単一株の挙動が腸内細菌叢の環境pHと浸透圧に対する応答を予測する

2023年7月28日 10:00

オープンアクセス
ヒトマイクロバイオーム
研究論文
2023年7月11日
単一株の挙動が腸内細菌叢の環境pHと浸透圧に対する応答を予測する

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.00753-23

著者 Katharine M. Ng https://orcid.org/0000-0003-3494-5697, Sagar Pannu https://orcid.org/0000-0002-9201-7621, Sijie Liu, Juan C. Burckhardt, Thad Hughes, Will Van Treuren, Jen Nguyen, SHOW ALL (13 AUTHORS), Carolina Tropini https://orcid.org/0000-0002-7542-1577 carolina.tropini@ubc.caAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.00753-23
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ABSTRACT
疾患や薬剤によるpHや浸透圧などの腸内環境因子の変化は、マイクロバイオーム組成の大きな変化と相関している。しかし、現在のところ、どの細菌種がこのような変化に耐えられるのか、また、その群集がどのような影響を受けるのかを予測することはできない。ここでは、28科にまたがる92の代表的なヒト腸内細菌株を用いて、複数のpH値と浸透圧にまたがるin vitroでの生育を評価した。極端なpHや浸透圧の条件下で増殖する能力は、多くの場合、既知のストレス応答遺伝子の有無と相関していたが、全てではなく、酸性ストレスや浸透圧ストレスからの保護に新たな経路が関与している可能性が示された。機械学習分析により、酸ストレスまたは浸透圧ストレスにおける耐性の違いを予測する遺伝子またはサブシステムが発見された。浸透圧ストレスについては、浸透圧擾乱時にこれらの遺伝子の存在量がin vivoで増加することが裏付けられた。また、試験管内で特定の分類群を分離し、制限条件下で増殖させたところ、試験管内の複雑な群集における生存率と、食餌誘発腸内酸性化モデルマウスにおけるin vivoでの生存率に相関が見られた。我々のデータは、in vitroでのストレス耐性の結果は一般化可能であり、物理的パラメータが群集メンバーの相対的存在量を決定する上で、種間相互作用に優先する可能性があることを示している。本研究は、腸内で遭遇する可能性のある一般的な摂動に対応する微生物叢の能力に関する洞察を提供し、これらの条件下で生存する能力の増加と相関する遺伝子のリストを提供する。
重要性
微生物叢研究においてより高い予測可能性を得るためには、pHや粒子濃度などの物理的環境因子を考慮することが極めて重要である。例えば、pHはがんや炎症性腸疾患、市販薬の使用など、様々な疾患で著しく変化する。さらに、吸収不良のような状態は、粒子濃度に影響を与える可能性がある。我々の研究では、環境pHと浸透圧の変化が、細菌の増殖と存在量の予測指標としてどのように役立つかを調査している。私たちの研究は、複雑な摂動時における微生物組成と遺伝子量の変化を予測するための包括的なリソースを提供する。さらに、我々の発見は、細菌組成の主要なドライバーとしての物理的環境の重要性を強調している。最後に、この研究は、微生物叢の存在量のシフトに影響を及ぼす要因をよりよく理解するために、動物および臨床研究に物理的測定を組み込む必要性を強調している。
はじめに
動物の消化管は、酸素濃度、酸性度、粘膜の硬さ、温度などの物理的・化学的条件が宿主と微生物の相互作用によって厳密に制御される多数の異なる環境から自然に構成されている。腸管に沿った環境勾配は、微生物叢が腸管に沿った航海の中で探索する生息地の連続体を作り出す(1 - 3)。pHと粒子濃度（浸透圧）の変化は、一般的に腸疾患で起こるか、特定の化合物の摂取によって生じる。例えば、炎症性腸疾患（IBD）、腸がん、制酸剤はpH値の異常と関連している（4、5）。さらに、下痢や加齢は腸内の酸素増加と関連しており、不耐症（セリアック病など）や塩分、アルコール、下剤の過剰摂取による吸収不良などの状態は、浸透圧の変化につながる(6 - 8)。さらに、微生物叢は、管腔酸素の消費、粘膜層の分解、発酵や短鎖脂肪酸（SCFA）産生による環境の酸性化によって、物理的パラメータに影響を及ぼす（9 - 11）。
腸内物理環境の変化は腸内細菌叢に広範な規模で影響を及ぼし、生化学的・物理的条件が各分類群の必要条件と一致した場合にのみ増殖が促進される(3)。特定の分類群の生存は、短期的・慢性的な時間スケールで代謝やストレス応答を制御する遺伝子や経路の機能によって左右される。これらの遺伝子や経路は、腸の特定の領域や宿主の状態で増殖できる微生物叢のメンバーを確立する上で重要な役割を果たしている(1 - 3)。例えば、腸管内酸素勾配が急な場合、フェカリバクテリウムのような嫌気性の強い細菌は酸素の多い上皮から遠ざかり、一方、腸内細菌科のような好気性の細菌は粘膜と共生することができる(12)。酸素感受性だけでなく、pHと浸透圧も細菌の増殖と生存に影響を与える(4, 13 - 15)。pHや浸透圧がわずかに変化するだけでも、酵素活性、特定の栄養基質のエネルギー的な好都合性、タンパク質合成速度が変化するため、細菌の増殖に劇的な影響を与える可能性がある（16 - 18）。
これまでの研究で、pHや浸透圧への適応における微生物分類群間の大まかな違いが浮き彫りになっており、これはpHの変化に反応してよく研究されている分類群の濃縮度が異なることからも明らかである（13）。例えば、ラクトバチルス属は広い範囲のpHで増殖するが、バクテロイデス属の一部は酸性環境で抑制される(19)。このような一般的な傾向にもかかわらず、これらの分類群の中には、pHや浸透圧が変化するような高ストレス条件下で優れた能力を発揮するものもあれば、これらのパラメーターに対して感受性を示すものもあり、属特異的、あるいは菌株特異的な違いが見られる(4, 20)。分類群が増殖できないような制限がない場合でも、物理的条件の変化が細菌の増殖速度に影響を及ぼし、その結果、腸内の競争が激しく栄養が乏しい環境下で微生物相組成が変化する可能性がある。例えば、ポリエチレングリコール（PEG）により誘発される軽度の浸透圧性下痢は、細菌の密度や量に変化がないにもかかわらず、腸内微生物のメンバー構成に長期的な変化を引き起こす可能性がある(14)。
これまでのところ、物理的パラメータが腸内細菌分類群全体の細菌増殖に及ぼす影響については、十分に報告されていない。さらに、物理的環境が細菌の応答や存在量を広く予測できるかどうかも不明のままである。この理解のギャップを埋めることは、微生物叢と疾患との関係を明らかにする上で特に重要である。というのも、特定の腸内細菌メンバーの存在は、疾患特異的な表現型よりもむしろ物理的環境によって強く規定される可能性があるからである。さらに、特定の腸内細菌がさまざまな物理的パラメーターに耐えられるようにする遺伝子を特定することも極めて重要である。糞便微生物叢移植やプロバイオティクスの投与といった治療法は、疾患によって変化した環境では生存できない細菌を移植することによって効果がなくなる可能性があるからである。
本研究では、28科92種の増殖表現型を、pHと浸透圧の値の範囲にわたって調べた。ハイスループット増殖測定、環境測定、機械学習（ML）支援型比較ゲノミクスを組み合わせ、健康と疾患に関連するpHと浸透圧の条件下で生存する微生物分類群の能力を系統的に同定した。我々は、個別に増殖した菌株の細菌増殖を試験管内で徹底的に分析し、既知の病原体やプロバイオティクス菌株を含む系統学的に近縁な微生物間の耐性の一般的傾向を明らかにした。ヒト微生物叢のin vitroおよびヒト化マウスモデルでの実験により、これらの結果を裏付け、複数のドナーおよび条件下で細菌量の幅広い予測可能性を実証した。重要なことは、in vitroにおける単一菌株のストレス耐性の結果が、in vivoの複雑な条件下における細菌の挙動を予測できることを見出したことである。また、浸透圧ストレス応答に関与する遺伝子の存在が、浸透圧が乱れた環境での生存を予測することもわかった。これらの結果を総合すると、物理的環境は細菌の応答と存在量を広く予測できることが実証された。この知見は、微生物叢療法の有効性を判定し、乱れた腸内環境で治療が実行可能かどうかを評価するのに役立つであろう。
研究結果
28科92菌株の収集
