腸脳軸のマルチレベル解析により、自閉症スペクトラム障害に関連した分子および微生物プロファイルが示される

オープンアクセス
出版：2023年6月26日
腸脳軸のマルチレベル解析により、自閉症スペクトラム障害に関連した分子および微生物プロファイルが示される

https://www.nature.com/articles/s41593-023-01361-0

ジェームズ・T・モートン
ジン・ドンミン
...
ギャスパー・タロンチャー・オルデンブルク
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ネイチャー・ニューロサイエンス (2023)この記事を引用する
95 Altmetric
指標詳細
要旨
自閉スペクトラム症（ASD）は、認知、行動、コミュニケーションに異質な障害を特徴とする神経発達障害である。腸脳軸（GBA）の破綻がASDに関与していることが示唆されているが、研究間の再現性は限られている。本研究では、ASDに関連する分子および分類群プロファイルを同定するために、ベイズ差分ランキングアルゴリズムを開発し、10の横断的マイクロバイオームデータセットと、食事パターン、メタボロミクス、サイトカインプロファイル、ヒト脳遺伝子発現プロファイルを含む15の他のデータセットを横断した。我々は、ASD表現型の不均一性と相関するGBAに沿った機能的アーキテクチャを発見し、それはASDに関連するアミノ酸、炭水化物、脂質プロファイルによって特徴付けられ、主にプレボテラ属、ビフィドバクテリウム属、デスルホビブリオ属、バクテロイデス属の微生物種によってコードされ、脳遺伝子発現変化、制限的な食事パターン、炎症性サイトカインプロファイルと相関していた。年齢と性別が一致したコホートで明らかになった機能的構造は、兄弟姉妹が一致したコホートには存在しない。また、マイクロバイオーム組成の時間的変化とASDの表現型との間に強い関連があることも示した。まとめると、我々は、明確に定義されたコホートから得られたマルチオミクスデータセットを活用し、GBAがASDにどのような影響を及ぼすかを調査する枠組みを提案する。
主な内容
自閉症スペクトラム障害（ASD）は、小児期の早期から現れる異質な認知、行動、コミュニケーションの障害によって定義される広範な神経発達疾患を包含する1。現在までに、ASDに関連すると推定される遺伝子として100以上の遺伝子が同定されており、いくつかの遺伝子型は現在標準的な臨床診断を受けている2。しかし、遺伝子の変異のほとんどは、まだ多様な表現型と関連しており、特定の障害の原因となる分子メカニズムを特定することは困難である3。また、ASD児のさまざまな脳領域における異常の存在に注目した研究もある4。 しかし、このような神経解剖学的特徴が自閉症をメカニズム的に決定するかどうか、また環境因子がASDに類似した症状を誘発するかどうかは、未解決のままである1。
危険因子に加えて、ASDと高い信頼性をもって関連している併存疾患のひとつに、便秘、下痢、腹部膨満感などの消化器（GI）症状の発現があるが、因果関係の解明はまだなされていない5。メカニズム的には、多くの研究が、消化管系と神経内分泌系、神経免疫系、自律神経系が制御するプロセスとの相互作用に焦点をあてており、これらすべてが消化管周辺に集まり、ともに腸脳軸（GBA）6を調節している。
GBAは腸と脳の双方向コミュニケーションを促進し、脳のホメオスタシスに貢献し、認知・情動機能の調節を助けている7,8。過去10年間、GBAを調節する因子に関する研究により、神経免疫ネットワークの調節、神経ネットワークの修正、脳との直接的なコミュニケーションにおいて、腸内微生物（腸内に生息する数兆個の微生物）が果たす中心的な役割が明らかになってきた9。腸内細菌叢の調節異常とそれに伴うGBAの崩壊は、自閉症を含む神経発達障害の病因に関与していると考えられているが、その根底にあるメカニズムや、微生物叢がこれらのダイナミクスをどの程度説明しているのかは、まだ明らかになっていない10。
数十件の自閉症腸内メタゲノミクス研究により、ASD患者における微生物の多様性には、神経発達障害患者と比較して、一貫性はないものの、多くの違いがあることが明らかにされている10。 同様に、メタゲノムを用いた機能的再構成や代謝解析でも、ASD患者と神経発達障害患者の間には、結論は出ていないものの、強い違いがあることが示されている11。他のオーミックレベルでの比較分析でも、研究間の一致はほとんど示されていない12。これまでの結果は、コホート間の本質的な生物学的差異を反映しているのか、統計的検出力が不十分なのか、意味のある比較を妨げる実験的バイアスがかかっているのかという疑問が投げかけられている13。
バッチ効果による交絡変動、不適切な統計学的手法の適用、ASDの表現型や遺伝型の多様性など、様々な要因が研究間の不一致を説明する可能性がある。バッチ効果は、誤った実験計画、技術的なばらつき、地理的な場所、人口構成など多くの要因によって引き起こされる可能性があり、それらを補正するためのアルゴリズムがいくつか提案されているが、標準化された統計手法がないことが解釈をさらに複雑にしている14。マイクロバイオームデータセットは、他のオーミックデータセットと同様、構成的なものであり、シーケンス数の構成的性質を考慮しないと、存在量の異なる微生物を同定する際に高い偽陽性率や偽陰性率につながる可能性がある15。ASDにおけるマイクロバイオーム解析は、ASDのサブタイプを層別化し、信頼性の高い診断法を構築するために重要であることが知られているが、一般的に測定またはコントロールされていないASDの表現型および遺伝子型の不均一性によってさらに混乱する1。
自閉症のような複雑な神経発達障害の機能的アーキテクチャー（個々の表現型を決定する様々なオーミックレベル間の相互作用のネットワーク）を理解するためには、それに寄与する様々なオーミックレベルを正確かつ包括的に特徴づける必要がある16。従来、ヒトのゲノム、代謝、細胞の構成要素に焦点が当てられてきたが、表現型の決定においてGBAが果たす役割の証拠が増えつつあり、自閉症の機能的構造17の重要な構成要素になりうるものとして、マイクロバイオームのメタゲノムと代謝の寄与を考慮する必要性が高まっている。
コホート特異的な交絡因子を減らしながら自閉症特異的なオーミックプロファイルを同定するために、我々はベイズ差分ランキングアルゴリズムを考案し、25のオーミックデータセットに含まれる複数の潜在的なASDサブタイプにまたがる微生物の差分分布、すなわち相対的な対数倍数変化15を推定した（表1）。log倍数変化で微生物をランク付けすることで、(1)マイクロバイオームデータセットに内在する構成バイアスを相殺し、(2)微生物特有の偽発見率（FDR）補正統計検定による偽陽性を最小化することができる15。我々のアプローチの主な特徴は、小児期の発達における交絡因子を調整するために、各研究の中で個々の研究参加者を性別と年齢で一致させたことである。この設定により、コホート特有の処理プロトコールによる交絡のばらつきも減少させることができた。自閉症が男性に多いことはよく知られており、この現象を説明する性依存的なメカニズムがいくつか提案されている。さらに、小児期のマイクロバイオームの発達は、ヒト腸内におけるマイクロバイオームの動態の特徴である。我々の解析では、ASDの背景において、GBAに沿ったオーミックレベル、特にマイクロバイオームの間に強い関連があることが明らかになった。最終的に、我々の解析は、自閉症の機能的構築の動態を理解するための横断的研究の本質的な限界を明らかにし、マイクロバイオームやその他のオーミックレベルとASDとの因果関係をより明確にすることを目的とした今後の研究の枠組みを提供するものである。
表1 本研究で対象としたASDのオーミックデータセット。すべてのシーケンスデータセットはSRAから取得した。
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解析結果
本研究の解析構造は、マルチコホートおよびマルチオミクスのメタ解析フレームワークで構成されており、独立および依存のオミックデータセットを1つの統合解析にまとめることができた19。構成性とシーケンス深度20の問題を最小化するために、負の二項分布21を用いてシーケンス数データをモデル化した（Extended Data Fig.） 我々の差分ランキングアプローチでは、交絡変動とバッチ効果を調整するために、各研究コホート内でASD児と年齢および性別が一致した神経健常対照児を個別にペアリングする症例対照マッチング要素を組み込んだ（補足情報）。最後に、年齢と性別を一致させた7つのコホートから得られた16S rRNA遺伝子（16S）アンプリコンデータから推定された微生物の差異ランキングを、他の15のオミックデータセットと相互参照し、これらの微生物が自閉症において果たしうる潜在的な機能的役割について整理した（図1）。
図1：年齢マッチングと性マッチングの概念を示す図。
a,ASD児と同性で同程度の年齢（±6ヶ月）の神経質児は、実験やその他のコホート特有の違いによるバッチ効果を減らすために、研究内でマッチングされた。そして、マッチさせたペアを用いて、様々なオミックの特徴（微生物、代謝物など）の差（log fold ratio）を計算した。研究間の下流分析では、マッチした個体の異なるペアについて決定された研究内差分を比較した（円内の数字は年齢を示す）。図2では、年齢と性別が一致したコホートから計算された16S差は、兄弟姉妹が一致したコホートからの16S差、および年齢と性別が一致した他のコホートからのSMS差と相互参照した。図3では、年齢が一致したコホートと性が一致したコホートの16S差分を、KEGGパスウェイを参照としてサイトカイン差分およびRNA-seq差分と相互参照した。図3には、微生物と食事の共起分析も含まれている。図4では、年齢をマッチさせたコホートと性別をマッチさせたコホートの16S差分が、KangらのFMT試験52から計算された16S差分とクロスリファレンスされた。
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年齢マッチングと性マッチングがASDデータ解析を強化
年齢マッチングと性別マッチングのベイズ差分ランキングアプローチの妥当性と頑健性を確立するために、我々は一連のベンチマーク演習と感度テストを行った。
まず、年齢をマッチさせたコホートと性別をマッチさせたコホートの16Sおよびショットガンメタゲノミクスシーケンス（SMS）の差の平均値と標準偏差を、各微生物の総シーケンス深度と比較して調査した（Extended Data Fig.） どちらの解析でも、不確実性の推定値を較正するためにシーケンシング深度を使用することができ、観測されたリード数が少ない希少な分類群では標準偏差が大きくなることが観察されました（Extended Data Fig.2b,d）。さらに、希少な分類群（合計100リード未満）は、ASD関連分類群の中で最も差分量の多い分類群には含まれていなかった（Extended Data Fig.）
次に、希少な分類群の頻度が高いことが、log fold changeの計算結果に影響を与えるかどうかを調べるために、希少化ベンチマークを行った。16Sクロスセクションデータセットから得られた希少化（9,000閾値）データと非希少化データ間の存在量の差分推定値の比較から、希少化は結果に実質的な影響を与えないことが示されました（Extended Data Fig.2e）。また、症例と対照の間の配列決定深度を変化させたデータ駆動型シミュレーションを行い、配列決定深度の交絡因子があるにもかかわらず、われわれの存在量の差分法は、グランドトゥルースの対数倍変化を正確に回復できることを示した（Extended Data図2f）。次に、11の16S研究のうち7つ22,23,24,25,26,27,28,29について、年齢と性別を一致させた我々の差分ランキング解析のパフォーマンスを、標準的なグループ平均差分ランキング解析と比較した（Extended Data 図2g）。次に、一般的に使用されている存在量の差分法ANCOM-BC（文献30）と並べて比較し、我々の方法論と最先端の存在量の差分法との違いを明らかにした（拡張データ図2i-k）。
