NLRP3インフラマソームのアラキドン酸阻害は、絶食の抗炎症効果を説明するメカニズムである

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論文|43巻2号、113700、2024年2月27日
NLRP3インフラマソームのアラキドン酸阻害は、絶食の抗炎症効果を説明するメカニズムである

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(24)00028-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124724000287%3Fshowall%3Dtrue

ミルトン・ペレイラ 9, 13
ジョナサン・リャン 13
ジョイ・エドワーズ＝ヒックス
マイケル・N・サック
クリストフ・ヘス
クレア・E・ブライアント 14
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脚注を表示オープンアクセス掲載:2024年1月23日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.113700

ハイライト

空腹時の血漿中IL-1βは摂食時と比較して低く、アラキドン酸（AA）は高い。

ヒトおよびマウスのマクロファージにおいて、外因性アラキドン酸はNLRP3インフラマソーム活性を障害する。

AAはホスホリパーゼCを阻害し、JNK刺激、ひいてはNLRP3活性を低下させる。
まとめ
インターロイキン（IL）-1βレベルの上昇、NLRP3インフラムソーム活性、全身性炎症は、慢性代謝性炎症症候群の特徴であるが、その機序は不明である。ここでわれわれは、血漿中のIL-1β濃度が空腹時では摂食時と比較して低いこと、一方で脂質アラキドン酸（AA）が上昇していることを示した。NLRP3刺激マウスマクロファージの脂質プロファイリングから、AA産生の亢進とNLRP3依存性のエイコサノイドシグネチャーが示された。非ステロイド性抗炎症薬によるシクロオキシゲナーゼの阻害は、エイコサノイドの産生を減少させるが、AAの産生は減少させない。また、NLRP3の活性化に反応してIL-1βとIL-18の両方の産生を減少させる。AAはヒトとマウスのマクロファージにおけるNLRP3インフラマソーム活性を阻害する。メカニズム的には、AAはホスホリパーゼC活性を阻害し、JNK1刺激、ひいてはNLRP3活性を低下させる。これらのデータは、AAがNLRP3インフラムマソームの重要な生理学的制御因子であることを示しており、絶食がなぜ全身の炎症を抑えるのかを説明し、また非ステロイド性抗炎症薬がどのように作用するかを説明するメカニズムを示唆している。
図解抄録
図サムネイルfx1
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キーワード
リピドミクス
炎症
メタ炎症
インフラマソーム
NLRP3
エイコサノイド
プロスタグランジン
研究テーマ
CP: 代謝
CP: 免疫学
はじめに
欧米型の高カロリー食（WD）の摂取は、慢性的な代謝性炎症症候群（メタ炎症）と関連しており、多くの非伝染性疾患の基礎となっている。断食は代謝性炎症の抑制につながり、血清中の炎症性サイトカイン、特にインスリン調節や血糖値と密接に関連するインターロイキン-1β（IL-1β）の低下によって特徴づけられる2,3,4。
メタ炎症の新たな制御因子のひとつに、ヌクレオチド結合・オリゴマー化ドメイン様受容体（NLR）ファミリー・ピリン・ドメイン含有3（NLRP3）の活性化によって誘導されるインフラマソームがある1。炎症マソームは、受容体（通常はNLR）、アダプター（カスパーゼリクルーティングドメインを含むアポトーシス関連斑点様タンパク質、ASC）、エフェクター（カスパーゼ-1）からなる多タンパク質のシグナル伝達プラットフォームであり、IL-1βとIL-18を共同で生理活性型に処理し、細胞死エフェクターであるガスダミンD（GSDMD）を切断してパイロプトーシスを促進する5。酸化された低比重リポタンパク質（LDL）とコレステロール結晶は、細胞のコレステロール代謝能力を超えるとマクロファージでNLRP3の活性化を引き起こすが、細胞がコレステロールを処理できる能力を維持していれば、抗炎症反応が誘導される1。パルミチン酸（PA）やステアリン酸のような飽和脂肪酸を多く含む食餌もNLRP3炎症活性を誘発する。1 マウスでは、Ldlr-/-にWDを与えると全身性の炎症が見られ、NLRP3を介した訓練された免疫が必要となるが、マウスを通常のチャウ食にすると逆転する6。
リポ多糖（LPS）のようなToll様受容体（TLR）活性化因子や腫瘍壊死因子αのような炎症性サイトカインによって、プロIL-1βとNLRP3の転写が誘導される。脾臓チロシンキナーゼとc-Jun N-末端キナーゼ（JNK）によるASCのリン酸化は、ASCシグナル伝達の足場の形成とインフラマソームの活性化につながる8。リン酸化によるNLRP3の制御はより複雑であり、このタンパク質のピリンドメインがリン酸化制御の標的である。9 我々は、ミトコンドリアの活性酸素種に応答してNLRP3がJNK1によって二相リン酸化されると、インフラマソームが活性化されることを示したが10、NLRP3のセリン58でのリン酸化とJNK2活性は、ともにNLRP3インフラマソームの活性化を阻止する11。このことは、NLRP3を制御するリン酸化事象の複雑なネットワークが存在することを示唆している。
12,13,14アラキドン酸（AA）の酸化から誘導されるエイコサノイドは、炎症制御に重要な役割を持つ複雑なシグナル脂質ファミリーを構成している15。その中でも、PGE2などのプロスタグランジン（PG）は、アラキドン酸のシクロオキシゲナーゼ（COX）代謝によって生成され、NLRP3活性を制御する可能性があるが、この脂質がインフラムマソーム活性の活性化因子または阻害因子としてどのような役割を果たすかについては議論がある。
