女性ホルモンによる腸内細菌叢の早期変調がアミロイド病態とミクログリア機能を変化させる

2024年1月22日 17:35

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出版：2024年1月21日
女性ホルモンによる腸内細菌叢の早期変調がアミロイド病態とミクログリア機能を変化させる

https://www.nature.com/articles/s41598-024-52246-6?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Piyali Saha, Ian Q. Weigle, ...Sangram S. Sisodia 著者一覧を見る
サイエンティフィック・リポーツ14巻、論文番号：1827（2024）この記事を引用する

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メトリクス詳細

要旨
アルツハイマー病の罹患者が女性に偏っていることはよく知られている。この性差の根底にあるメカニズムは完全には解明されていないが、性ホルモンの相互作用、遺伝的要因、腸内細菌叢など、しばしば関連するいくつかの因子がアルツハイマー病の病因に寄与している可能性が高い。ここでわれわれは、APPPS1-21マウスにおいて、Aβアミロイドーシスと神経炎症を媒介する性ホルモンと腸内細菌叢の役割を調べた。我々は、雌性APPPS1-21マウスにおける出生後の腸内細菌叢の摂動が、循環エストラジオールレベルの上昇につながることを報告した。早期の卵巣摘出（OVX）は、血漿中エストラジオールの減少をもたらし、これは腸内細菌叢組成の有意な変化およびAβ病態の減少と相関している。一方、OVX治療動物にエストラジオールを補充すると、Aβ負荷が回復し、腸内細菌叢の組成に影響を及ぼす。OVXによるAβ病態の軽減は、神経変性表現型（MGnD型）を獲得するプラーク関連ミクログリアのレベル低下と並行して起こるが、OVX処置動物にエストラジオールを補充すると、プラーク周辺の活性化ミクログリアが回復する。まとめると、我々の研究は、アルツハイマー病の病因における、性特異的ホルモン調節、腸内細菌叢動態、代謝擾乱、ミクログリア機能性の間の複雑な相互作用を解明するものである。

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はじめに
アルツハイマー病（AD）は、認知機能の低下、記憶喪失、行動変化を特徴とする神経変性疾患である。ADは男性に比べて女性に不釣り合いな影響を及ぼすが1、この著しい性差の根底にある分子的・細胞的メカニズムは十分に理解されていない。さらに、遺伝的およびエピジェネティックな因子もADの性差に寄与している可能性がある。例えば、遅発性ADの主要な遺伝的危険因子であるアポリポ蛋白質E4は、女性においてより高いリスクをもたらす2,3。さらに、性差に特異的なエピジェネティック修飾が遺伝子発現パターンに影響を及ぼし、ADに対する男女間の感受性の差に寄与している可能性がある4。

ADに関連する病態生理学的変化は、認知・行動症状が発現する数年前から始まることが知られている5,6。このことは、女性の場合、卵巣機能が停止する前の生殖期に、脳で発症過程が起こっている可能性を示唆している。卵巣機能は神経ネットワークに影響を及ぼし、周期的な変動を示すことが示されているが7,8、これらの機能が認知症の認知機能障害に寄与する根本的な病態生理学的基質に影響を及ぼすかどうかは依然として不明である。

われわれは以前、AβアミロイドーシスのAPPswe/PS1∆E9およびAPPPS1-21マウスモデルにおいて、抗生物質（ABX）を介した腸内細菌叢の形成異常が、雌マウスではなく雄マウスにおいてミクログリアの表現型の変化を通じてAβ沈着を減少させることを証明した9,10。脳の自然免疫細胞であるミクログリアは、遅発性ADに関連するリスク遺伝子を発現している11。さらに、現在のところ不明なメカニズムではあるが、腸内細菌叢はミクログリアの発達に性特異的な影響を及ぼす12。注目すべきことに、性ホルモンは腸内細菌叢の組成を調節し、その逆もまた同様であることが示されている13。これらの知見を発展させ、われわれは、生後間もない時期に循環する女性ホルモンの変化が、Aβアミロイドーシス、ミクログリアの表現型、および腸内細菌叢の組成に影響を及ぼすかどうかを検討した。

われわれの研究から、出生後のABXは循環エストラジオールの上昇をもたらし、幼若期の卵巣摘出（OVX）によって血漿エストラジオールを低下させると、Aβプラークの病理学的変化は有意に減少し、腸内細菌叢の組成は顕著に変化することが明らかになった。卵巣摘出マウスにエストラジオールを補充すると、プラーク負荷と腸内細菌叢の変化が回復した。さらに、卵巣摘出マウスにエストラジオールを補充すると、プラークに局在するMGnD型ミクログリア細胞14が回復した。RNAseq研究では、エストラジオール濃度の変動が、メスマウスの皮質組織における代謝過程や免疫プロファイルに関与するタンパク質をコードするmRNAレベルの変化と関連していることが確認された。このように、我々の研究は、AβアミロイドーシスモデルマウスにおけるAβ負荷、腸内細菌叢、自然免疫の制御におけるエストラジオールの多面的な役割を浮き彫りにした。

結果
抗生物質投与した雌性APPPS1-21マウスにおけるエストラジオールの循環レベル上昇
我々は、APPPS1-21マウスに高用量のABXカクテルを生後（P14-P21）投与したところ、腸内細菌叢に異常が生じたことを報告した10。ABXを投与した雌マウスの腸内細菌組成は、ビヒクルを投与したマウスと比較して顕著に変化していたにもかかわらず10。PlottelとBlaser13によると、「卵巣、副腎、脂肪組織で産生されたエストロゲンが血流にのって循環し、まず肝臓で代謝を受け、そこでエストロゲンとその代謝物が抱合されることはよく知られている。抱合型エストロゲンは、代謝によって水溶性分子に変換され、尿中または胆汁中に排泄され、体外に排出されます。胆汁中に排泄された不活性な抱合エストロゲンは、腸内の細菌種（「エストラボローム」）によって、微生物が合成したβ-グルクロニダーゼ（gmGUS）によって脱共役され、エストロゲンが循環中に再吸収される13。したがって、ABXが介在するディスバイオーシスは、循環エストロゲンを上昇させるような形でエストラボロームに影響を与えるのではないかと推測した。この仮説を検証するために、我々は超高感度GC-MS法を用いて、エストロゲン代謝物の中で最も生物学的に活性が高いと考えられている化合物であるエストロンとエストラジオールのレベルを調べた。その結果、ABXを投与した雌マウス（n = 5-7匹/群血漿プールサンプル）では、血漿中のエストラジオール濃度が、ビヒクル投与マウス（対照）の血漿中濃度と比較して、犠牲になった時点で上昇していた［Fig.） GC-MS分析では、化合物のフラグメンテーションによって、それぞれ特定の質量電荷比（m/z）によって特徴づけられる異なるイオン化フラグメントが生成され、分子「指紋」のような固有のパターンが形成される。我々の研究では、エストロン［図1B、パネルa］とエストラジオール［図1B、パネルb］について、クロマトグラム上の色のついた線がこれらのフラグメントに対応している。具体的には、エストロン断片は以下のように示される： 342（黒）、257（青）、218（緑）、73（赤）。同様に、エストラジオールについては、416（黒）、285（青）、129（緑）、73（赤）の断片パターンがある。このようにクロマトグラムを色分けすることで、化合物の正確な同定と定量が容易になり、分析の精度と特異性が高まる。図1Aのパネルaは、リテンションタイムとフラグメンテーションパターンの測定に使用したエストロン標準物質を示しています。曲線下面積の測定には、m/z比342のイオンを使用した。図1Aパネルc（対照）と図1Aパネルe（ABX）では、エストロンは検出されなかった。逆に、図1Aパネルbはエストラジオール標準物質を示しており、これも保持時間とフラグメンテーションパターンの確立に使用された。コントロール群（パネルd）とABX投与群（パネルf）の両方の血漿サンプルで検出されたm/zが416のイオンを測定に用いた。我々の分析では、コントロール群とABX投与群の両方の血漿サンプルで検出されたm/zのイオンを定量測定用に選択した。その際、GC-MS分析では「曲線下面積」（AUC）が重要な指標となる。AUCとは、クロマトグラムにおける時間または他の関連変数に対する化合物の強度のプロット下の面積のことである。これはサンプル中の化合物の濃度に正比例します。

