の生理反応に従って、閉じた状態から外向きのコンフォメーションに移行した。一方、Gln34の反転は、シュウ酸結合型、ギ酸結合型ともに、構造転移を伴わない他の軌道では観察されなかった（補足図11、12）。これらの結果は、Gln34側鎖がThr38とVal240の間の水素結合とともに、閉塞型から外向き型への構造変化を阻止する「ペリプラズムゲートのラッチ」として機能していることを示唆している。実際、Q34A変異体は、野生型タンパク質と比較して、結合および輸送活性が部分的に失われており（図2c-e）、この変異が閉塞型コンフォメーションの不安定化を示していることがわかった。Gln34はThr38とともに、OFAファミリー内で厳密に保存されている（補足図3）。
Gln34のフリップ後、閉塞結合部位のシュウ酸イオンのO-C-C-O二面角は約90°になり（補足図13a）、これは溶液中で観察される値である43。これは溶液中で観測された値である43。これとは対照的に、Gln34の反転を伴わない他の2つの軌道では、シュウ酸イオンの二面角は40-50°（反転位置は130-140°）付近にとどまり、結晶構造やQM/MM計算で得られた値とほぼ同じであった（補足図13a...)。興味深いことに、シミュレーション中に外向きOxlTに結合したシュウ酸塩で観測された値は、～60°と～120°に2つのピークを持つ広範な分布であり（補足図13b）、溶液中の値とは異なり、むしろ閉じた結晶構造での値に近かった。これらのことから、結合したシュウ酸塩は、OxlTのコンフォメーションスイッチングによる環境変化に応じてコンフォメーションが変化し、トランスポーターのサイクルの次のステップに有利なコンフォメーションが採用されると考えられる。
1μsのシミュレーションでは、閉塞状態からの軌道のいずれにおいても、細胞質ゲートの開放は観察されなかった。これは、外向きのコンフォメーションを安定化させることが知られている電荷リレーネットワーク（図2g）を含むモチーフAなど、細胞質側で観察される広範なドメイン間相互作用に起因していると考えられる38。これらの結果は、閉塞状態から内向き開口状態への移行は、輸送プロセス全体の中で遅い速度論を持っていることを示唆している。シュウ酸との結合は低下しているが輸送活性は維持されている謎の変異体のひとつ、Y124A（図2c-e）は、結合したシュウ酸の下の細胞質ゲートの入り口に位置している（図2fおよび図4f）。この変異は、ゲートの疎水性層を不安定にし、輸送の律速段階であるゲートの開口部を容易にする可能性があり、その結果、輸送活性においてシュウ酸への親和性の低下を補うことができる。
考察
OxlTの2つの結晶構造とそれに基づくMDシミュレーションは、OxlTの交互アクセス輸送過程を理解する手がかりとなった（図5）。O.formigenesが腸内で形成する電気化学的な勾配にしたがって、以下のプロセスを説明する。シュウ酸の取り込みプロセスでは、OxlTはペリプラズムに面した空洞に広範な正電荷表面を示し、酸性シュウ酸の結合部位への結合を可能にします。また、この正電荷表面は、アンチポーターに不可欠な基質不在時の次の輸送ステップへの構造変化を回避することができる。しかし、シュウ酸塩の結合は、局所的な正電荷を中和し、外向きのコンフォメーションから閉塞コンフォメーションへのコンフォメーション転換を可能にします。さらに、シュウ酸塩とOxlTの相対結合自由エネルギーを計算したところ、外向き開口型に比べ閉塞型は著しく安定化する（約20 kcal/mol減少）ことがわかり、シュウ酸塩結合による構造転換の物理的根拠となった（「方法」セクションおよび補足表4参照）。閉塞状態は、結合ポケットによるサイズ制限を利用して、シュウ酸塩とクレブスサイクルのような必要な宿主代謝中間体との間の識別チェックポイントとして機能する、輸送に必須のステップである。また、シュウ酸が細胞質へ放出されると、細胞質ゲートが開き、シュウ酸が細胞質へ放出されるようになると考えられる。
図5：OxlTの輸送過程とコンフォメーションスイッチングの模式図。
右上のパネルには、ペリプラズムゲートと細胞質ゲートの距離に沿ったOxlTのコンフォメーションランドスケープが示されている。閉塞状態、外向き開口状態、Gln34による転移のMDシミュレーションにおけるゲート残基のCα距離をそれぞれ赤、黄、青で示す。現在の閉塞状態（PDB ID 8HPK）および外向き状態（PDB ID 8HPJ）の結晶構造、ならびにNark内向き結晶構造（PDB ID 4U4T）におけるゲート残基の距離も示している。
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その後、ギ酸が内向きのOxlTに結合すると、トランスポーターは閉塞状態に戻ることができる。アンチポートサイクルで閉塞状態から最初の外向き状態に戻るのに必要な構造転移は、基質に隣接する残基Gln34の側鎖が一過性に反転し、Thr38とVal240の間の水素結合が破壊されることで達成されることができる。MDシミュレーションで得られたペリプラズムゲート（Thr38-Val240）と細胞質ゲート（Met128-Pro332）の距離42,44でプロットしたコンフォメーションランドスケープは、秩序パラメータが閉塞型と外向き型をよく分けていることを示す（赤と黄色のプロット、図5挿入図）。しかし、Gln34の反転に伴う軌道は、終点の閉塞型と外向き型の結晶構造をカバーする完全な遷移を示している（図5挿入図中の青点）。1つの側鎖の反転によって引き起こされる構造変化のメカニズム、および高いグリシン比によって促進される構造の柔軟性が、OxlT12が示す急速な触媒の回転を説明すると考えられる。
これらのことから、OxlTはMFS構造を利用し、宿主動物と腸内微生物の良好な共生関係に従って進化したことが示唆された。OxlTの構造的・機能的特徴は、他のOFAファミリーの構造的・機能的特徴も示唆していると考えられる。データベースには約2,000のOFAメンバーが登録されており45、OxlT以外は機能的に未解明である。したがって、本研究は、未知の「暗い」タンパク質ファミリーの理解にも貢献するものである。OxlTの内向き構造（図5挿入図中の点線円）を明らかにすることは、OxlTの構造生物学を理解する上で次の課題である。
研究方法
倫理観の表明
すべての動物実験は、「日本実験動物飼育・使用指針」のガイドラインに準拠し、東京大学動物実験委員会の承認を得た（許可番号：RAC07101）。
OxlTの調製
O. formigenes株OxB46由来のC末端非a-Hisタグ付きOxlTを、大腸菌XL3にて20℃で24時間、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）47で発現した。細菌細胞を溶解バッファー（50 mM Tris-HCl、200 mM 酢酸カリウム、1 mM EDTA、1 mM PMSF、5 mM MgCl2、20 µg/mL DNaseI および 0.23 mg/mL リゾチーム、pH 8.0） に懸濁し、EmulsiFlex C-5（Avestin） により破砕した。遠心分離（9,600×g、30分）により細胞破片を除去し、次に遠心分離（185,000×g、1時間）により細胞膜を回収した。膜画分を緩衝液A（20mM HEPES-KOH、200mM 酢酸カリウム、10mM シュウ酸カリウム、20％グリセロール、pH8.0）に40mM n-dodecly-β-D-maltoside（DDM）で可溶化し、XK16カラム（GEヘルスケア）のNi-NTA Superflow樹脂（QIAGEN）またはHisTrap FF crude（GEヘルスケア）に適用した。カラムを1mM DDMと30-50mMイミダゾールを含むバッファーAで洗浄し、1mM DDMと250mMイミダゾールを含むバッファーAでタンパク質を溶出した。