ここでわれわれは、血清IL-1βが抑制されている絶食被験者において、AAが上昇し、それが再栄養によって逆転することを示した。NLRP3刺激により、マクロファージからAAやエイコサノイドを含む脂質産生が誘導されるが、AAのみがホスホリパーゼC（PLC）とJNK活性を抑制することにより、このインフラマソームを深く阻害した。マクロファージにNSAIDを投与すると、NLRP3活性とプロスタノイド産生は抑制されたが、AAレベルは変化しなかった。これらのデータは、AAがNLRP3インフラムソームの重要な生理学的制御因子であることを示し、絶食が全身性炎症を抑制する理由を説明するメカニズムを提供するものである。
結果
断食中のヒトではAA濃度が上昇
NLRP3活性の制御における脂質の重要性が明らかになりつつあることから12、空腹時の脂質プロファイルを、摂食時と比較して調べることにした。血清サンプルはボランティアのコホートから採取した。この研究では、21人のボランティアがベースラインとして500kcalの食事を摂取し、24時間絶食した後、500kcalのレフェッドミールを摂取した。これらのボランティアの末梢血単核球（PBMC）において、IL-1βレベルは再食後3時間で上昇した（図1A）。血漿中のAA濃度は空腹時に上昇したが、再食により低下した（図1B）。
図サムネイルgr1
図1空腹時のヒトボランティアではアラキドン酸（AA）濃度が上昇している。
キャプション
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カノニカルNLRP3インフラマソームの活性化がAA産生につながる
空腹時のIL-1β産生抑制と相まってAA産生が上昇することから、マクロファージにおいてニゲリシンによるNLRP3刺激によりAAとそのエイコサノイド代謝物がどのように合成されるかを調べた。野生型（WT）とNlrp3-/-骨髄由来マクロファージ（BMDM）をLPS（3時間、200ng/mL）でプライミングし、ニゲリシン（10μM、1時間）で刺激した。予想通り、IL-1β産生はニゲリシン処理したWT BMDMでのみ起こった（図S1）。培養上清を回収して脂質を抽出し、逆相液体クロマトグラフィー／ドリフトチューブイオンモビリティー質量分析にかけた18。同定は、内部データベースとLIPIDMAPS19,20を用いて、イオンモビリティー測定から得られた正確な質量と衝突断面積をマッチングさせ、分析にかけた21,22。サンプルのヒートマップと主成分分析から、プライミングされたWTとNlrp3-/-BMDMの間でクラスタリングが見られ、これらの細胞集団の脂質組成が類似していることが示唆された。しかし、ニゲリシン刺激により、WT細胞とNlrp3-/-細胞は2つの異なるクラスターを形成し、NLRP3依存的な脂質シグネチャーが確立された（図2Aおよび2B）。脂質とその存在量の完全なリストは表S1にある。
図サムネイルgr2
図2カノニカルNLRP3インフラマソームによるエイコサノイド産生
キャプション
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PG PGD2および11-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（11-HETE）を含むエイコサノイドは、NLRP3活性化により多く存在することが同定された種の一つであった（図2C）。そこで、それぞれの保持時間と精密質量を用いて、様々なエイコサノイドを定量した。PGF2α、PGE2、PGD2、8isoPGF2α、11-HETE、15-HETE、13-ヒドロキシオクタデカジエン酸（13-ヒドロキシドコサヘキサエン酸は含まない）、トロンボキサンB2（TxB2）、およびエイコサノイド前駆体AAのような分子に関して、非常に類似したパターンが観察され、NLRP3刺激に応答して産生が亢進した（図2D-2M）。
AAはNLRP3インフラマソームを阻害する
我々は、ボランティア試料で見られたIL-1βとAAの逆相関は、AAまたはその関連エイコサノイド代謝物がNLRP3インフラムソーム活性を阻害する作用に関連している可能性があると仮定した。リピドミクス解析では、LPSでプライミングしたWT BMDMをニゲリシンで刺激すると、エイコサノイド産生に加え、AA放出の産生が大幅に増加した（図2）。そこで、NLRP3活性化に対するAAと多くのエイコサノイドの効果を比較した。外因性AA（40μM）存在下、LPSでプライミングしたBMDMをニゲリシンで刺激すると、NLRP3誘導性IL-1β産生が阻害された（図3A）。この阻害は、LPSプライミングとニゲリシン刺激の両方にAAを存在させると持続した（図3B）。滴定分析により、AAは低濃度のAAでもIL-1β産生を低下させたにもかかわらず、ニゲリシン刺激によるBMDMのNLRP3誘導性溶解細胞死を阻害しなかったことが明らかになった（図3Cおよび3D）。同様の結果は、BMDMにおいてATPを用いてNLRP3を刺激した場合にも見られた（図3Eおよび3F）。
図3AA
図3AAによるNLRP3インフラマソームの阻害
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血清PAはメタボリックシンドロームで上昇する23。そこで我々はこの脂質を用いて、PMAでマクロファージ様表現型に分化させたヒトTHP-1単球／マクロファージ細胞のNLRP3を刺激した。細胞はTLR1/2アゴニストPAM3CSK4（200ng/mL、4時間）でプライミングされ、続いてニゲリシンまたはPAでNLRP3が刺激された24。IL-1β産生を測定したが、これらの細胞内でのASC斑点形成の効率を調べるために、インフラマソームアダプタータンパク質ASCも免疫標識した。もしAAがNLRP3を阻害するならば、ASCの斑点形成はIL-1β産生と同様に減少すると予想される。AAはヒトTHP-1細胞のIL-1β分泌とASC斑点形成を阻害したが、溶解性細胞死も阻害した（図3G-3IおよびS2）。AAの阻害効果は、NLRP3トリガーとしてPAを用いた場合に特に顕著であり、脂質駆動性炎症の制御におけるAAの潜在的に重要な役割を示唆した（図3J-3L）。AAは、10-40μMの濃度範囲で、NLRP3誘導性のIL-1β産生、ASC斑点形成、およびPAによる活性化後の細胞死を用量依存的に阻害した（図S2）。
