キイロショウジョウバエの共生的物理的ニッチは、複数種の腸内細菌群の安定的な会合を制御する
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発行：2023年3月21日
キイロショウジョウバエの共生的物理的ニッチは、複数種の腸内細菌群の安定的な会合を制御する
https://www.nature.com/articles/s41467-023-36942-x
レン・ダッジ
エリック・W・ジョーンズ
...
ウィリアム・B・ルディングトン
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Nature Communications 14巻、記事番号：1557（2023） この記事を引用する
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メトリックス詳細
アブストラクト
腸内は食事や環境から多様な細菌に絶えず侵されているが、哺乳類から昆虫までの宿主種ではマイクロバイオーム組成は経時的に比較的安定しており、宿主特異的な要因が主要な細菌種を選択的に維持している可能性が示唆される。宿主特異性を調べるために、我々は、gnotobiotic Drosophila、微生物パルスチェイスプロトコル、および顕微鏡を用いて、ハエの腸内の異なる菌株の安定性を調査した。その結果、前腸に宿主が構築した物理的ニッチが、菌株レベルの特異性で細菌を選択的に結合し、そのコロニー形成を安定化させることがわかった。しかし、ラクトバチルス属細菌による最初のコロニー形成は、糖鎖に富む分泌物を産生することでニッチを物理的に改造し、アセトバクター属の無関係な常在菌による二次コロニー形成を促進させる。この結果は、複数種からなる腸内細菌叢の確立と安定性を理解するためのメカニズム的枠組みを提供するものである。
はじめに
宿主の健康は、腸内細菌叢の構成、特にどのような細菌種や菌株が腸内を占めているかによって影響を受けます1,2,3,4,5。マイクロバイオームは、日々の食生活の変化、病原体による侵襲6、抗生物質による障害7に直面しながらも、確立され維持されている。多くの腸内常在菌は、特定の種の代謝に適した化学環境に対応する腸の特定の領域に局在しています8。ある種のプロバイオティクス、すなわち乳酸菌は、さらに宿主の粘液と物理的に結合し、コロニー形成を安定化させます9,10。菌株レベルの多様性は数百から数千に及ぶが11、宿主がどのようにして特定の菌株を選択し、維持できるかは謎のままである。一つの仮説は、食事や生活習慣の長期的な維持がマイクロバイオームの安定性を強化するというものである12,13,14,15,16。もう一つの非排他的な仮説は、宿主が特定の共生菌を獲得し隔離する物理的ニッチを腸内に構築しているというものだ17,18,19,20,21,22。
ミバエ（Drosophila melanogaster）のマイクロバイオームは1世紀以上にわたって研究されており、その構成は哺乳類の腸内マイクロバイオームと比較して比較的単純である23が、ハエの腸内マイクロバイオームの組み立てがどのように制御されているのかは依然として不明である。哺乳類の大腸陰窩と同様に、ハエの腸は微好気性で、乳酸菌門とプロテオバクテリア門の細菌によってコロニー形成されている22,24,25,26。ハエは無菌状態で飼育し、定義された細菌株と関連付けることが容易であるため、高度な生物学的制御が可能である27。さらに、ハエの腸内細菌叢は多様性が低く、最近LactiplantibacillusとLevilactibacillusに分けられたLactobacillus属（門Firmicutes）とAcetobacter属（クラスα-Proteobacteria）の二つの主要グループから5種ほどの安定したコロニー形成者がいる26、28。これらの種は培養が容易で遺伝的に扱いやすく27、ハエの寿命、繁殖力、発育に影響を与える29,30,31,32,33,34,35. ハエの腸内コロニー形成は、長い間、摂食嗜好、免疫、消化などの宿主のフィルタリング機構によって非特異的に制御されていると主張されてきたが、最近の証拠によると、ハエも野生で乳酸菌や酢酸菌を選択的に獲得する可能性があり24、36、これらは幼虫期にハエの栄養となる可能性が37．
我々は、ショウジョウバエ成虫の前腸内に、LactobacillusとAcetobacterの野生株によって特異的にコロニー形成される物理的ニッチを発見した。ニッチの空間的特異性、コロニー形成のための細菌株特異性、コロニー形成の安定性を明らかにした。また、細菌種がコロニー形成する順序を制御する優先効果を測定する。最後に、ニッチの物理的変化や細胞外マトリックスのグリコシル化など、細菌コロニー形成に対するニッチの応答を測定する。
結果
野生ハエ由来Lactiplantibacillus plantarumの空間特異的な腸内局在性
以前の研究で、我々はラボまたは野生で捕獲したD. melanogasterに関連するさまざまな細菌株を調査し24、ラボのハエの腸に効率的にコロニーを形成する細菌株のサブセットを特定した。常在細菌がニッチの存在と矛盾しない方法でハエの腸に安定した会合を形成するかどうかを調べるために、蛍光タンパク質で標識した細菌細胞の定量接種をハエに行った（図S1A-G）。接種後、ハエは3日間毎日無菌食品に移し、さらに3時間新しい無菌バイアルに移し、一過性の細菌を腸から除去した（「方法」、Fig. S1）。分析前のクリアリングにより、腸内細菌の総数が減少し、細菌の位置の空間的変動も減少した（図S1H-J）。これらの実験により、野生ハエ（LpWF）から分離したLactiplantibacillus plantarum（Lp）株は、D. melanogasterの前腸（図1A-D、S1I、J）にのみ存在し、プロベントリック（食道と前中腸をつなぐ管腔部38）、クロップ（袋状の付属物）、クロップとプロベントリックをつなぐクロップ管に存在していた。細菌は、プロベセントリック内腔の表面、クロップ管、クロップの基部に並ぶ縦溝と関連していた（図1C-D、S1J）。交尾した雌成虫、処女雌、雄成虫でも同様のコロニー形成の空間パターンが見られ（図S2A-J）、性差が表現型に影響を与えないことが示された。クリアリング後の幼虫にはコロニー形成が見られなかったことから、この表現型は成虫の前腸に特異的であることが示された（図S2K-M）。成虫の交尾雌は腸の表現型においてフライ間の変動が少ないことが示されているため、全体を通して成虫の交尾雌に注目した39,40,41．
図1：LpWFは空間特異性をもって安定的にハエの腸をコロニー形成する。
A コロニー形成アッセイの概略図。0日目に初回投与し、分析前の3日間、毎日無菌食に連続移し替える。B 腸内図。C 一過性の細胞を除去した後の腸全体におけるLpWF-mCherryのコロニー形成の顕微鏡観察では、前腸に特異的なコロニー形成領域があることがわかる。最大強度のz-プロジェクションを示す。D プロベントリウルスはLpWFのコロニー形成の主要な部位である。E Aiのコロニー形成は、プロブレム管腔とクロップ管にも特異的である（図S2も参照）。F Bで解剖した領域のCFU密度。n = 3生物学的複製から得た23個の腸/領域。列は平均値を表す。エラーバーはS.D.である。 G マイクロサージェリーを実施し、作物を除去した。H 作物を除去したハエの前腸にLpWFがコロニー形成された（n = 15/15）。I プロベセントリック内腔のTEM断面。n = 3生物学的複製の代表画像。J (I)の詳細。スケールバーは図中のパネルで定義されている。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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LpWFと同様に、Acetobacter indonesiensisの株も同じ前腸領域にコロニーを形成しており（図1E、S2、S3）、ハエの腸内細菌の2大グループは前腸において同じ空間特異性を持っていることが示された。一方、実験用ハエ由来のLp（LpLF）（図S1K、L）またはヒトから分離したLpWCFS1株（図S1M、S2A-J）でコロニー形成したハエは、コロニー形成レベルがはるかに低いことが示された。一過性の細菌を除去した後、中腸やハエの他の領域で実質的に大量に存在するLp株は見つからなかった。顕微鏡検査と一致して、生菌密度は挑心嚢で最も高く、次いで作物で、中腸と後腸で最も低かった（図1F、S1N）。さらに、LpWFが新しい細菌細胞を摂取しない状態で、5日間にわたり安定したコロニー形成を維持することを検証した。その間、CAFÉフィーダー24を使用して食物の無菌状態を潔く維持することにより、付着していない細菌が腸から洗い流された（図S4A、B）。