7つの門にまたがる28の一般的な腸内細菌科から92菌株を培養し、ヒト分離株を中心とした多様な菌株群を構成した（図1A）。これらの菌株は、公開されていること、ゲノム配列が完全に解読されていること、腸内細菌叢に広く存在していることから関心が高いことを考慮して選んだ。ほとんどの菌株は、Human Microbiome Projectヒト株BEIコレクション、American Type Culture Collection（ATCC）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（DSMZ）、およびCollection of Inflammation-Associated Mouse Intestinal Bacteria（21）から入手した（材料と方法）。これらの菌株のうち、69株はヒト由来、10株はマウス由来、残りの13株はプロバイオティクスまたはその他の菌株から分離されたものであった。一部のプロバイオティクス株（11株）は市販の菌株から単離されたもので、これまでに塩基配列は決定されていない。有病率、存在量、または健康への関連性から関心の高い分類群については、種特異的な結論を導き出すことを避けるため、ファミリー内の複数の種または株を対象とした(22 - 30)。具体的には、Bacteroidaceae（バクテロイデス科）、Bifidobacteriaceae（ビフィズス菌科）、Lactobacillaceae（乳酸桿菌科）、Lachnospiraceae（ラクノスピラ科）、Enterobacteriaceae（腸内細菌科）、Prevotellaceae（プレボテラ科）のカバレッジを増やした。菌株のハイスループット培養と比較を容易にするため、大部分の菌（83/92株）をメガ培地で嫌気的に培養した。メガ培地は、多種多様な菌株の生育をサポートすることが以前に実証された、豊富で未定義の培地である（材料と方法）(31)。残りの菌株の増殖には、より特殊な培地が必要であった（Materials and Methods; Fig.）細菌増殖が環境pHに及ぼす影響を測定するため、実験培地に2'′,7′-ビス-(2-カルボキシエチル)-5-(および-6)-カルボキシフルオレセイン（BCECF）を添加し、光学密度（OD）測定と連動したリアルタイムのpH測定を可能にした（図1B）。異なる条件下での増殖に関して、培地の酸性化に有意な傾向は見られなかった（図S1A）。本菌株ライブラリーのゲノムは完全に配列決定され、アセンブルされているので、Pathosystems Resource Integration Center（PATRIC）のタンパク質アノテーションを組み合わせた比較ゲノム解析を行った。この解析を全菌株にわたって可視化するために、PATRICのアノテーションデータを探索し、複数のゲノム間で比較するための新しい可視化ツールを作成した（https://tropinilab.shinyapps.io/strain_heatmap_app/）（図1C）。4種類の浸透圧（未改変培地の浸透圧0.23-0.44 Osm/kgから最大条件1.8 Osm/kgまで）と4種類のpH値（4-7.4）にまたがる8つの異なる条件で菌株を培養した。腸内細菌が消化管沿いや摂動中に遭遇する可能性のある環境条件を模倣するために、これらの範囲を選択した（14, 32, 33）。
図1
図1 特徴的な腸内細菌株の系統学的概要と実験セットアップ。(A）菌株ライブラリーの各メンバーの16S rRNA配列をSILVAデータベースから取得し、系統樹の作成に使用した。 B）異なる物理的条件下での細菌株の増殖の特徴を調べるための実験デザインとワークフロー。(C)ストレス応答、防御、および病原性遺伝子カテゴリーのサブカテゴリー内における、特徴付けられた菌株のPATRICアノテーションのヒートマップ。
細菌ファミリーは浸透圧の増加に対して様々な耐性を示す。
浸透圧の上昇は、本研究でアッセイした細菌ファミリーに大きく異なる影響をもたらした（図2A）。高浸透圧のin vivo測定値は通常～1,100 mOsm/kg未満であるが（14）、本研究では多くの細菌分類群がこれらの値で強い増殖を示したため、より広い範囲の高浸透圧を探索しようとした。乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）と腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌は、中程度の高浸透圧（～1,176 mOsm/kg）と高浸透圧（～1,800 mOsm/kg）で力強い増殖を示した。興味深いことに、Lactobacillaceaeの属および種間で適度な不均一性が観察された。高浸透圧条件下でより悪影響を受けた菌株は、Lactobacillus murinus 1株（NM26）および2株（NM28）、Lactobacillus intestinalis NM61、Lacticaseibacillus rhamnosus HA-114であった。逆に、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Lachnospiraceaeの各ファミリーの細菌は、浸透圧の上昇に対して幅広い感受性を示し、Bifidobacteriumの2株を除いて、これらの細菌は浸透圧が1,800 mOsm/kg程度の培地では増殖できなかった。ムチン分解菌であるAkkermansia muciniphila ATCC BAA-835、試験したほとんどのPrevotellaceae属、Erysipelotrichaceae属のHoldemanella biformis VPI C17-5 ATCC 27806などである。多くの菌株が高浸透圧条件下で増殖速度の低下を示したが、それでも通常の浸透圧条件下と同様の最大収量に達しており、このような制限条件下でも栄養素を活用する能力は同じであることが示された（Fig.）
図2
図2 浸透圧およびpHストレス応答による表現型の変化。(A)92菌株の浸透圧条件下での正規化増殖速度とOD600を系統学的近縁度で並べたヒートマップ。成長速度とODは、浸透圧とpHの条件にわたって、特徴付けられた菌株内の最大成長速度とOD値で正規化した。浸透圧とpHを変化させた条件下で特徴づけられた増殖曲線は、細菌分類群全体にわたる耐性の一般的傾向を示している。(B-D)PATRICのアノテーションと、1レベル決定木回帰モデルによって得られた特徴付けされた菌株の増殖プロファイルデータのML解析。(B)～440、890、1,176、1,800 mOsm/kg（左）の浸透圧条件における最大ODの関数として、グルタチオン生合成およびγ-グルタミルサイクルの特徴を有する細菌種の存在（赤）または非存在（青）のボックスプロット。この経路は、浸透圧擾乱時に生体内で濃縮されることがわかった（右）。(C）コリンの取り込みとベタインクラスターへの変換の遺伝子をコードする（赤）、または欠損している（青）細菌種の、浸透圧を変化させた条件下での最大ODの関数としてのボックスプロット（左）。この経路は、浸透圧擾乱時にin vivoで濃縮されることがわかった（右）。(D) 浸透圧条件を変化させたときの最大ODの関数として、少なくとも10個の浸透圧ストレス遺伝子の存在（赤）または非存在（青）を強調したボックスプロット（左）。この経路は、浸透圧擾乱時にin vivoで濃縮されることがわかった（右）。**p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。
広範な腸内細菌の増殖能力に関するリソースを作成した後、我々は、耐性細菌において一貫して過剰発現している遺伝子や機能を見つけることによって、いくつかの細菌が異なる浸透圧条件に対して耐性を持つ根底にあるメカニズムを発見しようとした。私たちの菌株ライブラリーに含まれるゲノムの大部分（81/92）が完全に配列決定され、アセンブルされているので、PATRICが作成したツールを用いて行ったゲノムアノテーションと、私たちが定量した増殖表現型（34）を組み合わせて、比較ゲノム解析を行った。
次に、PATRICが採用した潜在的なアノテーションが、様々な環境浸透圧やpH条件下で生育する菌株の能力を示しているかどうかを調べるために、ML戦略を採用した。多くのMLアプリケーションでは、入力特徴量に基づいてモデルを学習し、その精度と汎化性を評価・最適化することが目的であるが、我々の目的は、利用可能なPATRICアノテーションの大規模なセットから特徴量を選択するタスクに限定されていた。そのため、我々はPATRIC注釈の新しい特徴化を構築し、決定スタンプと呼ばれる単純なMLモデルを使用して、多くの予測モデルをデータに当てはめた。PATRICの各特徴の候補について、トレーニングセットとホールドアウトテストセットの両方でモデリングエラーを測定した。そして、そのモデル化誤差を用いて、表現型を予測する能力に従って、すべてのPATRIC特徴をランク付けした。このML解析により、異なる生育条件における細菌増殖の最大ODの増加と相関するPATRICアノテーション（MLモデル特徴）が効率的に同定された（材料と方法；表S2）。
いくつかのサブシステムの存在が、高浸透圧でより高い最大ODと相関することがわかった（表S2）。この種の解析の課題は、多くの機能的アノテーションが相関し、同じ株に存在する可能性があるが（図S2）、必ずしも摂動に対する反応に直接関与しているとは限らないことである。そこで、成長表現型を区別する上で上位にランクされ、メカニズム的に妥当な特徴を同定した。重要なことに、ホールドアウトデータセットはトレーニングデータセットと同等の結果を示し、同定された特徴がこの菌株のサンプリング全体にわたって一般化されていることが示された（図S3A）。関連する特徴を検出する能力をさらに高めるために、ヒト化マウスモデルにおけるin vivo浸透圧擾乱のメタゲノム解析データセットを再解析した（14）。簡単に説明すると、このデータセットでは、マウスを浸透圧性下剤PEGに暴露し、平均腸管浸透圧を533から810 mOsm/kgに上昇させた。そして、浸透圧擾乱前、擾乱中、擾乱後のマウスについて、このコミュニティーに存在する機能的経路を定量化した。その結果、in vivoの高浸透圧で過剰に発現し、ML解析でも検出された機能が同定された。