次に、NLRP3インフラマソームに対するAAの作用が、その代謝産物によって媒介される可能性を探った。具体的には、LPSで刺激した（3時間、200ng/mL）WTおよびNlrp3-/-BMDMを、1μMの新しく調製したエイコサノイド／安定エイコサノイド類似体（PGE1類似体ミソプロストール、PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2）で1時間刺激した。これらのエイコサノイドで刺激しても、細胞死やIL-1β産生は誘導されなかった（図4Aおよび4B）ことから、これらの個々のエイコサノイドはインフラマソームの活性化を誘導しないことが示唆された。しかし、個々のエイコサノイドがNLRP3活性を変化させる可能性は残っていた。この考えを検証するために、LPSで刺激した（3時間、200ng/mL）WTおよびNlrp3-/-BMDMを、ニゲリシン（10μM、1時間）と1μMの新しく調製したエイコサノイドで同時に刺激した。ニゲリシンのみの対照と比較して、細胞死やIL-1β産生に統計的に有意な差は認められなかった（図4Cと4D）。次に、ニゲリシン（10μM、1時間）で刺激したLPS-primed（3時間、200ng/mL）WT BMDMを、濃度の増加するPGE2またはPGF2α（100pM-10μM）の存在下で、追加の滴定実験を行った。この場合も、細胞死に対する影響は見られなかった（図4Eおよび4G）。濃度とは無関係に、PGE2もまたIL-1β産生に有意な影響を与えなかったが、低濃度のPGE2ではIL-1β産生が低下する傾向が観察され、これは以前に報告されたデータと同様であった24。1μM以下の濃度のPGF2αは、IL-1β産生を有意に低下させた（図4Fおよび4H）。LPSプライミング中にPGE2濃度を上げて刺激すると、ニゲリシン刺激時にIL-1βが増加することが明らかになった（この実験では、PGE2はLPSプライミング中とニゲリシン刺激中の両方に存在した）（図S3）。これらの結果は、実験デザインに大きく影響されるインフラムマソーム活性化に伴う個々のエイコサノイドの複雑な制御ネットワークを示しており、おそらく文献に見られる明らかな矛盾を説明するものであろう。様々なCOX由来のエイコサノイドの正味の作用が、NLRP3炎症酵素活性に対する制御ネットワークを反映している可能性もあり、この炎症酵素活性の調節因子としての脂質の新たな役割と一致する。しかしながら、我々のデータを総合すると、AAそのものがNLRP3炎症酵素の強力な阻害剤であることが明らかになった。
図のサムネイルgr4
図4個々のエイコサノイドはNLRP3活性にほとんど影響しない。
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COXによるAAプロセッシングの阻害は、NLRP3活性を選択的に制御する。
AAはCOX（COX-1およびCOX-2）の活性によってPGなどのエイコサノイドに代謝される。NSAIDsによってCOX活性が阻害されると、エイコサノイドの産生が抑制され、代替代謝経路で処理されるAAの利用可能性が高まる。そこで我々は、NSAIDによるCOXを介したAA代謝阻害が、NLRP3インフラムソーム阻害にもつながるかどうかを調べた。リピドミクス解析の結果、COX-2阻害剤セレコキシブは、ニゲリシン刺激に対するPGF2α、PGE2、PGD2、11-HETE、15-HETE、TxB2などのエイコサノイドの産生を顕著に減少させたが、AAの放出は有意に抑制しなかった（図S4）。以前の研究では、COX阻害剤を用いて、PGE2がil1bの転写を増加させることでIL-1β産生を刺激する25,26か、転写または転写後効果によってIL-1β産生を抑制することが示されている16,24。これらの矛盾は、マクロファージへのLPSのプライミングとCOX阻害の実施方法がそれぞれの研究で異なっていることや、COX代謝産物がプロIL-1β発現に関与するシグナル伝達経路に影響を与える可能性があることから、実験デザインの違いによるものかもしれない27,28。この問題を回避するために、LPS刺激とCOX阻害を、プロIL-1β発現を同程度に誘導するが、COX-2、NLRP3、カスパーゼ-1がすべての実験条件下で同程度に発現する条件で行った（図S5A-S5E）。このシステムを用いて、LPSで刺激したWTおよびNlrp3-/-BMDMを、COX-1/-2阻害剤の存在下または非存在下で、正統的なNLRP3刺激剤であるニゲリシンまたはATPで刺激した。COX阻害剤単独では、ニゲリシンやATPの非存在下でも、インフラマソーム活性は誘導されなかった（図S5F-S5G）。Nlrp3-/-BMDMは、予想されたように、すべての条件下でニゲリシンに対する反応が乏しかったが、WT BMDMはニゲリシンまたはATPで処理すると、かなりのIL-1βとIL-18産生を示した。いずれの場合も、COX阻害剤の存在下でIL-1βとIL-18産生の両方が顕著に阻害された（図5A-5E）。非選択的COX-1およびCOX-2阻害剤インドメタシンとCOX-2選択的阻害剤セレコキシブは、NLRP3インフラムソーム活性に対して同様の効果を示した。これらのデータを総合すると、COX阻害剤がNLRP3によって誘導されるインフラムソーム活性を、おそらくAAの作用によって阻害するというモデルが支持される。
図5シクロオキシゲナーゼ
図5シクロオキシゲナーゼ（COX）活性はNLRP3活性を制御するが、NLRC4は制御しない
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18,29。COX阻害がNLRC4の活性化も制御するかどうかを調べるため、インドメタシンまたはセレコキシブの存在下で、BMDMをサルモネラ・チフス菌（MOI 10）に2時間感染させた。この条件下では、S. Typhimuriumは主にNLRC4インフ ラマソームを活性化する30 。BMDMsのサルモネラ感染中、以前の研究 と同様に、COX-1/-2阻害は予想通りPGE2産生を阻害したが、 NLRC4インフラマソーム活性には影響を与えなかった （図5F-5I）。これらのデータから、COX阻害剤はNLRP3誘導性インフ ラマソーム活性を抑制するが、NLRC4インフラマソームには 影響を与えないことが示唆される。
AAはPLC活性を阻害し、下流のプロテインキナーゼ（PK）を抑制する