抗体フラグメントの調製
精製した機能性OxlTを、免疫反応を促進するために、卵ホスファチジルコリン（PC）（Avanti Polar Lipids）とアジュバントリピッドA（Sigma）の10：1混合物からなるリン脂質ベシクルに高密度で再構成してプロテオリポソーム抗原を調製した。BALB/cマウス（7週齢の雌）に、2週間間隔で3回の注射を用いて、プロテオリポソーム抗原を免疫した。マウスは、周囲温度23±3℃、湿度40-60％の条件下で、12時間の明暗サイクルで飼育した。
D5901Fab
OxlTに対するマウスモノクローナル抗体は、以前に記載されたとおりに選択した48。抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、従来の融合プロトコルを用いて作製した。OxlT のコンフォメーションエピトープを認識する抗体を産生するハイブリドーマクローンは、精製 OxlT を含む固定化リン脂質ベシクルでリポソーム酵素結合免疫吸着法（ELISA）により選択し、 OxlT のネイティブコンフォメーションを認識する抗体のポジティブ選択を可能にしました。SDSで変性したOxlTに対する抗体の結合が減少していることを示す追加のスクリーニングは、直鎖エピトープを認識する抗体に対するネガティブセレクションに使用された。OxlTと各抗体クローンとの安定した複合体形成は、蛍光検出式サイズ排除クロマトグラフィーで確認した。モノクローナルハイブリドーマの大規模培養上清から採取し、プロテインGアフィニティークロマトグラフィーで精製した全IgG分子をパパインで消化し、HiLoad 16/600 Superdex200ゲルろ過後プロテインAアフィニティークロマトグラフィーでFabフラグメントを分離した。Fabの配列は、ハイブリドーマ細胞から単離した総RNAを用いた標準的な5′-RACEによって決定された。
20D033Fv
OxlTに対する一本鎖Fv（scFv）断片は、免疫マウスファージディスプレイ抗体ライブラリー49からスクリーニングされた。免疫マウスを安楽死させ、脾臓細胞RNAを分離し、逆転写PCRでcDNAに変換した。VLおよびVHレパートリーは、18アミノ酸のフレキシブルリンカーを介して組み立てられ、ファージディスプレイベクターpComb3XSSにクローニングされた。ビオチン化プロテオリポソームは、卵PCと1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-（cap biotinyl）（16:0 biotinyl Cap-PE; Avanti）の混合物で OxlTを再構成して調製し、 scFv-phage選択用結合標的として使用した。ターゲットはストレプトアビジンコート常磁性ビーズ（Dynabeads）またはストレプトアビジンコートマイクロプレート（Nunc）に固定化された。バイオパニングを4回行った後、個々のコロニーのペリプラズム抽出液に対してリポソームELISAを実施した。陽性クローンを集め、Biacore T100（GE Healthcare）を用いて評価した。
抗体scFvフラグメントは、分子間でドメインが入れ替わった二量体を形成する可能性があり、二量体-二量体の平衡が構造の不均一性を高める可能性があるため、結晶化シャペロンとして使用するには好ましくない。そこで、Fvフラグメントを結晶化実験に使用した。Fvフラグメントは、iRATシステム50を用いてBrevibacillus choshinensisで発現させた。培養上清を60%硫酸アンモニウム飽和に調整し、沈殿物をペレット化し、TBS緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM, NaCl）に溶かし、同じ緩衝液に対して一晩透析した。透析したタンパク質を、緩衝液B（10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole）で平衡化したNi-NTA樹脂と混合した。結合したタンパク質は、バッファC（10 mM Tris-HCl、pH7.5、150 mM NaCl、250 mMイミダゾール）で溶出し、TEV-His6と混合してTBSバッファーに対して一晩透析させた。タグのないFvフラグメントを濃縮し、TBSバッファで平衡化したHiLoad16/60 Superdex75カラム（GE Healthcare）にロードした。ピーク画分をプールして濃縮し、液体窒素で瞬間凍結して-80℃で保存した。
結晶化
D5901Fabと複合化したシュウ酸結合OxlTの結晶化のために、精製OxlTと精製D5901Fabを1：1.3のモル比で4℃で一晩混合し、ランニングバッファとしてバッファD (20 mM MES-KOH, 200 mM 酢酸カリウム、10 mM シュウ酸カリウム、20%グリセロール、0.51 mM DDM, pH 6.2) を使用する HiLoad16/60スーパーデックス200 pg カラム (GE healthcare) に適用しました。精製したサンプルをバッファE（20 mM MES-KOH、10 mMシュウ酸カリウム、0.51 mM DDM、pH 6.2）で透析した。精製サンプル（〜10 mg/mL）を0.1 Mクエン酸ナトリウム、pH 5.5、0.05 M NaClおよび26%（v/v）PEG400のリザーバー溶液と混合し、20℃で座滴蒸気拡散法により結晶を得た。結晶は、データ収集の前に液体窒素で凍結した。
20D033Fvと複合化したリガンドフリーOxlTの結晶化のために、精製OxlTを精製20D033Fvと1：2のモル比で4℃で一晩混合し、バッファF（20mM MES-KOH、100mM 酢酸カリウム、10mM シュウ酸カリウムおよび0.02％ DDM、pH 6.2）でSuperdex200 Increase 10/300 GL（GEヘルスケア）を用いて精製した。精製されたサンプルは、脂質メソフェーズに再構成された。タンパク質-LCP混合物は、50％（w/w）タンパク質溶液、45％（w/w）モノオレイン（Sigma）および5％（w/w）コレステロール（Sigma）を含んだ。得られた脂質性メソフェーズを50μLの滴として96ウェルガラスプレートに分注し、NT8-LCP結晶化ロボット（Formulatrix）を用いて0.8μLの沈殿剤溶液を重ね、薄いカバーガラスで覆った。結晶化セットアップと96ウェルガラスサンドイッチプレート（Molecular Dimension）は、20℃でインキュベートした。以下の沈殿条件下で、1週間で結晶を得た： 100 mM Glycine, pH 9.0, 26-36% (v/v) PEG400, および 50-150 mM MnCl2. 結晶は、Mesh Litholoops (Protein Wave) を用いて脂質性メソフェーズから直接採取し、液体窒素でフラッシュ冷却した。
データ収集と構造決定