特に興味深かったのは、グルタチオン生合成／γ-グルタミルサイクル、コリンの取り込みとベタインへの変換、浸透圧ストレスのサブクラスであった（図2BからD）。注目すべきは、異なる浸透圧条件下での生育を区別する特徴として、冷ショックタンパク質も同定されたことである（図S3BおよびC）。これらのサブシステムまたは役割の中でアノテーションされた遺伝子を持つ特徴的な細菌分類群は、浸透圧が高くなるにつれて、平均してより高い最大ODを示し、また高浸透圧条件下でin vivoで有意に過剰発現した。ストレス遺伝子アノテーションの重要性を確認するため、浸透圧ストレス遺伝子カテゴリーを、この解析における予測特徴のトップとして同定し、このカテゴリーで最低10個の特徴が高浸透圧条件下での成長を予測した（図2D; 表S2）。これらの解析から、これらの特徴が浸透圧耐性を支えるメカニズムを明らかにするために必要な、将来のトランスクリプトーム／プロテオーム研究の候補が明らかになった。
細菌ファミリーは、酸性／アルカリ性ストレスに応答して、増殖と収量において幅広い表現型変異を示す
pH4～7.4の範囲で菌株ライブラリーの生育を評価したところ、酸性条件に対する耐性が幅広いことが明らかになった（図2A）。腸内の生理的pHは腸内部位、食事、疾患によって変化するため、細菌種が直面しうる生理的関連性のある摂動を包含するようなpH条件を選択した（4, 22, 23, 25）。乳酸菌を除くほとんどの菌株は、pH 4では増殖できなかった。pH 5.5でも、これらの菌株は増殖速度と最大収量に重大な欠陥を示した。ラクトバチルス科の細菌は、乳酸菌として予想されるように、低pHに対して最も高い耐性を示した。ラクトバチルス属とリギラクトバチルス属のいくつかの菌株は、生理的pH（6.4-7）と比較して、pH4では増殖速度と最大ODが急激に低下し、pH7.4では増殖が阻害された。興味深いことに、市販のプロバイオティクス由来の分離株は、pHの変化に対して高い感受性を示した。さらに、pH5.5では、うどんこ病菌のような多くの菌種が増殖速度と収量の低下を示した。例外はデスルホビブリオナ科、フソバクテリウム科、ヴェイヨネラ科、ビフィドバクテリウム科のメンバーで、酸性環境（それぞれ酸性鉱滓、虫歯菌、膣、発酵食品など）で報告されているメンバーが含まれている（35～39）。バクテロイデス科に属するバクテロイデス属は低pHに感受性があるとの報告もある(40)が、この属ではpH5.5での増殖に幅広い感受性が観察されたことから、種や菌株によって酸性環境によりよく適応している可能性が示唆された。腸内細菌科（Enterobacteriaceae）や連鎖球菌科（Streptococcaceae）を含むいくつかの科では、pH 5.5で増殖速度や収量が著しく低下した。腸内細菌科のメンバー（大腸菌やサルモネラ菌など）については、酸耐性応答が報告されている（41）。われわれの実験では、実験条件下で増殖する直前に細菌を中性pHで再培養し、健康な微生物叢を疾患環境に移すことをシミュレートした。興味深いことに、ラクトバチルス科の細菌を含むいくつかの細菌は、pH耐性が狭く、弱アルカリ性条件下で抑制された。このようなアルカリ性条件に対する感受性は、乳酸桿菌科で報告されている(19)。興味深いことに、高浸透圧条件下での観察結果と同様、増殖速度における相対的な欠損は、最終的な収量の欠損には必ずしも結びつかなかった（図2A）。
菌株ライブラリー全体で増殖パターンを同定した後、酸性／アルカリ性ストレスにおける菌株増殖と相関するサブシステムを同定するために、再びPATRIC特徴についてML解析を行った。浸透圧解析とは異なり、同定されたPATRIC特徴は敏感であり、保留されたデータに対するモデルの適合は、より低い一般化を示した（表S2；図S4）。さらに、高い予測力を示したPATRICの特徴は、乳酸桿菌科のような特定の細菌科と強く相関していたため、同定された菌株全体ではあまり広い予測力を示さなかった。
pHと浸透圧に対する分類群特異的応答は、自然由来の複雑な群集における挙動を予測する。
腸内では、微生物叢を構成する微生物群集は、物理的環境だけでなく、資源を奪い合い、阻害分子を産生する可能性のある他の微生物種からも影響を受ける(42)。単一菌株の純粋培養における挙動が、群集における増殖表現型に一般化可能かどうかを調べるため、我々は、定義されたpHと浸透圧の環境を与えたin vitro培養における複合腸内細菌叢の増殖を調べた。健康なヒトドナー6名の糞便をメガ培地で48時間培養し、個々の菌株の単系統増殖を評価したのと同じ培地条件で培養した。無関係な複数のドナーから糞便微生物叢を選択することで、自然に共存し、特定の複雑な群集に適応している異なる分類群を研究することができ、特定の代謝的相互作用に依存しない一般化可能な挙動を同定することができた。pHと浸透圧を変化させた結果、群集組成は広範囲にわたった（図3A）。48時間後の群集のOD（図3B）とDNA濃度（図S5）は、試験した中で最も高浸透圧の場合を除き、一般的に浸透圧に強く、pH依存性が非常に大きいことがわかった。このことは、単一株生育（図2）において、最も浸透圧に強く、酸に強い種の挙動を反映しており、これらの株が観察された群集の挙動を牽引していたことを示唆している。異なる条件下での個体数の変化をファミリーレベルで比較し、菌株固有の潜在的な挙動を回避した。その結果、pHおよび浸透圧と、特定のファミリーの相対現存量との間に、多数の明瞭な正の相関と負の相関が観察された（図3C）。pHとの負の相関は、そのファミリーが低pHにより耐性があることを示し、浸透圧との負の相関は、そのファミリーが高浸透圧により耐性がないことを示す。pHの変化に対するヒトの分類群のこれらの相関は、個々の種の単一株増殖における我々の観察結果を反映しており、特定の分類群については、特定の微生物叢組成よりも環境pHの方が細菌量の強力な促進因子であることを示唆している。例えば、ビフィズス菌科の相対的な存在量は、pHの増加に伴って非常に負の相関（r = -0.86）を示し（図3D）、他の科に比べてビフィズス菌科の種が広く低pH耐性であることと一致した（図2A）。対照的に、腸内細菌科、タンネレラ科、オシロスピラ科、およびバクテロイデス科は、pHの増加に伴って正の相関を示し（酸感受性を示唆）、これは単一菌株の増殖データと一致した。糞便発酵における浸透圧の違いに対する細菌ファミリーの反応も、単一菌株の反応と類似していた。例えば、腸球菌科の相対存在量は浸透圧と高い正の相関（r= 0.71）を示し（図3E）、in vitro（図2A）やin vivo（14）での腸球菌科の高浸透圧に対する耐性と一致した。逆に、Lachnospiraceae科とBacteroidaceae科のメンバーは、浸透圧と強い負の相関を示した。これらの科における単一菌株の応答の不均一性（図2A）は、調査した群集内の集団が、比較的浸透圧に敏感なメンバーに偏っている可能性を示唆している。
図3
図3 試験管内の複数の複雑な微生物群集における細菌ファミリーの相対存在量と浸透圧およびpHとの相関（A）試験管内の単一菌株培養と同じ範囲のpHおよび浸透圧に供したヒト糞便サンプル（n =6）の試験管内培養から分離された細菌分類群の相対存在量の棒グラフプロット。細菌ファミリーの相対的存在量と構成は、16S rRNA配列決定により決定した。(B）48時間後のOD600。浸透圧とpHが群集の増殖に及ぼす影響を調べるために測定した。(C) in vitroで解析したヒト糞便サンプルの複雑な群集における細菌ファミリーのピアソン相関。相対存在量と浸透圧（左）およびpH（右）の間の負の相関を青で強調し、正の相関を赤で強調した。 (D) ビフィズス菌科細菌のpH上昇の関数としての相対存在量のプロット。pHと相対存在量の間に負の相関（r=-0.86）があることを示す。(E)腸球菌科の相対存在量と浸透圧の増加のプロット。浸透圧と腸球菌科の存在量の間に正の相関があることがわかる（r =0.71）。
しかし、試験管内で一貫した応答を示した菌株ライブラリーのメンバーであるいくつかの細菌ファミリーでは、環境pHまたは浸透圧との弱い相関が観察された。例えば、in vitroの単一株増殖で耐酸性を示した細菌種（例えば、乳酸菌科）の相関は、期待されたほど強くなかった。いくつかの例では、ドナー間で応答に不均一性が観察されたが、これはおそらく個々のドナーサンプルの分類群がまばらであることに起因している。例えば、ビフィズス菌科は、乳酸菌科のロイコノストカ科が優勢であった1つ[Tropini Lab 6 (TL6)]を除くすべてのサンプルにおいて、低pHで優勢な科であった；この科は、TL6を除くすべてのサンプルにおいて存在しないか、存在しても1%未満であった。乳酸菌科が検出された群集では、pH5.5の条件下でこの分類群の相対存在量が最も高かった。しかし、3つのドナーでは乳酸菌科はまったく検出されず、他のドナーでもpH5.5以外の条件下では検出されなかった（図3A）。このようにドナー間でも条件内でもばらつきがあることが、計算された相関関係に影響を与えた。さらに、腸内細菌種の相対的な存在量には、栄養や資源の競合など他の要因も寄与している可能性がある（図3C）。最後に、腸内細菌科は一部の糞便群集（TL1、TL2、TL4）においてのみ、浸透圧が高くなるにつれて存在量が増加したが、これは属や種・菌株レベルの変動によるものか、より可能性が高いのは、非反応性の糞便群集に存在する他の浸透圧耐性細菌による競合のためかもしれない。我々は16SリボソームRNA（rRNA）アンプリコンシークエンシングを用い、相対量を測定したため、他の浸透圧耐性細菌の生存と増殖が、腸内細菌科細菌の生存や絶対量の増加を覆い隠している可能性がある。