図1
図1
APPPS1-21雌マウスを用い、エストロゲン代謝とそれに伴う腸内細菌叢の変化に対するABX投与の影響を調べた。(A) 生後14日目から21日目までのビヒクル（対照）および抗生物質（ABX）のマウスへの投与と、その後の血清および糞便分析のための犠牲を示す実験デザインのタイムライン。(B)血漿中のエストロゲン代謝物の代表的なGC-MSクロマトグラム： (a) Estrone_standard-リテンションタイムとフラグメンテーションパターンを確立するためのリファレンスとして使用され、イオン342は生曲線下面積で定量された；(b) Estradiol_standard-リテンションタイムとフラグメンテーションのリファレンスとしても使用され、イオン416は定量に使用された； (c) Estrone_control-検出可能なエストロンがないことを示す；(d) Estradiol_control-ベースラインのエストラジオールレベルを示す；(e) Estrone_ABX-エストロンが検出されないことを示す；(f) Estradiol_ABX-ビヒクル投与群と比較してABX投与マウスではエストラジオールレベルが上昇していることを示す。曲線下面積に基づく計算では、ビヒクル投与群と比較してABX投与マウスではエストラジオールレベルが上昇している。このデータは各群5-8匹のマウスの血清サンプルをプールして得られたものであるため、統計解析は行っていない。(C) 16S rRNA配列決定解析（n = 6マウス/群）を以下に示す： (a)棒グラフは、ABX投与マウスとビヒクル投与マウスの系統的差異を明らかにし、特にファーミキューテス（Firmicutes）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の存在量に注目した。(b)APPPS1マウスにおいて、ABX投与マウスはビヒクル投与マウスに比べ、ファーミキューテス/バクテロイデス（F/B）比の有意な増加が観察された（Wilcoxon検定、p = 0.0079）。(c) Unweighted-UniFrac PCoA plotは分散の40.8%を占め（permanova検定、p = 0.02）、有意なクラスタリング効果を示した。(d) 分散の46.1%を占めるBray-Curtis PCoAプロット（ペルマノバ検定、p = 0.002）は、明確で有意なクラスターを明らかにする。(D)ハイスループットのメタゲノミクス解析によって得られた棒グラフ（n = 5 mouse/group）は、Thy1-APPPS1雌マウスの対照群と比較したABX群における細菌種Dubosiella newyorkensisとLactobacillus johnsiiの存在量の増加を示している（不対スチューデントのt検定：t[7]=1.95、p = 0.0461）。ABX群におけるこれらの菌種の増加は、エストラジオールレベルの上昇につながると推測される。これらの細菌は、ファーミキューテス門のエストロゲン代謝に関連している。データは平均値±SEMで示し、有意水準は以下の通り： *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.

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さらに詳しく説明すると、対照群を表す図1Aのパネルdでは、エストラジオールのAUCを21として定量している。この値は、クロマトグラムのピーク下面積を積分することによって決定される、対照群における観察された期間中のエストラジオールの総濃度または存在を示している。逆に、ABX投与群を描いた図1Aのパネルfは、エストラジオールのAUCが41であることを示している。この高い値は、ABX投与群では対照群と比べてエストラジオールの存在または濃度が高いことを示唆している。したがって、これらのAUC値（21と41）は各群で検出されたエストラジオールの相対量を示しており、GC-MS分析を用いた対照群とABX投与群とのエストラジオールレベルの定量的比較が可能である。同様に、以前の研究で、広域抗生物質［スルファメトキサゾールとトリメトプリム］の組み合わせがエチニルエストラジオールの血漿中濃度を上昇させることが示されている15。重要なことは、雌のAPPPS1-21マウスにABXを投与すると、マイクロバイオームの多様性が大きく変化し［図1C、パネルa、c、d］、生け贄に捧げる時点（n = 6匹/群、p = 0.008）で、ビヒクル投与マウスと比較してFirmicutes/Bacteroidetes（F/B）比が有意に増加したことである［図1C、パネルb］。F/B比の変化は、エストロボロームの組成に影響を与えることが報告されている13。包括的なメタゲノム研究の助けを借りて、ABX群で有意に増加し、腸内微生物β-グルクロニダーゼ（gmGUS）を発現することが知られているファーミキューテス科の2つの細菌種、Dubosiella newyorkensis（n = 6 mice/group、p = 0.002）とLactobacillus johnsii（n = 6 mice/group、p = 0.04）を同定した［図1D］。ABX群でこれらの種のレベルが上昇すると、エストラジオールレベルが上昇することが示唆された。

雌性APPPS1-21マウスの卵巣摘出により、アミロイドプラーク負荷は有意に減少したが、エストラジオールの補充により病理学的状態は回復した。
Aβ沈着の調節におけるエストロゲンの潜在的役割を評価するために、我々は雌性APPPS1-21マウスの卵巣摘出を4-5週齢で行い、Aβ沈着が大脳皮質で顕著になる時期である3ヵ月で動物を犠牲にした［図2A］。子宮重量、体重、エストロゲン／プロゲステロン比という3つの重要な指標を調べることで、OVXが成功したことを検証した（図S2A）。エストラジオールやプロゲステロンなどの卵巣ホルモンは、エネルギーバランス、体組成、グルコースホメオスタシスの維持に極めて重要な役割を果たしている16。APPPS1-21雌マウスのOVXは、偽手術群と比較して体重の有意な増加（n = 12匹/群、p = 0.007）をもたらし（図2Sa）、代謝過程への影響の可能性を示している。OVXはまた、子宮重量の有意な減少（n = 7-8、p < 0.001）をもたらし（図2Sb）、ホルモン調節機能の低下を示している17。予測されたように17、OVXは偽手術群と比較して、循環エストラジオール／プロゲステロンレベルの有意な低下を引き起こす（n = 4-5マウス／群、p = 0.005）（図2Sc）。同様に、OVX治療マウスの飲料水にエストラジオールを補充すると、OVXマウスで見られたOVXに関連したエストラジオール／プロゲステロンレベルの減少（n = 4-5マウス／群、p = 0.003）がすべて逆転した（図2SA）。したがって、OVXを受けたAPPPS1-21マウスは、エストラジオールの補充によって逆転しうる循環女性ホルモンレベルの減少をもたらすことが確認された。

図2
図2
OVXとエストラジオール補充がAPPPS1-21雌マウスのAβ病理に及ぼす影響。(A) Sham（対照）、卵巣摘出（OVX）、およびOVXとエストラジオール（E2）補充を示すタイムライン上の実験デザイン。マウスは犠牲後、免疫組織化学（IHC）のための脳切片作製とMeso Scale Discovery（MSD）を用いた脳溶解液分析に使用された。(B）3群の大脳皮質におけるAβプラーク負荷とプラークサイズの代表画像を示す： Sham-operated, OVX, and estradiol-supplemented mice (OVX + E2), using anti-Aβ monoclonal antibody, 3D6 (scale = 20 microns); Fr-pa Cx = Fronto-parietal Cortex, Hipp = Hippocampus, Th = Thalamus, Ag = Amygdala (n = 8 mice/group)。(C）Aβプラーク負荷とプラークサイズは、1症例あたり6切片の3D6陽性染色の閾値限定粒子解析を用いて定量化し、その結果を各スライスの皮質総面積に対する相対値で表した。注目すべきことに、OVXマウスはSham群と比較して皮質のAβレベルが減少し、プラークサイズも小さくなった。このAβレベルとプラークサイズの減少は、エストラジオールの補充を受けたマウス（OVX + E2）では逆転した（8匹/群）。(D)凍結腹側大脳皮質組織（n = 6マウス/群）中のAβ1-40およびAβ1-42の可溶性および不溶性の両形態のレベルを評価する生化学的アッセイを行った。これらの結果は免疫組織化学的所見を裏付けるものであり、OVXマウスではAβ1-40とAβ1-42の不溶性型が有意に減少していた。この減少は、エストラジオールを補充したマウスでは相殺された（統計解析で有意差はP < 0.05）。データは平均値±SEMで示した： *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.

