大腸癌モデルマウスにおいて糞便DNAウイルスが大腸新生物の発生と関連する

2023年6月29日 21:44

オープンアクセス論文
大腸癌モデルマウスにおいて糞便DNAウイルスが大腸新生物の発生と関連する

https://www.mdpi.com/2076-0817/11/4/457

著者
Yingshi Li
1,
ファン・チャン
1,
鄭慧敏
1,
サンジナ・カラサベイル
1,
クロエ・ヒックス
1,
カ・イー・フォン
2,3,
アデル・プローデ
2,3,
トレイシー・プトツキ
2,3,
ユリア・ベレトフ
4,5,
ユアン K. A. ミラー
4,5,
エマド・エル・オマル
1,
姜暁涛
1,および
ハワード・チー・ホー・イム
1,
1
UNSW Microbiome Research Centre, St George and Sutherland Clinical Campuses, School of Clinical Medicine, UNSW Medicine and Health, The University of New South Wales, Sydney, NSW 2052, Australia
2
ウォルター・アンド・イライザ・ホール医学研究所個別化腫瘍学部門、ビクトリア州、VIC 3052、オーストラリア
3
メルボルン大学医学生物学部、ビクトリア州、VIC 3053、オーストラリア
4
ニューサウスウェールズ大学UNSW医学・健康学部セントジョージおよびサザーランド臨床キャンパス（シドニー、ニューサウスウェールズ州2052、オーストラリア
5
ニューサウスウェールズ保健病理学解剖病理学部門、セントジョージ病院、コガラ、ニューサウスウェールズ州2217、オーストラリア
*
著者宛先
Pathogens 2022, 11(4), 457; https://doi.org/10.3390/pathogens11040457
受領：受理：2022年3月1日 / 改訂：2022年3月31日 / 受理：2022年4月7日 / 掲載：2022年4月11日受理：2022年3月1日 / 改訂：2022年3月31日 / 掲載：2022年4月11日
(この論文は特集号「健康と疾患における腸内マイクロバイオームの役割」に属しています。）
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総説レポートバージョンノート
要旨
腸内ビロームの変化は大腸がん（CRC）と関連しているが、いつ、どのようにして変化が起こるのかは研究されていない。ここでは、マウスを用いた縦断的研究により、アゾキシメタン（AOM）誘発大腸新生物における腸内ビロームの変化を明らかにし、腫瘍増殖に関連する重要なウイルスを同定した。AOMを投与した群では、対照群に比べ、マウスの加齢とともに腫瘍の数と大きさが増加した。腫瘍は12週目にAOM群で初めて観察された。腫瘍が最初に出現したとき、アルファ多様性が有意に低く、ウイルスプロファイルの変化が観察された。さらに、AOM群では腫瘍増殖と正の相関を示し、遅い時点で濃縮されるBrunovirus属、Hpunavirus属の新規ウイルスが同定された一方、Lubbockvirus属のメンバーは腫瘍増殖と負の相関を示した。さらに、ネットワーク解析の結果、AOMウイルス群には腫瘍増殖と正の相関を示すウイルスと負の相関を示すウイルスの2つのクラスターが存在することが明らかになった。この知見は、腸内ビロームが腫瘍形成に伴って変化することを示唆し、大腸新生物の発生にバクテリオファージが関与している可能性を示す強力な証拠となる。
キーワード
バクテリオファージ；大腸新生物；ビローム

はじめに