前腸で観察された空間的な局在を持つ細菌集団は、作物からの増殖と一定の再播種によって維持される可能性があり、その場合、作物を持たないハエは安定的にコロニー形成されないことになる。そこで、無菌のハエから作物を取り除くマイクロサージェリーを行い（図1G、「方法」）、術後5日でLpWFを接種し、接種後5日（dpi）で腸を解剖して画像化した。手術の成功が検証され、クロップ管の残りの部分には手術部位にメラニン化した傷跡があった（図1H）。すべてのクロップなしハエはLpWFによって安定的にコロニー形成され（n = 15/15）、無傷のクロップありハエと同様に、挑心管内腔に高い細菌密度を示した（図1C）。また、クロペクトミー後も同様のAiのコロニー形成が観察された（n = 14/14 colonized, Fig. S3E, F）。これらの領域をさらに調べると、プロベンチュラス内腔の透過型電子顕微鏡（TEM）により、一貫した組織形状が明らかになった（図1I、J）。宿主細胞体が形成する細長い溝内に縦方向に細菌細胞が密集し、断面あたり平均11本の隆起を構成していた（図S4C）。
したがって、LpWFやAiによる前腸の安定的なコロニー形成にはクロップは必要なく、プロベンチュラスとクロップダクトに特異的に結合する能力が、安定した細菌の会合に重要であることが示唆された。
このように、細菌は正確な個体数で飽和し、移動に耐えることができる。
ニッチでは、特定の結合部位に基づいて細菌が強く結合し、関連する細菌の集団サイズが明確に定義された値で飽和することが予想される。さらに、すでにプロベンチュラスに結合している細胞は、集団の安定性を促進し、後から来た細菌がコロニーを作るのを防ぐと予想される。これらの仮説を検証するため、無菌のハエにLpWF-mCherryを様々な用量でコロニー形成させ、その存在量を経時的に計測した。予想通り、広範囲の初期接種量において、関連する細菌集団は〜104 CFU/ハエで飽和した（図2A）。さらに、接種量がその飽和レベルを下回ると、挑心嚢内の細菌集団は徐々に増加し、5日以内にプラトーに達した。生きたハエ24での成長測定により、プラトーは、追加の細胞の摂取ではなく、最初に結合した集団の成長によって到達したことが示された。一方、最初に過剰なバクテリアを供給した場合、集団は1d以内に同じプラトー値まで減少し（図2A）、このニッチが有限かつ固定的な収容力を持つことが示された。同様の動態は、飽和密度で〜103個の細胞を持つAiでも観察された（Fig. S3G）。
図2：細菌会合の動力学的特性は、挑心窩にニッチが存在することを示唆する。
A LpWFによる無菌ハエのコロニー形成の時間経過で飽和が起こる。データポイントは、n≧48のハエ/データポイントにおけるlog10(CFUs)の平均値である。挿入：106 CFUを接種した後の20日間のタイムコース（24のデータ）。B バクテリアパルスチェイス実験デザイン：ハエをまずLpWF-mCherryでプレコロニー化し、次に非標識LpWF（青）を新鮮な餌で毎日過剰に与えた。C Lp-mCherryでプレコロニー化したハエに非標識LpWFを連続摂取させた場合とAi-GFPでプレコロニー化したハエに非標識Aiを連続摂取させた場合のパルスチェイスによる時間経過で定量したアクター細胞のターンオーバー。データポイントは、n≧34 flies/データポイントにおけるlog10(CFUs)の平均値である。エラーバーは1 s.e.m.を表す。 D 個々のハエのコロニー形成に対する用量応答によって定量化されたコロニー形成効率。CFUは2番目のコロニー形成者の3dpiで測定した。n = 24 flies/dose、エラーバーは割合の1標準誤差を表す。検出限界： 50 CFUs。E LpWF-mCherry（赤）で予めコロニー形成したハエをLpWF-GFPで侵入させ、接種後1時間（hpi）に撮像した場合の、挑心嚢におけるコロニー形成ダイナミクスの空間的構造。F光学x,z-slice。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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腸内細菌のコロニー形成の安定性を調べるため、LpWF-mCherryでプレコロニー化したハエに、10日間にわたって過剰に与えた非標識LpWFでチャレンジするパルスチェイス実験を行った（図2B）。腸内のLpWF-mCherryレベルは、最初の5日間で〜104CFU/flyから〜103CFU/flyへと90%以上減少し、その後5日間は〜103CFU/flyで推移した（図2C）。これは、ほとんど回転しない小さな境界集団と半減期2.5d（95%信頼区間（C.I） 1.6-4.3 d）の大きな関連集団が存在していたことを示す。対照的に、L. plantarumの弱いコロニー形成能を持つヒト分離株であるLpWCFS1は、腸から速やかに流された（図2C）。同様の動態がAiでも観察され（図2C、S3H）、半減期は2.5 d（95% c.i. 1.3-6.5 d）であり、ニッチは両菌種にとって同等の動態を持つことが示されました。
ニッチへの初期結合は、ニッチを満たす前の新しい細菌集団の確立における重要なステップである。定着は用量依存的であり24、後期コロニー形成者の最終的な存在量は初期コロニー形成者のそれよりも低いという我々の発見（図S4D）は、先行コロニー形成者の存在によって用量反応曲線がシフトすることを示唆した。このような優先効果を定量化するために、LpWF-mCherryをLpWF-pre-colonizedの個々のハエに様々な用量で与え、3日後にLpWF-mCherryでコロニー形成された割合を測定しました。50%のハエがLpWF-mCherryでコロニー形成されるには103CFUが必要であったが、102CFUという低用量で100%のハエがコロニー形成された（図2）。これらのことから，LpWFの脳室ニッチは，占有された場合，同じ菌株の後の用量によるコロニー形成に強く抵抗することがわかった．
定着確率と定着した細菌の最終的な量との関係は、開放的な生息地の有無が侵入の可能性を制御していることを示唆している。我々は、初期コロニー形成24とニッチ飽和42の統合理論を構築することで、この仮説の仮定を公式化し、N0�0の用量で接種した侵入種のコロニー形成の可能性P（N0）�（�0）を、侵入種の最終存在量A（N0）�（�0）の関数として予測する：
P(N0)=(1-p)A(N0)/pk,�(�0)=(1-�)�(�0)/��、
(1)
ここで、p�は個々の細菌細胞のコロニー形成確率、k�は1回のコロニー形成成功時に到達するサブポピュレーションサイズである（図S5A、B）。このモデルにより、コロニー形成確率と総菌量に基づいて、集団がどのような構造になっているかを推定することができた。LpWFの場合、式1はk�＝600個のサブポピュレーションサイズを推定し（図S5C）、これは個々の溝に含まれる細胞数とほぼ同じである。