シュウ酸塩結合型OxlTと配位子を持たないOxlTのX線回折データは、SPring-8ビームラインBL41XUにおいて、MX225HE（Raynoix）およびEIGER X 9 M検出器（Dectris, Ltd）を用いて、それぞれBSS51制御および100Kで作動するクライオストリーム下で1.0 Åで収集した。BLEND53、XDS54、XSCALE55を利用したKAMOシステム52を用いて、データのマージ、統合、2.6 Å（シュウ酸結合OxlT）および3.1 Å（リガンドフリーOxlT）へのスケーリングを行った（補足表1）。データはSTARANISOサーバー56を使用して異方性の補正を行った。この補正により、高分解能のシェルでは球面完成度が非常に低い弱い反射が多数削除された。精緻化には、3.0 Å（シュウ酸結合 OxlT）および 3.3 Å（リガンドフリー OxlT）までのデータのうち、最も高いシェルのデータをそれぞれ 25%（シュウ酸結合 OxlT）および 22%（リガンドフリー OxlT）以上含んでいるものを使用しました。結晶構造は、PHASER57を用いた分子置換法で解いた。検索モデルは、グリセロール-3-リン酸トランスポーターGlpTのN末端とC末端の構造（PDB ID: 1PW4）58とFabフラグメント（PDB ID： シュウ酸結合型OxlTは1XF4）59、リガンドフリーOxlTは本研究で決定したシュウ酸結合型OxlTのN末端とC末端の半分（それぞれ11-199と204-404）とscFvフラグメント（PDB ID: 5B3N）60の構造である。構造モデルはCOOT61で手動で再構築し、Phenix62で精密化した。リガンドフリーOxlT結晶では、OxlTの2つのユニット（チェーンAとD）が非対称に存在することが確認された。両者の間に大きな構造差は見られなかった（残基15-410のCα RMSDは0.365 Å）。データ収集と精密化の統計を補足表1および2に示す。MolProbity63で解析したラマンチャンドラン統計は、シュウ酸結合型OxlTでは97.8%が有利、2.2%が許容、0.0%が外れ値となり、リガンドを含まないOxlTでは97.5%が有利、2.5%が許容、0.0%が外れ値となりました。
リガンド結合アッセイ
OxlT のリガンド結合は GFP thermal shift assay (GFP-TS) 35 を用いて評価した。C末端GFPuv融合OxlTの発現ベクターは以前に構築した23。PrimeSTARMax（タカラバイオ）と補足データ1に記載したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRにより、ベクターに変異を導入した。このタンパク質は、基本的にBL21(DE3)で、サブセクション「OxlTの調製」に記載したように発現させ、OD600が0.8〜0.9のときにタンパク質生産を開始し、20℃で20時間誘導した。
C末端GFPuv融合OxlTを発現する細菌細胞を緩衝液G（20mM HEPES-KOH、300mM酢酸カリウム、pH7.0）に懸濁し、UD201（TOMY）を用いた超音波処理により破砕した。膜画分を得るために、遠心分離（17,800×g、4℃で15分間）により細胞破片を除去し、上清を252,000×g、4℃で30分間遠心分離をした。膜画分は、緩衝液Gでの懸濁を2回繰り返した後、252,000×g、4℃で30分間の超遠心分離を行うことで洗浄した。20mL培養液の膜画分を、1%(w/v)のDDMを含む240または480μLのバッファーGで可溶化した。4℃で1時間可溶化した後、161,000×g、20分間、4℃で超遠心分離して不溶物を除去した。
変異体アッセイでは、洗剤で可溶化した野生型および変異型OxlT-GFPuvタンパク質を1%DDMを含むバッファGで希釈し、同じ蛍光強度を与えるOxlT-GFPuv濃度を調整した。この溶液を3mMシュウ酸カリウムの存在下または非存在下で、氷上で1時間インキュベートした。リガンドアッセイでは、野生型OxlT-GFPuv溶液を10mMシュウ酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウムの存在下または非存在下でインキュベートした。インキュベーション後、緩衝液G中のオクチル-β-D-グルコシドを最終濃度1％になるように添加し、C-1000 Touch Thermal Cycler（BIO-RAD）を用いて溶液を30〜80℃で10分間熱変性させた。次に、凝集した画分を、溶液を10,740〜15,340×g（TOMY PCR96-02ローターを用いて14,000rpm、ローター内のチューブ位置による）で4℃、20分間遠心分離して除去した。得られた上清を384ウェルLow Volume Black Microplate（Corning）に分注し、Varioskan Flash（Thermo Fisher Scientific）を用いて励起波長395 nm、発光波長507 nmで蛍光強度を測定した。観測された蛍光強度は、バッファーバックグラウンドの値を差し引き、熱変性していないサンプルの値を1、バックグラウンドの値を0として正規化した。見かけの融解温度（Tm）値は、Kaleidagraph（Hulinks）を用いて、蛍光強度値をGibbs-Helmholtz方程式64に当てはめ、対象タンパク質がフォールディング状態とアンフォールディング状態の間で平衡状態にあると仮定し、アンフォールディングのエンタルピーと熱容量変化（ΔH、ΔCp）およびTmを独立変数として設定して推定しました。データは、Prism 8（GraphPad）において、野生型（WT）を基準として、Dunnettの検定による両側一元配置分散分析で分析した。統計的有意性は、*P < 0.05と定義した。
輸送アッセイ
OxlT の輸送活性は、組換え大腸菌を用いた in cellulo システムと精製 OxlT を再構成したプロテオリポソームを用いた in vitro システムの両方を用いて評価した。変異型OxlTアッセイでは、PrimeSTARMaxとSupplementary Data 1に記載されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行い、OxlT発現ベクターpRSF-OxlT36に変異を導入した。
in cellulo assay では、OxlT 活性は、以前に記述したように、大腸菌で共発現したゼノロドプシンによる光駆動の内向きプロトン移動とカップリングして測定した36。簡単に説明すると、OxlTとxenorhodopsinの発現ベクターで形質転換した大腸菌BL21（DE3）細胞を37℃で培養し、1 mM IPTGと10 μM all-trans retinal（Sigma）の添加により600 nmでの吸光度が0.8-0.9でタンパク質生成を誘導した。20℃で20時間培養した後、大腸菌の細胞を遠心分離で集め、50mM K2SO4で660nmのODが〜10の細胞密度になるように懸濁した。細胞懸濁液の光によるpH変化を、25℃で連続攪拌しながらpH電極でモニターした。まず、サンプルのpHが安定するまで、細胞懸濁液を暗所に置きました。次に、シャープカットフィルターY44（420nm以上のロングパスフィルター、HOYA）を通してXeランプで試料を10分間照射し、シュウ酸塩非存在下でのpH変化（ΔpH0）をモニターした。光強度は、光パワーメーターと光センサーを用いて、550nmで〜150mW/cm2に調整した。照明したサンプルを暗所に戻し、pHが安定したら、5 mMのシュウ酸カリウムをサンプルに加え、OxlTによる輸送を10分間可能にしました。再び上記と同じ条件で試料を照明し、pHの変化（ΔpHS）をモニターした。輸送活性は、ΔpHSとΔpH0の間のpH変化の差（ΔΔpH）で評価した。これはさらに、ゼノロドプシンを単独で発現する大腸菌で測定したバックグラウンドの差分pH変化（ΔΔpH）を差し引くことによって補正した。各変異体の活性は、補正したΔΔpHと、実験と同じ日に測定した野生型OxlTのPenta・His Antibody（QIAGEN, Cat.No. 34460, 1:2000 希釈）を用いたウェスタンブロッティングによって分析した相対発現レベルによって正規化した（補足図14；ノンクロップブロットはソースデータファイル内にある）。また、Y150A変異体のアッセイも行ったが、この変異体は原因不明でゼノロドプシンの発現量に影響を与えたため（補足図14）、Y150Aの結果を本論文から除外した。