大腸癌（CRC）は、3番目に多く診断される癌であり、癌による死亡原因の2番目に多いものである [1] 。2020年には、世界中で新たに114万人のCRC患者が発生し、576,858人が死亡すると推定されている[1]。CRCのリスク増加には、遺伝、年齢、炎症性腸疾患（IBD）の既往、食事、そして最近では腸内マイクロバイオームなど、多くの危険因子が関連している [2,3,4,5,6] 。腸内細菌叢は、100兆個を超える微生物（細菌、ウイルス、古細菌、真菌を含む）とそれらの集合ゲノムで構成されている [7] 。CRC患者は、腸内細菌叢のバランスが崩れている。これには、Fusobacterium spp.、Bacteroides fragilis、Escherichia coli、Streptococcus bovis、Enterococcus faecalisなど、大腸発癌に関与すると疑われる細菌の相対的存在量が高いことが含まれる [7] 。特にFusobacterium nucleatum (Fn)の濃縮は、全ゲノムシークエンシングを用いて大腸癌で認められ、大腸癌組織サンプルの大規模研究によって確認された[8,9]。CRC患者では、ClostridiumやFaecalibacteriumといった保護的な役割を果たす細菌属の減少も観察された[10]。
CRCとバクテリオームとの関連は広く研究されているが、腸内ビロームの役割についてはほとんど知られていない。腸内ビロームには、内在性レトロウイルス、真核ウイルス、バクテリオファージが含まれる [11] 。ヒトの腸内ビロームの変化は、1型糖尿病、2型糖尿病、IBD、HIV感染、がんなどの疾患と関連している [12,13,14,15,16,17,18]。最近の研究では、CRC患者の便検体における腸内ビロームについて議論のある所見が示されている。Nakatsuらによる研究では、CRC患者では健常対照群と比較してバクテリオファージαの多様性が相対的に増加していることが示されたが [17]、Hanniganらはシャノン多様性にもウイルスの豊富さにも有意差を認めなかった [18]。相対存在量プロファイルに基づくoperational viral units（OVUs）によると、Hanniganらは、がん関連ビロームは主に温帯バクテリオファージから構成され、ビロームのシグネチャーはSiphoviridaeとMyoviridaeに属するOVUsに由来することを示唆した［18］。Orthobunyavirusは、CRC患者と対照群を区別する最も重要なウイルス属として同定されたが、腸疾患におけるその潜在的な役割についてはまだ検討されていない。また、腸内ビロームの病期特異的変化の可能性も示唆された。しかし、この知見を検証するにはさらなる研究が必要である。
しかし、ビロームの変化が腫瘍増殖の原因なのか結果なのか、またビロームが経時的にどのように変化するのかは不明である。そこで我々は、大腸新生物の発生に伴って腸内ビロームが変化するという仮説を立てた。ここでは、マウスを用いた縦断的研究を設定し、この仮説を検証した。便サンプルは隔週で採取した。CRCの誘発によく使われる発癌物質であるアゾキシメタン（AOM）を投与したマウスとリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を投与したマウスとの間で、6つの時点で便のビロームの組成と存在量を比較した。そして、腸内ビロームと腫瘍増殖との相関関係を確立した。
結果
2.1. 腫瘍の数と大きさは治療後のマウスの老化とともに増加した。
大腸新生物の発生過程における腸内ビロームの変化を調べるため、AOM投与マウス8匹とPBS投与マウス8匹から、6つのタイムポイントにわたって合計96個のサンプルを採取した。マウスの体重は加齢とともに増加したが、AOM投与マウスとPBS投与マウスの間に有意差は認められなかった（図1a）。大腸内視鏡を用いると、PBSとAOMを投与したマウスでは、注射から12週間後に初めて大腸腫瘍が観察された（図1c,d）。注射後12週目に、8匹のPBS投与マウスのうち2匹に1匹ずつ腫瘍が認められた（図1c,dおよび補足データS1）。