LpWF-mCherryを後から投与した場合、常在LpWFによって空間的に排除されるかどうかを調べるため、LpWFのGFP発現株を作り、LpWF-mCherryで事前にコロニーを作ったハエに食べさせた。接種1時間後（hpi）に固定した腸全体を撮像し、LpWF-GFP細胞がハエから抜け出る前に捉えた（図2E）。挑心嚢では、侵入したLpWF-GFPは内腔の中心軸に沿って局在し、厚さ10μmまでの常在LpWF-mCherryの層によって内腔壁から分離されていた（図2E、F）。プロベンチュラス後部の溝にはLpWF-mCherryが密に存在し、LpWF-GFPは溝からほとんど見られなかったことから、この溝が安定したコロニー形成の場であることが示唆された。LpWF-mCherryを非標識LpWFで事前にコロニー形成したハエに与え、1時間後と24時間後の腸に沿ったmCherryシグナルを定量することで、蛍光色素がコロニー形成の差に関与していないことを確認した。104CFUを投与した24時間後の時点で、LpWFでプレコロニー化したハエは、顕微鏡でmCherryをほとんど検出できなかった（図S4E-H）。これらの結果は、LpWFのニッチが脳室溝であることをさらに支持するものである。細菌が急速に溝に入ってコロニー形成する初期コロニー形成時とは異なり、先行コロニー形成者がその後のコロニー形成を妨げたことから、溝にはLpWF細胞の結合部位が限られており、先行コロニー形成によってこれらの部位は飽和していると考えられる。ニッチの優先順位は空間的に決定されるというこの論理と一致して、LpWF-GFPがコロニー形成を示した場合（n = 5）、GFP標識細胞はmCherryと均一に混在するのではなく、溝に沿って互いに共局在していた（図S4I.）
AiとLpWFはproventriculus内で別々のニッチを占めている
種間相互作用は、競合排除や促進を含む優先効果を通じて、生態系のコロニー形成に大きな影響を与える可能性がある43,44,45,46,47。AiとLpWFは腸の同じ一般的な場所にコロニーを形成し（図1C-F、S3A-D）、それぞれの菌株は自身を排除する（図2D、3A）ため、互いに排除し合うと予想された。この仮説を検証するために、共同コロニー形成中のそれぞれの種の存在量と成長率を測定した。その結果、両種とも影響を受けず（図3B、C、S6）、両種が独立してニッチを飽和させていることが明らかになった。また、相互作用が新しいコロニー形成に影響を与えるかどうかを調べるため、用量反応アッセイを実施した。Aiの自己排除とは対照的に、LpWFの事前コロニー形成はAiのコロニー形成を促進し（図3A）、LpWFのコロニー形成はAiの存在に影響されなかった（図S6A-C）。D. melanogasterに多いAcetobacter48の系統的に異なる種であるA. pasteurianusも、LpWFによって促進された（図S6D）。熱処理したLpWFはAiのコロニー形成を促進しなかったことから、Aiのコロニー形成を促進するには生きたLpWF細胞が必要であることがわかった（図S7A、B）。
図3：AiとLpWFは、プロベンチュラス内で別々のニッチを占めている。
A菌株間の相互作用はコロニー形成効率に影響し、無菌ハエ（緑色の丸印）、Ai-プレコロニー化ハエ（黄色の丸印）、Lp-プレコロニー化ハエ（黒色の緑色の正方形）の用量反応曲線で確認できるように、Aiを摂取させた場合のコロニー形成効率を示す。投与量102.3 CFU/匹、p = 8.1×10-4; 投与量103.7 CFU/匹、p = 4.8×10-9; 投与量105 CFU/匹、p = 8.7×10-6. n ≥ 12 flies/data point.差のZ-テストはAi対胚性ハエにおける割合の差を表す。エラーバーは割合の1標準誤差を表す。B 5dpiにおけるAiの存在量は、Aiで単コロニー化したハエとLpWFでプレコロニー化した後にAiを与えたハエの間で差がなかった。n ≥ 65 flies/treatment；両側無対t検定、p = 0.38; nsは有意ではないことを示す。C5dpiのLpWF量は、LpWFでモノコロニー化したハエとAiでプレコロニー化した後にLpWFを与えたハエの間で差がなかった（n≧53 flies/treatment、two-tailed unpaired t-test; p = 0.06; nsは有意でないことを示す。B、C：ボックスの中心は中央値、ボックスは25～75パーセンタイルを囲み、ひげは最小値と最大値を示す。D 共焦点顕微鏡によるLpとAiの共コロニー化。Ai（緑）とLpWF（赤）は1dpiで前腸の同じ領域を占めた。スケールバー： 100 µm。E, F AiとLpWFのセクターのx,z-断面。G AiとLpWFが前腸管を共培養しているTEM断面図。スケールバー： 5 µm。H (G)の詳細。LpWFとAiの細胞は擬似色で表示されている。スケールバー：2 µm。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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LpWF-mCherryとAi-GFPが共殖した腸を蛍光顕微鏡で観察したところ、AiとLpWFは同じ前腸領域に共殖しており（図3D）、それぞれの種で異なるセクターが存在していた（図3E-H、Supplementary Movie 1）。このように、LpWFとAiは物理的にお互いを排除しているのではなく、組織が両株を受け入れている。
ニッチへの入植は、プロベンチュラスの形態的変化を引き起こす
物理的に狭い空間でのAiとLpWFの重複集団の共存を調べるため、X線マイクロCT（XR µCT）50,51を用いてハエの解剖学的構造を画像化し、体積画像データを分割して3D再構成を作成した（図4A）。無菌のハエと、LpWF、Ai、またはLpWFとAiの両方でコロニー形成されたハエを撮影した。腸の長さ方向に多数の陰窩が認められ、その中には、中腸や後腸の周囲栄養マトリックスで遮蔽された未コロニー化領域も含まれていた（図4A, S8）52。前腸のコロニー形成領域では、細菌が観察された縦筋は、挑心内腔やクロップダクトの宿主組織の隆起や溝と一致した（図4B-F）。溝は前部では直線的で、後部ではより大きく不規則になった（図4D, F）。内腔壁の横断面を見ると、無菌のプロベンチュラスでは狭い通路であったが（図4C）、コロニー形成されたプロベンチュラスでは開口部がかなり広くなっており（図4E）、無菌のハエに比べて内腔容量がかなり大きいことに対応していた（図4G）。
図4：ニッチのコロニー形成は、プロベンチュラスの形態変化を引き起こす。
ハエ全体のX線µCTモデル。切断面には、(1)露出した胃袋（(B)の挿入図も）、(2)前中腸、(3)後中腸を示す。B プロベセントリウルスの詳細。C 無菌プロベンチュラス内腔の断面図。スケールバー： 5 µm。D 無菌プロベンチュラス内腔のボリュームレンダリング。E LpWFが定着したプロビンチュール内腔の断面図。スケールバー：5µm： 5 µm。F LpWFプロビンチュール内腔の体積レンダリング。G 表面モデルから算出した心臓の体積（各条件につきn = 3～4匹；p = 0.0025、無菌と比較した一元配置分散分析；多重比較に対するTukeyの補正；GF vs. Lp p = 0.020; GF vs. Lp+Ai p = 0.022）. H-M透過型電子顕微鏡による前胃の横断面（（H）無菌フライ、（I）従来型飼育フライ（ラボフライ菌のみ；LpWFなし）、（J、K）LpWFで1hpi、（L、M）LpWFで3 dpiコロニー化（図S7参照）、TEMでは1処理につきn≧3生物学的複製物。黄色の矢印は内腔空間を示す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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XR µCT イメージングと一致して、無菌ハエの挑心部の TEM 断面は、直径約 0.5 µm の狭い管腔を示した（図 4H, S9）。同様の形態は、L. plantarum24を含む同じ細菌種のコロニー形成不良株と関連する、従来から飼育されているラボ用ハエでも観察された（図4I）。LpWFをコロニー形成したハエでは、溝の直径は1 hpiまでに〜1 μm（図4J、K、S9）、3 dpiまでに〜2〜3 μm（図4L、M、S9E〜J）に増加し、ニッチ占拠に対する宿主反応の持続を示唆した。熱キルしたLpWFはこのニッチ拡大を生じなかったことから、内腔の拡大には生きたLpWF細胞が必要であることがわかる（図S7C-F）。TEMで観察したところ、コロニー形成されたプロベンチュラスの拡大した内腔空間には、内腔壁に隣接する透明ゾーンと、内腔の中心部に近い細菌コロニー化ゾーンの2つが含まれていた（図4L、M、S9E-J）。高圧凍結固定でも同じ表現型を示し（図S9S）、ゾーネーションは単に固定のアーチファクトではないことが示された。以上のことから、今回のイメージング結果は、コロニー形成時にプロベントリルスが形態変化を起こし、それがAiコロニー形成の促進と一致することを示している。