リピドミクス解析から、COX阻害はマクロファージ中のAAの存在量にはほとんど影響しないことが示唆されたが、ニゲリシン刺激時のCOX阻害とAAの添加はともにIL-1β産生を減少させた。NLRP3は、リン酸化やユビキチン化などの翻訳後修飾（PTM）によって高度に制御されている。我々は、例えばCOX阻害剤の存在下で「静的な」AAプールが存在すると、PLCの古典的産物阻害32によって下流のPKが遮断され、その結果NLRP3が活性化するという負のフィードバックループが引き起こされるのではないかと考えた。
この考えを探るため、PLA2またはPLCの阻害がNLRP3依存性のIL-1β産生と細胞死に影響を及ぼすかどうかを調べた。PLA2阻害剤ASB14780およびNAAAは、NLRP3誘導性IL-1β産生に影響を与えなかったことから、PLA2はニゲリシンに対するNLRP3活性化の制御には関与していないことが示唆された（図6Aおよび6B）。しかしながら、U-73122でPLCを阻害すると、IL-1β産生は用量依存的に減少した（図6B）。細胞死は10μMの阻害剤で増加したが（図6A）、この効果は、インフラマソームとは無関係の毒性によるものであった（図S6）。PLC阻害剤の滴定は、細胞死に影響を与えることなく、ニゲリシン誘導IL-1β産生の用量依存的減少を示した（図6Cおよび6D）。同様に、ATPによるNLRP3インフラマソームの刺激も、PLA2ではなくPLCによって制御された（図6Eおよび6F）。
図のサムネイルgr6
図6正常NLRP3活性にはPLCが必要である
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産物の阻害は、代謝経路を制御するためのよく知られた負のフィードバック機構であるので32、我々は次にAAがPLC活性を阻害できるかどうかを調べた。この現象が起こることを示すいくつかの証拠がすでに存在するが33、負のAAフィードバックループがインフラマソーム活性化の文脈で働くかどうかは不明である。これを調べるため、LPSでプライミングしたWT BMDMをニゲリシン（10μM、1時間）で処理したタンパク質抽出液中のPLC活性を、AAまたはコントロールとしてPLC阻害剤（U-73122）の存在下で定量した。ニゲリシン処理により、PLC活性は有意に増加した。当然のことながら、U-73122はニゲリシンに対するPLC活性を抑制したが、AAもニゲリシン刺激PLC活性を低下させた（図6G）。これらのデータから、正統的NLRP3インフラマソームの活性化はPLA2ではなくPLCによって修飾され、AAが生成物阻害の負のフィードバックループによってPLC活性を阻害することが示唆された。
PLCは、PKC、PKD、JNK1,31,34,35などのPKの活性化を刺激し、その結果、NLRP3の活性化をアップレギュレートする。ニゲリシンで刺激したTHP-1細胞では、PKDまたはJNKのいずれかを阻害すると、NLRP3の活性化が低下した（図7Aおよび7B）。したがって、AAの存在は、リン酸化の減少によって示唆されるように、PKC、PKDおよびJNKの活性化を阻害した（図7Cおよび7D）。胆汁酸塩であるリトコール酸（LCA）もまた、NLRP3インフ ラマソームの活性化を阻害する38 。しかし、LCAはPKC、PKD、JNKのリン酸化に影響を与えないことから、AAと胆汁酸塩は異なるメカニズムでNLRP3インフ ラマソームを阻害することが示唆される（図7A-7D）。
図のサムネイルgr7
図7AAによるPKC、PKD、JNKの阻害
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同様に、PA刺激THP-1細胞では、PKC、PKDおよびJNKの阻害により、NLRP3の活性化が阻害された（図7Eおよび7F）。PAに応答して、JNKはリン酸化され、JNK標的c-Junのリン酸化によって示されるように活性化された。AAは、PAによって誘導されたJNKのリン酸化とc-Junのリン酸化の両方を抑制した（図7Gと7H）。これらのデータは、AAが産物阻害を介して、JNKリン酸化を介したNLRP3活性化を抑制する負のフィードバックループを駆動することを同定した。このことは、NSAID（COX）阻害または絶食に応答して、NLRP3活性がAAによってどのように制御されるかを説明するメカニズム的根拠となる。
考察
ここで我々は、AAがPLC-JNK依存的機序によりNLRP3インフラマソームを阻害し、生理的条件下でIL-1β産生を抑制することを示した。このことは、絶食のような食事操作がどのように炎症状態に影響を及ぼすかについてのメカニズム的根拠を提供し、WDによって誘導される多くの疾患を支えるメタ炎症を軽減するために重要であると考えられる。絶食はNLRP3活性を差 異的に制御し2、IL-1βの上昇が摂食後に観察されるが39,40、その機序は不明である。脂質がNLRP3活性の重要な調節因子であることは次第に明らかになってきている12,13が、どのようにしてこのようなことが起こるのかはまだよくわかっていない。ここで我々は、IL-1βが抑制されている空腹時被験者コホートにおいて、AAが上昇し、この効果は摂食によって逆転することを示した。AAがIL-1β産生を抑制するという直接的なin vivo証拠はないが、我々のデータは、AAまたはその代謝物の1つがNLRP3調節因子である可能性を強調した。予想外なことに、我々はin vitroで、AAそのものはNLRP3インフラムソームの活性化を阻害するが、AAの代謝物は阻害しないことを示した。COX阻害剤は、AAそのものではなく、AAのエイコサノイド代謝物の産生を低下させるが、NLRP3活性も低下させることから、NLRP3阻害作用は、代謝物ではなく、AAの直接的な結果であることがさらに証明された。
我々は、AAによるNLRP3阻害は、PLA2依存性であり、より低い程度ではPLC依存性である、AAを細胞膜から遊離させる酵素の産物阻害によって起こるのではないかと仮定した。PLCとカノニカル・インフラマソーム活性との関連は報告されているが41,42、PLCがどのようにNLRP3インフラマソームを活性化するかについては、まだ完全には解明されていない。ここでは、PLCがPKC、PKD、JNKを介してNLRP3活性を制御しているという仮説を立てた。PLCはセカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロールの生成を促進し、PKCとPKDを活性化する31,34,35。PLC/PKC軸はJNK1を活性化し、このJNK1はNLRP3の活性化に重要であることが私たちや他の研究者によって示されている8,10。PLC阻害剤はAAと同様にJNK1の活性化を阻害することから、PLC-JNK軸がNLRP3活性の重要な調節因子であることを示す証拠である。