in vitro アッセイでは、WT および変異 OxlT タンパク質を、上記および「OxlT の調製」小項目で述べたように発現および精製し、若干の修正を加えた。OxlTタンパク質は、溶出バッファー中のグリセロールの不在下でNi-NTA樹脂から溶出し、20mM MES-KOH、200mM酢酸カリウム、0.2mM DDM、pH6.2で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラム Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) 上で精製した。単量体画分をプールし、1 mg/mlまで濃縮し、20%(v/v)のグリセロールを加え、定量し、分注し、さらに使用するために瞬間凍結させた。プロテオリポソームは、Lee et al.65に記載されているものと同様に調製した。大腸菌全脂質抽出物（Avanti社製、クロロホルム中）をガラス管に分注し、窒素ガス気流下、室温で5分以上溶媒を蒸発させた。ユニラメラベシクルを得るために、乾燥した大腸菌脂質を、50mM MOPS-KOHと10mMギ酸カリウムを含むpH7.0の溶液に6.7mg/mlで再懸濁し、ウォーターバスソニケーターで45秒間超音波処理した。この一枚膜小胞を、脂質：タンパク質比が200：1（w/w）の精製OxlTバリアント、または相当量のコントロールバッファー（50 mM MOPS-KOH with 1.57 mM DDM, OxlT溶液と同量）をマイクロチューブに入れ、液体窒素と水浴を用いて凍結融解を3サイクル行い再構築をした。再構成した一枚膜小胞を、氷上でハンドプローブ装置を用いて合計15秒間3回超音波処理し、直径<200 nmの（プロテオ）リポソームを形成させた。
リポソーム溶液に50 mMのシュウ酸カリウムを加え、20℃でシュウ酸塩取り込みアッセイを開始した。実験を開始する前に、AG1-X8陰イオン交換樹脂（BioRad）を1：1（w/v）量の150mM酢酸ナトリウム、pH8.2で平衡化し、スピンカラムで400μLスラリーを700×g、4℃で1分間遠心分離して準備した。全部で50μLの反応液を、図に示した時間のインキュベーション直後またはインキュベーション後に採取した。反応液をAG1-X8スピンカラム上にアプライし、700×g、4℃で1分間遠心分離することにより、リポソーム外のシュウ酸イオンを除去し、マイクロチューブにサンプルを回収した。その後、各サンプルに10％（w/v）Triton-X100（ナカライテスク）溶液を5μL添加し、リポソーム内に輸送された、またはリポソームに付着したシュウ酸イオンを含むリポソームを溶解させた。シュウ酸イオンの濃度は、OxOx（B. subtilis, Biovision）を用いた酸化反応と Oxalate Oxidase (OxOx) Assay Kit (Abcam) を用いて測定した。10μLのリポソーム溶解液と10μLの検出バッファー（9μL OxOx Assay Buffer, 0.4μL OxOx Converter, 0.2μL Red Probe, 0.02μg OxOx, 最大10μLまで水と混合）を低容量384穴プレート（コーニング）の各ウェルでマルチチャネルピペットで混合した。このプレートを直ちにVarioskan Flashで、励起波長535nm（バンド幅12nm）、発光波長587nm、積分時間200msec、20秒間隔で、室温で合計83分間、蛍光速度論モードで読み取った。蛍光時間曲線の初期傾きは、最初の600秒のデータを線形回帰して求め、OxOx反応の初期速度として解釈し、この測定条件ではシュウ酸塩濃度と線形に相関していた（補足図6）。OxlT 変異体および陰性対照について、少なくとも 2 つの独立したリポソーム調製およびシュウ酸塩輸送アッセイを実施し、各条件について OxOx アッセイを二重または四重反復で実施した。最後の棒グラフは、60分でのWTデータの平均値に対して正規化した値を表示する。
データ（in vitroアッセイの場合は60分でのもの）は、WTを基準としてPrism 8でDunnettの検定による両側一元配置分散分析により分析した。統計的有意性は、*P < 0.05と定義される。
分子動力学シミュレーション
OxlT の結晶構造を初期構造として使用し、中央ループの欠損残基を MODELLER66 でモデリングした。プロトン化状態は、PROPKA 3.167,68を用い、デフォルトのパラメータで解析した。解析の結果、Lys355は外向き構造でpKa値7.00の偏差を示した。この偏差は、閉塞構造では観察されなかった（pKa値8.61）。したがって、Lys355のプロトン化状態は、外向き構造では両方とも考慮された。OxlTタンパク質は、CHARMM-GUIのMembrane Builderプラグインを使用して膜に埋め込まれた69,70。xとyの寸法が120Åの1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylethanolamine（POPE）二重層が使用されました。このPE脂質は、OxlTの由来となったO. formigenes71と輸送アッセイが行われた大腸菌72の両方で主要な成分である。また、他の特定の脂質が OxlT の活性に必要であることを示す証拠はない。タンパク質-膜系を TIP3P 水分子と 150 mM KCl で溶かし、z 次元の長さを 100 Å とした後、AmberTools1773 を用いて 87 Cl- をすべて 58 シュウ酸イオンで置き換え、溶液中のシュウ酸モデルのスケール有効電荷 (-1.5e) を考慮することで総電荷は変化させませんでした（下記 ECCR 参照）。最終的なMDシステムには、閉塞したOxlT系と外向きのOxlT系について、それぞれ146015と143611の原子が含まれていました。その後、NAMD 2.1274を使用してMDシミュレーションを実施しました。タンパク質と膜を表現するために、それぞれAmber ff14SBとLipid14力場が採用された75,76。溶液中のシュウ酸リガンドは、Kroutilらによって開発されたAb Initio Molecular Dynamicシミュレーションに基づく電子連続体補正と再スケーリング（ECCR）により決定されたパラメータで記述した43,77. OxlTの結合部位にあるシュウ酸リガンドは、タンパク質環境が水溶液と異なることを考慮し、ECCR補正を適用せずに拘束静電ポテンシャル（RESP）スキーム78で決定したパラメータを用いて記述しました。RESPの電荷は、Antechamberソフトウェア79によって計算された。シュウ酸アニオンのバルクでの溶媒和、カルシウムカチオンとの複合化、吸着表面過程のシミュレーションはいくつかのMD研究で行われているが、我々の知る限り、タンパク質との複合化をシミュレーションした研究はまだない80, 81, 82. MDシステムは10,000ステップの最小化で設定し、NVTアンサンブルで0から10Kまで1度あたり0.1nsのステップで加熱し、NPTで10から310Kまで30度あたり0.2nsのステップで、310KでのNPTアンサンブルシミュレーションで10nsの平衡化を行い、NPT条件で閉塞型と外向き型の OxlT（Lys355の各プロトン化状態）システムについてそれぞれ 1.0 μsと 1.7 μsの実走行を実行した。温度はランジュバンサーモスタットで310Kに保ち、圧力はノゼフーバーランジュバンピストンで1気圧に設定した。周期的境界条件を適用し、長距離静電相互作用は、実空間カットオフ12Å、スイッチ関数10Åの粒子メッシュEwald法で処理した。