単一菌株の挙動は、腸内の環境pHおよび浸透圧に対する応答と相関する
いくつかの主要な分類群について、複雑な微生物叢におけるpHと浸透圧の耐性が試験管内で一般化できることを示したので、これらの表現型が、微生物叢の相互作用を超えて、宿主の動態との相互作用が細菌量の決定に重要な役割を果たしているin vivoでも一貫しているかどうかを調べた。他の研究では、生体内の浸透圧に対する応答を調べているので（14, 43）、我々は、微生物叢のメンバーが生体内のpHの変化によってどのような影響を受けるかを調べようとした。我々は、食餌の変化が腸内の様々な区画で腸内pHに異なる影響を与えると推論した（44, 45）。具体的には、盲腸と結腸における炭水化物の微生物発酵はSCFAを産生し、これらの腸管区画のpHを低下させる。生体内における摂動と同様に、食餌を変化させると、複数の直交する影響（すなわち、この場合、pHと同様に宿主と微生物叢の両方にとっての栄養素の利用可能性の差異を組み合わせること）が生じる。ほとんどの単糖類や二糖類は小腸で加水分解され吸収されるが、多くのオリゴ糖や多糖類は宿主の酵素では加水分解できず、消化されないまま大腸に移行し、そこで細菌によって容易に発酵される。そのような糖質のひとつがグアーガム(46)であり、β-1,4結合マンノース残基の直鎖骨格にβ-1,6結合ガラクトース残基がランダムに結合したガラクトマンナン多糖で、この構造は哺乳類の宿主では消化できない(47)。われわれは、この餌を食べたマウスは、標準的な餌を食べたマウスに比べて、大腸での発酵と酸性化が進むと仮定した。無菌のスイス・ウェブスター（SW）マウスに健康なヒトドナーの糞便を摂取させ、ヒト腸内細菌の代表的な群集を腸内にコロニー形成させた（図4A）。標準的なげっ歯類の餌で6週間平衡化させた後、マウスを2群に分けた。一方の群にはグアーガムを30％添加した餌を与え、さらに2週間その餌に慣れさせる一方、もう一方の群には標準的なげっ歯類の餌を与え続けた（図4A）。その後、マウスを犠牲にし、異なる腸管セグメントについて16S rRNA配列決定（図4B）とpH測定（図4C）を行った。腸管内容物の測定から、グアーガム食を与えたマウスの空腸、盲腸、結腸ではpHが有意に低下し（図4C）、発酵が促進されたことが示唆された。他の部位のpHとは異なり、十二指腸と回腸のpH値は食餌の変化による影響を受けなかった。次に、盲腸でのSCFA産生が食餌によって変化したかどうかを調べた。実際、グアーガム食を与えたマウスでは、酪酸レベルが3倍に増加したのに対し、他のSCFAはバレレートが軽度減少した以外は有意な影響を受けなかった（図4D）。
図4
図4 グアーガム食を与えたヒト化マウスでは、糞便pHが著しく低下し、細菌ファミリーの構成が変化した。(A）無菌（GF）SWマウスの実験概略図。ヒト化およびグアーガム食への切り替え（n = 5）と対照食（n = 3）の時系列を詳細に示す。下図は、pH測定、16S配列決定、およびSCFA測定のために採取した消化管のセグメントを示す。(B）グアーガムまたは対照食を摂取したヒト化マウスの相対的細菌量。ファミリー分類学的レベルでの腸内微生物組成が強調されている。(C）グアーガムまたは対照食を摂取したヒト化マウスの消化管に沿ったpHの定量。(D）グアーガムまたは対照食を摂取したヒト化マウスの糞便内容物中のSCFA濃度。
次に、異なる腸管区分と食餌条件における細菌の相対的な存在量を、それらの領域から単離した群集の16S rRNA配列決定を行うことによって解析した。グアーガム食を与えたマウスでは、糞便と大腸の平均pH値はそれぞれ6.36と6.02であったのに対し、標準食を与えたマウスでは7.26と7.04であった（図4C）。各細菌ファミリーのpH耐性プロファイルが異なることから（図2A）、酸性化によって大腸内細菌叢の組成が変化すると考えられた。その結果、酪酸産生菌Blautia（Lachnospiraceae科）が増加し、Erysipelotrichaceae科が減少した（図4；図S6）。単株解析の結果、BlautiaはpH5.5で増殖することができ、in vivoでこの条件下で増殖する能力と一致した（図2Aおよび4B）。逆に、in vitroのデータから、多くのバクテロイデス属細菌は低pHに弱いことが示唆された（図2A）。興味深いことに、実験マウスの盲腸と結腸では、バクテロイデス属細菌が試験管内のpH5.5以下の条件下で感受性を示したにもかかわらず、生体内でバクテロイデス属細菌の増殖が観察された（図2Aおよび4B）。この観察結果は、物理的環境の変化により、同じニッチ内で比較的耐酸性の高いバクテロイデス単離株の拡大が起こる可能性を示唆している。
考察
本研究では、一般に入手可能で塩基配列が決定されている幅広い腸内細菌とプロバイオティクス菌株のpHおよび浸透圧耐性を明らかにすることを目的とした。われわれは、in vitroで複数のpHおよび浸透圧条件下で、28科にわたる92の腸内細菌代表の増殖を特徴付けた（図1A）。これらの細菌種のほとんどはヒトから分離されたもので、ヒトの腸との関連性を最大限に高めるために選択された。しかし、同じファミリーのマウスとヒトの分離株のpHと浸透圧に対する反応を測定することで、複数の宿主にまたがる腸内細菌に見られる多様性をより広範囲に網羅することができた。我々は、ハイスループット増殖アッセイを開発し、健康時と疾患時の腸内で見られる代表的なpHと浸透圧の条件下で細菌の増殖を試験した。我々の測定結果は、細菌ファミリー間で摂動に対する耐性の幅が広いことと、pHと浸透圧の変化に対するファミリー固有の応答があることを示している。また、細菌ファミリーの中でも、宿主ごとにin vitro条件に対する応答が異なることが示された。比較ゲノミクスを用いて、ストレスに応答する特徴的な微生物分類群における遺伝子の存在量と有病率を明らかにした。多くの場合、酸性ストレスや高浸透圧に耐える能力は、同定されたストレス応答遺伝子の存在量や存在と一致していた。この研究の限界の一つは、腸内細菌科やバクテロイデス科など、より深く研究されている科と、より新しく発見された比較的培養が困難な科とでは、遺伝子アノテーションの深さや知識が異なることに起因する（図2A）。しかし、今回の解析は、ストレス耐性遺伝子のアノテーションがないにもかかわらず、pHや浸透圧が制限される条件下で増殖する菌株を同定するための枠組みを提供するものである。
その結果、乳酸菌科（市販のプロバイオティクス由来の分離株を含む）と腸球菌科の代表的な菌株において、それぞれ広範なpH耐性と浸透圧耐性が観察された。逆に、バクテロイデス科とビフィズス菌科は、浸透圧とpHに対する応答に不均一性を示した。生育表現型が多様であるにもかかわらず、表現型の変異を説明できるようなゲノム上の特徴は観察されなかった。これは、注釈のない遺伝子、あるいは注釈のある遺伝子の発現の違いによるものである可能性があり、これらの細菌の耐性の違いの根底にあるメカニズムを解明するには、トランスクリプトーム解析や単一遺伝子ノックアウトライブラリーが必要であることを示唆している。
興味深いことに、低pHまたは高浸透圧で最大増殖速度に欠損を示す菌株の多くは、依然として同様の最大収量を示した（図S1B）。腸内細菌はウォッシュアウトを防ぐために十分な速度で増殖しなければならないが、バイオマス収量の最大効率を維持することも生存のための効果的な戦略かもしれない。また、これらの菌株の中には、理想的な条件下での最大増殖速度と比較して、相対的な増殖速度不足を示すものもあるが、ある菌株が腸内で増殖するためには、単に生存するか、他の細菌と比較してバイオマスを効率的に生産する必要があるだけであることに注意することも重要である。さらに、一部の細菌分類群は腸内の特定のニッチに空間的に生息しており、他の細菌との資源獲得競争を制限してウォッシュアウトを防いでいる。
我々のML解析は、特定の遺伝子の存在が、異なる浸透圧での増殖を強く予測することを強調した（図2BからD）。これらの遺伝子の多くはストレス耐性に関与している(48, 49)。浸透圧ストレスに対しては、グルタチオン生合成／γ-グルタミルサイクルのサブシステムが浸透圧適応をもたらすことが以前に示されている（48）。興味深いことに、大腸菌のこのサブシステム内の遺伝子（例えば、gshAやgor）を欠く変異体は、浸透圧が上昇すると生育不全を示す(48)。さらに、従来浸透圧ストレス応答遺伝子とみなされていなかった遺伝子も同定した（表S2）。例えば、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼが浸透圧耐性を予測することがわかった。このタンパク質は、オキシドレダクターゼとしてピンポン機構でジヒドロリポアミドを酸化する機能を持つ(50)。興味深いことに、同定されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼは、黄色ブドウ球菌の浸透圧耐性の増加に関与している(51, 52)。