研究内差分解析の総合的なバッチ効果低減力を、性マッチおよび年齢マッチのベイズ差分ランキングアプローチでベンチマークした。MicroBiome Quality Control（MBQC）研究（Sinha et al. 2017（文献31））を用いて、研究内差分解析が実験およびその他の研究に関連する交絡因子をどの程度除去し、独立した研究間で意味のある比較を可能にするかを評価した。2つの同一のMBQCマイクロバイオーム試料（試料'4'と'6'）を処理する4つの独立した研究室（研究室A、研究室B、研究室C、研究室D）が作成した微生物量データセット（16S微生物数）に焦点を当て、各研究室についてこれらの試料の微生物数の差分を計算した。2つのサンプル間の全体的な変動性の最初の評価（Bray-Curtis非類似度を用いた主座標分析（PCoA）プロット）（Extended Data図2l）は、微生物カウントに基づくだけで、両サンプル間に合理的な分離を示したが、研究メンバーの可視化により、かなりの程度の変動性がデータセットを作成した研究室に関連していることが明らかになった（Extended Data図2n）。各研究室によるメタゲノムサンプルが同一であったことを考えると、データセット間で観察された高いレベルの変動性は、実験および研究室固有のバッチ効果にのみ起因すると考えられる。McLarenら18の理論的知見と一致するように、我々の差分解析では、研究内の差分間に高い相関が見られた。このことは、グランドトゥルースの差分を高い信頼性で読み取り、独立したコホート研究の相互比較を可能にする方法として、研究内でスケール等変量対数フォールドチェンジ計算を使用することを明確に支持している（Extended Data Fig.）
我々の解析が16SとSMSのデータセット間で一般化できるかどうかを調べるために、16SとSMSのサンプルをペアにしたDanら28のコホートに注目した。Greengenes2データベース32にリードをマッピングして得られたアバンダンスは、属レベルで16SとSMSデータセット間の強い一致を強調した（r = 0.63, P < 1 × 10-100）。さらに、年齢マッチングと性別マッチングアプローチから得られた16SとSMSのlog fold changeも、属レベルで強い一致を示している（r = 0.47, P = 1 × 10-7）。
差異ランキング分析によりASDとマイクロバイオームの強い関連性が明らかになった。
本研究のために選択された7つの16Sデータセットについて、年齢と性別をマッチングさせたグローバルな差分ランキング解析を行ったところ、ASDとコホートメンバーに関する微生物の差異が明確に分割されていることが明らかになった（図2a）。全体的な症例と対照の差の分布は、ASD児に多く見られる591種類の微生物と対照児に多く見られる169種類の微生物によって、強いASD特異的シグナルが示された（補足表4）。観察されたばらつきは、アジア、ヨーロッパ、南米、北米の7つのコホートで、コホートの人口統計学や地理的位置などの交絡因子による可能性が高い。ビローム、SMS、RNAシーケンス（RNA-seq）データセットについても、同様の順位差傾向が観察された（Extended Data Fig.3）。これらの非常に有意なマイクロバイオームシグナル（P < 0.0025）を用いて、ASD児を年齢や性別をマッチさせた対照児と区別できるかどうかを調べるため、微生物群集の16SターゲットシーケンスおよびSMS全ゲノムシーケンスから得られたデータの訓練／検証／テスト分割でランダムフォレスト分類器を訓練した。個々のデータセットだけでなく、組み合わされたマイクロバイオームデータセットに対しても勾配ブースティング分類器を適用し、その性能を受信者動作特性曲線下面積（AUROC）で測定した。年齢と性別が一致した9つのコホート22,23,24,25,27,28,29,33,34のうち、6つの研究ではAUC＞0.87であり、年齢と性別が一致したコホートにおいて、ASD児と神経質児の間に微生物による強い違いがあることが明らかになった（図2b）。全コホートにわたる1,193サンプルすべてで1つの分類器を訓練すると、分類性能は低下したが、それでもASDの予測は可能であった（AUC = 0.78）。これは、他の疾患メタアナリシス35において、研究内分類の成績が研究横断的分類の成績よりも高いというこれまでの観察結果と一致している。私たちは、多様なヒト集団全体に広がる微生物の不均一性が、分類性能を阻害する役割を果たしているのではないかと考えている。
図2：オミックスレベル間の差分ランキング分析。
a,年齢と性別を一致させたASDと対照個体間のグローバル微生物16S対数倍変化。エラーバーは95%信頼区間を表す。ヒートマップは、全コホートにわたる、年齢が一致し性別が一致したASDと対照の各ペアについて、全中心対数比（CLR）変換した微生物の差異を示す。微生物は、年齢・性別一致の分類器を用いてASD関連、中立、対照関連グループにビニングされている（Methods）。b,本研究で解析したすべての16Sおよびショットガンメタゲノミクスデータセットにおけるサンプルサイズ、男女比（M:F）、平均年齢、およびAUROCで測定したホールドアウトグラディエントブースティングによるASD予測性能。V3-V4、V4、V4-V5は、解析した細菌のリボソームRNAの可変領域を指す。 c, ASDに関連すると分類された微生物と対照に関連すると分類された微生物の対数比を各サンプルについて計算した。x軸はこれらの対数比の症例対照差を表し、0より大きい値はASD児と神経質児の間に隔たりがあることを示している。箱ひげ図は、中央値（線）、25-75％の範囲（箱）、5-95％の範囲（ひげ）を示している。 d, 異なるオミックスレベルの効果量：ウイルス、16S、SMS、RNA-seq。
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年齢と性別が一致したコホートとは対照的に、兄弟姉妹が一致したコホートではAUCが大幅に低下した（Son et al.36 AUC = 0.69; David et al.37 AUC = 0.46; Elliot et al.38 AUC = 0.38）。同様にPERMANOVAは、年齢と性別が一致したコホートでのみASD特異的なマイクロバイオームの違いを検出した（P = 0.002）が、兄弟姉妹が一致したコホートではそのようなシグナルは認められなかった（P = 0.535）。どちらのコホートでも、年齢と性別は有意な交絡因子であったが（P < 0.002）、年齢と性別が一致したコホートでのみ、症例対照ペア間の年齢と性別の差を最小化することができた（Extended Data図6a-d）。兄弟姉妹一致コホートでは、家庭が交絡因子であることが観察されたが（P < 0.001）、年齢一致コホートと性別一致コホートでは、どの子供も同じ家庭に住んでいないため、強い分類器の汎化が見られた。しかし、家庭の食生活や社会経済的状況など、測定されていない交絡因子が、人為的に分類能を高める可能性がある。兄弟姉妹研究における潜在的な年齢と性別の交絡因子を調査するために、我々は既知のグランドトゥルースを用いてデータ駆動型のシミュレーションを行い、兄弟姉妹のような年齢分布（Davidら37から入手）と我々の全体的な性適合分布と年齢適合分布をそれぞれ用いて、最適化された年齢適合（±≦0.5歳）と比較して、大きな年齢差（±＞2歳）がモデリング結果にどのような偏りを与えるかを決定した（Extended Data図6c）。解析の結果、十分に大きな年齢の交絡因子を持つ症例対照では、年齢と性別のマッチングや兄弟姉妹のマッチングを用いる方法では、真実の対数倍変化を正確に復元できないことが示された。しかし、兄弟姉妹のような年齢分布の場合、推定された対数フォールド変化は大きなバイアス（平均二乗誤差＝589.3）を示し、それは性適合群と年齢適合群では一桁減少した（平均二乗誤差＝57.8）（Extended Data Fig.）
年齢・性別適合差分分析は、R2に関して標準的な群平均を上回り、その全体的な性能は、より多くの研究が追加されるにつれて厳密に向上した（拡張データ図2g,h）。この性能の向上は、コホートが大きくなるにつれてモデルの不確実性が減少したことを反映しており、これは、研究間で異なる発現量の分類群が重複していることと、交絡変動が減少していることを示している。分類結果の解釈を助けるために、年齢と性別を一致させた存在量差分析から得られた分類群の対数比を作成し、各研究においてASD児と神経質な対照群を強く分離した。これらの個々の分析から、対照群に比べASD児の分類群の強い一貫した濃縮を強調する単一の微生物対数比を組み立てたところ、対数比は88％のペアで0を上回った（図2c）。このパターンは、2つのショットガン・メタゲノミクスデータセットを含む、年齢と性別が一致したすべてのコホートで一貫していた： Wangら33（ペアの70％で対数比＞0）とDanら28（ペアの73％で対数比＞0）。
ASDに特異的なパターンがいくつかのオーミックレベルで存在する。
3つのオーミックレベル-マイクロバイオーム（16SとSMS）とヒトトランスクリプトーム（RNA-seq）-の差次分析では、ASD児と、年齢と性別をマッチさせた神経型健常児との間に、強く非常に有意な差があることが明らかになった（P < 0.0025）（図2d、補足表5と6）。メタボロームとビロームの2つのオーミックレベルは有意なシグナルを示さなかった（Extended Data Fig.4および補足表7）。
宿主サイトカインは微生物量と相関する
免疫異常は、循環する「抗脳」抗体やサイトカインプロファイルの乱れから、単に免疫異常の家族歴を持つことまで、ASDと繰り返し関連している39。例えば最近、Zuritaら24は、炎症性サイトカインであるトランスフォーミング成長因子β（TGF-β）の濃度がASD児で有意に上昇していることを示した。我々はこのデータセットを年齢マッチングと性別マッチング後に再分析し、Zuritaら24から推定された16S微生物の差分がTGF-βと関連し、ASDと対照のペア間のグローバル微生物のlog fold変化と正の相関があることを観察した（TGF-β: r = 0.237, P = 2.84 × 10-5）（補足表1および9）。対照的に、グローバル微生物の対数倍変化はインターロイキン（IL）-6濃度とはほとんど相関がなかった（r = 0.07, P = 0.17）。しかし、最も分化度の高い微生物分類群の対数比を計算すると、TGF-βとIL-6の両濃度と高い相関が見られた（TGF-β：r＝0.61、P＝1.84×10-5；IL-6：r＝0.73、P＝5.74×10-8）（図3a-d）。このことは、IL-6の変化がほんの一握りの分類群に関連しているのに対し、TGF-βははるかに多くの分類群に関連していることを強調している。
図3: ASDにおいて異なる頻度で存在する微生物とサイトカイン、脳内遺伝子発現、食事パターンとの関連を明らかにする。
a,b,年齢マッチング、性別マッチングとサイトカイン解析から得られた微生物の差の比較。 c,d,各サイトカインに対応する上位と下位の最も差のある50の微生物から構築された微生物の対数比。KとCは、ASD集団と神経型対照集団との間の微生物負荷のシフトによる未知のバイアスを表す。 e, ASDに濃縮されたマイクロバイオームと脳内のパスウェイ間の分子の重複を示すヒートマップ。f,g、微生物と食事の共起解析から得られたPC3は、Berdingら25の微生物対数倍変化と食事の違いに対して対比されている。ASDの子どもで枯渇している（P < 0.1）食事化合物は、「x」マーカーとして強調されている。T(ASD-Control)は、ASDと神経型の食事摂取の違いを測定するt統計量を表す。 conc.は濃度。
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プレボテラ（Prevotella）、バクテロイデス（Bacteroides）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）がサイトカインの差と主に関連していた。これらのサイトカインと微生物との関連については、部分的なメカニズム解明が以前に発表されている。バクテロイデス・テタイオタオミクロンは、TGF-βが減少した場合に2番目に多く上昇した微生物であり、行動学的症状に関連する母体の免疫活性化依存性代謝産物を調節する役割を担っていることが示唆されている40。ビフィドバクテリウム・カリトリシダラム（Bifidobacterium callitrichidarum）は、IL-6の濃度が低い場合に6番目に濃縮された分類群であった。ビフィドバクテリウム・ロンガムのような他のビフィズス菌種は、in vitroでヒト胎児腸細胞のIL-6をダウンレギュレートすることが観察されている41。プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）は、IL-6の濃度が低い場合には2番目に濃縮された分類群であり、TGF-βの濃度が低い場合には6番目に濃縮された分類群であった。この結果はTettら42と一致しており、P. copriと様々なサイトカインとの関連は、複数の疾患において観察された。同様に、P. copriとBacteroides fragilisはともに、ASDの子どもや神経発達障害のある子どもで濃縮されたファージと共存していた（Extended Data Fig.