ギ酸塩を用いたシミュレーション系を構築するために、シュウ酸塩のLys355に向かうカルボキシル酸部分を、シュウ酸塩結合閉塞構造の水素原子に置換し、ギ酸塩-OxlT複合体の初期構造を生成しました。さらに、負電荷の損失を考慮し、K+イオンを削除し、水分子に置き換えた。ギ酸塩にはGAFF力場パラメータ79が使用された。上述と同じ平衡化および生成プロトコルを実行した。平衡化ステップの終了時に OxlT タンパク質が完全に弛緩することで、より小さなリガンドに対する結合部位の良好な調整と、製造実行時の現実的なコンフォメーションが保証されます。
シミュレーションシステムの概要として、初期構造（外開き構造または閉塞構造）、Lys355のプロトン化状態、結合リガンド（シュウ酸またはギ酸；閉塞構造の場合）の組み合わせが異なる4つのシステムを構築しました。補足表5では、これらのシミュレーションシステム、トラジェクトリーの数、総シミュレーション時間をまとめている。
シュウ酸とOxlTの相対的な結合自由エネルギーは、MMPBSA.py83に実装されているMM/GBSA法によって計算された。MM/GBSA法では、結合自由エネルギーは気相エネルギーと溶媒和エネルギーに分解され、それぞれ分子力学力場（MM）と溶媒アクセス表面積（GBSA）を用いた一般化Born陰溶媒モデルによって計算されます。なお、エントロピー効果は計算に含まれていない。閉塞状態から外向き開口状態への構造変化を示す軌跡を解析した（図4d, fおよび補足図13a）。軌道は、シュウ酸二面体が50°の閉じたOxlT（0-40 ns；OxlT-occ-dih50と表記）、シュウ酸二面体が90°の閉じたOxlT（41-320 ns；OxlT-occ-dih90 ）、シュウ酸二面体が90°の外側に開いたOxlT（321-1000 ns；OxlT-op-dih90 ）に分割された。MM/GBSA結合自由エネルギーは、各軌跡段階について決定した（補足表4参照）。
シミュレーション中の水密度は、タンパク質をセンタリングして重ね合わせた後、MDAnalysis84のモジュールによって計算されました。
QM/MM計算
シュウ酸塩結合構造（PDB ID 8HPK）を用いて、いくつかのQM/MMモデルを用い、シュウ酸塩の内部構造に対する結合部位の環境の関連性を評価した。まず、シュウ酸リガンドをQM部分に、タンパク質全体をMM部分に割り当てた。次に、リガンドと直接相互作用する残基（Gln34, Tyr35, Tyr124, Arg272, Lys355）のファーストシェルをQMパートに追加した。第三に、結合部位の第二シェル（Tyr150、Trp324、Tyr328、Trp352）をQMパートに加え、シュウ酸リガンドを取り巻く完全な結合部位環境を構築しました。すべてのQM/MM計算は、Gaussian 1686に実装されたONIOM85で行われた。密度汎関数理論（DFT）法87,88を用い、B3LYP/6-31 + G（d,p）レベルの理論89,90でQM領域を扱い、Beck-Johnsonダンピング（D3BJ）91によるGrimmeの分散補正も行った。MM領域は、MDシミュレーションと同じ力場を用いて記述した。MM領域がQM電子密度を極性化するような電子埋め込みスキームを使用した。QM領域とMM領域の共有結合を扱うため、QM領域に位置する各残基のα炭素とβ炭素の間に明示的にリンク原子を追加した。ポテンシャルエネルギー曲面の極小値は、虚数周波数を持たないことで確認された。結合部位残基の側鎖を固定したシュウ酸リガンドの純粋なDFT計算を、QM/MM計算と同じQMレベルの理論で追加実施した。QM/MM計算と同様に、ポテンシャルエネルギー曲面上の定常点として得られた最適化構造は、虚数周波数のない真のエネルギー的極小値であった。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
OxlTの座標と構造因子は、Protein Data Bankにアクセッション番号8HPK (OxlT-fab complex; Oxalate-bound occluded form) 92と8HPJ (OxlT-Fv complex; ligand-free outward-facing form) 93で寄託されています。MD関連データはZenodoリポジトリ[https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686]94に寄託されています。PDBIDが1PW458, 1XF459, 5B3N60, 4U4W95, 4U4T96の座標とOFAファミリーのアミノ酸配列（IPR026355）は本研究で使用した。出典データは本論文に添付されています。
参考文献
Marengo, S. R. & Romani, A. M. 腎結石症におけるシュウ酸塩：どうしても消えない終末代謝物。Nat. Clin. Pract. Nephrol. 4, 368-377 (2008).
記事CAS PubMed Google Scholar
Massey, L. K. 食品シュウ酸塩：測定、生物学的変動、バイオアベイラビリティに影響する因子。J. Am. Diet. Assoc. 107, 1191-1194 (2007).
記事 PubMed Google Scholar
Miller, A. W. & Dearing, D. The metabolic and ecological interactions of oxalate-degrading bacteria in the Mammalian gut. Pathogens 2, 636-652 (2013).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Allison, M. J., Dawson, K. A., Mayberry, W. R. & Foss, J. G. Oxalobacter formigenes gen., sp. nov.: 胃腸管に生息するシュウ酸分解嫌気性菌. Arch. Microbiol. 141, 1-7 (1985).
記事CAS PubMed Google Scholar
Daniel, S. L. et al. 40 years of Oxalobacter formigenes, a gutsy oxalate-degrading specialist. Appl. Environ. マイクロビオール．87, e0054421 (2021).
記事 PubMed Google Scholar
Mehta, M., Goldfarb, D. S. & Nazzal, L. The role of microbiome in kidney stone formation（腎結石形成におけるマイクロバイオームの役割）. Int. J. Surg. 36, 607-612 (2016).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Sidhu, H. et al. 嚢胞性線維症患者におけるOxalobacter formigenesの不在：高酸化尿症のリスクファクター。Lancet 352, 1026-1029 (1998).
記事CAS PubMed Google Scholar
炎症性腸疾患におけるOxalobacter formigenesのコロニー形成の頻度の低さ：腎結石形成における役割の可能性(Kumar, R., Ghoshal, U. C., Singh, G. & Mittal, R. D.) J. Gastroenterol. Hepatol. 19, 1403-1409 (2004).
記事 PubMed Google Scholar
Allison, M. J., Cook, H. M., Milne, D. B., Gallagher, S. & Clayman, R. V. ヒト由来胃腸細菌によるシュウ酸塩分解. J. Nutr. 116, 455-460 (1986).