レクチン染色により、前腸ニッチに関連する糖鎖に富むマトリックスが明らかになった。
粘液は高度にグリコシル化されており、粘液の種類によってN-aceytlglucosamine, N-acetylgalatosamine, N-acetylneuraminic acid, Mannose, Glucose, Fucose, arabinoseなど様々な糖鎖サブユニットが存在する53。我々は、薄切TEM（図4, S9）で見たプロベセントリック内腔のコロニー形成領域の細胞外マトリックス（ECM）は、糖鎖リッチであると仮説を立てた。この仮説を検証するために、プロベンチュラスを切開し、粘液に含まれる糖鎖に特異性を持つレクチンのパネルで染色した（「方法」）。小麦胚芽アグルチニン（WGA）、Dolichus biflorusアグルチニン（DBA）、Lens culinarusアグルチニン（LCA）はプロベンチュラス切片のハエ細胞を染色したが、他のレクチンはプロベンチュラスに一貫して結合しなかった（図5A）。TEM（図4H-M、S9）で分泌層が現れるプロベンチュラスの内腔を調べると、WGAによる染色が観察された（図5B）。DBAとLCAの染色も内腔に存在したが、その位置はTEMで見える分泌層とは一致しなかった（図S10A、B）。WGAはN-アセチルグルコサミンと結合し、哺乳類細胞に見られる主要なシアル酸であるN-アセチルノイラミン酸54とも結合することができる。シアル酸を結合するSambucus nigra agglutininは染色されなかったが、これはシアル酸がハエの胚にのみ存在するという発表された報告と一致する55。サクシニル化WGA（sWGA）はN-アセチルグルコサミン54のみを結合し、WGAや分泌層のTEM画像と一致する染色パターンを示したことから、内腔のECMはN-アセチルグルコサミンに富むことがわかった（図5C）。キチンはN-アセチルグルコサミンのポリマーであり、浸透性のあるキチン質キューティクルがプロベンチュラスにも存在する38。キチンと結合するCalcofluorでキューティクルを染色したところ、内腔上皮細胞と分泌層の間にはっきりと確認でき、分泌層はキチンではないことがわかった（図5B、C）。TEMにより、胚芽のないハエも狭い分泌層を持っていることが示唆された（図4H）。生殖不能ハエを分析したところ、この狭い層はWGAで染色され、N-aceytlglucosamineが生殖不能ハエの分泌層の主要な糖鎖であることがわかった（図5D、S10C）。この層が餌に含まれる酵母細胞壁のキチンが消化された産物である可能性があるかどうかを調べるため、初食前に新たに羽化した処女雌を切開したところ、その挑心部の染色が無菌ハエと一致していることがわかった（図5E、S10D、E）。蛹化の際にイマジナルディスクから形成されるため、分泌されたN-アセチルグルコサミンに富むECMは明らかにハエによって生成されることを示す証拠である。
図5：レクチン染色により、前腸ニッチに関連する糖鎖に富むマトリックスが明らかになった。
Aプロベセントリルスを染色したレクチンの表。Bコロニー形成されたハエのWGA、Cコロニー形成されたハエのsWGA、D無菌ハエのWGA、E初めて食物を摂取する前に新たに羽化した無菌ハエのWGAの、挑心嚢横切片のレクチン染色の様子。スケールバー：20μm。矢印はプロベンチュラス内腔のレクチン染色を示す。 n ≥ 3生物学的複製/処理。CF: calcofluor。
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ディスカッション
その結果、ショウジョウバエの腸内細菌の特定の菌株が、プロベンチュラスのクリプト状の溝にコロニー形成すること、これらの菌株によるコロニー形成は飽和的であり、結合部位の数が限られていることを示唆すること、プロベンチュラスは、ハエに利益をもたらす細菌によるコロニー形成を促進するエンゲルメントによってコロニー形成に対して応答することがわかった32、33、56。ショウジョウバエが、作物管や胸部の部位に常在菌を結合させるための特定のニッチを持つという発見は、マイクロバイオームが宿主に制御され、相互に利益をもたらすような方法で宿主と相互作用できる方法についての洞察を提供するという意味で、重要である。さらに、プロベンチュラスの細胞外マトリックスに、コロニー形成に適した菌株の細菌表面には結合するが、コロニー形成に適さない菌株には結合しない特定の分子が存在することも予想される。ここではムチンを調査していないが、ハエにはムチン57,58があり、そのうちの3つがプロベンチュラスに発現している52。さらに、プロベンチュラスの細胞外マトリックスの形態は、哺乳類の粘液を彷彿とさせる。粘液は、上皮に隣接する密集した非コロニー化層と、細菌によってコロニー化された薄い遠位層の2層からなる59。我々は、プロビュラー溝のニッチ細胞が細菌の接着基質を生成するか、あるいは唾液腺などの別の供給源から接着基質を隔離する細胞外マトリックスを生成していると推測している。ニッチ細胞（図1J）のTEMで観察された膜が明らかに密に積み重なっていることから、これらは分泌細胞である可能性があり、これはプロビンスルーの広範囲な分泌の性質と一致する38。ある細菌株が結合することで、第二の細菌種のためのニッチサイトを開く構造変化が起こるという発見は、宿主が第一のコロニーを選択し、さらに第二のコロニーを選択するという形で、細菌株の複雑な集合体が宿主の消化管内でどのように発生し維持できるかのモデルを示している。実際、L. plantarumはホモ発酵性であり、我々は以前、LpWFがAi60を含むハエの腸内で見つかったAcetobacter株と正の代謝的相互作用を有することを示した。
ショウジョウバエのマイクロバイオームに関する研究は長い歴史があるにもかかわらず、特定のニッチの存在は、食物中や従来の培養培地上に存在する細菌の存在によって不明瞭であった。このような条件下では、関連するニッチに結合した特定のマイクロバイオームメンバーが存在する可能性があるにもかかわらず、かなりの割合の腸内細菌が単に通過し、腸と特異的に相互作用することはない61。私たちは、細菌パルスチェイスプロトコルを使用して、結合していない細菌を押し出した。この方法論の進歩により、特異的に相互作用する細胞のみを濃縮し、共生ニッチを特定することができました。
アクセニックのハエは成長と繁殖力が強く低下することから29,30,31,32,62,63、マイクロバイオームを保有することはショウジョウバエにとって非常に有益であることは明らかである。しかし、宿主と特定の菌株の関係がどのように安定的に永続するのかは、あまり明らかではない。以前の研究で、幼虫はフラス中にN-アセチルグルコサミンを排泄し、ハエの餌で外部L. plantarumの成長を助ける栄養素を提供することが示された37。幼虫の排泄物であるN-アセチルグルコサミンの起源は明らかにされていないが、今回の結果から、成虫の挑心ニッチはハエが産生するN-アセチルグルコサミンに富んでおり、このニッチがL. plantarumに空間的な生息場所と栄養源の両方を提供していることが示唆された。