マイクロバイオームの代謝はASDにおけるヒトの脳代謝を反映する
マイクロバイオームの生理学とヒトの脳との間の潜在的なクロストークを明らかにするため、数千種類の微生物の個々の代謝能力を統合した微生物メタゲノムと、脳内で異なる発現を示すヒトゲノム、全く異なる生物学的文脈を表す2つのオーミックレベルがコードする代謝能力を比較した。SMSとRNA-seqからそれぞれ推定された、ASDの表現型に関連する138の微生物および1,772のヒト代謝コード遺伝子を同定した。ASD患者の脳組織で異なる発現を示した95のヒト代謝経路は、ASD児のマイクロバイオームで異なる発現量を示した微生物経路と類似しており、ASDにおいてオーミックレベルを超えた代謝経路が協調している可能性が示唆された（図3e）。アミノ酸代謝、炭水化物代謝、脂質代謝に関連するパスウェイは、重複するパスウェイの中で不均衡に発現していた（拡張データ図9および補足表14）。ASDに関連する微生物酵素コード遺伝子と、以前にGBMフレームワークの一部として定義された腸脳モジュール（GBMs）を比較したところ、約48.5％の重複が見られ（101/208）、オーミックレベルを超えた潜在的な代謝クロストークという概念をさらに裏付けている45（補足表13）。
マイクロバイオームの代謝能力はASDの食事パターンを反映する
幼児期における自閉症的特徴は、その後の食生活の質の低さと相関することが示されている。しかし、食生活の質が自閉症的特徴とどのように直接結びついているかについては、ほとんど知られていない46。ここでは、Berdingら25のマイクロバイオームと食事調査のペアデータを再分析した。微生物-食事共起分析により、微生物-脳代謝能分析で観察されたパターンと驚くほど類似したアミノ酸、炭水化物、脂質代謝の関連パターンが明らかになった（補足表2および15）（Q2 = 0.43）。微生物-食事共起分析から、微生物-食事分散の3％を説明する主成分（PC）3のみがASDと神経型の食事を区別でき（r = 0.26、P = 0.004）、ASDと年齢マッチおよび性別マッチの対照群との微生物対数倍変化と強い相関があった（r = 0.22、P = 4.3×10-9）。自閉症児は、神経伝達物質の生合成に関与するグルタミン酸、セリン、コリン、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、バリン、ヒスチジンを多く含む食品の摂取が少なかった47。興味深いことに、複数のBacteroides属菌とP. copri属菌がMMvec PC3沿いの上位20分類群に含まれており、これらの分類群がアミノ酸食餌性化合物の代謝に関与している可能性が浮き彫りになった（図3fおよびExtended Data Fig.8）。メタボローム解析では、FDR補正後に統計的に有意なシグナルは得られなかったが、最も強いシグナルを示した代謝物にはグルタミン酸とフェニルアラニンが含まれ、微生物食解析と一致した48,49,50。これらの神経伝達物質分子の生合成における障害は、さまざまな精神疾患に関与しており、最近の血液メタボロミクス研究では、分岐鎖アミノ酸を使用して自閉症のサブタイプを定義できる可能性が示された51。データセット間の分子的特徴の互換性がないため、メタボロミクスデータセットのいずれかを組み合わせて統計的検出力を高めることはできず、メタボロミクス技術の大きな限界となっている（Methods）。
ASDマイクロバイオームは糞便移植後の行動改善を反映する
前述の横断的解析では、いくつかのオーミックレベル（ウイルス、マイクロバイオーム、免疫）または食事とASDとの間に有意な関連が示されたが、因果関係についての洞察はまだ限られている。これとは対照的に、縦断的介入研究は、因果関係についてのより強い洞察を得る機会を提供する。このことを検証するために、18人のASD患者を対象とした2年間の非盲検糞便移植（FMT）研究のデータを再分析した52。この研究では、小児は2週間の抗生物質治療と腸内洗浄を受けた後、2日間の高用量FMT治療と8週間のFMT維持用量の毎日投与を受けた。ASDの最も一般的な評価尺度のひとつである小児自閉症評価尺度（CARS）によると、10週間の治療で有意な改善がみられた。2ヵ月後、初期の改善はほぼ維持され、2年間の追跡調査では、ほとんどの患者でさらなる改善の兆しがみられた。この結果は、自閉症症状の改善におけるマイクロバイオームの役割の可能性と一致しているが、他の研究で見られたようなマイクロバイオーム組成の根本的な変化がどのように関連しているのかは不明である。
本研究では、我々の横断的差分順位分析によって明らかになったASDプロファイルとの関連において、オリジナルの生データを再分析した（補足表3および16）。FMT治療前の18人の子どもたちのASDに関連する微生物はすべて、年齢と性別を一致させた断面分析でASD関連微生物として同定されていた。2年後、不確実性が低かった（事後標準偏差＜3）これらの微生物の91％が存在量の平均減少を示し、この減少は57％の微生物で有意（95％対数倍変化量分位値＜0）であった（図4）。Kangらによるオリジナルの分析結果と一致し、2年間の調査期間中にPrevotella sp.の増加が検出された。また、Desulfovibrio pigerの増加も確認されたが、ビフィズス菌には大きな変化は見られなかった。このうち13の分類群はPrevotella属、Bifidobacterium属、Bacteroides属、Desulfovibrio属に属しており、最初の研究では指摘されなかった、これらの属における幅広い機能的多様性の可能性を示唆している。これらの属の中には、B. fragilis、B. thetaiotaomicron、B. longum、P. copri42などが含まれ、以前は免疫調節に役立つとされていた。また、Butyricimonas属やAnaerobutyricum属に含まれる複数の酪酸産生菌は、2年間の研究を通して安定しており、GBAのホメオスタシスに貢献する役割を果たす可能性を示している53。
図4：FMTは自閉症腸内細菌叢に長期的な影響を及ぼす。
a, 各ASD児のCARSの経時的改善。子どもたちは、CARSスコアが30点以下か、30点以上37点以下か、37点以上かによって、非ASD、軽度/中等度、重度の3つのグループに分けられた。b, 微生物の対数倍数変化の経時変化：時系列は、各微生物のタイムポイント間の対数倍数変化を計算することによって作成された。赤で強調表示されたASD特異的微生物は、横断的研究で決定された。c-f, 微生物のlog fold変化は、サイトカイン比較で強調表示された属で再度色付けされている。
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考察
ASDの機能的構造、特に自閉症の文脈におけるGBAの調節においてマイクロバイオームが果たす潜在的な役割については、既存のマイクロバイオーム研究およびその他のオーミック研究の間で意見の相違があるため、まだ十分に理解されていない。しかし、最近報告された知見54とは対照的に、我々はASD児と、年齢・性別をマッチさせた無関係の神経型健常対照児との間に明確な分離を観察し、このシグナルは3つの異なる方法論-すなわちPERMANOVA、分類、および複数のコホートにわたる存在量の差-を用いて検証された。年齢と性別を一致させた解析とは異なり、ASDの危険因子として知られる染色体16p11.2欠失を持つ個体からなるElliottら38のデータセットを含む、兄弟姉妹を一致させたコホートでは、ASD-マイクロバイオームシグナルは検出されなかった。一つの可能性は、年齢が幼児期のマイクロバイオーム発達における主要な交絡因子であることに変わりはないため、兄弟姉妹コホートにおける年齢と性別の交絡によるものである55。しかし、年齢や性別を一致させたコホートにおいて、ASDの個人ではなく、世帯間の差異を我々の分類法が識別している可能性も否定できない。以前の研究では、ヒトのマイクロバイオームに対する家庭特有の影響が確認されており56、また他の研究では、兄弟姉妹は一般集団に比べてASD発症リスクが高いことが多いため57、これらの研究における兄弟姉妹対照の問題が指摘されている。しかし、コホート内の家庭間で一般化するASD-マイクロバイオームシグナルが明らかに見られたという事実は、これらの腸内細菌叢が果たしうる機能的役割を理解するために、これらの交絡因子をコントロールする必要性を強調している。したがって、ASD児のいる家庭といない家庭の腸内細菌叢と遺伝的変異を調査するフォローアップ研究が必要である。
イムノーム、ヒトトランスクリプトーム、ダイエトームレベルの並行解析により、オーミックレベル間の強い関連性が明らかになった。ビロームと直接的なメタボロームシグナルは、存在するものの、他のオーミックシグナルに比べ著しく弱かった。一方、マイクロバイオームとヒトトランスクリプトームから推定されたASD特異的代謝プロファイルは、それぞれ腸と脳で発現する微生物とヒトのパスウェイにおいて、高度で有意な重複を示した。この重なりによって示唆される代謝的関連性には、ASDにおいて濃縮された炭水化物代謝経路とアミノ酸代謝経路が含まれており、先験的に代謝能力の重なりが少ないことが示唆されるであろう腸と脳の生理学の根本的な違いを考えると、驚くべき観察結果である。マイクロバイオームと食事の共起性分析では、ASD児の特定のマイクロバイオーム・プロファイルに関連するアミノ酸と炭水化物の摂取量の減少も強調された。これらの代謝と食事の不均衡、特にグルタミン酸レベルに関する不均衡は、解析した血清、糞便、尿のメタボロームにおいて、弱いながらもさらに明らかになった。GBAに沿って観察されたこのマルチスケールのオーバーラップは、ゲノムおよびメタゲノムレベルの代謝ポテンシャルによって駆動されるASDの機能的アーキテクチャーの存在を指し示している。
研究間の異質性を考慮すると、我々の解析では、興味深い機能的関連性を示唆するいくつかの微生物が、オーミックレベルで一貫して検出された。食事共起性解析では、IL-6のアップレギュレーションに加えて、ASDにおけるP. copriと炭水化物欠乏との強い関連も示された。バクテロイデス属はASDの食事分化において重要な役割を果たすことが観察され、B. thetaiotaomicronはTGF-βの枯渇と関連していた。その他、P. copriやいくつかのバクテロイデス属を含む複数の微生物が、免疫およびウイルス解析で目立った。FMT試験では、複数の酪酸産生菌に加えて、バクテロイデス、プレボテラ、ビフィズス菌、デスルホビブリオからなる安定したコアマイクロバイオームが観察された。このコア微生物叢の存在は、ASDに関連する分類群のほとんどが減少していることと相まって、自閉症症状の形成にこれらの微生物が関与していることを示唆している。
現時点では実際のメタボロームプロファイルを決定することはできないが（Methods）、微生物由来の代謝物および脳由来の代謝物の推論、ならびに食事由来の代謝物データに基づく代謝物解析により、統一された明確なASDの機能的構造像が明らかになった。脳、免疫、食事が主要なエフェクターであることから、ASDの多因子による複雑性は、ヒトと細菌の代謝を中心としたマルチスケールの相互作用に還元され、それが複数のフィードバックループを介して、表現型、ゲノム、メタゲノム属性を決定している。マイクロバイオームに対する遺伝子型の影響は観察されなかったが、先行研究ではASDのハイリスク遺伝子が特定されている2。腸内マイクロバイオームとヒトの脳や他の末梢システムとのコミュニケーションを仲介する免疫系の極めて重要な役割もまた、しっかりと確立されている。さらに、食事由来の栄養動員を媒介するマイクロバイオームの中心的な役割も広く立証されており、視床下部が媒介する食欲と食事の調節など、これらのエフェクター間のいくつかのハードワイヤードなフィードバックループも報告されている6。