これらの腫瘍のうち1つは注射12週目以降に消失したが、もう1つの腫瘍は実験の残りの期間を通してその大きさが増大することはなかった（図1cおよび補足データS1）。対照的に、AOM投与マウスでは、これらの腫瘍の数と大きさはマウスの加齢とともに増加し、24週目にはマウス1匹当たり最大17個の腫瘍が観察された（補足データS1）。大腸内視鏡検査で同定された正常組織と腫瘍組織は、異なる時点で採取された生検の病理組織学的検査で検証された（図1eおよび補足データS1）。二元配置分散分析（ANOVA）検定では、12週目からAOM投与マウスとPBS投与マウスの間で腫瘍の大きさに有意差が認められ（p < 0.05）（図1b）、14週目から腫瘍の数に有意差が認められた（p < 0.05）（図1c）。これらのデータは、AOMが注射後12週目から大腸新生物を誘導し、マウスが老化すると新生物が成長することを示唆している。
図1 （a）AOM投与マウスとPBS投与マウスの体重（g）。(b) 0週、10週、12週、14週、20週、24週におけるAOMおよびPBS投与マウスの平均腫瘍サイズ。(c）AOM投与マウスとPBS投与マウスの0、10、12、14、20、24週目の平均腫瘍数。(* p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001; **** p ≤ 0.0001)。(d)AOMを投与したマウスの初回注射後1週間における代表的な大腸内視鏡画像。腫瘍は黒丸で囲んだ。(e）AOM投与マウスから採取した大腸生検の代表的なH&E画像。スケールバー＝50μm。
2.2. 大腸新生物における腸内ウイルスの多様性の変化（腫瘍が最初に出現した時
まず、観察されたOVU数、シャノン多様性、およびBray-Curtis指標を用いて、治療と時間の間のビロームの違いを評価することにより、腸内ビロームの多様性に対する大腸新生物の影響を調べた。AOMを投与したマウスでは、観察されたOVU数に各時点での有意な減少は観察されなかった（図2a）。しかし、PBS投与マウスでは、0週目（p値0.001、Q値0.002）および12週目（p値0.007、Q値0.009）と比較して、20週目にOVU数の有意な減少が観察された。これらのパターンはAOM処理マウスでは観察されなかった（補足データS2）。AOMモデルでは、10週目（p値0.021、Q値0.083）および0週目（p値0.028、Q値0.225）と比較して、12週目に低いシャノン多様性が観察された（図2b）。PBS投与マウスでは、0週目（p値0.0002、Q値0.001）および12週目（p値0.015、Q値0.017）と比較して20週目に、0週目（p値0.003、Q値0.019）および12週目（p値0.05、Q値0.133）と比較して14週目に、シャノン多様性の有意な低下が観察された（補足データS2）。これらのデータは、加齢がシャノン多様性の減少に寄与している可能性を示唆しており、一方、最初の腫瘍の発生はこのシャノン多様性の減少の早期発症に関連している。
図2 （a）観察されたOVU数に基づくアルファ多様性。(b）シャノン多様性に基づくアルファ多様性。パネルaおよびbについて、箱ひげ図は中央値（中央の線）、25パーセンタイル、75パーセンタイル（箱）を示し、pはペアワイズ・ウィルコクソン検定により算出した。
AOMモデルでは、0週目と比較して12週目、14週目、24週目にウイルスプロファイルの有意なシフトも観察された（PERMANOVA、p値0.001、Q値0.066）（図3）。0週目のAOMビロームは12週目のビロームからシフトしたが、20週目と24週目には元の位置に戻ったが、ベータ多様性の変化は有意ではなかった（補足データS3）。PBS投与マウスでは、ウイルスプロファイルの有意な変化は観察されなかった（Q値カットオフ0.1）。これらのデータは、最初の腫瘍が出現して以来、腸内ビロームの多様性が変化していることを示唆している。