プロビュラス・ニッチを理解することは、（1）細菌が宿主に影響を与え、おそらくペリトロフィック膜とともに分子を腸内に導入する空間的な位置を明らかにし、（2）ある種によって引き起こされたニッチ構造の変化が、LpWFやAiといったマイクロバイオームの異なるメンバーの機能経路に関連する、より複雑な関連性の素地を作っているかを明らかにすることによって、マイクロバイオームの機能に対する洞察をもたらすと考えられる。最後に、これらの観察結果は、ショウジョウバエの消化器官やヒトを含む他の動物の腸内の他の場所に、さらなるニッチが存在するかどうかという疑問を提起している。
研究方法
ハエの系統と飼育
昆虫モデルは現地の法律や規制で倫理的な承認が必要ないため、倫理的な承認は得ていない。本研究のすべてのハエは、腸の形態に低い異質性を示す交配雌（図 S2 を除く）であった40。以前の研究では、我々が測定したコロニー形成の表現型は、CantonS、w1118、OregonR24を含む複数の遺伝的背景で一般的であることが示された。ハエは、Wide Drosophila Vial (Cat #: 32-114, Genesee)で、Droso-Plugs® (Cat #: 59-201, Genesee)で飼育された。餌の組成は、10%グルコース（フィルター滅菌）、5%オートクレーブした生きた酵母、0.42%プロピオン酸（フィルター滅菌）、1.2%オートクレーブした寒天、0.5%オートクレーブしたコーンミール。各バイアルには4 mLの餌が含まれていた。生後5日の交尾した雌成虫は、実験開始の前日に選別された。
液体餌は10%のグルコース、5%の酵母エキス、0.42%のプロピオン酸で構成されていた。液体餌と固体餌の唯一の栄養上の違いは、酵母の細胞壁が液体餌に使用する毛細管を詰まらせるため、オートクレーブ処理した生きた酵母の代わりに酵母エキスであった。キャピラリーフィーダーバイアルの底には、水分補給と湿度源として1.2％の寒天が含まれています。CAFÉおよび固形飼料で飼育したハエは、細菌の再摂取を最小限に抑えるため、毎日新鮮なバイアルに移し替えました。ハエのサンプルは、表面殺菌と粉砕を行い、CFUを計数した。
細菌株
細菌株は、Lactobacillus plantarum WF、L. plantarum LF、L. plantarum WCFS1が文献24に報告されており、文献24ではL. plantarum HSと呼ばれていた。Acetobacter indonesiensis SB003は、文献24のFig.S1においてコロニー形成についてアッセイされた。蛍光タンパク質発現プラスミド株は、文献24,60で開発・報告されている。pCD256-p11-mCherry は L. plantarum に使用し、Reingard Grabherr（オーストリア、BOKU）64 の寛大な贈り物である。
コロニー形成アッセイ
コロニー形成アッセイは、文献24のFig.S1Aで使用したプロトコルに従った。簡単に言うと、測定した量の細菌を、無菌のハエの餌バイアルの表面に均一にピペッティングし、15分間吸着させた。25匹の無菌、5-7-d post-eclosion、交尾した雌のハエをバイアルに導入し、定められた時間、摂食させた。その後、ハエを接種用バイアルから取り出し、新鮮な無菌バイアルに入れた。細菌はPBSで激しく洗浄することにより接種バイアルから集められ、その量はCFUによって定量化された。指定された時点で、個々のハエのCFUは、ハエを70％エタノールで6回洗浄し、次いでddH2Oですすぎ、CFU列挙のために粉砕してプレーティングすることにより、列挙した。
菌の調製
菌の培養は、3mL液体培地で30℃にて一晩培養した。Lp株はMRS液体培地（Hardy Diagnostics, #445054 ）で培養し、mCherry発現株には10μg/mLクロラムフェニコールが添加された。AiはMYPL培地で培養し、GFP発現株には25μg/mLテトラサイクリンを添加した。菌は400×gで3分間スピンしてペレット化し、PBSに再懸濁した後、目的の濃度に希釈した。投与量は、OD600またはプレーティングしてCFUをカウントすることで定量化した。OD1.0は、LpWFでは2×108 CFUs/mL、Aiでは3×108 CFUs/mLに相当します。
ハエの植え付け
ハエは、適切な濃度の接種液を50 µLずつピペッティングして餌に接種し、バイオセーフティキャビネット内で15分間乾燥させた。ハエを4時間飢餓状態にしてから接種用バイアルに反転させ、そこで1時間摂食させた後、新しいバイアルに反転させた。ハエ1匹あたりの投与量は、消費された接種液の量をバイアル内のハエの数で割った値として計算されました。ハエが餌の上に置かれた細菌を食べたことを確認し、摂取した接種物の量を測定するため、餌を与えた後にバイアルから食べられなかった細菌を回収し、元の投与量から差し引いた。細菌の投与量を標準化する実験では、固化した寒天食品をキャップに入れた50mLコニカルバイアルを倒立させて使用し、食品CFUとバイアル壁面のCFUを分離することができました。他の実験では、オートクレーブ処理したポリプロピレン製ワイドフライバイアル（Genesee社製）を使用した。
幼虫のコロニー形成
幼虫のコロニー形成は、まずODが1の細菌培養液100 µlを食品バイアルに接種し、少なくとも25匹の交尾した雌ハエをバイアルに加え、1日間産卵させた後、取り出した。3日後、3齢幼虫を回収し、PBSで洗浄した後、滅菌寒天水バイアルに移し、4時間かけて一過性の細菌をクリアした。幼虫の腸を丸ごと解剖し、マウントメディア（80%グリセロール、20%トリス0.1M pH9.0）にマウントし、共焦点顕微鏡を使用して、挑心嚢全体のZスタックを撮影した。
ハエ中のCFUの定量化
腸内の量は、ハエ全体をホモジナイズし、CFUをカウントするためにプレーティングすることで測定した。ハエはまずCO2で麻酔し、70%エタノールで2回、PBSで2回洗浄し、表面殺菌した。次に、ハエを96ウェルプレートのウェルに個別に入れ、100μLのPBSと0.5μmのガラスビーズ（Biospec）～50μLを加え、熱シール（Thermal Bond Heat Seal Foil、4titude）した。プレートをビーズビーター（Biospec Mini-beadbeater-96, #1001 ）で最大速度で4分間激しく振り、ハエをホモジナイズした。我々は以前、0.5 µm のビーズサイズが細菌数を減少させず、ハエの組織を効果的に破壊することを示した24。液体ハンドリングロボット（Benchsmart）を用いて、プレート全体の希釈系列を調製した。寒天培地は長方形のトレイプレートに用意し、プレーティングの30分前に加温・乾燥させた。プレートは、ウェルあたり2μLのハエホモジネートを接種し、CFUを列挙するための円形パッチとした。プレートは30℃で一晩インキュベートした。コロニーを数えるために、プレートを蛍光灯下で撮影し、ImageJ 2.1.065 を用いて半自動的に数えた。
フライバイアル内のCFUの測定
フライバイアル内の細菌数は、バイアルから細胞を回収し、栄養寒天成長培地（MRSまたはMYPL）にプレーティングしてCFUをカウントすることで測定した。細菌を回収するために、2mLの滅菌PBSをバイアルにピペッティングした。その後、バイアルを再注入し、10秒間ボルテックスした。PBS洗浄液100 µLから希釈系列を作成し、CFUを数えるためにプレーティングした。この方法は、ハエが排泄した（脱糞した）生菌、またはバイアル内の細菌増殖、または食べきれなかった接種物の残りを定量するために使用された。排泄と接種を1～2時間かけて測定し、新たな細菌の増殖の機会を最小限に抑えた。
CAFÉアッセイ