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OVX群とOVX-エストラジオール群の脳におけるAβ沈着を調べるために、Aβ特異的モノクローナル抗体3D610を用いて免疫組織化学（IHC）を行った18,19。その結果、シャムマウスでは大脳皮質に有意なAβ沈着が観察されたが、OVXを投与した雌性マウスでは、シャムマウスに比べて大脳皮質のAβ沈着が減少し、プラークサイズも小さくなった（n = 8匹/群、p = 0.01）（図2BおよびC）。この減少は、エストラジオールを補充したOVXマウス（n = 8匹/群、p < 0.001）では相殺された（図2BとC）。これらのIHC研究を検証するために、メソスケール・ディスカバリー（MSD）プラットフォームを用いて、凍結腹側大脳皮質組織中のAβ1-40およびAβ1-42の不溶性型のレベルを評価する生化学的アッセイを行った［図2D］。不溶性（ギ酸（FA）可溶性）Aβ1-40（n = 6 mouse/group、p = 0.03）およびAβ1-42（n = 6 mouse/group、p = 0.004）のレベルは、OVXを受けたマウスの脳からの抽出物では、Sham手術を受けたコントロールのレベルと比較して有意に減少していた。MSDアッセイでは、FA-不溶性Aβ種のレベルが、Sham処置動物の脳に存在したレベルまで戻ったことが確認された（n = 6 mice/グループ、p < 0.0007）。最後に、OVXあるいはOVX処置動物へのエストラジオール補充が、APPPS1-21マウスの脳におけるトランスジーンコードヒトAPP751トランスジーンの定常状態レベルに影響を及ぼさないことを確認することが重要であった。この解析のために、マウスAPPの類似配列（"DAEFGHDSGFEVRHQ"）とは異なるヒトAPP配列のアミノ酸 "DAEFRHDSGYEVHHQ "内のエピトープを検出するヒトAPP特異的6E10抗体（Biolegend）を用いて、皮質抽出物のウェスタンブロット解析を行った（図2SB）。これらの研究では、大脳皮質におけるヒトAPP751の定常状態レベルに対するOVXまたはOVX＋エストラジオール補充による影響は認められなかった（n = 3マウス/群、p = 0.2）。これらの所見を総合すると、雌性APPPS1-21マウスにおいて、OVXはAβアミロイドーシスの有意な減少をもたらし、エストラジオールはこれらの動物の病理学的修飾に役割を果たしていることが示された。

エストラジオールの循環レベルは、雌マウスの腸内細菌叢プロフィール／組成の変化と相関する
エストラジオールの循環レベルが雌マウスのマイクロバイオーム・プロファイルに及ぼす影響を調べるため、エストラジオールレベルを変化させた3つのマウス群、すなわち、生理的エストラジオールレベルが正常なSham群、エストラジオールレベルが低いOVX群、エストラジオール5μg/mlを補充したOVX＋E2マウスの腸内細菌叢組成を解析した。我々は、エストラジオールの循環レベルがマイクロバイオーム・プロファイルに大きな影響を及ぼすことを見出した。腸内細菌叢の系統的組成は、シャムマウス、OVXマウス、OVX＋E2マウスの雌マウスのコホート間で異なるプロフィールを示した（図3A）。これは主座標分析（PCoA）プロットでも観察され、血漿中のエストラジオール濃度が高いマウスのサンプルは、低いエストラジオール濃度のサンプルとは別に有意にクラスター化していた（n = 5-8マウス/グループ、p < 0.001）（図3C）。さらに、種の豊富さと存在量を測定するアルファ多様性解析（シャノン指数および逆シンプソン指数）により、血漿中エストラジオール濃度が低いマウスは、高いマウスに比べて微生物の多様性が増加していることが明らかになった（n = 5-8マウス/群、p < 0.001）（図3B）。これらの結果は、エストラジオールの循環レベルがメスマウスのマイクロバイオームプロファイルに影響を与えていることを示している13。シャムマウス、OVXマウス、OVX＋E2投与マウス（n = 5-8マウス/群、p < 0.001）の間で観察された系統組成の違いは、腸内細菌叢組成の形成におけるエストラジオールの調節的役割を示唆している。

図3
図3
APPPS1-21雌マウスの腸内細菌叢プロフィールに対するエストラジオールの循環レベルの影響。(A）シャムマウス、OVXマウス、OVX＋E2マウスのコホートにおける系統分類群の存在量の差を示す棒グラフ。(B) アルファ多様性解析は、血漿中エストラジオール濃度が高いShamマウスと比較して、血漿中エストラジオール濃度が低いOVXマウスで微生物の多様性が増加していることを示している（p < 0.001***）。(C）主成分分析（PCA）プロットは、血漿エストラジオールレベルに基づくOVX、Sham、OVX + E2サンプルの明確なクラスタリングを表し、低エストラジオールレベル、中間レベル、高エストラジオールレベルのマウスの別々のグループ分けを示している。全体的な結果は、OVXマウス、Shamマウス、OVX + E2マウスの違いを強調し、腸内細菌叢の組成に対するエストラジオールの有意な制御的影響を示唆している。データは平均値±SEMで表した；*, p < 0.05; **, p < 0.01, ***, p < 0.001. サンプルサイズ：n = 5-8マウス/群。

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エストラジオールによる皮質転写物レベルの調節
卵巣摘出とエストラジオール補充が大脳皮質遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにするために、我々は、Sham、OVX、またはOVX + E2処理を行った雌性APP/PS1-21トランスジェニック（Tg）マウスとその非トランスジェニック（非Tg）マウスの大脳皮質背側から単離したRNAについて、包括的なバルクRNAシーケンス（RNA-seq）研究を行った。RNA-seqデータのメタアナリシスにより、Sham、OVX、OVX + E2のTg群と非Tg群との間に有意な転写の違いがあることが明らかになった（n = 6 mice/群、偽発見率[FDR]調整p値<0.05を採用、図4Aに詳述）。図4Aのヒートマップは、絶対対数倍変化（正規化されたカウントのzスコア）をグラフ化したもので、上位のアップレギュレート遺伝子とダウンレギュレート遺伝子を強調している。驚くべきことに、シャムTgマウス群では、非トランスジェニックマウス群と比較して、MGnD型ミクログリアに関連するミクログリア特異的遺伝子群（Itgax、Cst7、Ccl3、Clac7a）の特徴的なアップレギュレーションが観察された。このパターンはさらに、Gm37593、Gm37266、Gm48181などと注釈された遺伝子を含む他の遺伝子の発現における有意な変化によって補完された。OVX後にこれらの遺伝子の発現が増加しなかったことは、ミクログリア機能を支配するホルモン依存性メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、大脳皮質における卵巣ホルモンの神経保護的役割を潜在的に強調するものである。その後、OVXマウスにエストラジオールを補充すると、Clec7a、Cst7、Ccl6、Itgaxの発現が顕著に回復し、Lilrb4（自然免疫系と抗原処理に関連）、Ly9（免疫制御に関与するSLAMファミリー受容体）、Mpeg1（免疫機能に関与するマクロファージ発現遺伝子）、Cd84（もう一つのSLAMファミリー受容体）、C4b（補体系成分）などの発現も回復した。これらの所見を裏付けるために、ボルケーノプロット解析（図4B）が採用され、倍数変化とP値の点で統計的に有意な変化が強調された。興味深いことに、ミクログリア特異的遺伝子（すなわち、Clec7a、Cst7、Ccl3、Ccl6、Itgax）は、非Tgマウスと比較して、OVX処理Tgマウスのエストラジオール補充によって発現が上昇することがわかった。遺伝子オントロジー（GO）パスウェイ解析（図4C、パネルa）によるさらなる検証の結果、免疫制御パスウェイ（図4C、パネルc）がエストラジオール投与によって顕著な影響を受けることが明らかになり、パスウェイの濃縮研究によってミクログリア特異的な細胞タイプに有意な影響があることが示された（図4C、パネルb）。