腸内細菌叢が食事の嗜好性、宿主免疫、GIやASDの行動症状とどのように関連しているかについての理解は、横断的研究では限られているため、因果関係を推論することには限界がある。自閉症の機能的構造に関する因果関係の洞察を得るには、主要な微生物の培養とその代謝能力のプローブから、モデル生物を用いた実験的介入の実施、縦断的観察研究の実施、マルチオミクスデータ収集と自然介入の効果を観察するための広範な表現型プロファイリングに至るまで、多方面からのアプローチが必要になると想定している。自閉症の現実的な因果関係モデルの構築には、ASDの様々なサブタイプの根底にある多因子による複雑性を考慮する必要があり、そのためには、複数のオミックスレベルを臨床的に関連するタイムスケールで同時に解析する協調的な努力が必要となる。例えば、FMTの生着ダイナミクスとレシピエントの腸内細菌叢への機能的な影響を理解するには、マイクロバイオーム、免疫、メタボロームの初期サンプリングを頻繁に行う必要があるが、経時的な行動の変化を追跡するには、信頼性の高い行動、医療、食事調査と組み合わせて、数年にわたるサンプリングの頻度を少なくする必要がある58。このようなマルチスケールのオーミックデータセットを収集・統合することは、ロジスティックスと分析において独特の課題をもたらす。
データの取得と利用を管理するためには、複数のサイトを調整し、サンプル処理の一部を集中管理する必要がある。国際的な長期多施設共同研究であるThe Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY)研究のような最近のイニシアチブは、特定の環境的誘因と特定の1型糖尿病関連遺伝子型を関連付けるものであり、ASDにおける同様のアプローチの青写真を提供している。このようなイニシアチブの重要な構成要素は、標準化されたサンプリングと処理のプロトコルを確立することであり、これにより、ほとんどのオーミックレベルで最も大きな交絡因子の一つである技術的交絡因子を最小限に抑えることができる。さらに、マイクロバイオームのデータセットを較正するための広範な取り組みが進行中であるが、メタボロームなどの他のオーミックレベルでは、さらに根本的な技術的問題があるため、統合解析に含めることができるような協調的な戦略を開発することが不可欠である。
データセット間で統計的性質にかなりのばらつきがあることに加え、オーミックレベル間の相互作用はほとんど未確定であるため、有益なモデルの構築が大きな課題となっている。必要な生物学的な仮定を決定することは、自明なプロセスではなく、不注意にモデルのミススペックを引き起こし、誤解を招く結論をもたらす可能性がある。Yapら54は、食事と微生物とASDの表現型との因果関係を検証するために提案したモデルが、食事と腸内細菌叢との間に関係がないことを暗黙のうちに仮定し、腸内細菌叢とASDとの間の潜在的な役割を早々に否定してしまった。集団規模の研究から因果メカニズムを推論するためには、このようなモデルの誤設定問題に対処することが重要である。加えて、ASDの多様性を考慮すると、交絡因子の影響を最小化するコホート研究をデザインすることが、自閉症の理解を深める鍵となる。例えば、今回の解析ではASDのサブタイプを特定することはできなかったが、腸内微生物、宿主免疫、脳発現、食事パターンとの間に、これまでの報告よりも強い関連があることが明らかになり、包括的なオーミック解析によって統計的検出力と生物学的洞察を高める可能性が強調された。
我々は、適切に層別化されたコホートにおけるマルチオミックス縦断的介入研究は、包括的な患者メタデータと組み合わされ、ASDにおけるGBAに沿ったメカニズム研究を進めるために必要なエントリーポイントを提供すると結論づけた。集団規模の研究から因果メカニズムを推定するために我々が提案する実験的枠組みは、同意の得られた学際的戦略の開発を必要とする。例えば、メタボロームがオーミックレベルを越えて情報を伝達する上で中心的な役割を果たすことを考えると、データの種類（標的対非標的、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）対ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS））や検体の起源（血液・血清、尿、糞便）の違いを克服するために、メタボローム研究に対する統一的なアプローチが必要となる。ASD児の行動学的症状や消化器症状を表現型分類することも、まだ解決にはほど遠い問題であり、患者コホートを層別化することをさらに困難にしている。分子レベルから行動レベルまでのタイムスケールの問題は、適切な因果関係を推論するために、統計的に適切な方法で調和させる必要がある。最後に、潜在的な因果関係を特定するために適切な統計学的方法論を用いることは、提案されているメカニズム研究を成功させ、ASDの全体的な機能構造との関連においてマイクロバイオームが果たす役割の理解を進める上で非常に重要である。
方法
検索戦略と包含基準
米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のデータベース（PubMed、Sequence Read Archive（SRA）、BioProject）、UCSDのMassIVEリソース、PsychENCODEコンソーシアム、American Gut Project、および世界中の研究グループから、ヒトマイクロバイオーム、メタボローム、イムノーム、トランスクリプトーム、自閉症/ASDのデータセットを系統的に検索した。我々が同定した70以上の研究の約半分は、すでに公開データリポジトリに寄託されているか、研究グループから直接入手可能であった。
ほとんどの研究は、遺伝子型や表現型の層別化を行わない異種性-ASDと神経型の年齢・性別一致コホートで構成され、1つまたは2つのデータセット（マイクロバイオーム（16S、SMS）、メタボローム（尿/血清/糞便）、イムノーム（サイトカイン）、トランスクリプトーム（RNA-seq）、食事調査、行動調査）が関連付けられており、3つ以上のオーミックデータセットが関連付けられている研究はわずかであった（表1）。我々はマルチコホート・マルチオミクスのメタアナリシスの枠組みを採用し、独立したオミクスデータセットと依存したオミクスデータセットを1つの全体的な解析にまとめることができた19。合計で528組のASDと対照のペアを解析し、年齢と性別、または兄弟姉妹のマッチング情報を得た。マイクロバイオーム解析の主要な交絡因子である16Sデータセットのプライマー選択に伴うバッチ効果とノイズを減らすため、16Sデータセットを、他の可変領域よりも高い不均一性と低い進化率を示す領域である細菌リボソームRNAの可変領域V4を標的とするものだけに制限した64。以前の研究では、16S中の隣接領域をターゲットにしたプライマーが、属レベルまで同様の組成推定値をもたらすことが示された65。我々の解析では、V4領域のみ、V3-V4領域、またはV4-V5領域をターゲットとして得られた16Sデータセットを対象とした。
ここで紹介するメタボロームメタ解析は、独立に前処理され、正規化され、解析された4つのメタボロームデータセットを組み合わせたものである。ASD関連のデータセットは他にもいくつかあるが、作成に使用された質量分析技術にばらつきがあり、代謝物のサブセットが異なって検出されるため、横並びで比較することはできなかった（表1）。たとえば、標的質量分析法では有限の代謝物について正確な濃度を測定できるのに対し、非標的質量分析法では最大で 2～3 桁多くの代謝物が検出されますが、本質的には組成分析であるため、絶対量は得られません。さらに、試薬、サンプルの保存、質量分析装置の違いなど、サンプル処理によるバッチ効果によって、存在量と検出された分子特徴の両方に望ましくないばらつきが生じる可能性がある66。さらに、メタボロミクスデータセットの多くが独自に開発されたものであるため、生データにアクセスして標準化されたワークフローを実行することができないという障害もあった。
recount3（参考文献67）で利用可能だった40のトランスクリプトームデータセットのうち、大部分はモデル動物を使った研究から得られたもので、自閉症患者と神経発達障害患者の脳サンプルの死後処理から得られたものは4つしかなかった。これら4つのデータセットは、扁桃体、前頭前野、前帯状皮質、背外側前頭前野など、異なるタイプの脳組織を集めている。
Martin-Brevetらのコホート
Martin-Brevetら38のデータは、2つの異なるコホートから得られた。1つはSimons Variation in Individuals Projectのもので、主に米国の家族から構成されている。このコホートからは、16p11.2欠失を持つ24人と、欠失を持たない同家族の対応する24人の兄弟姉妹が得られている。もう1つは、ヨーロッパの16p11.2コンソーシアム（24人の欠失キャリアと24人の家族性コントロール）からの個体からなるコホートである。このコホートに関するより正確な情報は以前に発表されている38。欠失保因者は年齢や臨床診断に関係なく確認された。便サンプルからDNAを抽出し、V4領域に対するプライマーを用いて16S配列決定を行った。
データ処理
16SおよびSMSデータ解析のためのマッチした参照データベースを構築した。Web of Life 2 (WoL2)参照ゲノムデータベースは、生物多様性を最大限に表現するためにNCBIからサンプリングされた15,953の細菌および古細菌ゲノムを含む。WoL（10,575ゲノム）より大幅にアップグレードされている。uDanceという分割統治法を用いた新しい系統推定ワークフローを用いて、387のユニバーサルマーカー遺伝子に基づいて参照系統を再構築した。ゲノムの分類学的割り当てはGenome Taxonomy Database (GTDB) r207に基づき、tax2treeを用いて系統樹に従ってキュレーションした。WoL2全ゲノム系統樹に基づいてGreengenes2参照16S rRNAデータベースを構築し、Living Tree Projectの全長16S rRNA配列と高品質な細菌オペロンの16Sで更新し、uDanceを用いてトポロジーを修正した。このバックボーンに、DEPPを用いてQiitaの公共および民間サンプルからの16S V4アンプリコンシーケンスバリアントをすべて挿入した。GTDB r207に基づく分類学に、GTDBには存在しないLiving Tree Projectの系統を追加し、tax2treeを用いて系統樹上に装飾した。WoLとGreengenes2の構築に関する詳細は、Usyk et al.32に記載されている。
16SアンプリコンサンプルとショットガンメタゲノミクスサンプルはSRAからダウンロードした。16SアンプリコンサンプルはDeblurを用いて処理し、その後qiime2を用いたVsearchを用いてGreenegenes2にマッピングした（文献68）。ショットガンメタゲノミクスサンプルは、Woltka69に続いてBowtie2を用いて、WoL2に取り込まれた細菌全ゲノムにマッピングされた。ウイルス量は、GPDとBWAを用いてショットガンメタゲノミクスサンプルから抽出した。RNA発現データはrecount3（文献67）から直接入手した。4つのメタボロミクスデータセットは著者から提供された。
年齢と性別のマッチングを可能にするため、年齢と性別の共変数を用いてASD患者と神経健常者の二分割マッチングを行った。この方法は症例対照マッチングに最適であることが示されている70。マッチングできなかった個体はメタ解析から除外された。16SとSMSのデータセットの中には、複数の縦断的データセットがあった。これらのデータセットを横断解析に統合するため、各個人について最初のタイムポイントのみを選択した。
差異順位分析