図3. PBS投与マウスとAOM投与マウスのウイルスプロファイルの週ごとの分離を示す主座標分析プロット。黒矢印は、0週目、10週目、12週目におけるAOMビロームのウイルスプロファイルの変化を示す。
2.3. 腸内ビロームの構成と大腸新生物に濃縮されるウイルス
OVUの55％以上が未分類であるため、ビローム組成分析は分類されたOVUについてのみ行った。ファミリーレベルでは、OVUの76.51±4.21％が未分類であった。ファミリーレベルで分類されたOVUは、シホウイルス科（13.56±3.42％）およびミオウイルス科（9.59±1.24％）のバクテリオファージで占められていた（図4a）。属レベルでは、96.4 ± 0.8%のOVUが未分類であった（図4b）。属レベルで未分類のOVUを除くと、Lagaffevirusのメンバーが最も多く（1.57±0.41%）、次いでBrunovirus（0.94±1.13%）、Toutatisvirus（0.47±0.23%）であった（補足図S1）。ブルノウイルスは、AOMおよびPBS処理マウスの両方で12週目に存在量が急増したが、この存在量の変化は有意ではなかった（ダンの検定、p > 0.05）（補足図S1）。種レベルで注釈付けされたOVUはなかった。このビロームの構成は分類されたOVUから得られたものであるが、多くのウイルスが分類学的に十分に特徴づけられていないため、科および属レベルでは未分類のウイルスが依然としてかなりの割合を占めていた。
図4 (a) 平均相対存在量(%)上位11のウイルスファミリーの積み上げ棒グラフ。(b) 平均相対存在量(%)が上位12位までのウイルス属の積み上げ棒グラフ。(c)10週目におけるAOMモデルとPBSモデルで有意差のあるウイルス種の線形判別分析（LDA）スコア（p < 0.05、LDAスコア > 2.0）。(d)24週目における、AOMモデルとPBSモデルで有意に豊富なウイルス種のLDAスコア（p < 0.05、LDAスコア > 2.0）。LDAスコアは、各分泌量の異なる分類群の効果の大きさと順位を示している。
OVUレベルおよび属レベルのウイルスがAOMモデルとPBSモデルで濃縮または減少しているかどうかを調べるために、LEfSeアルゴリズムを用いて、各時点におけるAOM処置マウスの腸内ビローム組成をPBS処置マウスのそれと比較した。属レベルでは、PBS投与マウスでは10週目にToutatisvirusが濃縮された（図4c）。BrunovirusとHpunavirusは24週目にAOMモデルマウスで濃縮され、Fromanvirusは24週目にPBSモデルマウスで濃縮された（図4d）。AOM モデルで濃集した OVU とウイルス属は、腫瘍ビロームに関連している可能性がある。1つ以上のタイムポイントで一貫して濃縮されたウイルス属はなかった。0週目、12週目、14週目、20週目では、有意に豊富な属は同定されなかった。
OVU レベルでは、AOM 群で 2 つの OVU が 3 つ以上のタイムポイントで濃縮された。OVU#200524は10週、12週、14週、24週に、OVU#208593は0週、10週、20週に濃縮された（表1）。逆に対照群では、OVU#272093、OVU#79336、OVU#175582、OVU#99458の4つのOVUが一貫して濃縮されていた（表1）。初期時点（0週、10週、12週）で濃縮されたほとんどのOVUとは異なり、OVU#99458は後期時点（14週、20週、24週）で濃縮された。いずれのグループでも濃縮されたOVUの全リストは補足データS4に記載されている。
表1. LEfSe による比較で AOM と PBS モデルで濃縮された OVU。
2.4. 腸内ウイルスと腫瘍増殖との関連性