図4
図4
非トランスジェニック（non-Tg）マウスとトランスジェニック（Tg）マウスにおける皮質トランスクリプトームRNA-seq解析。(A）シャム（対照）、卵巣摘出（OVX）、エストラジオール添加OVX（OVX + E2）群における有意な遺伝子発現変異のヒートマップで、正規化カウントのzスコアを用いて非TgマウスとTgマウスの違いを強調した。(B)ボルケーノプロット。これらのグループ間の遺伝子発現の違いを強調している。(C）包括的な遺伝子リストアノテーションと解析のための高度なツールであるMetascapeソフトウェア（現在のバージョンはv3.5.20240101）。STRING、EggNog、WikiPathwaysなどのリソースを活用し、OVX + E2 Tgマウスにおける濃縮されたジーンオントロジー（GO）用語解析（パネルa）をP値の有意性で分類し、エストラジオールによって調節される特定の細胞タイプを図示し（パネルb）、濃縮された用語のネットワーク（パネルc）を提供し、異なるGO用語とパスウェイ間の相互関係を示す。データはn = 6マウス/グループを表し、統計的有意性はp < 0.05で記した。

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図5に描かれているように、バルクRNA配列決定によってミクログリア遺伝子の標的パネルの発現レベルをさらに調べた。ヒートマップ解析の結果、トランスジェニックAPPPS1-21マウスと非トランスジェニックマウスとの間のトランスクリプトーム・プロファイルが対比されただけでなく、非トランスジェニックグループ内での予想外の変動も明らかになった。特に、P2ry12、Gpr34、Tmem119、Siglech、Hexb、Csf1r、Tgfbr1、Clec7a、Lgals3、Gpnmb、Itgax、Ccl2、Fabp5、 Cx3Cr1、Tyrobp、Trem2、Ctsd、B2m、Axl、Cd68、Cd9、Lyz2、およびCcl6は、OVX後の非Tgマウスで観察され、この傾向はE2補充によって明らかに逆転した。これらの所見は、エストラジオールによって制御されるミクログリア遺伝子特異的トランスクリプトームプロファイルが、非トランスジェニックマウスとトランスジェニックマウスの間で顕著に異なっていることを強調するものであり、対応するヒートマップによって立証された（図5）。この研究に非トランスジェニックマウスを組み入れたことは、病的状態と健常状態との間にミクログリア組成の本質的な違いが存在するかどうかを見極める上で極めて重要であった。仮説通り、基礎ミクログリア発現プロファイルはこれら2つのコホート間で著しく異なっていた。

図5
図5
Thy1-APPPS1と非トランスジェニックマウスにおけるミクログリア遺伝子のトランスクリプトーム解析。ヒートマップは、OVX非トランスジェニックマウスにおけるミクログリア遺伝子の有意なアップレギュレーションを示し、E2補充によって逆転した（n = 6マウス/グループ、p < 0.05）。Thy1-APPPS1マウスでは、MGnD遺伝子P2ry12、Cx3cR1、Hexbを除き、逆の傾向が見られ、E2補充コホートではさらにダウンレギュレートされた（p < 0.01）。この分散は、アルツハイマー病におけるミクログリア、エストロゲンレベル、アミロイドベータ斑の間の複雑な相互作用を強調している。

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プラークに局在するClec7a +およびP2y12 +ミクログリアのレベルは、OVXおよびエストラジオール添加動物で異なっている。
トランスクリプトームデータを補完し、アミロイド斑近傍でのミクログリア遺伝子発現の空間分布を明らかにするために、「MGnD」型神経変性ミクログリア14を標識するClec7a +と、M0恒常性ミクログリア14を標識するP2y12 +に特異的な抗体を用いてIHCを行った［図6A］。OVXの結果、プラークの周囲に局在するClec7a +ミクログリアの数は、偽手術群と比較して有意に減少した（n = 8 mouse/群、p < 0.001）（図6B）。逆に、OVXを行い、エストラジオールを補充したマウスでは、OVX群と比較して、プラーク周辺に局在するClec7a +ミクログリアの数が有意に増加した（n = 8 mouse/群、p < 0.001）。対照的に、OVXは、偽手術群と比較して、プラークに関連したP2y12 +ミクログリアの数を増加させた。注目すべきは、OVXを受けたマウスにエストラジオールを補充すると、プラークに関連したP2y12 +ミクログリアの数が有意に減少し（n = 8匹/群、p < 0.001）、シャム手術群と同様のレベルに近づいたことである［図6B］。これらの結果は、OVXとエストラジオール補充がプラーク病態におけるミクログリアの反応にダイナミックな影響を与えることを強調している。エストラジオール補充によるミクログリアの表現型の調節は、ミクログリアの機能を調節し、プラーク沈着に関連した神経変性過程に影響を及ぼす可能性のあるこのホルモンの役割の可能性を示唆している。

図6
図6
APPPS1-21マウスにおけるプラーク局在ミクログリア集団に対するOVXおよびエストラジオール補充効果の免疫組織化学的画像（スケール＝20ミクロン、n＝8マウス/群）。(A）Clec7a＋変性ミクログリア（MGnD）およびP2y12＋恒常性ミクログリアに特異的な抗体を用いた免疫染色により、プラーク周囲のミクログリアの表現型が明らかになった。(B) 定量化すると、OVXではプラーク周囲に局在するClec7a +ミクログリアがSham手術群と比較して有意に減少する（p < 0.0001, ****）一方、OVX処置マウスにエストラジオールを補充するとClec7a +ミクログリアの数が増加する（p < 0.0001, ****）。逆に、OVXの結果、プラークに関連したP2y12 +ミクログリアの数が増加したが、エストラジオールの補充により有意に減少し（p < 0.0001, ****）、シャム手術群で観察されたレベルに近づいた。

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考察
現在では、女性のAD有病率が男性よりも高いことはよく知られている1。実際、APOE-ε4ヘテロ接合の女性は、年齢をマッチさせたAPOE-ε44ヘテロ接合の男性よりもAD発症リスクが高いことが研究で示されている。大規模なメタ解析20やADに関する大規模な集団研究21では、APOE-ε4対立遺伝子のヘテロ接合の女性は、ヘテロ接合の男性よりも5年早くADと診断された。同様に、APOE-ε4対立遺伝子を1コピー持つ女性のADのオッズ比は、男性の4倍である20。