記事CAS PubMed Google Scholar
Pao, S. S., Paulsen, I. T. & Saier, M. H. Jr. Major facilitator superfamily. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 1-34 (1998).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Anantharam, V., Allison, M. J. & Maloney, P. C. Oxalate:formate exchange. オキサロバクターにおけるエネルギー結合の基礎となる。J. Biol. Chem. 264, 7244-7250 (1989).
記事CAS PubMed Google Scholar
Ruan, Z. S. et al. Oxalobacter formigenes のシュウ酸：ギ酸アンチポートタンパク質 OxlT の同定、精製、再構築。J. Biol. Chem. 267, 10537-10543 (1992).
論文CAS PubMed Google Scholar
Maloney, P. C., Anantharam, V. & Allison, M. J. 可溶化膜担体の基質解離定数の測定。Oxalobacter formigenesの陰イオン交換タンパク質OxlTの基質安定化。J. Biol. Chem. 267, 10531-10536 (1992).
記事CAS PubMed Google Scholar
Pajor, A. M. SLC13ファミリーのナトリウム共役型ジカルボン酸およびクエン酸トランスポーター. Pflug. アーチ．466, 119-130 (2014).
記事CAS Googleスカラー
Abramson, J. et al. Escherichia coliのラクトースパーミアーゼの構造と機構. Science 301, 610-615 (2003).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M. & Wang, D. N. Escherichia coli由来グリセロール-3-リン酸トランスポーターの構造と機構. Science 301, 616-620 (2003).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Jardetzky, O. メンブレンポンプの単純なアロステリックモデル。Nature 211, 969-970 (1966).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Yan、N. Major Facilitator Superfamilyトランスポーターの構造生物学。Annu. Rev. Biophys. 44, 257-283 (2015).
記事CAS PubMed Google Scholar
Quistgaard, E. M., Low, C., Guettou, F. & Nordlund, P. Major Facilitator Superfamily (MFS) による輸送の理解：構造が道を切り開く。Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 123-132 (2016).
記事CAS PubMed Google Scholar
Drew, D., North, R. A., Nagarathinam, K. & Tanabe, M. Major Facilitator Superfamily (MFS) による構造と一般的な輸送機構. Chem. Rev. 121, 5289-5335 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Hirai, T. et al. 細菌のシュウ酸トランスポーターの三次元構造。Nat. Struct. Biol. 9, 597-600 (2002).
CAS PubMed Google Scholar
バクテリアのシュウ酸トランスポーターOxlTの構造と輸送機構. Biophys. J. 87, 3600-3607 (2004).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
蛍光検出と流体力学的状態評価が可能な膜タンパク質の高分解能Native-PAGE. Anal. Biochem. 412, 217-223 (2011).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Hunte, C. & Michel, H. 抗体フラグメントを介した膜タンパク質の結晶化。Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 503-508 (2002).
記事CAS PubMed Google Scholar
Bukowska, M. A. & Grutter, M. G. 結晶化を促進するための新しい概念と補助具。Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 409-416 (2013).
記事CAS PubMed Google Scholar
NarKによる硝酸塩/亜硝酸塩アンチポートの動的機構の構造的根拠を明らかにした。Nat. Commun. 6, 7097 (2015).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Nomura, N. et al. 哺乳類果糖トランスポーターGLUT5の構造と機構. Nature 526, 397-401 (2015).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Javadpour, M. M., Eilers, M., Groesbeek, M. & Smith, S. O. ポリトピック膜タンパク質におけるヘリックスパッキング：膜貫通ヘリックス結合におけるグリシンの役割. Biophys. J. 77, 1609-1618 (1999).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Zheng, H., Wisedchaisri, G. & Gonen, T. 硝酸塩/亜硝酸塩交換体の結晶構造. Nature 497, 647-651 (2013).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
シュウ酸ジアニオン, C2O42-: 平面的か非平面的か？J. Chem. Educ. 89, 417-418 (2012).
論文CAS Google Scholar
Oxalobacter formigenesのシュウ酸-ギ酸トランスポーターOxlTの構造/機能相関。膜貫通ヘリックス11のトランスロケーション経路への割り当て。J. Biol. Chem. 276, 8753-8760 (2001).
論文CAS PubMed Google Scholar
Yang, Q. et al. Oxalobacter formigenes のシュウ酸トランスポーター OxlT のホモロジーモデルに関する実験的検証。Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 8513-8518 (2005).
記事ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wang, X., Sarker, R. I. & Maloney, P. C. Oxalobacter formigenesのシュウ酸塩：ギ酸塩アンチポーターOxlTにおける基質結合要素の解析. Biochemistry 45, 10344-10350 (2006).
記事CAS PubMed Google Scholar
Wang, X., Ye, L., McKinney, C. C., Feng, M. & Maloney, P. C. システイン走査型変異導入によるTM5の変化から、Oxalobacter formigenesのシュウ酸トランスポーター、OxlTのコンフォメーション変化が明らかになった。Biochemistry 47, 5709-5717 (2008).
記事CAS PubMed Google Scholar
Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M. & Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nat. Commun. 9, 4253 (2018).
記事ADS PubMed Central Google Scholar
光駆動プロトンポンプを共発現する大腸菌を用いたエレクトロジェニックトランスポーターの光遺伝学的アッセイ法.林真理子、小島健太郎、須藤祐一郎、山下明彦 Protein Sci. 30, 2161-2169 (2021).
論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Bosdriesz, E. et al. 低親和性ユニポーターキャリアタンパク質は、排出を減らすことで正味の基質取り込み率を高めることができる。Sci. Rep. 8, 5576 (2018).
記事ADS PubMed Central Google Scholar
Zhang, X. C., Zhao, Y., Heng, J. & Jiang, D. MFSトランスポーターのエネルギーカップリング機構. Protein Sci. 24, 1560-1579 (2015).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
岡崎恭子ほか：電気陰性ナトリウム/プロトンアンチポーターPaNhaPの遷移経路撮影による機構解明。Nat. Commun. 10, 1742 (2019).
記事ADS PubMed Central Google Scholar
Koziolek, M. et al. intellicap((R))システムを用いた空腹時の消化管におけるpHおよび温度プロファイルの調査. J. Pharm. Sci. 104, 2855-2863 (2015).
記事CAS PubMed Google Scholar
高山雄三、Castaneda, C. A., Chimenti, M., Garcia-Moreno, B. & Iwahara, J. Direct evidence for deprotonation of a lysine side chain buried in hydrophobic core of a protein. J. Am. Chem. Soc. 130, 6714-6715 (2008).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Feng, J., Selvam, B. & Shukla, D. アンチポーターはどのようにして細胞膜上で基質を交換するのだろうか？NarKの完全な交換サイクルを原子レベルで記述した。Structure 29, 922-933.e923 (2021).
記事CAS PubMed Google Scholar
Kroutil, O., Predota, M. & Kabelac, M. Force Field parametrization of hydrogenoxalate and oxalate anion with scaled charges. J. Mol. モデル 23, 327 (2017).