また、AAがNLRP3を介したIL-1β産生を阻害する一方で、細胞死に対する効果はわずかであることも観察された。最近発表された研究では、樹状細胞は酸化リン脂質（OxPaPC）で刺激すると、細胞死がないにもかかわらずIL-1βを放出することが示された43。このメカニズムは、GSDMDによって穿孔された細胞膜が、細胞膜で輸送IIIに必要なエンドソーム選別複合体（ESCRT III）機構の組み立てを誘発することによって修復され、そこでESCRT III機構がGSDMDの孔を小胞に脱落させることによって除去し、GSDMDが介在するパイロプトーシスを防ぐためである44。我々は、AA、ESCRT III、NLRP3間の関係はまだ解明されていないが、同様のGSDMD孔修復過程が我々の観察を説明するのではないかと推測している。
われわれの研究は、非ステロイド性抗炎症薬COX阻害剤が、NLRP3活性をAAが阻害することによって、広範な抗炎症作用を発揮するメカニズムを実証している。COX由来のエイコサノイドが、どのように炎症マソームと接点を持つのかについては、多くの論文が研究している。IL-1βのエイコサノイド制御は、ほとんどの場合、転写イベントに焦点を当てている。解析の結果、個々のエイコサノイドは、正統的なNLRP3の活性化に対して、若干の調節作用を持つことが示された。PGE2やPGF2αのようなエイコサノイドは、ニゲリシンで刺激したLPS刺激BMDMにおけるIL-1βの産生をいくらか減少させたが、これはPGE2がPKAとNLRP3のリン酸化を介してインフラマソームを阻害するという以前の報告と類似している23。COX阻害はPGE2（および他のエイコサノイド）の産生を減少させるが、AAは減少させないことから、エイコサノイドではなく脂質がNLRP3の活性化を制御していることが示唆される。NLRP3インフラムソーム活性のエイコサノイド制御に関するデータの明らかな食い違いは、濃度依存性を持つ複雑な脂質制御ネットワークが存在することを示唆している。
また、我々のデータは、絶食がAAを上昇させ、そのAAがIL-1βを抑制しながら、再び炎症マソームにフィードバックするという重要な代謝ループを裏付けている。エレガントなデータによると、成人では、IL-1β産生は食物に対する生理的反応として産生される。このことは、IL-1βが常に病的反応に関与しているのではなく、摂食に反応して、IL-1β、NLRP3、およびAAの間に新たな生理的調節ループが存在することを示唆している。NLRP3インフラムソームの活性化がAAの増加をもたらすことが示されたので、この調節ループは正常な生理的条件下での過剰なインフラムソームの活性化を防ぐのかもしれない。このことは、NLRP3インフラムソームが慢性的に活性化され、IL-1βが長期にわたる炎症の病態に寄与しているWDでは異なるという仮説を立てた。このような人々においてAAがどのように制御されているかは不明であるが、間欠的絶食ダイエットの成功には、絶食によって誘発されるAA産生が関与しており、その結果インフラマソーム活性が抑制され、WDメタボリックシンドロームに関連するメタ炎症が軽減されているのではないかと推測したくなる。
結論として、われわれは、AAがNLRP3炎症酵素の重要な生理的阻害剤であることを示唆するデータを提供した。断食志願者の血漿脂質におけるAAの上昇は、これらの人々のPBMCからのIL-1β産生の低下を説明するメカニズムを提供し、潜在的には、断食が有益な抗炎症効果をもたらす一つの方法となる。我々のデータはまた、NSAIDsが抗炎症作用を示すメカニズムを示唆しており、AAが主要なシグナル伝達脂質として、これまで認識されていなかった役割を担っている可能性を明らかにしている。
研究の限界
我々の研究は、in vitroにおいてAAが介在するinflammasome阻害のメカニズムを実証した。ヒトボランティアから得られたin vivoのデータでは、AAの上昇とIL-1βの減少が観察され、in vitroのデータと一致しているが、この証拠は間接的なものである。AAとin vivoでの炎症抑制との関係を明確にし、本稿で提案したメカニズムを検証するためには、さらなる研究が必要である。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
ウサギpAb 抗Caspase-1 p10 Santa Cruz sc-514; RRID AB_2068895
ヤギ pAb 抗IL-1 β/IL-1F2 R&D AF-401; RRID AB_416684
マウス mAb 抗アクチン Abcam AB3280; RRID AB_303668
ラット mAb 抗 NLRP3 R&D MAB7578; RRID AB_2889405
ヤギ pAb 抗COX2 R&D AF4198; RRID AB_2229909
ウサギ pAb 抗ヤギ IgG ペルオキシダーゼ Santa Cruz sc-2922; RRID AB_656965
ウマ pAb 抗マウス IgG ペルオキシダーゼ Cell Signaling 7076; RRID AB_330924
ヤギ pAb 抗ウサギ IgG (whole molecule) ペルオキシダーゼ Sigma-Aldrich 7077; RRID AB_10694715
ウサギ pAb 抗ホスホ-PKC (pan) Cell Signaling 9371; RRID AB_2168219
ウサギ pAb 抗ホスホ-PKD Cell Signaling 2051; RRID AB_330841
ウサギ pAb 抗ホスホ-JNK Cell Signaling 4668; RRID AB_823588
細菌およびウイルス株
Salmonella Enterica Typhimurium SL1344 Hoiseth and Stocker46 N/A
生物学的サンプル