先行研究では、出生後にABXカクテルを用いて腸内細菌叢を変化させると、APPswe/PS1ΔE99,22とAPPPS1-21の両Aβアミロイドーシスモデルマウス10,19,23において、Aβ負荷が男性特異的に減少することが示された。これと並行して、我々はAPPPS1-21マウスにおいて、皮質ミクログリアの転写ランドスケープが男性特異的に変化していることを記録した10,19,23。これらの知見から、腸内細菌叢の擾乱が雌マウスのエストロゲンレベルに影響を及ぼし、それがAβ負荷とミクログリアの表現型に影響を及ぼすのではないかという仮説を検証した。この仮説を支持するいくつかの重要な知見が得られた。第一に、APPPS1-21マウスでは、出生後ABXを投与すると、淘汰時期である3ヵ月目に循環エストラジオールレベルが上昇することがわかった。第2に、4-5週齢の若い雌マウス（Aβ沈着が始まる2-3週間前）にOVXを行うと、3ヵ月齢のAβ負荷が有意に減少する。第三に、OVXを受けた別のコホートのマウスの飲料水にβ-エストラジオールを補充すると、Aβ病理が回復する。

このパラダイムによって、疾患の発症と進行に影響を及ぼす可能性のある早期の分子的・細胞的事象を同定することが可能になったからである。実質的な病理学的徴候が現れた後に卵巣を外科的に摘出することによって「閉経脳」状態を誘導することも、マウスにおける閉経状態をシミュレートするために一般的に用いられる方法である慢性的／長期的なエストラジオール欠乏戦略を実施することも、意図的に選択しなかった24。さらに、閉経脳をシミュレートするために用いられる慢性エストロゲン欠乏試験で一般的な植物性エストロゲンを含まない飼料ではなく、標準的な社内飼料を選択した。APPPS1-21マウスにOVXを行ったところ、大脳皮質内のプラーク負荷とプラークサイズの両方が減少したというわれわれの所見は、MuckeらがJ20-hAPPマウスで報告した所見と同じである25。さらに、3週齢でOVXを行ったJ20-hAPPマウスにエストラジオールを補充したところ、Aβレベルが有意に上昇した。この後者の設定では、Aβ沈着は卵巣が無傷の2.5ヵ月齢のマウスで観察されたものにほぼ戻った25。Aβ負荷に対するエストロゲンの作用機序を明らかにするため、われわれはトランスクリプトーム解析を行い、卵巣摘出によって影響を受ける可能性のある基礎的な生物学的プロセスを同定した。解析の結果、大脳皮質で最も顕著な影響を受けた遺伝子は、主に代謝過程と免疫系に関連するものであった。中枢神経系の主要な常在免疫細胞であるミクログリアは、アミロイドクリアランスに大きく関与しており、代謝的に駆動されることが知られている26。驚くべきことではないが、OVXによってアミロイド負荷が減少すると、プラークの周囲に存在するClec7a＋変性ミクログリアが減少し、P2y12＋神経保護ミクログリアが増加した。対照的に、エストラジオールの補充はこれらの効果を逆転させた。このことは、シャム、OVX、OVX＋E2群におけるエストラジオールレベルの違いが、ミクログリアの活性化を選択的に制御できることを示唆している。

他のAβアミロイドーシスモデルマウスでは、OVXがAβ負荷の調節に及ぼす影響について、この分野のコンセンサスはほとんど得られていない。例えば、ADのトリプル・トランスジェニック・マウスモデル（3xTg-AD）では、成熟雌性3xTg-ADマウスのOVXによる性ステロイドホルモンの枯渇は、Aβ蓄積を有意に増加させ、記憶能力を悪化させた。卵巣摘出した3xTg-ADマウスをエストロゲンで処理したが、プロゲステロンではこれらの影響を防いだ27。一方、Heikkenenら28は、FAD結合APPsweとPS1-A246Eを共発現するトランスジェニックマウスにおいて、OVXマウスまたは偽手術マウスにエストロゲンを補充しても、海馬のアミロイド蓄積には影響がなかったと報告している。同様に、Greenら（2005）は、PDGFプロモーターによって駆動されるFAD結合APP V717F変異を発現する雌性PDAPPマウスでは、OVXもエストロゲン補充を伴うOVXも海馬や新皮質におけるAβ蓄積を変化させなかったと報告している。しかし、Zhengら24は、マウスPrPプロモーターによって駆動されるAPPsweを発現するTg2576マウスのOVXでは、偽手術した同腹子と比較して可溶性Aβ40のレベルが有意に増加し、Aβ42ペプチドが増加する傾向が見られたが、これらのAβペプチドの増加はAβ沈着の増加とは関連しなかったと報告している。対照的に、Levin-Allerhandら29は、AβPPSWEトランスジェニックマウスのOVXではAβレベルは変化しなかったが、17β-エストラジオールによってAβレベルが低下したことを報告している。機序的には、エストラジオールがsAβPPαのレベルを増加させ、その結果、アミロイド形成過程の指標であるAβ/sAβPPαの比が、すべてのエストロゲン含有群で減少したことが示唆された。注意しなければならないのは、これまでの研究では、発情周期の変動を考慮していなかったことである。一方、発情周期を考慮した最近の研究では、J20-hAPPマウスではOVXによってこのペプチドのレベルが減少したのに対し、エストラジオールの一過性のスパイクによってAβ1-42レベルが増加した25。これらの知見を補完するように、妊娠中のエストロゲンレベルの変動がADリスクの上昇に関連することも示されている。このリスクは多胎妊娠の場合、さらに増幅されるようである31。まとめると、トランスジェニックマウスモデルにおけるOVXがプラークの病理学的あるいは関連する細胞・生化学的結果に及ぼす影響については、意見の一致をみるに至っていない。このような研究間の相違は、使用した特定の動物モデル、動物の年齢、発情期におけるホルモンとAβの正確な測定時期、その他の方法論の相違によるものと思われる。

十分に立証された危険因子を考慮すると、20年にわたる経験的研究では、エストロゲン療法は認知機能低下に対する緩和戦略であり、特に女性の約55歳を「臨界期」とすることが提唱されていた30。この長年の仮説は、5589人の認知症患者と55,890人の対照者を含む包括的なデータセットを活用した、2000年から2018年にかけて実施された最近のデンマークの症例対照研究（Pourhadi et al. このデータは、エストロゲン療法がすべての認知症およびアルツハイマー型認知症のリスク上昇と関連することを決定的に示している。注目すべきことに、このリスク増加は、治療期間や治療開始年齢とは無関係である。これらの説得力のある結果は、これまで女性におけるエストロゲン療法の利点とされてきたものを、直ちに包括的に再評価することを要求するものである。この点に関して、発情周期（ホルモンの振動に代表される雌性哺乳類の生殖周期）は、AD研究の領域ではほとんど無視されてきた31。歴史的に、AD研究は主に男性を対象としてきたか、女性における発情周期の影響を十分に認めてこなかった32。この見落としは、疾患の理解や効果的な治療法の開発に重大な影響を及ぼす可能性がある。動物モデルにおいて、発情周期が実際にADの病態や認知機能に影響を及ぼすことを示唆する新たな証拠が得られている25。ADのトランスジェニックマウスモデルを用いた研究では、発情周期中のホルモン変動がAβ蓄積、タウ病理、神経炎症、シナプス機能に影響を与えることが示されている25,33,34。例えば、発情周期の特定の時期にエストラジオール濃度が高くなることは、J20-hAPPマウスにおけるAβ負荷の増加と関連している25。これらの所見から、発情周期に伴うホルモンの変化は、ADの病態に影響を及ぼす重要な機会である可能性が示唆される。ホルモンの変動は実験的介入の効果を覆い隠したり、混乱させたりする可能性があるため、発情周期を無視すると、一貫性のない、あるいは誤解を招くような結果を招く可能性がある。従って、発情期がAβ25レベルの上昇と関連している可能性を示唆する証拠がいくつかある一方で、われわれは発情期にすべての動物を犠牲にすることで、研究の一貫性を維持した。