ウイルスと腫瘍特性の相関を調べるために、RパッケージMaAsLin2を用いて相関解析を行った。MaAsLin2は、AOM処置マウスにおける注射後週数と有意な正の相関を示した8つの高濃度OVUを同定した（Q≦0.05）（図5a）。8つのOVUのうち、7つは未分類で、1つはBrunovirus属に属していた（OVU#24213）。これらのOVUはいずれも、PBS処理マウスにおける時間と有意な相関は認められなかった（補足データS5）。腫瘍数と有意な相関を示した OVU は 1 つだけで、この OVU は時間と有意な相関を示さず、分類されていない（図 5b）。注射後週数と有意な相関を示したOVUのうち3つは、腫瘍の大きさとも有意な正の相関を示した（図5c）。そのうち2つは未分類で、1つはブルノウイルス（OVU#24213）に分類された。興味深いことに、AOMモデルで一貫して濃縮されていることが判明したOVU#200524もまた、週数（Q < 0.0001）および腫瘍サイズ（Q値0.0002）の両方と有意に相関していた。これらの OVU の存在量は、AOM モデルにおいて週数、腫瘍サイズ、腫瘍の特徴とともに増加したことから、これらの OVU は腫瘍の増殖と関連している。有意な相関を示した未分類の OVU の Fasta 配列を補足データ S6 に示す。腫瘍サイズおよび腫瘍数と有意に相関する OVU の存在量を補足図 S2 に示す。
図 5. (a) 発がん物質（AOM）投与マウス（n = 48）における注射後週数と有意に相関する OVU の存在量。X軸は週数、Y軸はOVUとその相関係数。有意な相関はすべてQ値≦0.05である。(b）発がん物質（AOM）投与マウス（n＝48）におけるOVUの存在量と腫瘍数の相関。(c) 発がん物質（AOM）投与マウス（n = 48）におけるFPKMカウント≧1000のOVUの存在量と腫瘍サイズの相関。パネルbとcについて、オレンジ色の線は線形回帰直線、オレンジ色の領域は傾きの95％信頼区間を示す。
2.5. ウイルス属間のネットワーク相関と腫瘍増殖との関連性
あるウイルス属が腫瘍増殖と関連しているかどうかを判定するために、eLSAを用いて、分類されたウイルスと腫瘍の特徴との間の線形および非線形の関連を明らかにした。その結果、腫瘍の数、腫瘍の大きさ、週数は互いに正の相関を示した（図6）。2つのウイルス属が週、腫瘍サイズ、腫瘍数と有意な正の相関を示した、すなわちBrunovirusとHpunavirusであった（図6）。ラボックウイルスは、相関は弱いが腫瘍の成長と有意な負の相関を示した（図6）。ブルノウイルスは他のウイルス属とも相関があり、ラガフウイルスやムシュウイルスとも負の相関があった（図6）。LagaffevirusとMushuvirusも他のウイルス群と相関があることから、このネットワークには2つの主要なウイルス群があると推測できる。一方のグループは腫瘍増殖と正の相関を示し、もう一方は腫瘍増殖と負の相関を示している。相関の詳細とそれに関連する正規化LS値は補足データS7に記載されている。腫瘍増殖と有意に相関するウイルス属の存在量プロットを補足図S3に示す。
図6. 分類されたウイルス種と腫瘍の特徴との間の関連ネットワーク。統計的に有意（p≦0.05、Q≦0.1）かつ強い相関（正規化局所類似度（LS）値≧0.4および≦-0.4）のみを図に示す（ウイルス種と腫瘍の特徴の相関を除く）。ノードの大きさは次数に比例し、色は対応する属を表す。円形のノードはウイルス種を表し、三角形はメタデータを表す。線の太さは正規化LSスコアの絶対値に比例する。赤い線は正の相関、青い線は負の相関を表す。
考察
最近の研究で、CRC患者は健常対照群と比較して腸内ビロームが変化していることが示された。我々の知る限り、本研究は大腸新生物の発生過程における糞便ビロームを解析した初めての縦断的研究である。われわれは、腸内ビロームの変化が腫瘍発生中に起こることを示し、腫瘍増殖に関連する可能性のあるウイルスを同定した。