pH耐性に関与する遺伝子やパスウェイの同定は、浸透圧耐性の同定ほど明確ではなかったことから、家族特有の耐性メカニズムが作用し、一般化できる可能性のある特徴を覆い隠している可能性が示唆された。この結果は、メタゲノミクスのような群集ベースの手法では、pH耐性に関与する特定の遺伝子の重要性を明らかにできない可能性があることを示している。したがって、アノテーションが不十分な細菌においてpH耐性に関与する遺伝子を発見するには、より伝統的な遺伝学的スクリーニングやトランスクリプトミクスアッセイが必要になると予測される。ファミリー内で表現型に変異がある場合は、比較ゲノム技術が有用であろうが、分類群内で表現型が完全に浸透している場合は、そのような特徴の解明はより困難であろう。また重要なことに、最も酸に強い細菌と浸透圧に強い細菌は、一般的に重複していないことがわかった（図2）。このことは、酸耐性と浸透圧耐性にはそれぞれ異なるメカニズムがあることを示唆している。これはML解析でも確認され、浸透圧耐性を予測する特徴セットはpH耐性では上位にランクされなかった（図S4C）。
次に、単一分類群の表現型が、複雑な培地で培養された複雑な微生物叢に一般化できるかどうかを調べた（図3）。6種類の異なるヒト糞便微生物叢サンプルを用いて、pHと浸透圧の条件下で増殖試験を行ったところ、単離された細菌で観察された増殖パターンは、複合微生物叢コミュニティにおける相対的存在量と一致することがわかった。ビフィズス菌科とバクテロイデス科は、それぞれpHと負の相関と正の相関があり、単一菌株の増殖における酸耐性と感受性と一致していた（図2A）。同様に、腸球菌科などは浸透圧と正の相関を示し、浸透圧に対する耐性を反映していた。腸内細菌科もまた、純粋培養と3つのドナーサンプル（図3；TL1、TL2、TL4）において浸透圧耐性を示し、このファミリーは中間および高浸透圧でも増殖した。ドナー間で有意な相関が見られなかったのは、種レベルでの遺伝的または表現型の変異や、腸球菌科のような高浸透圧耐性細菌による競合外など、いくつかの理由が考えられる。単一菌株の反応データは、耐性や生存のための潜在的なメカニズムを浮き彫りにするかもしれないが、最終的には競合する細菌の相対的な耐性と回復力が成功の決め手となるかもしれない。例えば、pH5.5で乳酸菌Leuconostocaceae（ロイコノストッカス科）のブルームが1つのドナーサンプル（図3；TL6）で観察された。乳酸桿菌は低pHでより多く存在するにもかかわらず、乳酸桿菌とpHの相関は弱かった。この結果は、不均一なヒト集団における多様な応答の可能性を捉えるために、複数の細菌ファミリーを横断して耐性を定量化することの重要性を強調している。
最後に、in vitroでの観察結果が、腸内pHの変化に応答するin vivoの微生物叢を代表しているかどうかを調べた（図4）。複数の腸管セグメントでpHが低下し、糞便内容物に含まれるSCFAである酪酸が有意に増加するような食事介入を行った動物モデルを選択した。これらの変化は、H. biformisの単株増殖においてpHに極めて敏感であったErysipelotrichaceaeの消失に対応していた（図2A）。さらに、われわれのin vitro株特性解析は、われわれが以前にPEG下剤によって誘発された軽度の浸透圧性下痢の動物モデルで観察したin vivo表現型を確認した(14)。我々の試験管内菌株ライブラリーでは、腸内細菌科と腸球菌科が高い浸透圧耐性を示した。これらの科は、ヒト化マウスのPEG治療中に著しく増殖した(14)。同様に、Verrucomicrobiaceae科（A. muciniphilaを含む）は、in vitroの特性評価では浸透圧に極めて敏感であった。
これらの結果を総合すると、pHと浸透圧という物理的パラメーターの重要性と、腸内に生息する細菌分類群の生存率、ひいては腸内群集組成全体におけるそれらの役割が浮き彫りになった。広範な代表的な腸内細菌ファミリーのpHと浸透圧の耐性を定量化することで、単一株の増殖における物理的パラメーターに対する試験管内の耐性が、生体内の物理的環境における複雑な群集への変化の影響を予測できることがわかった。私たちが調べた耐性は、in vivoの動物モデルでも複数の分類群について一貫していた。このように、環境擾乱に対する腸内細菌叢の分類群特異的応答を定量化することで、健康時や疾患時の群集変化の動態に関する重要な情報が得られる。
異なる環境条件下における個々の種の増殖と群集の相対存在量パターンとの間の一貫性だけでなく、我々の研究の貴重な示唆は、微生物相研究において物理的環境を広く特徴づけることの重要性である。IBDのような腸内細菌叢の異常と環境擾乱の両方に関連する疾患を改善する方法をより良く理解するためには、健康な環境と擾乱された環境における物理的パラメータの範囲を確立することが極めて重要であり、これには疾患状態に関連する腸に沿った微小環境も含まれる。これらの環境パラメータが定量化されれば、既存のpHと浸透圧が腸内の有望な群集の生存にどのような影響を及ぼすかを予測する努力ができる。このような測定は微生物叢治療においても重要であり、浸透圧や酸性の摂動に対するプロバイオティック株の耐性を同定し、摂動のある腸内環境における生存可能性と治療薬としての潜在的機能を決定しなければならない。治療効果をもたらすためには、プロバイオティクス株は、その環境内で増殖し、常在微生物と競合できなければならない。現在市販されているプロバイオティクス菌株の多くを含む乳酸菌科（Lactobacillaceae）（図2A）においても、強い不均一性が観察された。物理的パラメータが変化したり、誤った制御を受けたりするような疾患環境では、これらのプロバイオティクスが同じようにうまくいくとは限らないことが、今回の結果から示唆される。従って、特定の菌株を選択する際には、潜在的な治療用プロバイオティクスの耐性だけでなく、対象疾患状態からの物理的測定値も考慮する必要がある。
全体として、これらの結果は、物理的環境が、広範な条件下で、複数のコミュニティにわたる細菌量の重要な予測因子であることを示している。生理学的範囲にわたるこの予測可能性は、細菌の利用可能性の主要なドライバーとして、微生物叢研究における物理的環境のモニタリングの重要性、および単一株培養における細菌の多様な個別応答を決定することの有用性を強調している。
材料と方法
系統樹の構築
SILVAデータベース（https://www.arb-silva.de/search/）およびNational Center for Biotechnology Information（NCBI）から、ほとんどの細菌種の16S配列を入手した（プロジェクトID：PRJNA474907）。SILVAからダウンロードした配列は、少なくとも1,500 bpの配列長であった。ダウンロードしたFASTAファイルを1つのファイルにまとめ、MEGA 11.0.10: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11にインポートし、MUSCLEアルゴリズムを用いたアラインメントと、"Construct/Test Neighbor-Joining Tree "オプションを用いた系統樹の構築を行った(53, 54)。その後、MEGA 11.0.10によって生成されたNewickファイルをiTOL v6 (https://itol.embl.de/)にアップロードし、修正とカラーリングを行った(53)。
細菌培養
本研究で使用した細菌株と対応するメタデータ（すなわち分類学）を表S1に報告する。すべての細菌株は、5%CO2、5%H2、90%N2（Linde Canada, Delta, BC, Canada）の雰囲気に保たれたビニール製嫌気チャンバー（Coy Laboratories, Grass Lake, MI, USA）で培養・接種した。すべての菌株は37℃で培養して増殖させ、すべてのグリセロールストックは-80℃で保存した。
培地
メガ培地の調製は、Supplementary Methodsに記載されているプロトコールに従い、以前の論文(31)から最小限の変更を加えた。液体培地と固体培地の各バッチは、使用の少なくとも24時間前にオートクレーブ滅菌し、嫌気チャンバーで予備還元した。株のpHと浸透圧耐性を調べるため、液体メガ培地を無菌の96穴プレート2枚に無菌的に充填し、培地を8つの異なる条件に調整した。培地条件は、pH4、5.5、6.9、8（浸透圧はpH4条件の浸透圧である～600 mOsm/kgに標準化）、または浸透圧～440、～890、～1,176、～1,800 mOsm/kgに調整したメガ培地であった。培地の浸透圧は塩化ナトリウムで調整した。調整した培地の最低浸透圧条件は、菌株の特性評価に使用した培地の基礎浸透圧に依存し、～234～～440 mOsm/kgの範囲であった。培地のpHは、10N塩酸とNaOH（水中33wt%溶液）を用いて調整した。pH測定には、培地調整用のマイクロpHプローブ（Orion PerpHecT ROSS Combination pH Micro Electrode、カタログ番号：8220BNWP）を校正した。浸透圧測定では、Ease-Eject 20-µL Samplerと清潔なサンプラーチップを用いて、Advanced Instruments Osmo1シングルサンプル微量浸透圧計に20µLの培地を注入した。調整後、150 mL 0.22 µm真空ろ過トップ（VWR：10040-444）を用いて培地をろ過滅菌した。pH培地の塩基浸透圧が比較的高いため、一部の株はどのpH条件でも生育できず、ヒートマップでは灰色で表示した（図2A）。増殖中の環境pHを測定するため、1 µg/mL BCECF（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を含む培地を1枚のプレートに負荷した。BCECFは蛍光pHセンサーで、440nmと490nmの励起波長における発光強度のpH依存比を確立することにより、培地pHの細胞外変化を検出する。pH計算中のBCECFシグナルを正確に測定するため、BCECFを含まないもう1枚のプレートを装填した。両プレートとも嫌気チャンバー内で24時間インキュベートし、嫌気的増殖のために培地をあらかじめ還元し、平衡化した。メガ培地で生育できない菌株のために、表S1に記したように、ペプトン酵母グルコース（PYG）培地、脳心筋梗塞補足（BHIS）培地＋ムチン、乳酸塩またはクエン酸ナトリウムとMgSO4の組み合わせを添加したメガ培地の固体培地と液体培地を使用した。