12匹のハエを、ddH2O中の1.2%寒天2 mLを含む滅菌ポリプロピレン広口ハエバイアルに入れた。4本のガラスキャピラリーチューブをフラッグから挿入し、フィルターで滅菌した液体フライフード（10%グルコース、5%酵母エキス、0.42%プロピオン酸）12μLを満たした。10マイクロリットルのオーバーレイオイルを上に加え、キャピラリーの底にリキッドフードを押し込んだ。ハエをバイアルに入れたまま24時間放置した後、新しいセットアップに移し替えた。バイアルは12時間ごとにチェックし、ハエが餌にアクセスできることを確認した。餌へのアクセスを妨げるキャピラリーに空気が入っている場合は、新しいキャピラリーを持つ新しいフラグを挿入した。フライバイアル5本をまとめて1Lビーカーに入れ、底に濡れたペーパータオル、上部にアルミホイルをかぶせ、ビーカーを25℃、12時間-12時間の明暗サイクル、相対湿度60％に設定したフライインキュベーターの背面に設置した。
熱殺LpWF処理と用量反応性
LpWF菌は、MRS＋10μg/mLクロラムフェニコールで一晩培養し、30℃で調製した。この培養物を400×gの遠心分離でペレット化し、ODが2になるようにPBSに再懸濁した。細菌を殺すために、1.5mLのマイクロ遠心管に入れた得られた懸濁液1mLをUSA Scientific Mini Dry Bathで30分間65℃に加熱した。この懸濁液のサンプルをMRSプレートに広げ、2日間培養して、すべての細胞が正常に死滅したことを確認した。
生きたLpWFによるコロニー形成をシミュレートするため、ハエに毎日過剰な熱殺細菌を3日間与えた。5～7日齢の交配雌ハエは、他のコロニー形成実験と同様に25匹/バイアルで飼育した。毎日，100 µLの加熱死菌懸濁液（4 × 107 CFU/vial）を新鮮な無菌餌にピペッティングし，ハエをバイアルに移す前に乾燥させた．宿主への影響を評価する実験を行う前に、ニッチから過剰な死菌を除去するため、ハエを新鮮な無菌フードに一晩移し、さらに寒天-水培地に4時間置くことで除去してからイメージングまたはAiを投与しました。これ以降は、我々の標準的な方法でハエをコロニー形成させた場合と同じ方法である。
細菌コロニー形成のためのパルスチェイスプロトコル
定着した細菌集団のターンオーバー時間を推定するため、5～7日齢の交尾した雌のハエを25匹/バイアルで飼育した。PBSに再懸濁した培養液（OD600 = 1）50μLを餌にピペッティングし、接種バイアルにハエを反転させる前に乾燥させることにより、蛍光標識した抗生物質耐性細菌のパルスを最初にハエに接種した。パルス用量は、チェイスの前に3日間、腸内でコロニー形成を確立させた。ハエは10日間、毎日同じ方法で追跡用量を与えられた（OD600 = 1）。標識された居住者の存在量は、毎日、ハエのサンプルをホモジナイズし、選択培地にプレーティングしてCFUを数えることによって測定された。侵入チェイス量は、非選択性培地上にプレーティングすることによってアッセイした。レジデントの存在量に影響を与える可能性のある他の要因を制御するために、コントロールグループもまた、チェイス用量のない新鮮な餌に毎日継代し、CFUをカウントするために毎日アッセイした。
パルスチェイス解析
異なる実験から得られた個々のハエの測定値は、時間ポイントごとにプールされた。データはPrismを用いて指数関数的減衰に当てはめ、半減期とその信頼区間を報告した。
生体内における成長速度の測定
選択しない場合のプラスミド損失は、細菌増殖速度の代理として使用した24。簡単に説明すると、プラスミド含有細胞を1日2回、新鮮な培地でOD0.01まで1:100に希釈して6日間継代することにより標準曲線を作成し、希釈前の培養液中のCFU数をカウントすることにより細菌の世代数を推定した。プラスミドを含むCFUとプラスミドを含まないCFUの比率は、蛍光を発するコロニーと蛍光を発しないコロニーの数として数えた。倍加時間は、各菌株でおよそ2時間である。標準曲線データのフィッティングには、線形回帰を用いた。次に、ハエに100％プラスミド含有細胞を与えた。様々な時点でプラスミド含有CFUとプラスミド非含有CFUの比率をカウントし、標準曲線を用いて比率を倍加回数に換算した。二重プラスミド含有株（図S7C）の場合、成長は、GFP-Ermプラスミド（急速に失われる）陽性コロニーとmCherry-Cam（はるかに長く保持される）陽性コロニーの比率として測定された。非線形（指数関数的減衰）回帰が用いられた。2つの注意点は、(1)集団ボトルネックによりプラスミド比のばらつきが大きくなること、(2)in vivoでのプラスミド損失率がin vitroと異なる可能性があることです。我々は以前、最初の注意点を用いてボトルネックを推論できることを示した。また、2つ目の注意点に関しては、制御された実験において成長速度を比較するためにこの方法を使用したため、標準曲線を用いた絶対的な成長測定が必要ではないことに注意しています。さらに、in vivoでの成長速度はin vitroと同様であり、細胞の成長段階の違いによるプラスミド損失率の差は小さいと考えられる。
クロペクトミー
鉗子（#5, Dumont）のみを使用し、生きたハエに対してクロペクトミーを実施した。鉗子、フライパッド、顕微鏡エリアは70%エタノールで洗浄した。5～10日齢の雌のハエは、まずCO2を用いて麻酔し、手術のためにうつぶせのスライドに乗せた。ハエを仰向けにし、1セットの鉗子で胴体を押さえながら、図1Oに示すように胸郭のすぐ下の腹部に小さな穴をあけた。鉗子の圧力を少し緩めて先端を開かせ、作物を掴んで穿刺口から引き抜く。クロップダクトがまだ付いている場合は、鉗子の縁に沿って切断した。ハエは滅菌済みフードバイアルに入れ、少なくとも3日間かけて回復させた。生存率は、10匹中1匹から3匹中2匹まで、オペレーターによって異なる。
顕微鏡観察用サンプルの調製
細鉗子（Dumont）を用いた解剖により、ハエから全腸を取り出した。組織はPBS中の4％PFAで24℃で3時間、または4℃で一晩固定した。腸は、PBS中の0.1% Triton-Xを用いて室温で30分間透過処理し、PBSで2回洗浄し、10 µg/mL DAPIで30分間染色し、PBSで2回洗浄し、マウント培地に最長1時間置いた後、太めの200 µLピペットでスライドに移した。その後、各腸を正電荷をかけたガラス製顕微鏡スライドに置き、約60 µLのマウントメディウムを加えた（マウントメディウム：80%グリセロール、20% 0.1 M Tris 9.0, 0.4 g/L N-propyl gallate）。0.1mmのガラスビーズ（Biospec）を5～10個、マウントメディウムに加え、サンプルの破砕を防ぐスペーサーを形成した。その後、スライドを1.5号カバーガラスで覆い、マニキュアで密封した。
共焦点顕微鏡観察
顕微鏡観察は、Leica DMi8 共焦点顕微鏡を用い、40× (1.30 NA) HC Plan Apo または 60× (1.40 NA) HC Plan Apo 油浸対物レンズを使用して行った。レーザーラインはAOTF結晶付き白色光レーザーを用いて生成し、蛍光色素の励起波長は次の通りである：mGFP5、488nm、mCherry、591nm、Cy5、650nm。全腸の画像は、複数のキャプチャをタイリングし、Leica Application Suite LAS XのMosaic Merge機能を使ってマージし、1つのスタックにステッチすることで生成しました。全腸のZスタックは厚さ70～80μmで、0.5μm以下の間隔でスライスした。出版用の2次元画像を作成するため、蛍光チャンネルは最大強度のZ投影として処理し、明視野チャンネルはスタックの中央から1枚のZスライスで表現した。
コロニー形成の空間的定量化
FIJIで画像から腸領域をマスクしてセグメント化し、MATLABでコロニー形成の程度を定量化することで、顕微鏡画像に基づく腸内コロニーの空間分布を定量化した。まず、FIJIで、80μmの光学切片の強度和Z投影を生成し、1μm/pxのスケールにリサイズした。半径50pxのローリングボールによるバックグラウンドサブトラクションが適用された。部位によって異なる腸の自家蛍光を定量化するため、無菌の腸で同等の測定を行った。