AOMを投与したマウスでは、腫瘍が最初に出現した12週目に、α多様性が有意に低下し、ウイルスプロフィールが変化することが示された。ヒトのCRC患者においてビロームの多様性の増加を示した中津らの研究とは異なり、我々はマウスモデルにおいてビロームの多様性の減少を示した[17]。この矛盾した所見は、我々の研究がヒトのCRCではなく、ポリープのあるマウスで行われたためかもしれない。それにもかかわらず、我々の所見は、腫瘍形成が腸内ビロームの変化と相関していることを示している。興味深いことに、このようなビロームの変化パターンは対照マウスでは観察されず、腫瘍が最初に出現した時にのみ生じた。この点から、この多様性の変化は、加齢による影響というよりも、むしろ腫瘍に関連した影響である可能性が高い。
12週目のAOM処置マウスにおけるα多様性の減少に加えて、20週目のPBSモデルマウスでもα多様性（観察されたOVU数とシャノン多様性の両方）の有意な低下が観察されたが、このパターンはAOMモデルでは検出できなかった。我々は、PBSモデルにおけるこのアルファ多様性の変化は老化によるものであり、AOMの注入がこの老化を促進するため、アルファ多様性の減少がより早い時期（12週目）に観察されたという仮説を立てた。もうひとつの仮説は、決定的な結論を出すにはサンプル数が少なすぎたということである。PBS投与マウス、AOM投与マウスともに、有意な減少が見られた後の時点におけるシャノン多様性は、減少前の初期時点のものと比べて有意な変化は見られなかった。もし我々の最初の仮説が正しければ、減少後の時点における変化は、減少前の初期の時点における変化と比較して、統計的に有意なままであるはずである。しかし、そのような変化は観察されなかった。これは、大きなエラーバー（図2b）から明らかなように、後の時点ではシャノン多様性のばらつきが大きいためと考えられる。したがって、今後サンプル数を増やして同じ実験を行い、どちらの仮説が正しいかを検証する必要がある。
ビロームの未解明とウイルス（我々の配列の55％以上を占める）の分類学的情報の不足を考慮し[19]、ビローム解析をまずOVUレベルで行った。腫瘍の成長と相関する4つのOVUを同定したが、最も重要なOVUはOVU# 200524で、腫瘍の大きさおよび週と有意な正の相関を示し、AOMビロームで一貫して濃縮されている。しかし、このOVUは未分類であるため、さらなる解析を行わなければ、それ以上の情報は推測できない。OVU#24213とOVU#73531も腫瘍増殖と正の相関があり、Brunovirus属に分類される。Brunovirusもまた、属レベルの相関で腫瘍増殖と正の相関を示し、AOMモデルの24週目に濃縮されていることから、腫瘍発生に関与している可能性が高い。興味深いことに、この属はAOMモデルでもPBSモデルでも12週目以降にのみ存在するが、AOMモデルでの存在量はPBSモデルに比べてはるかに高い。このパターンの理由は不明である。Brunovirusに加え、Hpunavirusも腫瘍増殖と正の相関があり、AOMモデルでは24週目に濃縮される。一方、ラボックウイルスは腫瘍増殖と負の相関があり、腫瘍増殖を抑制する役割を担っている可能性を示唆している。これらの重要なウイルス属はすべて、ミオウイルス科に属するバクテリオファージであり、CRCのビロームシグネチャーがミオウイルス科のOVUによって駆動されていることを示したHanniganらの知見と一致している[18]。同じ科のウイルス属は腫瘍増殖と正反対の関連を示すため、より信頼性の高い関連を同定するためには、科レベルより低いレベルでの相関解析が重要である。中津らは、Orthobunyavirus、Inovirus、Tunalikevirusのような属レベルで重要なウイルスを同定したが、我々が分類したOVUの中にはこれらのウイルス属に属するものはなかった［17］。