最後に、考慮すべき重要な要因として、動物施設によってマイクロバイオームの構成が大きく異なる可能性があること35,36があり、これらの違いはADモデルマウスにおけるOVXに関する研究を含む研究結果に影響を及ぼす可能性がある。われわれの研究では、OVX群に外因性エストラジオールを投与しても、Sham群のマイクロバイオーム組成は反映されないことが観察された。この結果は、約5週間にわたり外因性エストラジオールを飲料水に添加することで、マイクロバイオームの増殖と組成を調節するという我々のアプローチに起因している。この方法は、微生物の自然な成長と再コロニー化を阻害し、淘汰時にシャム群の自然なものとは異なるマイクロバイオーム組成をもたらした。これらの知見は、マイクロバイオームの動態に対するホルモン介入の重要な影響を強調し、このような実験環境に固有の複雑さを浮き彫りにし、科学研究におけるホルモン治療と微生物生態系との間の微妙な相互作用を強調している。さらに、体内および体上に存在する微生物群集からなるマイクロバイオームは、脳機能やAD37を含む神経変性疾患など、健康や疾患のさまざまな側面に影響を及ぼす重要な因子として認識されている。動物施設では、飼育環境、食餌、微生物曝露などの特定の環境条件が維持され、その中で飼育されている動物のマイクロバイオームを形成する可能性がある38,39。したがって、ADモデルマウスにおけるOVXの効果を研究する場合、異なる動物施設間でのマイクロバイオーム組成のばらつきが、これらの研究結果に影響を及ぼす可能性がある。さらに、ADマウスモデルで観察されたOVXの効果の頑健性と一般化可能性を検証するためには、異なる動物施設で得られた知見を再現することが不可欠である。ADにおけるエストロゲンの役割とマイクロバイオームの影響をより包括的に理解するためには、複数の動物施設を用いた共同研究や多施設共同研究が必要である。

本研究は、アルツハイマー病の雌性モデルマウスにおけるエストロゲン、腸内細菌叢の擾乱、代謝変化、Aβ負荷の相互作用に関する貴重な知見を提供するものである。しかし、今後の研究で対処すべきいくつかの限界がある。第一に、本研究の大部分は特定のマウスモデルに依存しており、他のモデルやヒトに対する知見の一般化可能性に疑問がある。上述したように、異なる動物モデル間でAβ負荷に対するOVXの結果にばらつきがあることは、この懸念を強調するものである。第2に、われわれの研究ではマウスに「更年期脳」の状態を誘発することを意図的に避けたが、この選択によって、閉経がADにどのような影響を及ぼすかについての理解が制限されることになる。第三に、卵巣摘出の影響は主にエストラジオールとの関連で検討され、プロゲステロンなど他の性ホルモンの潜在的役割は考慮されなかった。最後に、本研究は単一の動物施設で実施されたものであり、様々な施設間でのマイクロバイオーム組成の違いが結果に及ぼす役割については検討されていない。将来的には、更年期障害を含むより広範な動物モデルを取り入れたり、他の性ホルモンの役割を検討したり、複数の動物施設間で協力して研究結果の頑健性と一般化可能性を検証するなどして、これらの限界に対処することを目指すべきである。

要約すると、我々の研究は、Aβアミロイドーシスの雌性マウスモデルにおいて、エストロゲン調節、腸内細菌叢の調節異常、代謝シフト、Aβ蓄積の間の多面的な相互作用を明らかにした。これらの知見は、根本的なメカニズムに関する貴重な洞察を提供し、Aβアミロイドーシスと神経炎症の調節に関与するホルモン因子と微生物因子を標的とした予防的・治療的介入をデザインするための新たな道を提供するものである。

材料と方法
動物の取り扱いと飼育
ドイツのチュービンゲン大学のM. Juckerから入手したAPPPS1-21マウスをC57BL6Cjバックグラウンドで飼育した。マウスは滅菌マイクロアイソレーターケージで飼育され、標準的な飼料を自由摂取させた。動物実験を含むすべての手順は、シカゴ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認された動物飼育使用プロトコルに従って行われた。本研究は、https://arriveguidelines.org に概説されているARRIVE（動物実験：生体内実験の報告）ガイドラインに従って報告されていることをここに確認する。

抗生物質の投与
ABXを投与された仔マウスは、経口投与（動物用給餌シリンジを介して200μlのABX；品番7901；Cadence）され、予め定義されたABX混合物（Stefka et al、 2014；4mg/mlカナマイシン、Sigma-Aldrich K4000-5g；0.35mg/mlゲンタマイシン、Sigma-Aldrich G1914-250mg；8500U/mlコリスチン、Sigma-Aldrich C4461-1g；2.15mg/mlメトロニダゾール、Sigma-Aldrich M1547-25g；0.45mg/mlバンコマイシン、Sigma-Aldrich V2002-1g）を滅菌水中でP14日からP21日まで経口投与した。生後7日間のABX投与期間中、ケージの糞からの細菌曝露を防ぐため、投与ごとにマウスを清潔な無菌ケージに移した。ABXを投与した仔マウスと同じケージの成体マウスは離乳後に処分し、それ以降の実験や繁殖から除外した。ABX水は5-6日ごとにリフレッシュした。

剖検と組織採取
犠牲となったマウスから様々な臓器を採取する手順は、シカゴ大学で承認され公表されている動物飼育使用プロトコルに従って行われた。安楽死当日、マウスにはケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内注射した。深麻酔を確認した後、25ゲージの注射針を用いて心臓穿刺により採血し、EDTAコート採血管（BD Vacutainer; 365974）に保存して氷上に置いた。採血後すぐに下行大動脈をクランプし、マウスを生理的食塩水（pH7.4）で3分間灌流した。一方は組織学的検査のために4%パラホルムアルデヒドで後固定し、もう一方はトランスクリプトーム解析のために直ちに凍結した。盲腸を採取し、抗生物質治療の効果を評価するために重量を測定した。これらの処置の終了後、血漿はBeckman Coulter社製の遠心分離機を用い、2000rpm、10分間、4℃で遠心分離して分離し、将来の使用のために-80℃で保存した。

マウス血清中のエストロゲン代謝物のGC-MS分析
質量分析用に、500μLの血清を窒素下で完全に乾燥させた。エストラジオールとエストロンの揮発性を改善するため、代謝物は分析前に誘導体化した。サンプルバイアルに250 µLのN,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)と250 µLのピリジンを加え、サーモミキサーで70 °C、1400 rpmで30分間インキュベートした。その後、サンプルを窒素下で完全に乾燥させ、1 mLのヘキサンで再構成した。誘導体化後、各サンプル 1 µL をガスクロマトグラフィー質量分析計 (GC-MS, Agilent 7890B GC/ Agilent 5977B MSD) に注入した。代謝物を分離し (HP-5MSUI カラム、30 m × 0.25 mm、0.25 µm)、ヘリウムをキャリアガスとする電子衝撃 (EI) イオン化を用いた GC-MS で検出した。オーブン温度は200 °Cで1分間保持し、200 °Cから250 °Cまで10 °C/分で昇温し、250 °Cから270 °Cまで5 °C/分で昇温し、最後に270 °Cから300 °Cまで10 °C/分で昇温した。データ解析は、MassHunter Quantitative Analysisソフトウェア（バージョンB.10、Agilent Technologies）を用いて行い、真正標準物質との比較およびNIST Tandem Mass Spectral Library Version 2.3の類似性検索によって確認した。誘導体化された真正標準物質の保持時間とフラグメンテーションパターンは、内因性血清化合物の確認に使用されました。