次に、スプラインフィットを用い、特定部位の腸幅に応じて幅を40～200μmに可変した分割線（例えば、クロップ上の最遠位点を原点として、クロップ上の幅広部は200μm、プロベンショナル部は40μm）を腸の長さに沿って描きました。Plot Profile」機能を用いて、クロップ（2セグメント）、クロップダクト（2セグメント）、クロップダクトと胸壁の接合部（1セグメント）、胸壁（1セグメント）、中腸（3セグメント）、後腸（2セグメント）の11セグメントに沿った強度を測定した。これらの強度プロファイルは、MATLABにエクスポートされた。
MATLABでは、バイリニアフィットを用いて、各腸領域のセグメント長を各セグメント平均長に較正した。このステップにより、すべての腸が整列され、全体のサイズが同じになったので、複製した腸全体で腸の各領域の強度を比較することができました。次に、スプラインに沿った各強度値をバックグラウンド減算し、その領域で目視確認された細菌の強度に正規化しました。このステップは、腸に沿った自家蛍光のばらつき（作物と後腸で最も高い）を調整し、組織の深さの違いによる細菌の蛍光強度の違いを調整する。この正規化ステップの後、各腸領域の境界内で100μmの移動平均フィルターを適用し、小規模な空間変動を平滑化しました。腸に沿った各空間位置をコロニー形成の強度からコロニー形成/未形成に変換するために、目視検査に基づいて各腸の強度を閾値化しました。そして、スプラインに沿った各位置でコロニー化した全腸の比率を図のパネルにプロットした。さらに、区切られた各領域内で5%以上のコロニー形成を持つ腸の数を、以下のように各領域の割合として報告する：クロップ、クロップダクト、プロベセントリック、ミッドガット、ヒンズーガット。
ビーズエグジッションの測定
ポリスチレンビーズ（Spherotech FP-0552-2、スカイブルー）の脱落を測定するために、フローサイトメトリーで脱落ビーズ数を定量化した。ハエは倒立した50 mLコニカルチューブに入れ、キャップに1 mLの固形餌を入れた状態で飼育した。排出物を回収するため、チューブを10 mLのPBSで洗浄し、10秒間ボルテックスした後、清潔なキャップを上にかぶせた。溶液を濃縮するために、サンプルを遠心分離機で400×gで7分間回転させ、ペレットを200μLのPBSに再懸濁した。濃縮したサンプルをAttuneフローサイトメーター（Thermo Fisher）で計数した。
電子顕微鏡観察
全腸をCacodylate pH7.4（Cac）バッファーで解剖し、0.1M Cac中の3%GA+1%FAで2日間、4℃で固定した。サンプルはアガロースで包埋し、さらに処理するまで4℃で保存した。その後、サンプルをCacバッファで洗浄し、1% OsO4 + 1.25% KfeCNで1時間染色、水で洗浄、0.05Mマレイン酸pH6.5（Mal）で処理、Mal中0.5%酢酸ウラニルで1時間25分染色、さらに濃度を上げてエタノールで洗浄しました。樹脂への埋め込みは、埋め込み前に移行溶媒として一晩蒸発させた樹脂＋酸化プロピレン（1：1）で処理し、エポキシ樹脂（エポン＋クエトール（2：1）＋スパー（3：1）＋2% BDMA）に55℃で一晩埋め込み、70℃で4日間養生した。
X線マイクロコンピューティングトモグラフィー（XR µCT)
試料は、文献51のプロトコルに従ってXR µCT用に準備した。51のプロトコルに従ってXR μCT用のサンプルを準備した。簡単に説明すると、ハエをPBS中の1% Triton-Xで洗浄し、クチクラワックスを減少させた。固定液と染料の浸透を高めるため、細いタングステンピンで腹部と胸部に浅い穴を開けた。固定はBouinの溶液で行った。染色は、ホショタングステン酸で3週間行った。フライは、脱イオン水を含む10 µLのマイクロピペットチップにイメージング用にマウントし、パラフィルムで密封した。画像処理は、ローレンスバークレー国立研究所のシンクロトロンAdvanced Light Sourceのビームライン8.3.2において、Dula Parkinsonの協力のもと実施した。180度回転させ、20倍の倍率で1つの標本につき1313枚の画像を取得した。バックプロジェクションはTomopyを使用し、以下の仕様で行われた：
doFWringremoval 0 doPhaseRetrieval 1 alphaReg 0.5 doPolarRing 1 Rmaxwidth 30 Rtmax 300
詳細な仕様については、こちら（http://microct.lbl.gov/）をご覧ください。図4A、Bの画像は、Octopus 8.8.2.7およびVG Studio 2.2で作成されたものである。図4D-Gの腸管内腔の体積再構成は、Imarisで手動セグメンテーションを使用して行った。
クライオセクショニング
OCT（McKessen、981385）にハエを埋め込むために、まず脚と翼を取り除いた。次に、ハエをOCT培地に浸漬し、撹拌して気泡を除去することにより、OCT培地に平衡化した。次に、ハエをクライオモールド（Ted Pella Inc.、4565、Lot 78652）内の新鮮なOCTに移した。1つのモールドに最大5匹のハエを並列に配向させた。ブロックを粉末ドライアイスのベッドに置くことで急速凍結し、切片化まで-80℃で保存した。Leica CM3050クライオスタットを用いて-24℃で10μmの切片を作成し、正電荷をかけたスライド（VWR Superfrost Plus, 48311-703）に移した。切片はMini Dry Bath (USA Scientific, BSH200)を用いて風乾し、染色まで-20℃で保存した。
レクチン染色
切片の固定と染色は、切片作成後2日以内に行った。まず、HBSS（Cold Harbor Springs Protocol）で短時間洗浄することにより、スライドから過剰なOCTを除去した。次に、切片を4％PFAで30分間固定し、HBSSで1回洗浄した。染色前に、切片をHBSS中の1％BSAでブロックした。切片を最適濃度の特異的レクチンで30分間染色した：（12. 5 µg/mL Wheat germ agglutinin (WGA - Biotium, 29026-1, Lot 18W1205), 50 µg/mL Dolichos biflorus agglutinin (DBA - Glycomatrix, 21511013-1, Lot L20092804ZH)、 50 µg/mL Lens culinarus agglutinin (LCA - Glycomatrix, 21511020-1, Lot L20092902ZH), または 50 µg/mL WGA-Succinylated (S-WGA - Vectorlabs, FL-1021S-5, Lot 2008145). レクチン染色は、HBSS中でカウンターステインCalcofluor (Sigma-Aldrich, 910090, Lot MKCL1227)と同時に行った。その後、切片をHBSSで1回、10%HBSSでもう1回洗浄した。切片をマウントメディア（80%グリセロール、20%トリス0.1M pH9.0）にマウントし、#1カバースリップでカバーした。
各レクチンの染色に最適な濃度は、500 mMの濃度の特定のハプテン酸糖の存在下で、50 µg/mL、12.5 µg/mL、3 µg/mLの濃度を調製して決定した。WGAおよびS-WGAについては、ハプテン性糖はN-アセチルグルコサミン（Vectorlabs, S-9002, Lot ZJ022）であった。DBAはN-アセチルガラクトサミン（Vectorlabs, S-9001, Lot ZJ0301）をハプテン酸とした。LCAはD-マンノース（Sigma, M602025G, Lot SLBG0980V）である。各レクチンの特異性は、ハプテン酸による染色の阻害で評価した。組織を染色し、対応するハプテン酸で染色を阻害できる最低のレクチン濃度を最適濃度として選択し、その後の処置に使用した。
統計情報