ヒト血液サンプル 被験者コホートから - ClinicalTrials.gov ID NCT02719899 N/A
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
酢酸 Millipore Sigma 5330010050
アラキドン酸 トクリス 2756
アラキドン酸 Sigma-Aldrich 10931
ASB-14780 シグマアルドリッチ SML1913
ATP シグマアルドリッチ A1852
セレコキシブ ミリポア シグマ SML3031
クロロホルム Millipore Sigma 288306
CRT0066101 トクリス 4975
脱イオンCOXおよびLOX LC-MS混合物 Cayman Chemical 19228
ダルベッコ変法イーグル培地 コーニング 10-013-CV
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 コーニング 21-031-CV
ゲンタマイシン ミリポア シグマ G1397
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) Thermo-Fisher 1862495
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) サーモフィッシャー 87786
ヘキサン Millipore Sigma 1043911000
HyClone ウシ胎児血清 Fisher Scientific SH3008803
インドメタシン Millipore Sigma I7378
イソプロパノール Millipore Sigma 1027811000
L-グルタミン Millipore Sigma G7513
LBブロス（ミラー） シグマアルドリッチ L3522
LB寒天ブロス（ミラー） シグマアルドリッチ L3147
リトコール酸 Millipore Sigma L6250
メタノール Sigma 1.06035
ミソプロストール Tocris 2297
N-(p-アミルシンナモイル)アントラニル酸 Sigma-Aldrich A8486
ニゲリシン Sigma-Aldrich N7143
NP-40 (Nonidet P-40 Substitute) ボストンバイオプロダクト #P -877
パルミチン酸 Millipore Sigma P0500
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms
Penicilin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Pierce™ レーンマーカー還元サンプルバッファー Thermo-Fisher 39000
プロスタグランジン D2 Cayman Chemical 12010
プロスタグランジンE2 Tocris 2296
プロスタグランジンF2α Tocris 4214
プロスタグランジン I2 Tocris 2989
ソトラスタウリム Abcam ab219867
SP600125 トクリス 1496
TMB基質試薬セット BD 555214
超高純度LPS、大腸菌O111:B4 Invivogen tlrl-3pelps
U-73122 シグマアルドリッチ 662035
重要な市販アッセイ
CytoTox 96(R) 非放射性細胞毒性アッセイ Promega G1780
クラリティマックスウェスタンECL基質 Bio-Rad 1705062
EnzChek(TM) ダイレクトホスホリパーゼCアッセイキット Invitrogen E10215
ヒト IL-1Beta/IL-1F2 デュオセット ELISA R&D Systems DY201
マウス IL-1Beta/IL-1F2 デュオセット ELISA R&D Systems DY401
マウス IL-18 エリサキット MBL International 7625
Pierce BCA タンパク質測定キット Thermo Scientific 23225
PGE2 ELISAキット Enzo Life Sciences ADI-900-001
寄託データ
生データ 本論文 Mendeley データ：https://doi.org/10.17632/vtpjtgm2tw.1
実験モデル 細胞株
thp-1 atcc atcc tib-202
実験モデル 生物／系統
マウス C57BL/6 Charles Rivers N/A
マウス C57BL/6 NLRP3 ノックアウト Millenium Pharmaceuticals N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
GraphPad Prism グラフパッドソフトウェア www.graphpad.com
ImageJ NIH imagej.nih.gov/ij/
SIMCA サルトリウス www.sartorius.com
新しいタブで表を開く
リソースの有無
連絡先
詳細情報およびリソースのリクエストは、リードコンタクトであるClare E. Bryant (ceb27@cam.ac.uk)までご連絡ください。
材料の入手可能性
本試験で使用したマウス系統および細胞株は、Materials Transfer Agreement（材料譲渡同意書）に記入の上、研究責任者から入手可能である。
データおよびコードの利用可能性

免疫ブロット、定量データ、リピドミクスデータはMendeley Dataに寄託されており、発表日現在一般に入手可能である。DOIはKey resources tableに記載されている。

本論文ではオリジナルコードは報告していない。

本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要求があれば、主担当者から入手可能である。
実験モデルと研究参加者の詳細
マウス