記事 PubMed Google Scholar
Stelzl, L. S., Fowler, P. W., Sansom, M. S. & Beckstein, O. Flexible gates generate occluded intermediates in transport cycle of LacY. J. Mol. Biol. 426, 735-751 (2014).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Blum, M. et al. The InterPro protein families and domains database: 20 years on. Nucleic Acids Res. 49, D344-D354 (2021).
記事CAS PubMed Google Scholar
Oxalobacter formigenesのシュウ酸：ギ酸交換タンパク質OxlTのエシェリヒア・コリでのクローニング、配列決定、および発現を行った。J. Biol. Chem. 271, 6789-6793 (1996).
論文CAS PubMed Google Scholar
Oxalobacter formigenesのシュウ酸トランスポーターOxlTの二次構造を円偏光二色性分光法で評価した。J. Biol. Chem. 272, 2129-2135 (1997).
記事CAS PubMed Google Scholar
Jaenecke, F. et al. 多剤耐性トランスポーターMdfAの結晶化のためのコンフォメーション特異的抗体フラグメントの作製。メソッズ・モル. Biol. 1700, 97-109 (2018).
記事CAS PubMed Google Scholar
Suharni et al. Proteoliposome-based selection of the recombinant antibody fragment against human M2 muscarinic acetylcholine receptor. モノクロン。Antib. Immunodiagn. イミュノサー．33, 378-385 (2014).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Nomura, Y. et al. Intervening Removable Affinity Tag (iRAT) production system facilitates Fv antibody fragment-mediated crystallography. Protein Sci. 25, 2268-2276 (2016).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
ビームラインスケジューリングソフトウェア：SPring-8における理研構造ゲノムビームラインの自動運用のための管理ソフトウェア. J. Synchrotron Radiat. 12, 380-384 (2005).
記事 PubMed Google Scholar
KAMO：微小結晶の自動データ処理に向けて. Acta Crystallogr. D Struct. Biol. 74, 441-449 (2018).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Foadi, J. et al. 高分子結晶学において、複数の結晶からデータセットを最適に選択するためのクラスタリング手順. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.69, 1617-1632 (2013).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
カブシュ、W. XDS. アクタ・クリスタロガー（Acta Crystallogr. D Biol．Crystallogr.66, 125-132 (2010).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kabsch, W. 積分、スケーリング、空間群割り当て、ポストリファインメント。Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 133-144 (2010).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Tickle, I. J. et al. STARANISO https://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi (2018).
McCoy, A. J. et al. Phaser crystallographic software. J. Appl Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M. & Wang, D. N. E. Coli由来グリセロール-3-リン酸トランスポーターの結晶構造. Protein Data Bank https://doi.org/10.2210/pdb1PW4/pdb (2003).
Schuermann、J. P., Prewitt、S. P., Deutscher、S. L. & Tanner, J. J. 完全半面双晶の結晶から得られた空間群P321におけるリガンドフリーFab DNA-1の構造。Protein Data Bank https://doi.org/10.2210/pdb1XF4/pdb (2005).
Kujirai, T., Horikoshi, N. & Kurumizaka, H. 抗H4K20me1_scFvの結晶構造、15F11. Protein Data Bank https://doi.org/10.2210/pdb5B3N/pdb (2016).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G. & Cowtan, K. Cootの特徴と発展。アクタ・クリスタロガー（Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Adams, P. D. et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Davis, I. W. et al. MolProbity: All-atom contacts and structure validation for proteins and nucleic acids. Nucleic Acids Res. 35, W375-W383 (2007).
記事ADS PubMed PubMed Central Google Scholar
Greenfield, N. J.タンパク質のアンフォールディングと結合相互作用の熱力学を決定するために、温度の関数として収集した円偏光二色性を使用する。Nat. Protoc. 1, 2527-2535 (2006).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Lee, Y. et al. トリオースリン酸/リン酸トランスロケーターの構造から、基質特異性の根拠が明らかになった。Nat. Plants 3, 825-832 (2017).
記事CAS PubMed Google Scholar
Webb, B. & Sali, A. MODELLERを用いた比較タンパク質構造モデリング。Curr. Protoc. バイオインフォメーションズ 54, 5 6 1-5 6 37 (2016).
記事 Google Scholar
Sondergaard, C. R., Olsson, M. H., Rostkowski, M. & Jensen, J. H. Improved treatment of ligands and coupling effects in empirical calculation and rationalization of pKa value. J. Chem. Theory Comput. 7, 2284-2295 (2011).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Olsson, M. H., Sondergaard, C. R., Rostkowski, M. & Jensen, J. H. PROPKA3：経験的pKa予測における内部および表面残基の一貫した処理。J. Chem. Theory Comput. 7, 525-537 (2011).
論文CAS PubMed Google Scholar
CHARMM-GUI: a web-based graphical user interface for CHARMM.Jo、S.、Kim、T.、Iyer、V. G. & Im、W。J. Comput. Chem. 29, 1859-1865 (2008).
論文CAS PubMed Google Scholar
Wu, E. L. et al. CHARMM-GUI Membrane Builderによるリアルな生体膜シミュレーション。J. Comput. Chem. 35, 1997-2004 (2014).
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Oxalobacter formigenes HC1株およびOxWR株のUHPLC-HRMSによるメタボロームおよびリピドーム特性評価。Anal. Bioanal. Chem. 411, 4807-4818 (2019).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
エイムズ、G. F. サルモネラ・チフィムリウムおよびエシェリヒア・コリの脂質：構造および代謝。J. Bacteriol. 95, 833-843 (1968).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Case, D. A. et al. AMBER 2017 (San Francisco, University of California, 2017).
Phillips, J. C. et al. Scalable molecular dynamics on CPU and GPU architectures with NAMD. J. Chem. Phys. 153, 044130 (2020).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Maier, J. A. et al. ff14SB：ff99SBによるタンパク質側鎖およびバックボーンパラメータの精度を向上させる。J. Chem. Theory Comput. 11, 3696-3713 (2015).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Dickson, C. J. et al. Lipid14: The Amber lipid force field. J. Chem. Theory Comput. 10, 865-879 (2014).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kroutil, O., Minofar, B. & Kabelac, M. 溶媒和したシュウ酸水素イオンおよびシュウ酸アニオンの構造とダイナミクス：理論的研究。J. Mol. Model. 22, 210 (2016).
記事 PubMed Google Scholar
Bayly, C. I., Cieplak, P., Cornell, W. D. & Kollman, P. A. A well-behave electrostatic potential based method using charge restraints for deriving atomic charges - the RESP model. J. Phys. Chem. 97, 10269-10280 (1993).
記事CAS Google Scholar
Wang, J., Wolf, R. M., Caldwell, J. W., Kollman, P. A. & Case, D. A. Development and testing of a general amber force field. J. Comput. Chem. 25, 1157-1174 (2004).
論文CAS PubMed Google Scholar
Minofar, B. et al. ジカルボン酸ジアニオンのバルクと界面での水溶液の比較. J. Am. Chem. Soc. 126, 11691-11698 (2004).