マイクロバイオーム研究やその他のオーミック研究を評価するための最も一般的なアプローチのひとつは、微生物分類群、ヒト代謝産物、その他のオーミック特徴の症例と対照の間の存在量の差を決定することである。このような存在量の差の解析は、一般的に症例群と対照群間の対数倍変化を計算することによって行われる21。しかし、性、年齢、地理に関連するバッチ効果、組成性、高次元性、過分散性、スパース性などの交絡因子は、差分存在量の信頼性の高い推定を妨げ、その結果、従来のメタアナリシスのように、研究間でこれらの差分存在量を並べて比較することに支障をきたした。ここでは、ASDに特異的なオミックスシグナルを包括的に明らかにするのに役立つ、選択的な交絡因子をコントロールするための一般化可能なアプローチを開発することで、従来のメタ解析に内在するこれらの限界を克服することを目指した。
交絡因子の影響を最小化するために、我々は、各データセット内のASD個体と対照個体の年齢ベースおよび性別ベースのペアリングを最適化するために、二分割マッチングを使用するベイズ差分ランキングアルゴリズムを開発した。このアプローチは、潜在的な年齢と性別の交絡因子をコントロールすると同時に、サンプル収集方法、サンプル処理プロトコール、異なるプライマー、地理的出所などのバッチ効果を最小化するのに役立った71。我々のアプローチは、プロトコールバイアスの乗法的性質に関する最近の洞察を活用することによって、これを行うことができた18。フォールドチェンジの計算は、同じプロトコールで処理されたサンプルだけでフォールドチェンジが計算されるのであれば、プロトコールによって誘発されるバイアスに対してロバストに設計することができる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーの違いによって誘発されるバイアスに関しても、同じプロトコルで作成されたデータセットに限定して比較する限り、存在量ベースのベータ多様性メトリクスはプライマーのバイアスに対してロバストであるという同様の見解がある71。われわれはこの戦略を、年齢と性別のマッチングを扱うように拡張し、われわれが解析したコホートのほとんどが、参加者の年齢と性別がマッチするように選択されているという事実を利用した。16SデータセットとSMSデータセットにおける症例-対照ペアのほとんどは1年以内の間隔であり、下流の解析において年齢に関連した交絡因子を除去する機会を提供した。ベイズモデルは、Stan72を用いたマルコフ連鎖モンテカルロ法（MCMC）でフィッティングした。概念的には、これによって年齢が一致した個体と性別が一致した個体間の微生物のlog fold changeの差を計算することができたが、絶対的な存在量の情報がなかったため、このlog fold changeは定数73までしか推定できなかった（補足情報）。
私たちが提案した存在量の差分戦略がシーケンスの深さに対してどの程度敏感であるかを調べるために、シミュレーションベンチマークに加えてレアファクションベンチマークを実施した。16S横断コホートデータの希釈化されていないデータ（平均シーケンス深度がサンプルあたり200,000リード以上）と希釈化されたシーケンスカウントデータ（サンプルあたり9,000リードまで）を比較したところ、希釈化されていないログフォールド変化と希釈化されたログフォールド変化の間に強い一致が見られました（Extended Data図2e）。このことは、私たちが開発したアバンダンス差分法がスケール等変量であり、シーケンシングの深さが変わっても平均ログフォールド変化の推定値に大きな影響を与えないという理論的根拠を裏付けるものであった。
これはシミュレーションベンチマークでさらに検証され、私たちのモデルは年齢と性別が一致したコホートからの16S差分に基づいて、真実のログフォールド変化を捉えることができることが示された（Extended Data図2f）。年齢と性別が一致した差分ランキング法をANCOM-BCおよび年齢と性別が一致しない差分アバンダンス法（これをグループ平均差分ランキングと呼ぶ）と比較し（拡張データ図2i-k）、これらの手法の違いを示した。このベンチマークは、16Sコホート解析から得られたデータ駆動型シミュレーションを用いて行った。(1)症例-対照差のみ['formula=disease status']、(2)年齢と性別の交絡因子で調整した症例-対照差['formula=disease status + age + sex']、(3)年齢と性別のマッチングによる症例-対照差['formula=disease status + (disease status-age sex matching IDs)']。最初の構成は、われわれの「標準群平均差分ランキング」との直接的な比較対象となり、3番目の構成は、われわれの「性・年齢マッチング差分ランキング」との最も直接的な比較対象となった。3つのANCOM-BCモデルのいずれも、我々のシミュレーションではグランドトゥルースの対数フォルド変化を回復することができなかった（それぞれ、実装1、2、3でr = 0.38、0.37、0.39）のに対し、「標準群平均差分ランキング」と「性・年齢マッチ差分ランキング」モデルはともにグランドトゥルースを回復することができた（それぞれr = 0.64と0.79）。結局のところ、これは我々の方法がいかに年齢と性別のマッチングを考慮し、仮定が満たされていれば期待通りの性能を発揮できるかを示している。
他のシミュレーションに基づくベンチマークと同様に、これは我々の手法の性能向上を示す厳密なベンチマークではなく、むしろ3つの手法がいかに異なる仮定を持っているかを示すものである。どのような生物学的シナリオにおいて、年齢と性別のマッチングが世帯のマッチングよりも情報量が多いかを決定するために、世帯の交絡因子と年齢の交絡因子の両方を組み込んだ別のシミュレーションを作成した。被験者の年齢と年齢差は、Davidら37.で観察された年齢分布からサンプリングした。前回のシミュレーションと同様に、16Sコホート解析のモデルを用いて、真実のlog fold changeをシミュレーションした。ここでは、十分に大きな年齢の交絡因子がある場合、家計マッチングは顕著に大きなバイアス（平均二乗誤差= 589.3）でlog fold変化を推定することが観察された（Extended Data Fig.） 対照的に、年齢と性別のマッチングでは、真実の対数倍変化を正確に推定することはできませんでしたが、バイアスは10倍減少しました（平均二乗誤差=57.8）（拡張データ図6f）。このシミュレーションでは、推定値の分散が増加する代わりに、コホートのランダム化が年齢交絡によってもたらされるバイアスを緩和する役割を果たす可能性があることも示された。
我々の提案する豊度差戦略がバッチ効果に対してどの程度敏感であるかを調べるために、MBQC研究31の2つのサンプル、「sample4」と「sample6」の間の対数倍変化を、各処理研究室について計算した。これらのサンプルは複数のラボで複製・処理され、バッチ除去法を検証するための実験セットアップを提供した。Bray-Curtis PCoAは、サンプル名では弱い分離を示しているが、処理プロトコルの違いによって誘発されるバッチ効果による強い分離を示している。しかし、各処理研究室のlog fold changeを比較すると、強い一致（r > 0.5, P < < 0.05）が見られ（Extended Data Fig.6m）、処理プロトコールが研究内で一貫している限り、研究内のfold change計算はバッチ効果に影響されないというMcLarenら18の主張を支持している。
年齢をマッチさせたペアと性をマッチさせたペアの間に有意差があるかどうかを判定するために、モデルの不確実性推定を用いて効果量の指標を構築した（詳細は補足方法を参照）。16S、SMS、RNA-seqの各データタイプのグローバルモデルを用いて、各データタイプ間で年齢が一致した症例-対照ペアと性が一致した症例-対照ペアの間に有意差があるかどうかを判定した。16S、SMS、RNA-seqデータセットでベイズモデルフィットを評価したところ、モデルフィットはRhat値1.1以下、ESS値300以上を達成し、事後分布からのドローが信頼できることを示した。
年齢適合および性適合分類器は、コホート間で一般化する分類器を構築するために構築され、年齢適合および性適合の症例-対照ペアを一貫して区別する微生物を同定した。年齢・性適合分類法を構築するために、年齢・性適合16Sコホート内でベイズモデルを当てはめ、分類群を3つのグループに分類した： ASD関連、コントロール関連、ニュートラルである。事後サンプルの70％が0より大きい場合、その分類群はASD関連グループに割り当てられ、事後サンプルの70％が0より小さい場合、その分類群はコントロール関連グループに割り当てられた。各グループに分類群を割り当てた後、各サンプルについて、各グループ内のすべての分類群の存在量の幾何平均をとることで、単一の対数比（balance15）を計算します。コホート間で一般化できる単一の対数比を作成するため、少なくとも2つの研究でASDに関連すると思われる分類群についてはASD関連群に割り当てた。同じ手順をコントロール関連グループにも適用した。図2cに、年齢と性別が一致したコホートについて、症例-対照ペア間のこれらの対数比の差を示す。このアプローチはショットガンメタゲノミクスのデータセットには適用しなかったが、16Sデータセットから構築された対数比も、ASD-対照サンプルの70％以上を分離しており、追加のクロスバリデーションとして機能していることが示された。
ある微生物が2つのサンプルグループ間で増加しているか減少しているかを判断するためには、どの微生物グループが安定しているかを特定する参照フレームが必要である。ベイズモデルを用いてこれを行うには、log fold changeの事後分布から推定される分位数が使用される。事後サンプルの95%でlog fold changeが0より大きい場合（5% log fold change quantile > 0）、その微生物は有意に増加したと言われる。最後に、事後分布の90%分位数が0と重なり、事後分布の標準偏差が3より小さい場合、微生物は安定していると言われる。同様に、log fold changeが事後サンプルの95%で0より小さい場合（95% log fold change quantile < 0）、微生物は有意に減少していると言われる。FMT分析における参照枠は、年齢および性別が一致した分類器によって中立または対照に関連すると同定された微生物を使用し、これらの分類群の平均存在量は2年間の追跡調査全体を通して安定しているという仮定を置いた。FMT解析では同じマッチング戦略を用いたが、年齢と性別でマッチングする代わりに、異なるタイムポイントを比較するために被験者でマッチングを行った。コアマイクロバイオームとなる微生物を特定する際には、0と重複し、事後標準偏差が3未満の分類群に注目した。同様に、横断コホートとFMT後に枯渇した微生物との重なりを計算する際には、事後標準偏差が3未満で不確実性の低い分類群に注目した。
図2bに示すヒートマップは、各症例-対照ペアの対数倍変化を表示したものである。このために、ロバストな中心対数比（CLR）変換を行い、可視化の目的ですべてのゼロを平均存在量にインプットした。その後、各症例-対照ペアについて、症例-対照の対数倍変化を計算した。
ベイズ差分ランキング
概念的に、差分分析の目的は、以下の帰無仮説を評価することによって、条件Aと条件Bの間の与えられた特徴iの存在量の変化について声明を出すことである：
$$\frac{{A}{i}}{{B}{i}}=1$$
しかし、ほとんどのオミックスデータセットでは、AiとBiの絶対量や微生物負荷の総量は直接観測できない、 p}{A}{i}}）、及び、それぞれ（｛p}{B}{i}}）の各データセット内の割合の観測のみであり、これらはバイアス項｛｛｛frac｛N}{A}｝｛｛N}{B}｝｝｝｝によって決定される。このバイアス項は