WT C57BL/6マウスは英国Charles River社から入手した。C57BL/6バックグラウンドのNlrp3-/-マウスは、Millenium Pharmaceuticals社により作製され、Kate Fitzgerald（マサチューセッツ大学）から入手した。すべての動物は病原体のない施設に収容され、生きた動物を含むすべての作業は、内務省プロジェクト許可番号80/2572に基づき、ケンブリッジ大学倫理委員会の規定に従った。本研究では、オスとメスのマウスを同程度の割合で使用し、いずれも8週齢から12週齢であった。
ヒト試験
健康なボランティアを対象とした絶食および再栄養臨床試験は、米国国立衛生研究所学内施設審査委員会（ClinicalTrials Identifier No.NCT02719899）によって承認された47。最初の訪問では、ボランティアは外来診療所でスクリーニングを受け、試験に登録する前にプロトコルに関するインフォームド・コンセントに署名した。2回目の訪問では、ベースラインの免疫反応を確立するために、一晩絶食した参加者から採血が行われた。次に、一晩絶食した参加者は、午前8時前に500カロリーの食事を摂り、24時間絶食した。24時間後に採血を行い（絶食サンプル）、参加者は500カロリーの食事を摂り、3時間後にもう一度採血を行った（再給餌サンプル）47。24時間の絶食後と再給餌後3時間後にPBMCを抽出し、ELISAアッセイによるIL-1β放出の測定前に、ATP（3mM）と30分間インキュベートした2。
方法の詳細
脂質抽出と質量分析
脂質抽出および質量分析抽出は、以下のように行った18: 4℃のイソプロパノール/ヘキサン/酢酸溶液（20:30:2、v/v/v）2.5 mLとCOXおよびLOX LC/MS混合物（CAY19228-1、Cayman Chemical）10 ngを、刺激または刺激を受けたBMDMからの上清1 mLに加え、氷上で10分間静置した。その後、サンプルを15秒間ボルテックスし、2.5mLのヘキサン（4℃）を加え、溶液をさらに15秒間ボルテックスした。サンプルを遠心分離（5分間、4℃、900G）し、有機層を回収した。水性画分を3.75 mLのクロロホルム/メタノール（1:2, v/v）を加えて再抽出し、15秒間ボルテックスし、1.25 mLのクロロホルムを加えた。その後、サンプルを15秒間ボルテックスし、1.25mLの水を加え、再度ボルテックスし、遠心分離した（5分間、4℃、900G）。有機層を最初の抽出からの有機層と合わせ、窒素下で乾燥させ、液体クロマトグラフィー/ドリフトチューブイオンモビリティーと高分解能質量分析（LC/DTIM-MS）を結合させて分析した（逆相ACQUITY CSH C18カラム（Waters Company）を備えたAgilent 6560 IM QTOF MS（Agilent Technologies））。脂質のアノテーションと同定は、LIPID MAPS Structure Databaseと内部脂質ライブラリーからなる複合アノテーションを用いたKniMetパイプライン22を適応して行った19。
細胞の単離と培養
C57BL/6マウスを頚椎脱臼で殺し、滅菌のために70%エタノールを噴霧し、脚周囲の皮膚を剥いだ。その後、脚を摘出し、氷上でDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）に入れた。層流キャビネット内で、筋肉を除去し、脛骨と大腿骨を膝靭帯で分離し、近位骨端と遠位骨端を除去した。骨髄由来マクロファージ（BMDM）培養のために、BMDM増殖培地（10％HyClone（Thermo Fisher Scientific）、20％L929コンディショニング培地および5mM L-グルタミン（Sigma）を添加したDMEM）を用いて骨髄を洗い流し、回収した細胞を300×G、15℃で10分間遠心し、BMDM増殖培地に再懸濁した。培養2日後に適切な培地を等量添加し、培養4日後に培地を完全に補充した。すべての実験は、培養7-9日目の細胞を用いて行われた。
L929コンディショニング培地は、L929細胞を10%Hycloneと5mM L-グルタミンを添加したRPMI1640（Sigma）中で2週間コンフルエントになるまで培養して調製した。培養上清を回収し、0.22μmフィルター（Milipore）でろ過して滅菌した。
細胞刺激と感染
サルモネラ・チフス菌SL134446株は、5mLのLBブロス（シグマ社製）を用いて37℃、200rpmで17.5時間前培養した後、前培養液をLBブロスで10分の1に希釈し、さらに2時間培養することにより対数相まで培養した。2時間および6時間のタイムポイントでは、感染後に洗浄し、50μg/mLのゲンタマイシン（Sigma）を含む培地でさらに1時間インキュベートした。6時間のタイムポイントでは、培地を10μg/mLゲンタマイシンを含むDMEMに交換し、37℃でさらに4時間インキュベートした。
一部の実験では、LPSまたはPam3CSK4によるプライミングが必要であった。これは、大腸菌O111:B4由来の200ng/mL超高純度LPS（Invivogen社製）を含む増殖培地中で細胞を3時間、または200ng/mL Pam3CSK4（Invivogen 社製）を含む増殖培地中で細胞を4時間、37℃、5% CO2でインキュベートした後、培地のみで連続的に洗浄することにより行った。プライミングの前に、COX阻害実験ではインドメタシン100μM（Sigma）またはセレコキシブ10μM（Sigma）を用いて30分間のプレインキュベーションを行った。COX阻害剤は、LPSのプライミングと刺激の間にも、これらの濃度で存在した。
刺激実験では、LPSでプライミングした細胞をニゲリシン10μM（Sigma）と1時間、またはATP 5mM（Sigma）と30分間インキュベートした。選択したアッセイでは、ニゲリシン10μMとプロスタグランジン（Tocris社から入手）1μMを同時に添加し（特に断りのない限り）、1時間インキュベートした。アラキドン酸40μM（Tocris社製）、U-73122 1μM（Sigma社製）、ASB14780 1μM（Sigma社製）を含む実験では、プライミング後に30分間のプレインキュベーションを行った、 N-(p-Amylcinnamoyl)anthranilic acid 1 μM (Sigma), sotrastaurin 10 μM (abcam), CRT0066101 10 μM (Tocris), SP600125 10 μM (Tocris), LCA 30 μM (Sigma).