実験モデル
卵巣摘出
卵巣摘出は5週齢で行い、偽手術は同腹動物に行った。動物は3ヵ月齢で傷害され、分析のために脳が摘出され、子宮重量が評価された。

エストラジオール補充試験
エストロゲン補充については、雌マウスを5週齢で卵巣摘出した。8週齢から、Gordonら(1986)40のプロトコールに従い、エストラジオールを飲料水中に投与した。エストラジオール（Sigma, St. この原液を新鮮な飲料水に分注し、実用濃度を5 µg/mlとした。実験期間中、この濃度を一定に保つため、溶液の正確な測定、飲料水レベルの定期的なモニタリング、必要に応じて溶液の適時交換など、慎重な措置がとられた。

ホルモンのELISA
E2およびP4の血清濃度は発情期に測定した。血液は麻酔下で該当日の 0800 時に心臓穿刺により採取し、3000 g で 5 分間遠心後、血清を調製し、測定まで-80 ℃で保存した。E2レベルはALPCOの市販ELISAキット（11-ESTHU-E01；Alpco, Salem, NH）を用いて測定し、P4レベルは自動化学発光アッセイシステム（Immulite 2000；Diagnostics Products Corp.）これらのアッセイの最小検出限界は、P4が0.08 ng/ml、E2が5 pg/mlであり、アッセイ内およびアッセイ間の変動係数はいずれも10％であった。

大脳皮質RNA抽出、ライブラリー調製および塩基配列決定
Dodiyaら10によるプロトコールに従って、Trizol試薬を用いて大脳皮質背側から全RNAを抽出し、RNAeasy Micro kit（Qiagen）で洗浄した。品質評価はAgilent Bioanalyzerで行った。RNA-seqライブラリーの調製とシーケンシングは、The University of Chicago Genomics Core FacilityでIllumina HiSeq4000を用いて行った。データはバイオインフォマティクス解析のためにFASTQフォーマットで収集された。

RNA-seqバイオインフォマティクス解析
FASTQフォーマットで提供されたDNAリードの質を、FastQCを用いて評価した。アダプターはトリミングされ、質の低いリードやrRNA配列にアライメントされたリードはTrim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)を用いてフィルターされた。クリーニングしたリードをSTARを用いてマウスゲノム(mm10)にアライメントした。各遺伝子のリードカウントは、Ensembl (http://useast.ensembl.org/index.html)から取得したmm10の遺伝子アノテーションファイルと併せて、HTSeq-Countsを用いて計算した。MultiQCを用いて包括的な品質管理レポートを作成した。有意な差次発現遺伝子（DEG）を同定するためのカットオフはFDR調整P値<0.05とした。遺伝子オントロジー（GO）解析と特定のパスウェイ内のDEGの同定はMetascapeを用いて行われ、その結果はDAVIDとGorillaオンラインサービスを用いて検証された。本書で取り上げたデータは、National Center for Biotechnology InformationのGene Expression Omnibusに寄託されており、GEO SeriesのアクセッションNo. GSE245831 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ query/acc.cgi?acc = GSE245831)。

糞便DNA抽出
標準化されたEarth Microbiome Projectのプロトコール（www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/）に従い、既述の方法に従い、糞便および糞便内容物から細菌DNAを抽出した。簡単に説明すると、組織は0.4 mg/mlのプロテイナーゼKを含む抽出バッファー（50 mg組織/mlバッファー、50 mM Tris（pH 7.4）、100 mM EDTA（pH 8.0）、400 mM NaCl、0.5%w/v SDS）に溶解した。 1 mm（500μl/mlバッファー、BioSpec Products社製）のガラスビーズを加え、Mini-Beadbeater-8K Cell Disrupter（BioSpec Products社製）を用いて微生物細胞を溶解し、その後55℃の水浴中で一晩インキュベートした。続いて、フェノール：クロロホルム：IAA混合溶媒（25:24:1 v/v、pH 8.0、Ambion）を用いて、メーカーのガイドラインに従って全DNAを抽出した。DNA収量を定量し、Nanodrop Lite（Thermo Fisher）とQubit®蛍光光度計（Invitrogen）を組み合わせた評価を用いて品質を決定した。

16S rRNA遺伝子Illumina® MiSeqシーケンス
糞便および糞便内容物から分離したDNAから、定量的PCR（QPCR）を用いて16S rRNA遺伝子のコピー数を定量した。2～5ng/µlのDNA濃度に、iQ-SYBR Green PCR Supermix（Bio-Rad）、518F（5′-TCC-TAC-GGG-AGG-CAG-CAG-T-3′）および338R（5′-GGA-CTA-CCA-GGG-TAT-CTA-ATC-CTG-TT-3′）プライマー（2. 5 μM）、Q-PCRはLightCycler® 480システム（Roche）で行った。反応条件は以下の通り：95 °Cで5分間の初期変性、95 °Cで10秒間、64 °Cで45秒間、72 °Cで45秒間のサイクルを35回行い、40 °Cで30秒間最終伸長した。コピー数は、Qubit® 蛍光光度計（Invitrogen）を用いた事前評価で決定した、反応ごとに添加した特定のDNA濃度に対する相対値で表した。すべての反応は三重で行われ、適切な陰性対照を含んでいた。本研究中に生成および/または解析されたデータセットは、National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (SRA)のアクセッション番号PRJNA1030000 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1030000)で入手可能である。

糞便微生物叢解析
Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）パイプラインとvsearch 8.1を利用して、標準的なデマルチプレックスとクオリティフィルタリングを行った。固有のASVはDeblur法を用いて同定し、分類学はGreengenes Database（2013年5月リリース；http://greengenes.lbl.gov）を用いて割り当てた。統計解析はRで行い、主に'vegan'ライブラリーと'phyloseq'ライブラリーに依存した。

ウェスタンブロット分析
50mMトリス（pH7.4）、150mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル、1mM PMSF、1×ホスファターゼ阻害剤カクテルからなる溶解バッファーを用いて、Thy1-APP/PS1半脳から脳溶解液を調製した。ホモジナイズと超音波処理を氷上で行った後、サンプルを10,000g、4℃で20分間遠心した。上清を全タンパク質溶解液として回収した。タンパク質濃度はBCA分析を用いて定量した。ゲル電気泳動では、Minter et al., 2016に記載されているように、12%グリシンSDS-PAGEまたは10-16.5%トリシンSDS-PAGEゲル上で行う前に、サンプルを還元バッファー中で95℃で変性させた。続いて0.2μmニトロセルロース膜に湿式転写した。膜はPBS-T中5％脱脂乳で室温で1時間ブロッキングした。抗体の検出には、6E10抗体（Biolegend）を1:2000希釈で用い、ヒトFL-APPを同定した。β-アクチンは、1:15,000希釈のアクチン一次抗体で検出し、ローディングコントロールとして用いた。すべてのブロットに1:5000希釈の抗マウス二次抗体を用いた。洗浄後、膜はHRP標識二次抗体と1時間インキュベートした。シグナル検出はWestern Lightning® Plus ECLとX線フィルムを用いて行った。デンシトメトリー解析はImageJを用いて行った。

MSD分析
可溶性および不溶性Aβレベルを測定するために、-80℃で保存した凍結脳の腹側半分を用いた。プロテアーゼ阻害剤とEDTAを加えたTBS溶液でホモジナイズした。超遠心後、可溶性Aβ分析のために上清を回収した。残りのペレットを70％FAで処理し、再度超遠心して上清を回収し、不溶性Aβレベルを測定した。これらのサンプルはハーバード大学に送られ、Quickplex SQ 120システムを用いてMinterら（2016）のプロトコルに従ってMesoScale Aβ分析が行われた。