$$\frac{{A}{i}}{{B}{i}}=\frac{{p}{{A}{i}}{N}{A}}{{p}{{B}{i}}{N}{B}}=\frac{{p}{{A}{i}}}{{p}{{B}{i}}}\frac{{N}{A}}{{N}{B}}$$
は、NAとNBの変化に対する全体的な寄与を明確に定量化できないため、組成オミックスデータセットを解析するモデルでは調整できない高いFDRをもたらす74。従来のFDR補正を行うことなく、総バイオマスバイアスを回避するために、絶対的な変化量の大きさとは無関係に、対数倍変化量によってオミックスフィーチャーを並べ替えることができるランキングアプローチを採用した73。バイオマスバイアスはデータセット内のすべての生物種に等しく影響するため、ランキングアプローチはこのバイアスを無視し、アプローチをスケール不変にする（式1）。
$${{{\rm{rank}}}}\left(\frac{A}{B}\right)={{{\rm{rank}}}}\left(\frac{{p}{A}{N}{A}}{{p}{B}{N}{B}}\right)={{{\rm{rank}}}}\left(\frac{{p}{A}}{{p}{B}}\right)$$
我々が設計した全体的なモデルは、解析に含まれる各研究の実験デザインを活用して、研究固有の特徴摂動プロファイルを決定し、それを他の研究の正規化摂動プロファイルと組み合わせてグローバルな差分摂動解析を実行できる、カスタマイズされた差分アバンダンスツールで構成されていた。全体的なモデルは次のような構造であった：
begin{array}{rcl}{y}{i,˶,˶}& \sim &{{rm{NegativeBinomial}}}({lambda }{i,˶,˶},{alpha }{ij})∕=&log {N}{i}+{C}{k(i),˶,j}+{D}{j}{{{{rm{I}}}}[i=ASD]∕=&log {N}{i}+{C}{k(i),˶,j}+{D}{j}{{{{rm{I}}}}[i=ASD]∕=&log
ここで、yi,jはd種にわたる種jのサンプルiにおける微生物カウントを表し、λi,j,αijは種jの期待カウントを表し、サンプルi,jは微生物固有の過分散項を表し、Niはシーケンス深度を表す（自己正規化、希薄化の先取り）； Ck(i),jはk(i)対照被験者（年齢マッチ、性別マッチ）における種jの対数割合を表し、DjI[i = ASD]は対照被験者とASD被験者間の対数変化差を表し、iがペアになったASD被験者に対応する場合は1に等しく、iが対照被験者に対応する場合は0に等しい補正関数を持つ。Niをモデルに組み込むことで、モデルは自己正規化され、希薄化に依存しなくなり、Ck(i),jは、与えられたペアkの年齢マッチングと性別マッチングの要素を組み込む。
begin{array}{rll}{alpha}{ij}&=&frac{{a}{0,k(i),˶,j}}{{lambda}{ij}}+{a}{1,k(i),˶,j}+{beta }{p}quad {a}{0} \sim {{rm{LogNormal}}}(0,1)}} && {a}{1}. {a}{1} &sym& {{beta }{p} &sym& {{rm{Normal}}}({beta }{mu },{beta }{sigma }){quad{beta }{mu } }. \Ⱚ {{rm{Normal}}}(0,3)Ⱚ && {beta }{sigma }. &sim & {{rm{Normal}}}({C}{mu }{j},{C}{sigma }{j}){{quad{C}{mu }{j}}. \D}{j} &sim& {{rm{Normal}}}(0,3)㎤$。
ここでは、各微生物、各バッチ、ASD群とコントロール群について過分散パラメータを推定しています。このアプローチはDESeq2から採用されたもので、過剰分散を存在量に関して線形項と2次項の両方でモデル化することができます。さらに、このパラメタリゼーションは、以下の理論的根拠により、組成の解釈を可能にします。オフセット項を持つポアソン分布は多項分布に近似することが知られている。さらに、負の二項分布はガンマ-ポアソン分布として再パラメータ化することができ、ポアソン分布に固有の平均-分散関係を壊すことによって、過剰分散のモデル化を可能にする。
年齢と性別をマッチさせた差分豊度は、ペアのt検定やウィルコクソン検定などのペア検定と同様の方法論を持っている。このため、FMTデータセットの解析にもこの差分豊度法を用いた。ここでは、被験者のペアをマッチさせる代わりに、タイムポイントのペアをマッチさせ、それぞれのタイムポイントのペア間の存在量の差を計算した。これらの差分を比較できるようにするため、対照群との関連が検出された共通の分類群を選択した。具体的には、横断コホートで対数倍変化が0未満であった分類群をこの参照セットに割り当てた。推定されたlog fold変化は、参照データセットにおける平均log foldを中心に、以下のように調整された：
$${{{{\boldsymbol{D}}}}}^{* }={{{\boldsymbol{D}}}}-{\bar{{{{\boldsymbol{D}}}}}}{R}$$
ここで、{bar{{{boldsymbol{D}}}}{R}}は参照分類群のlog fold changesの平均を表し、D*は最近接log fold changesを表す。こうすることで、すべてのタイムポイントが同じリファレンスを持ち、より直接的に比較できるようになります。
これはDがコホート内でのみ計算され、その結果コホート特有のバッチ効果が軽減されるからです。提案されたモデルのもう1つの利点は、負の2項モデルが各微生物について独立に適合できることである；その結果、ある微生物についての対数フォルド変化の推定値は、他の微生物の推定値に影響しない。このモデルはフィルタリング基準の選択に対して不可知論的であり、ある微生物をフィルタリングしても残りの微生物のlog fold change推定値に影響を与えないので、これは利点となりうる。さらに、この差分存在量モデルは、さまざまなタイプのオミックスデータに適用することができる。さらに、我々はベイズ環境で差分ランキングモデルを構築したため、結果の事後分布をサンプリングすることで不確実性を推定するMCMCアプローチを使ってモデルを当てはめることができた。
例えば、推定された事後確率分布 p(D∣ y) の値について声明を出すには、以下の近似を用いて平均値を計算することができます：
$${\mathbb{E}}[D]\approx \frac{1}{m}\mathop{\sum }\limits{i=0}^{m}{\hat{D}}{i}\quad {\hat{D}}{i} \sim p(D| ,y)$$.
i の N サンプルを事後分布 p(D∣y) から抽出するこの古典的な MCMC サンプリングの応用により、事後差分存在量分布の真の平均とそれに対応する効果量を近似することができました。これにより、大域的な差異が検出されたかどうかを判断する効果量指標を計算することができる。この指標はPERMANOVAに類似しているが、年齢と性を一致させたデザインを使って対数倍変化から計算するものである。効果量Eは次のように測定される：
E=frac{| | {{mu }{D}| {| }{2}}}{{r}{D}},\quad {mu }{D}=frac{1}{m}mathop }sum }limits_{i=0}^{m}{hat{D}}{i}quad {r}{D}=mathop{max }limits_{hat{D}}{i} \Γsim p(D| y)}parallel | {{hat{D}}{i}-{mu }{D}parallel {| }{2}$
ここで，μDは事後分布の平均，rDは事後分布からのすべての標本を含む球の半径を表す．効果量が1より大きい場合、それは0が事後分布に含まれず、差が有意であることを意味する。ベイズの P 値は、事後分布 p(D∣y)からシミュレートされたΓ({@hat{D}}{i}} のドロー数から計算される。例えば、事後分布から 100 回の抽選を行い、その 100 回の抽選から推定される球の中に 0 がなければ、 P < 0.01 で有意に 0 と重なっていないと言える。
その他の手法
q2-sample-classifier68を用いて、10個の16Sデータセットと3個のSMSデータセットに勾配ブースティング分類器をあてはめた。サンプルを80/20のトレーニング用とテスト用にランダムに分割し、最適なモデルパラメータを得るためにトレーニング用データセットで5倍のクロスバリデーションを行い、保持したテスト用データセットで予測値を計算した。PERMANOVAとBray-Curtis距離を用いて、家庭、年齢、性別による交絡変動が兄弟コホートにおいて統計的に有意であるかどうかを決定した。
MMvec73を用いて、食事と微生物の共起分析を行った。ここでは、微生物を用いて食事摂取量を予測した。この解析により、条件付き確率、すなわち、微生物がすでに観察されていると仮定した場合の食事化合物の観察確率を推定することができた。これらの条件付き確率を推定するために、MMvecは行列因数分解を行い、これらの相互作用において最も多くの情報を説明する因子を特定する。我々は、MMvec微生物因子と横断的対数倍変化を比較した。次に、MMvecの食事因子と、ASD児と健常児の食事成分の違いを測定するt統計量を比較した。
ウイルスと微生物の相互作用の候補を同定するために、SMSデータセットのそれぞれについてMMvecを実行した。そして、各微生物について、条件付き対数確率が1より大きい上位の共起ウイルス分類群を抽出し、78,580の微生物-ウイルス相互作用とした。次に、Gut Phage Database（GPD）44に存在しない微生物-ウイルス相互作用を除外し、31,276の微生物-ウイルス相互作用を残した。Danら28およびWangら33が推定した微生物-ウイルス相互作用は、弱い一般化可能性を示した（Q2 =0.0036 > 0およびQ2 =0.0114 > 0）。しかし、Averina et al.34から推定された微生物-ウイルス相互作用は、ランダムな偶然に近いものであった（Q2 = -0.005）。
Songbird15を用いて、サイトカインを用いて微生物量を予測する多項回帰によりサイトカイン-微生物解析を行った。サイトカイン濃度差に関して、偏った微生物対数倍変化を報告した。ピアソン相関を用いて、16S断面の微生物差と微生物-サイトカイン差の一致を判定した。これらの微生物量とサイトカイン濃度を直接結びつけるために、各サンプルについて微生物の対数比（バランス）を計算した。例えば、IL-6の場合、分子はIL-6濃度が増加したときに最も存在量が増加すると推定される上位50種類の微生物で構成され、分母はIL-6濃度が増加したときに最も減少すると推定される下位50種類の微生物で構成された。これらのパーティションが定義されると、各サンプルのバランスは、分子グループと分母グループの平均存在量の対数比を取ることによって計算される15。これらのバランスとサイトカイン濃度の間のピアソン相関を計算し、微生物の存在量とサイトカイン濃度の一致を測定した。