細胞生存率アッセイ
BMDM細胞毒性は、CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（Promega）を用いて測定した。簡単に説明すると、上記のように細胞感染と刺激を行った後、接着した細胞を非補足DMEMで3回洗浄し、ウェルあたり40μLのTriton X-100 0.5%と4℃で15分間インキュベートした。その後、細胞をウェルから掻き出し、各ウェル10μLを、ウェル当たり105μLのTriton X-100 1.2%を含む別のプレートに移し、37℃で1時間インキュベートし、必要であればPBSで希釈し、CytoTox試薬をメーカーの説明に従って使用した。細胞生存率は、200.000個の細胞を含む感染していないコントロール（生存率100%）との関係で計算した。細胞死を定量化するため、刺激細胞の上清を回収し、CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（Promega社製）を用いて、CytoToxキットに含まれる溶解試薬で200.000細胞を溶解した100％細胞溶解コントロールに対するLDH活性を測定した。
サイトカインの定量
分泌されたサイトカインは、増殖培地で適切に希釈した後の実験上清を用いて、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）により定量した。すべてのサイトカインは、製造元の説明書に従って測定した。IL-1βはOptEIA Mouse IL-1β Set（BD Biosciences）およびHuman IL-1β DuoSet（R＆D Systems）のキットを用いた。IL-18はmouse IL-18 ELISA (MBL International)を用いた。
免疫ブロット
刺激後、10 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM NaVO4, 20 mM PMSF, Phosphatase inhibitor cocktail 3 (1 in 100 dilution, Sigma) and Protease inhibitor cocktail (1 in 100 dilution, P8340, Sigma)を含むバッファーで細胞を氷中で10分間溶解した。タンパク質量はPierce BCA Protein Assay Kit（Life Technologies）を用いて定量し、イムノブロット用に500μg/mLに調整した。その後、サンプルをPierce Lane Marker Reducing Sample Buffer（Life Technologies社製）を用いて100℃で5分間インキュベートした。ゲルには1レーンあたり20μLのサンプルをロードし、最終タンパク質量は10μgとした。
イムノブロットは以下の一次抗体を用いてプローブした：カスパーゼ-1 p10（マウス）（sc-514、Santa Cruz）500分の1；IL-1β（ヤギ）（AF-401、R&D Systems）1000分の1；β-アクチン（マウス）（AB3280、ABCAM）2500分の1；NLRP3（ラット）（MAB7578-SP、R&D Systems）2000分の1；COX2（ヤギ）（AF4198、R&D Systems）。使用した二次抗体：抗ヤギIgG-HRP（sc-2922、Santa Cruz）5000分の1；抗マウスIgG-HRP（7076、Cell Signaling）6000分の1；抗ウサギIgG-HRP（A24537、Thermo Scientific）適宜6000分の1；抗ラットIgG-HRP（7077S、Cell Signaling）5000分の1。
PLC活性アッセイ
10,000,000個のBMDMを一晩シャーレにプレーティングし、上記のようにLPSでプライミングした。次に、上記のように細胞をアラキドン酸またはU-73122でプレインキュベートし、次にニゲリシン10μMで1時間、阻害剤の有無にかかわらず刺激した。次に細胞を回収し、10 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM NaVO4, 20 mM PMSF, Phosphatase inhibitor cocktail 3 (1 in 100 dilution, Sigma) and Protease inhibitor cocktail (1 in 100 dilution, P8340, Sigma)を含むバッファーで氷中で10分間溶解した。PLC活性は、EnzChek Direct Phospholipase C Assay Kit（Thermo社）を用いて、メーカーの指示に従い測定した。
定量および統計解析
データ解析は、個々の実験に示されたように、ソフトウェアPrism 6.0（GraphPad Software）を用いて行った。要約すると、2群間の統計的差は対にならないt検定を用いて決定し、複数群間の差はTukeyの事後検定による一元配置分散分析（ANOVA）を用いて決定した。本研究では、p値が0.05未満を有意とみなした。メタボロームデータの解析にはSIMCA 15（Sartorius）を使用した。
謝辞
本研究は、Wellcome Trust Investigator award（108045/Z/15/Z）およびMRC project grant（MR/X000826/1）によるC.E.B.への助成を受けた。Stephen WebsterおよびPanagiotis Tourlomousisには、実験計画の支援と指導をいただき、本研究に重要なリソースを提供していただいたことに感謝したい。J.L.G.研究室での研究はMedical Research Council（MR/P011705/1）の支援を受けている。オープンアクセスのため、著者は本投稿から生じるすべての著者受理済み原稿にCreative Commons Attribution (CC BY)ライセンスを適用している。
著者貢献
M.P.、J.L.、J.E.-H.、A.M.M.、C.H.、S.L.、M.H.、K.H.が実験とデータ解析を行い、M.P.、J.L.、J.M.、J.L.G.、I.F.、M.N.S.、C.H.、C.E.B.が実験デザインを行い、M.P.、J.L.、C.E.B.が原稿を執筆した。
利益申告
C.E.B.はDanger Bio社の共同設立者であり、Nodthera and Related Sciences社の科学諮問委員会委員、Janssen社のコンサルタントである。
補足情報
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資料S1. 図S1-S6
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表S1. LC/DTIM-MSで検出された脂質の存在量とその同一性
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論文情報
出版履歴
出版 2024年1月23日
受理 受理：2024年1月5日
改訂版受理 2023年11月27日
受理：2023年11月27日 受理日：2023年8月10日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.113700

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図1ヒトの空腹時ボランティアはアラキドン酸（AA）濃度が高い。
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図2カノニカルNLRP3インフラマソームによるエイコサノイド産生
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図3AAがNLRP3インフラマソームを阻害する
図3AAによるNLRP3インフラマソームの阻害
図4個々のエイコサノイドはNLRP3活性にほとんど影響しない
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図5シクロオキシゲナーゼ（COX）活性はNLRP3活性を制御するが、NLRC4は制御しない
図のサムネイルgr6
図6NLRP3活性にはPLCが必要である
図サムネイルgr7
図7AAはPKC、PKD、JNKを阻害する
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