細菌の増殖
グリセロールストックから個々のコロニーを単離するために、細菌単離株を固体培地上にストリークし、37℃で培養した。24～48時間後に単一のコロニーを摘出し、37℃で16～36時間、「一晩」あらかじめ還元した液体培地で培養した。一晩培養したものを、あらかじめ還元した液体培地で10倍に希釈し、37℃で2時間培養した。その後、5 µLの培養液を384ウェルプレートの各培地条件75 µLに添加し、16倍希釈、合計80倍希釈を行った。各384ウェルプレートは、pHと浸透圧の異なる8つの条件で構成され、各菌株は各条件で4倍ずつ増殖した。このうち3つの複製はBCECFを含み、1つの複製はBCECFを含まないため、OD測定と連動したリアルタイムの環境pH測定が可能であった。培養は37℃で行い、Synergy H1プレートリーダー（BioTek Instruments, Winooski, VT, USA）を用いて13分ごとに600nmの吸光度とBCECF蛍光を48-96時間測定した。440nmと490nmの励起波長を用い、535nmで検出されるBCECF蛍光を、成長曲線上の各時点について測定した。培地のpHを定量するために、490 nmでの励起と440 nmでの励起の発光強度の比を求め、この比をInvitrogenのプロトコールに従って、各実験前に測定したpH値の検量線に較正した。カスタムメイドのMATLABプログラム（https://github.com/Tropini-lab/Strain_library_paper）を用いて解析を行った。
成長解析
成長曲線はカスタムMATLABスクリプト（https://github.com/Tropini-lab/Strain_library_paper）を通して実行した。簡単に説明すると、このプログラムは、割り当てられたメタデータ（菌株、pH/浸透圧など）に基づいて複製を識別し、平均化とプロットのために、各条件について最も類似した3つの複製を自動的に選択する。各 OD 曲線の最大増殖率は、OD 曲線を Gompertz 方程式(54)に最小二乗フィットを行った後に決定される。
増殖データ標準
増殖データを対照条件と比較することにより、各条件で増殖させた菌株の適切な増殖データを選択した。コントロールは滅菌メガ培地（またはBHIS+ムチン、PYG、乳酸またはクエン酸MgSO4+ナトリウム添加メガ培地）で構成され、コントロールのウェルと同時またはその後にODが増加した菌株は廃棄し、以降の実験で再実行した。選択され、清浄とみなされた菌株については、四重反復のOD測定で異常値検出を行い、各条件の4つのテクニカルレプリケートのうち最良の3つを下流の解析用に選択した。
特性解析のための市販プロバイオティクスの単離
地元の薬局で購入したプロバイオティクスを、嫌気チャンバー内で滅菌した1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS; Fisher Bioreagents: BP3991）に溶解した。溶解したスラリーを寒天プレートにストリークし、37℃で24時間嫌気培養した。メガ培地を用いて乳酸菌科を、ビフィドバクテリウム選択的ヨード酢酸ムピロシン培地を用いてビフィドバクテリウム科を、既報の方法（表S1）に従って分離した（55）。
株の調製
BEI、ATCC、DSMZなど複数の培養コレクションから細菌分離株を入手した。株元培養物をメガ培地寒天培地または表S1に記載した適切な培地上にストリークし、単一コロニーを摘出し、培養物と50％グリセロール溶液の1：1混合液を用いて凍結保存した。ストック生産に使用した固体培地と液体培地を表S1に示す。最終培養物の純度は、8Fおよび1391Rプライマー（8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1391R：5′-GACGGGCGTGWGTRCA-3′）を用いた16S rRNA遺伝子のサンガー配列決定によって確認した。
PATRICアノテーション
公開されている種のゲノムをNCBIからダウンロードし、アノテーションのためにPATRIC (https://www.patricbrc.org/)に提出した(56)。提出にはNCBIの分類学IDとドメイン（すなわちバクテリア）が必要である。RStudioのShynyライブラリを用いて、アノテーションされたゲノムの特徴をサブシステムレベルで種間で比較した。
試験管内増殖とPATRICサブシステム解析
解析とグラフ化はR v4.1.2とRStudio v1.4.1717を用いて行った。RAST（rapid annotation using subsystem technology）サブシステムと増殖データのヒートマップ解析は、自社開発のRライブラリ "strains_heatmaps"（以下のGitHubリポジトリでダウンロード可能：https://github.com/Tropini-lab/Strain_library_paper）とComplexHeatmapsパッケージv2.10.0（57, 58）を用いて行った。簡単に説明すると、我々のRライブラリーは、RASTからダウンロードしたすべてのテーブルを、異なる系統に存在する特徴の数を比較するデータフレームに組み立てる。次に、R ライブラリは大まかなアノテーションカテゴリー（我々の場合、酸/浸透圧耐性に関与するサブシステム）に基づいてデータフレームをフィルタリングして折りたたみ、ComplexHeatmaps ライブラリで使用できる形式に変換する。その後、ComplexHeatmapsライブラリを実装し、各菌株の各サブシステムの特徴量に基づいた色分けや、成長データを追加ヒートマップやヒートマップアノテーションとして加えた様々なヒートマップを作成する。より詳細な説明については、GitHubリポジトリにあるスクリプトとチュートリアルを参照してください（https://github.com/Tropini-lab/Strain_library_paper）。
機械学習
私たちの ML モデルの目的は、PATRIC のアノテーションが、pH と浸透圧の異なる条件下で生育する菌株の能力を予測できるかどうかを判断することでした。
モデル入力特徴の準備
Python（バージョン3.10.5）を用いて、PATRICサブシステムのアノテーション出力から、各菌株のゲノムの特徴を表形式のPandas（バージョン1.4.3）DataFrameに構築した(59)。PATRIC は、菌株ゲノム名（表 S3 の genome_name）を多数の PATRIC ID にマッピングし、各 PATRIC ID は Superclass、Class、Subclass、Subsystem 名、および Role ID でアノテーションされています。これはゲノム名からPATRIC IDへの1対多のマッピングであるため、各ゲノム名は複数の行に表示され、各ゲノム名に対して様々な数のPATRIC IDが表示される。
MLモデルを効率的に適合させるために、各ゲノム名を表す固定長の数値リスト、すなわち特徴ベクトルを使用した。PATRICのアノテーションを用いて81の配列決定されたゲノム名を特徴化するために、あるゲノム名について、PATRICのSuperclass、Class、Subclass、Subsystem name、Role ID列に特定の値が出現する回数をカウントした。
例えば、あるゲノム名が、PATRIC Subsystem 列の値が "DNA repair, bacterial "であるちょうど 7 つの PATRIC ID に対応する場合、そのゲノム名の行の特徴値が 7 である "Subsystem Name = DNA repair, bacterial "という名前の特徴列を作成する。
さらに、各ゲノム名に対して、系統樹内での位置を示すバイナリインジケータ変数を持つ特徴列を追加して、Feature化されたDataFrameに注釈を付けました。例えば、"Family = Bacteroidaceae "というカラムがあり、その値はBacteroidaceaeファミリーの全てのゲノム名で1、その他のゲノム名で0となります。我々は、Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species列で観測されたすべての値に対して、これらのインジケータ変数を追加しました。
特徴DataFrameは比較的まばらで、そのため、0カウントを含む多くのセルで満たされています。多くのゲノム名は、我々がカウントしたPATRIC列の値と関連しませんでしたが、我々はこのまばらさを利用しませんでした。
モデル出力値
各株のゲノムの生育データ出力（pH および浸透圧条件における最大 OD；表 S4）と genome_name に基づいて得られた情報を結合した。