主要な微生物遺伝子を同定するために、我々は比較ゲノム解析を行い、ショットガンメタゲノミクスデータ中の微生物ゲノムをASD被験者と関連するものと対照被験者と関連するものにビン分けした。ASDと強く関連する微生物、具体的にはASDで濃縮されると推定される分類群の10％より有意に多い微生物に焦点を当てた。二項検定を用いて、特定の遺伝子がランダムな偶然よりもASDに関連する微生物でより一般的に観察されるかどうかを判定することができた。その結果、ASDに関連する微生物ゲノムと神経型に関連する微生物ゲノムを区別する、統計的に有意な微生物遺伝子が2,176個同定された。同様に、ASD被験者と神経型被験者で発現が異なるヒトの転写物を1,570個同定した。その後、有意な微生物遺伝子とRNA転写物をKEGGパスウェイにマッピングした。対照的な2つのオミックスレベルを直接比較し、代謝の類似性を測定するために、微生物とヒトのパスウェイの両方に関与するすべての分子を検索し、それらの交点を計算した。メタボロミクスデータセットはシーケンスのカウントデータのように離散的な値ではないため、元の論文で強調されている参照フレームを使用して、メタボロミクスデータセットを加法対数比（ALR）変換しました。次に、各コホート内の年齢および性別が一致したメタボロミクスサンプルについて、個別にWilcoxon検定を行いました。解析の結果、P値0.05の閾値を下回る代謝物が複数見つかりましたが、FDR補正後の閾値を通過した代謝物はありませんでした。
報告概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryをご覧ください。
データの利用可能性
本研究は、これまでに発表された16S22,23,24,25,27,28,29,37,38,52,36、メタゲノミクス28,33,34、RNA-seq59,60,61,62、メタボロミクス48,49,50のデータに基づいている。(Martin-Brevetら38の16Sシーケンスデータは、アクセッション番号ERP147524で入手可能）。すべての処理済みデータセットと調和されたメタデータは、Zenodoの10.5281/zenodo.7877350およびGithubのhttps://github.com/mortonjt/asd_multiomics_analyses。
コードの利用可能性
我々のベイズ型年齢・性別適合差分ランキングアルゴリズムのソフトウェア実装は、https://github.com/flatironinstitute/q2-matchmaker。グループ平均差分ランキングアルゴリズムは、https://github.com/mortonjt/q2-differential。最後に、我々の解析スクリプトはhttps://github.com/mortonjt/asd_multiomics_analyses。Matplotlib, Seaborn, Scipy, Numpy, Xarray, Arviz Scikit-learn, biom-format, Scikit-bioは、この研究の基盤となるソフトウェアを提供してくれた。
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参考文献のダウンロード
謝辞
J.T.M.はユニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健・人間発達研究所（NICHD）の学内研究プログラムの助成を受けた。Y.S.とT.D.L.はWellcome Trust（WT206194）の支援を受けている。M.W.は中国国家自然科学基金（プログラム番号82071733）および上海人材開発基金（番号2020115）の支援を受けている。E.E.はイスラエル科学財団（Israel Science Foundation）の助成金818/17およびアズリエリ医学部（Azrieli Faculty of Medicine）の支援によるテバ・ファーマシューティカルズ（Teva Pharmaceuticals）の研究助成金の支援を受けている。O.K.は、欧州連合（EU）のHorizon 2020 Research and Innovation Program（助成金協定ERC-2020-COG番号101001355）に基づく欧州研究会議（ERC）の支援を受けている。A. Packer、P. Wang、N. Volfovsky、K. Martin、J. Spiroの批評に感謝する。Greengenes2 および Web of Life データベースの構築についてご意見をいただいた S. Mirarab に感謝する。A.Amir氏には、GetDataソフトウェアパッケージを用いたショットガンメタゲノミクスおよび16Sシーケンスデータの処理に関する知見をいただいた。また、K. Liu、H. Sherman、X.-J. Kongには洞察に満ちた議論をいただいた。
著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： James T. Morton、Gaspar Taroncher-Oldenburg。
著者および所属
計算生物学センター、フラットアイアン研究所、サイモンズ財団、ニューヨーク州、米国
ジェームズ・T・モートン、ボブ・カーペンター、リチャード・ボノー
ユニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健・人間発達研究所生物統計学・バイオインフォマティクス部門、米国メリーランド州ベセスダ、国立衛生研究所
James T. Morton
ゲノミクス・システム生物学センター、ニューヨーク大学、生物学部、ニューヨーク州、USA
ジン・ドンミン、リチャード・ボノー
米国マサチューセッツ州ウォータータウン、プレシディアグ社
ロバート・H・ミルズ
ウェルカム・サンガー研究所（英国・ヒンクストン）、宿主-微生物叢相互作用研究室
ヤン・シャオ & トレバー・D・ローリー
バイオインフォマティクス＆システムバイオロジー・プログラム、カリフォルニア大学サンディエゴ校（米国カリフォルニア州ラホーヤ
ギブラーン・ラーマン＆メティン・バラバン
米国カリフォルニア大学サンディエゴ校ラホヤ校医学部小児科
ギブラーン・ラーマン、ダニエル・マクドナルド、カレン・カントレル、アントニオ・ゴンザレス、ロブ・ナイト、ジャック・A・ギルバート
アリゾナ州立大学生命科学部（米国アリゾナ州テンピ
Qiyun Zhu
アリゾナ州立大学バイオデザインセンター（米国アリゾナ州テンピ
Qiyun Zhu
カリフォルニア大学サンディエゴ校電気・コンピューター工学科（米国カリフォルニア州ラホヤ
Yueyu Jiang
カリフォルニア大学サンディエゴ校（米国カリフォルニア州ラホヤ）ジェイコブス工学部コンピューターサイエンス・エンジニアリング学科
カレン・キャントレル＆ロブ・ナイト
アズリエリ医学部、バー・イラン大学、サフェド、イスラエル
ジュリー・カーメル、リノイ・ミーア・フランキンズタイン、オムリ・コレン、エヴァン・エリオット
スイス、ローザンヌ、ローザンヌ大学大学病院臨床神経科学部神経科学研究センター神経画像研究室
サンドラ・マルティン・ブレヴェ
米国イリノイ大学アーバナ校栄養科学部
キルステン・ベルディング、シャロン・M・ドノバン
スターク神経科学研究所、インディアナ大学医学部、インディアナポリス、USA
ブリタニー・D・ニーダム
インディアナ大学医学部 解剖学・細胞生物学・生理学教室 （米国・インディアナ州・インディアナポリス
ブリタニー・D・ニーダム
エクアドル、キト・サンフランシスコ大学微生物学研究所・健康科学カレッジ
マリア・フェルナンダ・ズリタ
米国オレゴン州コーバリス、オレゴン州立大学微生物学・薬学部
モード・デイヴィッド
ロシア科学アカデミー・ヴァヴィロフ一般遺伝学研究所（ロシア・モスクワ
オルガ・V・アヴェリーナ、アレクセイ・コフトゥン、ヴァレリー・N・ダニレンコ
スコルコボ科学技術研究所（ロシア、スコルコボ
アレクセイ・コフトゥン
イタリア、カリアリ、カリアリ大学医学部生物医学科
アントニオ・ノト
イタリア、カリアリ、カリアリ大学医学部外科学研究室
ミケーレ・ムサップ
復旦大学小児病院新生児科、国立小児保健センター、中国・上海市、先天異常上海重点実験室
王明博・周文浩
深圳大学健康科学センター華南病院マイクロバイオーム治療センター（中国・深圳
王明博
米国コロラド州オーロラ、コロラド大学アンシュッツ・メディカル・キャンパス医学部
ダニエル・N・フランク
米国ニューヨーク州ストーニーブルック、ストーニーブルック大学、消化器・肝臓内科
エレン・リー
新生児集中治療室および新生児病理学、カリアリ大学医学部外科学教室、イタリア、カリアリ
ヴァシリオス・ファノス
スタンフォード大学小児科（システム医学）、生物医学データ科学、精神医学・行動科学（米国カリフォルニア州スタンフォード市
デニス・P・ウォール
微生物学研究所、COCIBA、サンフランシスコ・デ・キト大学、エクアドル、キト
パウル・カルデナス
エクアドル・キト、エクアドル国際大学、医学・健康・生活科学学部
マヌエル・E・バルデオン
サント・ジュスティーヌ病院研究センター（カナダ、QC州モントリオール
セバスチャン・ジャクモン
モントリオール大学小児科（カナダ・QC州モントリオール
セバスチャン・ジャックモン
レスリー＆スーザン・ゴンダ学際脳研究センター（イスラエル・ラマットガン、バー・イラン大学
エヴァン・エリオット
ブロード研究所（マサチューセッツ工科大学・ハーバード大学、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
ラムニック・J・ザビエル
米国マサチューセッツ州ボストン、マサチューセッツ総合病院分子生物学科
ラムニック・J・ザビエル
米国マサチューセッツ州ボストン、マサチューセッツ総合病院、炎症性腸疾患研究センター
ラムニック・J・ザビエル
カリフォルニア工科大学生物学・生物工学部（米国カリフォルニア州パサデナ
サルキス・K・マズマニアン
米国カリフォルニア州ラホヤ、カリフォルニア大学サンディエゴ校生物工学部
ロブ・ナイト
カリフォルニア大学サンディエゴ校マイクロバイオームイノベーションセンター（米国カリフォルニア州ラホヤ
ロブ・ナイト＆ジャック・A・ギルバート
スクリプス海洋研究所、カリフォルニア大学サンディエゴ校、ラホヤ、カリフォルニア州、USA
ジャック・A・ギルバート
米国ニューヨーク州ニューヨーク、ジェネンテック・アクセラレーター、プレシエント・デザイン
リチャード・ボノー
ギャスパー・タロンチャー・コンサルティング（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア
ギャスパー・タロンチャー・オルデンバーグ
サイモンズ財団自閉症研究イニシアチブ、サイモンズ財団、ニューヨーク州、米国
ギャスパー・タロンチャー・オルデンバーグ
貢献
J.T.M.とG.T.-O.は本研究の着想と設計、ソフトウェアパッケージq2-matchmakerの開発、データ解析、結果の解釈、原稿執筆を行った。R.B.は研究デザイン、データ解析、結果の解釈に貢献した。R.H.M.は研究デザイン、データ解析、原稿編集に貢献した。R.J.X.とS.K.M.は試験デザインに貢献した。G.R.とB.C.はソフトウェア開発と原稿編集に貢献した。D.M.、Q.Z.、K.C.、A.G.、M.B.およびY.J.はGreengenes2およびWeb of Life 2データベースに貢献した。D.-M.J.およびY.S.はデータ解析に貢献した。K.B.、B.D.N.、M.F.Z.、M.D.、O.V.A.、A.S.K.、A.N.、M.M.、M.W.、J.C.、S.J.、S.M.-B.、O.K.、E.E.、D.N.F.、E.L、 W.Z.、V.F.、V.N.D.、D.P.W.、M.E.B.、R.K.、J.A.G.、S.M.D.、T.D.L. J.C.とM.F.Z.はデータへのアクセスを提供した。すべての著者が原稿の編集に貢献した。
責任著者
Gaspar Taroncher-Oldenburg宛。
倫理申告
競合利益