論文CAS PubMed Google Scholar
Darvas, M., Picaud, S. & Jedlovszky, P. Molecular dynamics simulation of adsorption of oxalic acid on an ice surfaces. Chemphyschem 11, 3971-3979 (2010).
論文CAS PubMed Google Scholar
Riley, J. M., Kim, H., Averch, T. D. & Kim, H. J. Effect of magnesium on calcium and oxalate ion binding. J. Endourol. 27, 1487-1492 (2013).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Miller、B. R. 3rd et al. MMPBSA.py: an efficient program for end-state free energy calculations. J. Chem. Theory Comput. 8, 3314-3321 (2012).
論文CAS PubMed Google Scholar
Michaud-Agrawal, N., Denning, E. J., Woolf, T. B. & Beckstein, O. MDAnalysis: a toolkit for analysis of molecular dynamics simulations. J. Comput. Chem. 32, 2319-2327 (2011).
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Chung, L. W. et al. ONIOMメソッドとその応用。Chem. Rev. 115, 5678-5796 (2015).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Frisch, M. J. et al. Gaussian 16, Revision C.01 (Gaussian, Inc., 2016).
Hohenberg, P. & Kohn, W. Inhomogeneous electron gas. Phys. Rev. 136, B864-B871 (1964).
記事ADS MathSciNet Google Scholar
Kohn, W. & Sham, L. J. 交換効果および相関効果を含む自己無撞着方程式。Phys. Rev. 140, A1133-A1138 (1965).
記事ADS MathSciNet Google Scholar
ベッケ、A.D.密度汎関数熱化学。III. 正確な交換の役割。J. Chem. Phys. 98, 5648-5652 (1993).
記事ADS CAS Google Scholar
Lee,C.、Yang,W.、Parr,R. G. Colle-Salvetti相関エネルギー式の電子密度汎関数への展開。Phys. Rev. B Condens. Matter 37, 785-789 (1988).
記事ADS CAS PubMed Google Scholar
Grimme, S., Ehrlich, S. & Goerigk, L. 分散補正密度汎関数理論における減衰関数の影響。J. Comput. Chem. 32, 1456-1465 (2011).
論文CAS PubMed Google Scholar
細菌性シュウ酸塩トランスポーターOxlTのシュウ酸塩結合型閉塞体の結晶構造。Protein Data Bank https://doi.org/10.2210/pdb8HPK/pdb (2023).
細菌性シュウ酸塩トランスポーターOxlTのリガンドを持たない外向き型の結晶構造。Protein Data Bank https://doi.org/10.2210/pdb8HPJ/pdb (2023).
Jaunet-Lahary, T. & Okazaki, K. I. 腸内細菌叢のシュウ酸分解菌におけるシュウ酸トランスポーターOxlTの構造と機構」のデータです。Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686 (2023).
福田真也他. 硝酸塩/亜硝酸塩アンチポーターNarKの硝酸塩結合閉塞状態での構造. Protein Data Bank https://doi.org/10.2210/pdb4U4W/pdb (2015).
Fukuda, M. et al. 硝酸塩/亜硝酸塩アンチポーターNarKの硝酸塩結合内向き開口状態での構造. Protein Data Bank https://doi.org/10.2210/pdb4U4T/pdb (2015).
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謝辞
X線回折データ収集のサポートをいただいたSPring-8の長谷川和也博士、奥村英夫博士、川野義明博士、平田邦夫博士、抗体作製の技術協力をいただいた野村弥生氏、中田名倉佳子氏、佐藤由美氏、機能アッセイの技術協力をいただいた藤田京子氏、OxlT機能アッセイの貴重なアドバイスをいただいた安倍圭右教授に感謝します。放射光実験は、SPring-8のBL41XUおよびBL32XUで行い、高輝度光科学研究センター（JASRI）の承認（課題番号2012B1096、2015A1080、2015B2080）を得て行った。計算の一部は、計算科学研究センター（岡崎市、日本）（プロジェクト：21-IMS-C175、22-IMS-C189）を用いて実施しました。本研究は、日本学術振興会 科学研究費補助金 JP20H03195 (to A.Y.), JP18H02415 (to K.O.), JP26440086 (to T.H.) および小柳財団研究費 (to A.Y.), 武田科学振興財団 (to Ta.S.), AMED 創薬・生命科学研究支援プラットフォーム事業 [BINDS] （助成番号：21.IMS-C175, 22.IMS-C189 ）により資金を提供されています。JP20am0101079（S.I.へ）。英文校閲を担当したエナゴ(www.enago.jp)に感謝したい。
著者情報
著者と所属
自然科学研究機構 分子科学研究所 計算科学研究センター 〒444-8585 岡崎市旭町1-1-1
ティトゥアン・ジャウネ・ラハリー＆岡崎桂一
京都大学大学院医学研究科 〒606-8501 京都府京都市下京区錦町1-1-1
島村達郎、野村訓通、平沢耕太、岩田壮
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 〒700-8530 岡山県岡山市北区旭町1-1-1
林昌宏、堤直孝、小島慶一、須藤祐樹＆山下敦子
理化学研究所 SPring-8センター 〒679-5148 佐用郡佐用町佐用
清水哲也、山下正雄、平井照久＆山下敦子
岡山大学薬学部 〒700-8530 岡山県岡山市北区弥生町1-1-1
堤 直孝さん、末広 祐太さん、山下 敦子さん
岡山大学大学院環境生命科学研究科 〒700-8530 岡山県岡山市北区弥生町1-1-1
田村隆
東京大学先端科学技術研究センター 〒153-8904 東京都中央区日本橋茅場町1-1-1 Tel.
岩成博子＆浜久保隆夫
貢献度
Te.H.とA.Y.が研究を考案した。Te.S.、M.Y.、Ta.S.、K.H.、N.N.は、タンパク質の精製を行った。N.N.、H.I.、Ta.H.、S.I.は抗体作製を行った。Te.S.、M.Y.、A.Y、Te.H.、Ta.S.、K.H.が結晶化およびX線データ収集を行っている。Ta.S.、Te.H.、M.H.、A.Y.が構造解析を行った。M.H.、N.T.、Yut.S.、K.K.、A.Y.、Yuk.S.は機能性アッセイを実施した。T.J.L.とK.O.は分子動力学とQM/MMシミュレーションを行った。T.T.は予備的な分子動力学シミュレーションを行った。A.Y., K.O., Ta.S., N.N., T.J.L., M.H., N.T., Yut.S. は、他のすべての著者からの情報とともに、論文を執筆した。
対応する著者
島村達郎、岡崎圭一、平井輝久、山下敦子のいずれかに対応すること。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
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Nature Communicationsは、Lan Guanと他の匿名査読者に感謝し、本作品の査読に貢献した。査読報告書はこちらです。
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Jaunet-Lahary, T, Shimamura, T., Hayashi, M. et al. Structure and mechanism of oxalate transporter oxlT in an oxalate-degrading bacterium in the gut microbiota. Nat Commun 14, 1730 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5
引用元：ダウンロード
2021年11月01日受領
2023年2月20日受理
2023年4月3日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5
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