pH と浸透圧の応答を予測するために別々のモデルを構築した。これらのモデルの中で、それぞれの摂動に関連するすべてのオブザベーションを共同でモデル化した。例えば、ゲノム名を表す上記の特徴に基づき、すべてのpH条件にわたって正規化最大OD観察値を予測する単一のモデルを構築した。したがって、pH応答を予測する我々のモデルは、pH=4, 5.4, 6.7, 7.3でのオブザベーションに対して4つの実数値出力を持つ。同様に、浸透圧予測モデルには、最低浸透圧、890、1,180、1,800 mOsm/kgの4つの出力があります。
そのため、浸透圧モデルのフィッティングに使用したDataFrameからこの行を削除し、79行を残しました。pHデータでは、失敗した行は1行だけでした。
モデル構造、損失関数、学習手順
PandasのDataFrameは81×11,514と非常に短く、81種類のゲノム名と11,514種類の特徴列を1行で表現しています。この形状はオーバーフィッティングの可能性があるため、MLアプリケーションでは典型的ではないが、我々は正確なモデリングよりも特徴評価に興味があった。sklearnの回帰木のデフォルトのパラメータ値を用いてこのモデルを適合させたが、これはデシジョン・スタンプの両側の二乗誤差の合計を最小化する(60, 61)。
決定スタンプの2乗誤差式
デシジョン・スタンプは、1つの数値特徴と分割しきい値を用いて、データ集合を2つのグループに分割する。特徴量が閾値より小さい行は木の左の枝を下って左端のリーフノードに到達し、特徴量が閾値より少なくとも大きい行は右端のリーフノードに到達する。
左右のリーフノードのそれぞれで、フィッティング・アルゴリズムは、そのノードに割り当てられた行を使用して、各出力の平均値を計算し、これは同じ分類を持つすべての行に対するモデルの予測値として機能する。フィッティング・アルゴリズムは、関連する平均値からの各行の距離の総二乗誤差を最小化する特徴量と分割しきい値の選択を試みる。Pedregosaらは、このアルゴリズムを、「特徴選択基準としての分散削減と等しく、各終端ノードの平均を用いたL2損失を最小化する平均2乗誤差」を最小化すると表現している(61)。
単一特徴決定スタンプ
各候補特徴の品質を識別するため、11,514個の個別特徴すべてについて単一特徴決定スタンプをトレーニングした。決定木フィッティングコードは、ルート分割のために競合する特徴の間で選択する必要がないため、残されたタスクは、4つの応答すべてにわたる最大ODを予測する際に、左右の終端リーフノードにわたる総二乗誤差を最小化する分割しきい値を特定することだけである。このアプローチは、決定木回帰多出力問題(61)の体制に入ることに注意する。
K-フォールド交差検証
単一特徴決定スタンプが比較的単純なモデルであるにもかかわらず、データをオーバーフィットする可能性がある。評価される特徴の数が多いので、いくつかの特徴でこれが起こる可能性が高くなります。このリスクを軽減するために、sklearnのデフォルトのパラメータ設定（K = 5）を使って、フィットした全てのモデルに対してK-foldクロスバリデーションを行った。K-foldクロスバリデーションは、シャッフルされたデータを5つのパーティションに分割することで機能する。モデルを適合させるたびに、パーティションの1つがトレーニングセットから外される。そして、トレーニング・パーティションとテスト・セット・パーティションの両方で、トレーニングされたモデルの2乗誤差を評価する。
各特徴に対してK = 5つの異なるモデルを訓練したので、訓練セットとテストセットの両方で各特徴の二乗誤差の5つの異なる推定値を計算した。各特徴の品質に関する全体的な推定値を計算するために、これら5つの推定値の平均を取りました。
特にpHデータのモデリングでは、訓練セットでは比較的誤差が大きいにもかかわらず、テストセットではたまたま二乗誤差が小さくなる特徴があることに注意されたい（図S4B）。これをさらに緩和するために、訓練セットとテストセットのスコアにおける全特徴の中での各特徴の順位を計算し、最終的に訓練セットとテストセットのスコアにおける最大（最悪）順位に従って各特徴をランク付けした。
最後に、各特徴に対して5つの異なるモデルをトレーニングしたため、各モデルがその特徴に対して異なる決定分割閾値を選択した可能性がある。箱ひげ図とヒートマップを作成するために使用したデータの2値分割については、5つのモデルのそれぞれについて選択された決定閾値の平均値をとりました。
コロニーポリメラーゼ連鎖反応と実験に用いた株の確認
ここで、37℃で24時間培養した一晩培養液1mLを5,000×g（相対遠心力）で5分間スピンダウンし、回収したペレットを5分間煮沸した。滅菌DNaseフリー水を用いて1：10および1：100希釈液を調製し、コロニーポリメラーゼ連鎖反応（PCR）［（98℃ 2分）→（98℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 45秒）×30サイクル→（72℃ 10分）→（4℃ ∞）］に備え、8Fおよび1391Rプライマー（8F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1391R：GACGGGCGTGWGTRCA）を用いて塩基配列を決定した。一部の培養ではPCRの前にDNA抽出が必要であり、Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit（カタログ番号：69504）を用いて行った。
ヒト糞便サンプルの採取、発酵、DNA抽出
実験の前日または当日の朝に、6個体（TL1、TL2、TL3、TL4、TL5、TL6）から糞便を採取した。糞便サンプルはすべて滅菌コニカルチューブに入れて-80℃で保存してから処理した。糞便サンプル（1.5g）を滅菌済み1×PBSに懸濁し、内容物を沈降させて液体を回収した。液体メガ培地は、5％CO2、5％H2、90％N2の嫌気チャンバー環境で少なくとも24時間、予備還元した。各サンプルについて、1μLの上清を回収し、その後、2枚の96ウェルプレート上で、pH4、5.5、6.9、7.6、浸透圧472、670、862、1,047、1,247、1,437、1,637、1,824 mOsm/kgに調整した200μLの減菌済み液体メガ培地に接種した。生成されたOD600測定値に基づいて物理的条件を選択し、DNeasy PowerSoil Pro Kit（カタログ番号：47016）を用いて96ウェルプレートからDNAを抽出した。
グアーガム食を添加したヒト化マウス
無胚芽のSWマウスにヒト腸内細菌叢（TL1）を9週目に投与し、標準的なげっ歯類用飼料（LabDiet 5k67）を与えた。コロニー形成の6週間後、5匹のSWマウス（雄2匹、雌3匹）をグアーガム食（TestDiet 5BSE）に2週間切り替え、3匹（雄3匹）は標準食のままとした。図4Bでは、M1とM2、M3はオス3匹で同居させ、標準食を与えた。M4とM5はオスで同居させ、M6、M7、M8はメスで、これも別々に同居させた。M4～M8にはグアーガム食を与えた。食餌で平衡化させた2週間後、マウスは二次的頸椎脱臼で炭酸ガスを用いて犠牲にした。消化管の十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸から内容物を採取し、pHと浸透圧を測定した。採取したマウスの腸管内容物は1.5mLの微量遠心管に保存し、pHおよび浸透圧測定の準備中は氷上に保った。腸内容物の測定には、上記と同じマイクロpHプローブ（Orion PerpHecT ROSS Combination pH Micro Electrode、カタログ番号：8220BNWP）とAdvanced Instruments Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometerを用いた。さらに、16S rRNA配列決定のために上記のようにDNA抽出を行い、SCFA分析のために糞便内容物を送付した。
16S配列決定ライブラリーの調製と配列決定