免疫細胞化学
Aβアミロイドーシスを評価するために、免疫蛍光染色を以前に発表されたプロトコールに従って行った。具体的には、40μm厚の脳切片一式をAβ染色し（3D6、1:10,000）9、一次抗体P2RY12（Invitrogen、1:1000）とClec7a（Invitrogen、1:250）を用いてミクログリア染色を行った。手順としては、まず、フリーフローティングのレベル合わせした40μm切片を希釈培地で60分間（1回の洗浄につき10分間）洗浄した。その後、切片を血清ブロッキング溶液に常温で1時間浸し、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。翌日、切片を希釈培地で60分間洗浄し（10分間/洗浄）、その後二次抗体と室温で1時間インキュベートした。Aβ染色とミクログリア染色には、それぞれロバ抗マウス488（Invitrogen；1:500）、ロバ抗ウサギ647（Invitrogen；1:500）、ロバ抗ウサギ647（Invitrogen；1:500）を二次抗体として用いた。その後、切片を洗浄し、スライドグラスにマウントし、Fluoromount aqueous mounting medium (Sigma-Aldrich; F4680)を用いてカバースリップした。3D6 + Aβプラークの画像は、3D Histech Pannoramic MIDIホールスライドスキャナーとZeiss AxioCam MRM CCDカメラを用い、The University of Chicago Integrated Light Microscopy Facilityのスタッフが担当した。一方、ミクログリアの画像はLeica SP5 3D STEDレーザー走査型共焦点顕微鏡を用い、40×1.5の倍率で撮影した。

アベータ負荷解析
Aβ負荷とアミロイドプラークの大きさの評価は、以前に定義されたプロトコールに従って行った9,10,19,22。簡単に言えば、3D6 +アミロイド斑の解析には、嗅球の先から海馬の中間レベルまで、480μm間隔で6枚の等距離切片を用いた。Fiji ImageJソフトウェア（NIH; ImageJ 1.51n）を用い、2人の独立した盲検観察者が、平均プラークサイズとAβ分画面積（アミロイド負荷としても知られる）を決定した。個々の画像は、3D Histech Pannoramic viewer software（3DHistech Kft）を用いて処理され、その後正規化された。ヒストグラム・エントロピーに基づく自動閾値処理がアミロイド斑の同定に適用された。画像を8ビットフォーマットに変換した後、特定の閾値が適用され、これに続いて "fill holes "および "watershed "アルゴリズムを用いて2値化された。最後に、"analyze particles "機能を用いて、プラーク数、プラークサイズ面積、プラークに包含される総面積（すなわちAβ負荷）を計算した。Aβ負荷は面積分率として表され、プラークが占める総面積を対象領域である大脳皮質の総面積で割ることによって計算された。アミロイド負荷とプラークサイズの両方のデータを用いてグラフを作成した。

統計解析
統計解析はGraphPad Prismソフトウェア、バージョン7.0eを用いて行った。16S rRNA微生物叢解析におけるα-およびβ-多様性指標を複数の群間で比較するために、Wilcoxin解析を利用した。これにより、異なるグループ間の分布と中央値を注意深く比較することができ、結果の完全性を保証するために多重比較の補正が行われた。短期ABX試験や、Sham、OVX、OVX + E2試験間の比較など、その他の試験では、方法論に特に指定がない限り、一元配置分散分析（ANOVA）が採用された。一元配置分散分析は、いくつかのグループの平均値間の差を調べることを可能にし、どの特定のグループが互いに異なっているかを識別するために、事後比較が続いた。すべての分析において、0.05未満の統計的P値は、比較対象のグループ間の有意差を示すとみなされた。追加試験や調整を含む統計的方法と所見に関する詳細と詳細は、結果に添付された図の凡例に記載されている。

データの利用可能性
16S rRNA遺伝子Illumina® MiSeqシーケンス中に生成および／または解析されたデータセットは、National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (SRA)のアクセッション番号PRJNA1030000 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1030000)で入手可能である。RNAシーケンス解析で議論されたデータは、National Center for Biotechnology InformationのGene Expression Omnibusに寄託され、GEO Series accession number. GSE245831 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ query/acc.cgi?acc = GSE245831)。

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謝辞
The University of Chicago Integrated Light Microscopic Core FacilityのShirley Bond女史とVytas Bindokas博士のスライドスキャナー画像処理に感謝する。Pieter W. Faber博士には、The University of Chicago Genomics Core Facilityのバイオアナライザーおよび次世代シーケンサーサービスにご協力いただいた。Duchossois Family Institute Host-Microbe Metabolomics and Microbiome Metagenomics Facilitiesの実験サポート、およびEric Pamer教授の貴重な意見に感謝する。これらの研究は、Cure Alzheimer's Fund（S.S.SisodiaおよびR.E.Tanziへ）、Open Philanthropy ProjectおよびGood Ventures Foundation（S.S.SisodiaおよびR.E.Tanziへ）、Luminescence Foundation（S.S.Sisodiaへ）、The Safadi Program for Excellence in Clinical and Translational Neuroscience Postdoctoral Fellowship Support（P Sahaへ）の支援を受けた。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Ian Q. Weigle、Nicholas Slimmon。

著者および所属
米国イリノイ州シカゴ、シカゴ大学神経生物学部

ピヤリ・サハ、イアン・Q・ヴァイグル、ペドロ・ブラウト・ポリ、シャオキオン・チャン、サングラム・S・シソディア

米国テキサス州ダラス、UTサウスウェスタン医療センター、生物医学部

ニコラス・スリモン

ノースウェスタン大学遺伝医学センター（米国イリノイ州シカゴ

プリヤム・パテル

米国イリノイ州シカゴ、シカゴ大学ゲノム施設

曹雅軍

米国イリノイ州シカゴ、イリノイ大学、生理学・生物物理学科

ジュリア・ミハルキヴィッチ

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部神経科

アシュレー・ゴム、カン・チャン、ルドルフ・E・タンジー

デュショソワ・ファミリー・インスティテュート、シカゴ大学（米国イリノイ州シカゴ

ニコラス・ディラ

米国イリノイ州シカゴ、シカゴ大学産科婦人科

アイマン・アル＝ヘンディ

貢献
P.S.は短期ABXおよびOVX実験の実施、腸内細菌叢およびウェスタンブロットデータの解析、免疫細胞化学、SP5レーザー共焦点画像、Imaris評価の実施、RNA-seqデータの解釈、最終図および原稿の作成を行った。I.W.はShamマウスとOVXマウスの手術と犠牲、3D6抗体による免疫組織化学、N.S.は免疫化学、ウェスタンブロット実験、MSD生化学アッセイ用脳ホモジネートの調製、P.B.P.は脳切片作製、ミクログリア免疫細胞化学の補助、ImageJを用いたOVX研究のアミロイドーシスとミクログリアの定量化における第二のブラインドオブザーバーを務めた。P.P.はバイオインフォマティクスを実施し、RNA-seq図の作成を手伝った。X.Z.とY.C.はマウスの維持管理と遺伝子型決定を行った。N.D.はマイクロバイオームデータに関するバイオインフォマティクス解析と統計的評価を行った。J.M.はハイスループットRNAシーケンス研究のためのRNA単離を実施した。C.Z.およびA.G.は、TBSおよびFA可溶性脳ホモジネートを用いたMSD生化学アッセイを実施した。R.T.とA.A.-H.は原稿の査読と批評を行った。S.S.S.は、微生物に関連した仮説を立て、実験研究を共同デザインし、原稿の査読と批評を行った。

責任著者
Sangram S. Sisodia宛。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社からのコメント
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報
補足凡例。
補足図2.
補足図
権利と許可
オープンアクセス本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

この記事について
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この記事の引用
Saha,P.、Weigle,I.Q.、Slimmon,N.他、女性ホルモンによる腸内細菌叢の早期変調がアミロイド病理とミクログリア機能を変化させる。Sci Rep 14, 1827 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-52246-6

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受理
2023年10月18日

受理
2024年1月16日

出版
2024年1月21日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41598-024-52246-6

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