統計テストはPrismで行った。一般に、データはShapiro-Wilk検定を用いて正規性をチェックした。正規性が確立された場合、Welchのt-testが実行された。CFU量の統計的検定は、log10変換されたデータに対して行われた。CFUが0の場合、logは0に設定された（擬似カウント1に対応する）。複数の比較を行う場合は、通常の一元配置のANOVAを実施した。有意な場合は、Tukeyの多重比較検定で複数の一対比較を行った。データが正規分布していない場合は、ウィルコクソン順位検定で比較した。割合のエラーバーは、割合の標準誤差（s.e.p.）、または本文中で指定したClopper-Pearson法またはJeffries法による二項95％信頼区間である。割合の差の統計的有意性は、Z-testを用いて評価した。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
この研究で生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文（およびその補足情報ファイル）に含まれています。ソースデータは本論文に添付されています。
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謝辞
Plasmid pCD256-mCherry64は、オーストリアBOKUのReingard Grabherrから寛大に提供されました。プラスミドpCM6266は、米国San Jose State UniversityのElizabeth Skovranから惜しみなく提供された。KCHはChan-Zuckerberg Biohub Investigatorである。EWJにはBanting and the Pacific Institute for the Mathematical Sciences Postdoctoral Fellowships、AA-DにはHoward Hughes Medical Institute International Student Research fellowship、Stanford Bio-X Bowes fellowship、Siebel Scholars program、KCHにはAllen Discovery Center at Stanford on Systems Modeling of Infection、JMCにはUS Army Research Officeからのグラント W911NF-09-0001 を通じて David and Lucile Packard財団および Institute for Collaborative Biotechnologiesから資金を供与されました、 DAS にはカナダ自然科学・工学研究評議会の Discovery Grant と Canada Research Chairs プログラム、ACS と CW には Howard Hughes Medical Institute、WBL には National Institutes of Health grants DP5OD017851 と R01DK128454 が授与されました、 WBLとKCHにはNational Science Foundation grant IOS 2032985、WBLにはNational Science Foundation grant IOS 2144342、WBLとACSにはCarnegie Institution for Science Endowment、WBLとDASにはCarnegie Institution of Canada grant、KAにはNational Institutes of Health training grant T32GM007231を支給した。ELBとMVの研究は、米国エネルギー省の契約番号DE-AC02-05CH11231のもと、ローレンスバークレー国立研究所のLaboratory Directed Research and Development Programの支援を受けている。
著者情報
著者と所属
カーネギー科学研究所発生学部門（ボルチモア、メリーランド州、21218、アメリカ
レン・ドッジ、ハオロン・ズー、ダニエル・J・マルティネス、チェンホイ・ワン、ケビン・オーミラー、アラン・C・スプラドリング、ウィリアム・B・ルディントン
サイモンフレーザー大学物理学科（カナダ、BC州バーナビー、V5A 1S6）。
エリック・W・ジョーンズ＆デヴィッド・A・シヴァック
カリフォルニア大学サンタバーバラ校物理学科、カリフォルニア州、93106、米国
エリック・W・ジョーンズ＆ジーン・M・カールソン
ジョンズ・ホプキンス大学生物学部（メリーランド州ボルチモア、21218）、米国
朱浩隆、ケビン・オーミラー、劉哲賢、アラン・C・スプラドリング、ウィリアム・B・ルディントン
カリフォルニア大学バークレー校分子・細胞生物学部、94720、米国
ベンジャミンオバディア
ハワード・ヒューズ医学研究所（メリーランド州ボルチモア、21218、米国
王晨輝＆アラン・C・スプラドリング
スタンフォード大学バイオエンジニアリング学部（スタンフォード、カリフォルニア州、94305、米国
アンドレス・アランダ＝ディアス＆カーウィン・ケイシー・ホアン
ローレンスバークレー国立研究所（カリフォルニア州バークレー、94720、米国
マルコ・ヴォルトリーニ＆エオイン・L・ブロディ
ミラノ大学地球科学研究所、イタリア、ミラノ
マルコ・ヴォルトリーニ
スタンフォード大学医学部微生物学・免疫学教室（スタンフォード、カリフォルニア、94305、米国
カーウィン・ケイシー・ホァン
チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、94158、米国
カーウィン・ケイシー・ホァン
貢献度
R.D.、E.W.J.、H.Z.、B.O.、C.W.、E.B.、J.M.C.、 D.A.S., A.S., and W.B.L. designed the research. R.D., E.W.J., H.Z., B.O., C.W., K.A., A.A.-D., M.V., and W.B.L. performed the research. R.D.、E.W.J.、D.J.M.、W.B.L.はデータを分析した。R.D.とW.B.L.は原稿を執筆した。R.D., E.W.J., K.C.H., D.A.S., J.M.C., A.C.S., and W.B.L. が原稿を修正した。投稿前に著者全員が原稿を確認した。
筆頭著者
ウィリアム・B・ルディントン宛に通信を行う。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
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Nature Communicationsは、François Leulierと他の匿名の査読者の方々に感謝します。査読者の報告書はこちらです。
追加情報
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この記事について
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Dodge, R., Jones, E.W., Zhu, H. et al. Drosophila melanogasterにおける共生物理ニッチは、複数種の腸内細菌叢の安定した会合を制御している。Nat Commun 14, 1557 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36942-x
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2022年1月11日受理
2023年2月22日受理
2023年3月21日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-36942-x
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