抽出したDNAは、Quant-iT 1 × dsDNA HS（High-Sensitivity） Assay kit（カタログ番号：Q33232）を用いて定量した。DNAサンプルは、ブリティッシュ・コロンビア大学生命科学研究所にある高スループット生物学施設Biofactorial、またはブリティッシュ・コロンビア小児病院研究所とブリティッシュ・コロンビア大学にあるGut4Health Microbiome Core Facilityのいずれかに提出し、デュアルインデックスのV4V5プライマー（Biofactorial）またはV4プライマー（Gut4Health）を用いたMiSeqv3-600装置を用いてペアエンドシーケンスを行った。Biofactorialで配列決定したサンプルについては、Quanta repliQa HiFi ToughMixを用い、0.5 ngの入力DNAと、Illumina Nexteraアダプター、インデックス、および16S rRNA遺伝子のV4/V5領域を標的とする特定領域を含む完全な「融合プライマー」を用いて、デュアルインデックスの1ステップ10 µL PCR反応をLabCyte Access Workstationで行った（62）。ピコグリーンアッセイ（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いてアンプリコンを定量した後、AmpureXP PCR cleanup protocol（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いて各生成物2 ngをプールし、クリーンアップを行った。プールしたライブラリーをピコグリーンアッセイで定量し、15% PhiXを用いてメーカーの推奨に従ってIllumina MiSeq Reagent Kit v3（600サイクル）にロードした。Gut4Healthに提出されたサンプルは、以前に発表された方法（63）に従って調製された。KAPA HiFi HotStart Real-time PCR Master Mix (Roche, Grenzach-Wyhlen, Germany)を用いて、インデックス配列を含むバーコードプライマーで16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅した。Bio-Rad CFT Connect Real-Time PCRシステムでPCR産物の増幅と濃度をモニターした。その後、アンプリコンライブラリーを精製し、正規化し、SequalPrep正規化プレート（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いてプールした。さらに、プールしたライブラリーをAgencourt AMPure XPシステム（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製した。ライブラリー濃度は、Qubit dsDNA high-sensitivity assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)およびKAPA Library Quantification Kit (Roche, Grenzach-Wyhlen, Germany)を用いて、メーカーの指示に従って確認した。精製したプールライブラリーは、ブリティッシュコロンビア大学のBioinformatics+Sequencing Consortiumに提出し、Agilent 2100 Bioanalyzer上で高感度DNAキット（Agilent）を用いてDNAの質と量を確認した。シーケンシングはIllumina MiSeq v2プラットフォームを用い、2×250ペアエンドリードケミストリーで行った。
16S rRNAデータ解析
MiSeq v3-600ランで生成した16S rRNAリードをQIIME 2 2020.11にインポートして解析した(64)。リード品質はFastQC (https://github.com/s-andrews/FastQC)で評価した。DADA2（https://github.com/qiime2/q2-dada2）を用いて配列を処理した。プライマーはトリミングし、品質スコアが30以下の配列は切り捨てた。SILVA v138で学習した分類器(65)を用いて、ノイズ除去された配列を分類した。
グアーガム食のマウス糞便サンプルのSCFA分析
ガスクロマトグラフィー分析用の SCFA サンプルを調製するため、40～100 mg の糞便内容物から SCFA を抽出した。サンプルを混合し、800μLの25%リン酸でホモジナイズした。15,000×g、10分間、4℃で遠心分離し、上清を回収した。その後、200 µLのイソカプロン酸と0.2 mLの25%リン酸を内部標準として加えた。上清は定量化のため、アルバータ大学のAFNSクロマトグラフィー施設に送られた。サンプルは、Stabilwax-DAカラム（長さ：30 m、内径：0.53 mm、膜厚：0.5 µm）とヘリウムキャリアガスを備えたVarian 430ガスクロマトグラフで、スプリット比5、注入量1 µLの250Cインジェクターを用いて分析した。検出器温度250℃の炎イオン化検出器を使用しました。保持時間は既知の標準物質と比較した。
ソフトウェアとアルゴリズム
本研究では、上述のように、MATLAB 2020a（MathWorks, Natick, MA, USA）を利用して細菌の増殖を解析した。BioTek GEN5 ソフトウェアを用いて細菌の吸光度と蛍光を収集した。RStudioを採用し、RStudioのサブシステムレベル（Shiny library）で、アノテーションされたゲノム特徴の豊富さを種間で比較した。上記のように、R v4.1.2とRStudio v1.4.1717を用いて解析とグラフ化を行った。
謝辞
著者らは、我々がこの研究を行った土地がxwməθkwəy̓əm（Musqueam）民族の伝統的、先祖伝来の、そして未承認の領土であることを認める。著者らは、自分たちが生活し、働いている先住民の土地について、https://native-land.ca/。著者らはCanadian Institutes of Health Research Team Grantの支援を受けた： Canadian Microbiome Initiative 2、Crohn's and Colitis Canada、Canadian Institute for Advanced Research、Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award（C.T.へ）、Paul Allen Distinguished Investigator Award（C.T.へ）、University of British Columbia Killam Postdoctoral Fellowship（J.N.へ）。 N.へ）、全米科学財団生物学博士研究員（J.N.へ）、ジョンソン・エンド・ジョンソンWiSTEM2D賞（C.T.へ）、Biotalent（S.P.へ）、GSAT夏季研究賞（S.P.へ）、NSERC USRA（S.P.へ）、CBR-SBME夏季学生賞（B.N.へ）。また本研究は、ブリティッシュ・コロンビア大学Global Research Excellence Biological Resilience Initiativeの支援を受け、生命科学研究所Biofactorial High-Throughput Biology Coreからも支援を受けた。本研究の一部は、ブリティッシュ・コロンビア大学のAdvanced Research Computing (ARC)が提供する計算資源とサービスによって支援された。また、K.C. Huang博士には有益な議論を、Lisa Osborne博士とNaomi Fettig博士にはマウス実験用の特別食の提供を、Negin Rahanjam博士には動物飼育のサポートを、Ho Pan Sham博士とCatherine Chan博士（Gut4Health）、Tom Pfeifer博士（Biofactorial）には次世代シーケンシングの支援をいただいた。著者らは、John Nomellini博士の研究支援、Richa Anand博士とNina Maeshima博士の本研究の最終的な資金源となった助成金の編集支援に感謝する。また、Giselle McCallum、Sophie Cotton、Lisa Osborne博士には、本原稿を批評的に読み、フィードバックをいただいた。
K.M.N.、S.P.、C.T.は研究をデザインした。K.M.N.、J.C.B.、T.H.、W.V.T.、C.T.は新しい試薬/分析ツールを提供した。K.M.N.、S.P.、S.L.、J.C.B.、T.H.、C.T.はデータを解析した。K.M.N.、S.P.、S.L.、C.A.C.が研究を実施。D.M.P.、J.N.、K.N.はin vitro増殖実験用の細菌培養液を調製した。S.L.、K.M.N.、S.P.、B.N.は細菌の配列を検証した。K.M.N.、S.P.、S.L.、J.C.B.、T.H.、C.T.は論文を執筆した。D.M.P.はゲノムデータ解析ワークフローの開発に貢献した。S.R.C.はgnotobioticの技術サポートを行った。全著者が投稿前に論文に目を通した。
補足資料
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図S1～S6、表S1～S4のキャプション。
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表S1 - mbio.00753-23-s0002.xlsx
本試験で使用した増殖培地の培地成分。
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表S2 - mbio.00753-23-s0003.xlsx
異なる浸透圧およびpH条件下での生育を区別するためにMLによって同定されたPATRICの特徴。
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表S3 - mbio.00753-23-s0004.xlsx
MLモデルで使用されたPATRIC特徴量。
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表S4 - mbio.00753-23-s0005.xlsx
異なる生育条件下における、MLモデルで使用したすべての配列決定株の正規化成長率（GR）と最大OD。
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