R.H.M.はPrecidiag, Inc.の科学ディレクターである。T.D.L.はMicrobiotica社の共同設立者兼最高科学責任者。S.K.M.は、Axial Therapeutics社の共同設立者であり、同社に出資している。R.J.X.は、Celsius TherapeuticsおよびJnana Therapeuticsの共同設立者であり、Nestle社の科学諮問委員会のメンバー、Moonlake Immunotherapeutics社の取締役会のメンバーです。R.B.は現在、ジェネンテックのアクセラレーターであるプレシエント・デザインのエグゼクティブ・ディレクター。J.T.M.はGutz Analyticsの創設者であり、Integrated Omics AIの共同創設者でもある。G.T.-O.はサイモンズ財団のコンサルタント・イン・レジデンス。残りの著者は、競合する利害関係はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Neuroscience誌は、本論文の査読にご協力いただいた匿名査読者に感謝いたします。
その他の情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図および所属機関に関する管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
図1 研究アプローチ。
メタゲノム配列データは、絶対的な微生物量の決定を妨げる総微生物負荷量の測定の欠如と、メタゲノムが不完全に表現される結果となるサンプリングおよび配列決定深度の制限によってもたらされる限界のために、定量化というユニークな課題を抱えている。我々は、ベイズ差分ランキングアルゴリズムを考案し、これら2つの課題、すなわち組成の課題とゼロ・インフレーションの課題に対処した。組成の課題： ほとんどのシーケンスカウントデータセットには、体積あたりの細胞数、コロニー形成単位、転写産物の絶対量情報がない。この制限はlog fold change（LFC）の信頼性の高い推定を妨げ、絶対存在量の変化の大きさによっては過剰な偽陽性や偽陰性につながる可能性がある組成データの特徴である15。パネルa)～c)に示すように、微生物数(a)は通常、比例存在量(b)に変換され、対数倍比の計算に使用される。フォールドチェンジの計算には、一般式( \frac{B}{A}=frac{{N}{B}{p}{B}}}{{N}{A}{p}{A}}=frac{{p}{B}}{{N}{A}}times ⌈prac{N}{B}}{{N}_{A}}) を用いる、 ここで、AおよびBは比較される2つのサンプルを表し、pAおよびpBはAおよびBにおける微生物の割合を表し、NAおよびNBはAおよびBにおける微生物の総数を表します。シークエンシングカウントデータの主な限界は、シークエンシング深度の制約により、元のサンプル中の対応する絶対量に比例しないことです。NAとNBを観察できないことで、最終的に偽発見率（FDR）補正を行い、異なる存在量の微生物を同定できないバイアスが生じます。このバイアスは微生物個体数の変化に依存し、個体数のシフトが大きいと偽陽性率や偽陰性率が高くなり、全体的に歪んだ表現になります（c）。ゼロ・インフレーションの課題：サンプリングエラーと浅いシーケンシングは、特に存在量の少ない微生物に対して、不釣り合いに多いゼロカウントをもたらす（d）。ゼロカウントを明示的に扱うために、多項分布、ポアソン分布、負の二項分布が使用されてきた21。しかし、log 0は-∞であるため、ゼロカウント微生物の真のlog-fold変化を決定することができないため、あるグループのどのサンプルでも微生物が観察されない場合、log-fold差の推定には問題が残る(e)。ベイズ推論では、無意味なlog-fold変化の推定を防ぐ事前分布を導入することで、この問題を回避します（f）。具体的には、すべての微生物が観測される確率がゼロでないという丸めゼロの仮定を導入する。パネルhは、ディリクレ事前分布を使った場合のlog-fold変化の様子を示している。
拡張データ 図2 ベンチマーク。
(a-d)各微生物の総シーケンス深度（log10スケール）と比較した、微生物ごとのlog-fold変化の平均値と標準偏差。 e)希薄化ベンチマーク。微分存在量解析が希薄化の影響を受けないことを示す。(f) データ駆動型のシミュレートされた16Sデータセットから得られた存在量の差分推定。(g)11件の16S研究のうち7件（Kang et al52、David et al37、Son et al36を除く）のデータセットサイズに関して、標準的なグループ平均と比較した年齢と性別のマッチングアプローチの比較。x軸は集約されたデータセット数を表し、左パネルのy軸はモデル誤差を測定する平均R2指標である。(h)y軸は解析されたサンプル数、右図のx軸は集約されたデータセット数。(i-k)マッチングされた症例と対照の間のシーケンシングの深さに差があるデータセットをシミュレートしたもので、マッチングされた対照のシーケンシングの深さは常に症例のものよりも大きい。このベンチマークでは、ANCOM-BC、グループ平均差分ランキング、年齢性別マッチ差分ランキングが、どの程度グランドトゥルースのlog-fold変化を回復できるかを調査しています。(l-m)世帯マッチングと年齢-性マッチングを比較したシミュレーションデータセット。(l-n)MBQC31の4つの処理ラボで再現された2サンプルのBray-Curtis PCoA。(m)グループ平均化存在量差分分析を用いた、全4ラボにわたる2サンプル間のlog-fold変化の一対比較。
Extended Data 図3 本研究で解析したビローム、16S、SMS、およびRNAseqデータセットで観察された差異のあるランキング傾向。
差分存在量の多い上位10％の特徴を赤色で強調した。ビローム、16S、SMSデータセットのx軸は、フィーチャー数の違いを示すために同等である。RNAseqデータセットのx軸は10倍大きく、他の3つのデータセットと比較して、このデータセットのフィーチャー数の顕著な違いを示している。
Extended Data 図4 4つの研究にわたるメタボロミクスの差分ランキング分析。
一対のt検定を行い、代謝量の異なる代謝物を同定した。Needhamらの代謝物は、糞便代謝物と血清代謝物の両方で構成されている。どの代謝物もFDR補正を適用した後、有意なlog-fold変化は見られなかった。
Extended Data 図5 16SとSMSから計算したlog-fold変化の比較。
(a)Greengenes2にマッピングした後、横断データセットであるDan et al28のすべての16SおよびSMSサンプルにわたる分類群の割合の比較。 (b)両方のデータセットで観察された分類群にわたるDan et alの同じサンプルの16SおよびSMSから得られた差分の比較。ここでは信頼度の高い（標準偏差＜0.5）対数倍変化のみを示す。
Extended Data 図6 症例-対照マッチング間の年齢差。
(a)16S年齢-性マッチデータセット、(b)SMS年齢-性マッチデータセット、(c)David et al家庭マッチデータセット（16S）37、(d)Son et al家庭マッチデータセット（16S）36すべてのデータセットにおいて、対照被験者の年齢は対応するマッチしたASD被験者の年齢から差し引かれている。Davidら37もSonら36も、世帯間の年齢間の統計的な差は示さなかった。(e)推定された微生物のlog-fold変化と、世帯をマッチさせたシミュレーションにおけるground truthの微生物のlog-fold変化との比較。(f)年齢と性別を一致させたシミュレーションにおける、推定微生物のlog-fold変化量と地上真実の微生物のlog-fold変化量との比較。(g)年齢-性別マッチデータセットと兄弟姉妹マッチデータセットにおける1年以内の症例-対照ペアの割合。(h)年齢と性別が一致したデータセットと兄弟姉妹が一致したデータセットにおける、性別が同じである症例対照ペアの割合。
図7 MMvecを用いて推定された微生物-ウイルス共起ネットワーク。
微生物は赤、ウイルスは青で着色されている。微生物とウイルスが高度に共起しており、相互作用がGPDでアノテーションされている場合は、微生物とウイルスの間にエッジが描かれている。
図8 微生物と食餌の共起。
MMvecから推定された(a)第1主成分と(b)第3主成分によってソートされた微生物-食餌共出現ヒートマップ。
Extended Data 図9 SMSおよびRNAseqデータから検出されたASDおよび対照関連遺伝子におけるパスウェイの分布。
(a-b)SMSデータにおけるASDと神経型対照に関連するパスウェイの内訳。(e）マルチコホート横断解析から得られたASD関連KEGG酵素と、KangらFMT研究で減少した微生物に存在することが判明したKEGG酵素の重なり。 f）マルチコホート横断解析でKangらFMT研究とASD児の両方に見つかったKEGG酵素のパスウェイ分解。Kangらの研究では、SMSデータでも見つかった微生物のみが考慮された。
補足情報
補足情報
補足表1-3。
報告概要
補足表4-16
表S4： 各微生物の平均対数変化量、標準偏差対数変化量、90％信頼区間および分類を含む、16S差分の統計量の表。表S5：各微生物の平均対数変化量、標準偏差対数変化量、90％信頼区間、分類学を含むSMS差分の統計量表。表S6： RNA-seq差分の統計量の表。各転写物の平均対数変化量、標準偏差対数変化量、90％信頼区間を含む。表S7：各ウイルスの平均対数変化量、標準偏差対数変化量、90％信頼区間を含むウイルス差分の統計量表。表S8：年齢、性別、家庭による交絡変動を調べた、兄弟姉妹をマッチさせたコホートのPERMANOVAの内訳。表S9：サイトカインの違いによる微生物の対数倍数変化（各サイトカインの平均対数倍数変化を含む）。表S10: MMvecによって推定された微生物とウイルスの共起確率。最初の2列はt統計量と症例と対照の食餌嗜好の差を測定するP値。表S11：多重比較で補正した片側二項検定を使用して、ASD関連微生物ゲノムにおいて統計的に豊富であると決定された遺伝子およびその関連KEGGパスウェイのリスト。表S12：多重比較で補正した片側二項検定を用いて、ヒトで統計的に発現していると判定された遺伝子とその関連KEGGパスウェイのリスト。表S13：ASD関連微生物ゲノムに統計的に豊富に存在し、かつGBMに存在した微生物パスウェイのリスト。表S14: 重複代謝産物の数に加え、微生物とヒトのパスウェイの対のリスト。表S15: MMvecによって推定された微生物と食餌の共起確率。表S16：FMT研究の全個体にわたる、一対のタイムポイント間の微生物対数倍数変化。報告された対数倍変化は、横断解析で推定された参照枠を使用して計算された。
権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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Morton, J.T., Jin, DM., Mills, R.H. et al. 腸脳軸のマルチレベル解析により、自閉症スペクトラム障害に関連する分子および微生物プロファイルが示された。Nat Neurosci (2023). https://doi.org/10.1038/s41593-023-01361-0
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2022年11月11日受領
受理2023年5月13日
2023年6月26日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41593-023-01361-0
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テーマ
自閉症スペクトラム
データ統合
ゲノミクス
微生物学
ネイチャー・ニューロサイエンス (Nat Neurosci) ISSN 1546-1726 (online) ISSN 1097-6256 (print)
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