本研究では、大腸新生物におけるビロームのシグネチャーの同定に主眼を置いたため、細菌とバクテリオファージの相互作用は評価しなかった。細菌、バクテリオファージ、およびそれらの哺乳類宿主間の相互作用を解析することを含むさらなる研究が、哺乳類宿主および周囲の微生物群集がバクテリオファージによってどのような影響を受けるかを明らかにするために必要である（もしあれば）。もしバクテリオファージと細菌との間に特異的な相互作用が見出された場合、その相互作用をin vitroおよびin vivoの実験によってさらに検証する必要がある。
我々の研究にはいくつかの限界がある。第一に、腸内ビロームの変化が腫瘍形成の前後に起こったかどうかを確認するのに十分な時点を配列決定していない。われわれの既存のデータは、AOMモデルにおいて12週目にシャノン多様性の有意な減少とウイルスプロファイルの変化を示しているが、腫瘍は12週目にすでに形成されていた。したがって、他の時点を調べない限り、ビロームの変化が腫瘍形成の前後で起こったかどうかを推論することはできない。腫瘍形成前後の時点、例えば11週目や13週目を調べれば、ビロームの変化がいつ起こったかをより正確に知ることができる。第二に、糞便ビロームは粘膜ビロームを反映していない可能性がある。以前の研究では、糞便サンプルと粘膜サンプルの微生物叢は有意に異なっていた（ペアでも非ペアでも）が、CRC患者と対照の間の差は依然として明らかであった[20]。粘膜のビロームの解析は技術的にまだ困難である。生きたマウスの大腸内視鏡検査で得られたマウスの大腸生検や、異なる時点で安楽死させたマウス群から得られたマウスの大腸組織は、大腸がん発症の初期段階で腫瘍が非常に小さかった場合、下流のビローム抽出と組織学的検査の両方に十分な大きさではない。このような早期の時点が分析されなければ、腫瘍の発生過程における粘膜ビロームの重要なプロフィールが見逃されることになる。糞便DNAの大部分（〜99％）はバクテリオームとビロームに属するため、糞便DNAからより完全なウイルス配列を容易に同定することができる。対照的に、大腸組織から抽出された粘膜ビロームのDNAは、全組織DNAの90％以上を占めるマウスのDNAと遺伝的かつ必然的に混同された。宿主DNAに対するウイルスDNAの比率が低いため、糞便DNA配列決定と同じ深さの配列決定を行った場合、ウイルス配列の発見の妨げとなる。一つの解決策は、宿主DNA配列のストリンジェントなフィッティングを行った後、十分なシーケンスリードを得るためにシーケンス深度を深くすることであるが、これは現時点では財政的に不可能である。もう一つの解決策は、DNA抽出と塩基配列決定の前に、マウスの大腸組織からウイルス様粒子（VLP）を分離することである。これは今後の研究課題である。第三に、ウイルソームはマウスの種類や感染源によって異なる[21]。したがって、本研究の実験は今後、異なる動物施設やペットショップのマウスを使用して繰り返す必要がある。あるいは、我々の主な目的はヒトのビロームの変化とCRC発症の関係を理解することであるため、将来的にはCRC発症に伴うビロームの変化を解析するために、健常人や腺腫またはCRC患者のヒト糞便ビロームを我々のモデルマウスに移植することも実施する予定である。第四に、我々はdsDNAの塩基配列しか決定していないため、潜在的に重要なssDNAウイルスやRNAウイルスを見逃している可能性がある。最後に、本研究で使用したA/Jマウスは、他のマウス系統と比較して、AOM誘発腫瘍の発生に対して非常に感受性が高いことが以前に示されている[22]。A/Jマウスのこの高い感受性は、大腸腫瘍形成からマウスを保護することが示されているNaip5遺伝子[23]の欠損に起因している可能性がある[24]。このことは、PBSを投与したマウスの一部で自然発生的な大腸腫瘍が観察された理由を説明することができる。PBSを投与したマウスでは、これらの腫瘍の発生率、多発性、大きさはAOMを投与したマウスよりも有意に低かったが（図1）、このことがビロームのプロファイルを阻害している可能性がある。従って、将来C57BL6のようなNaip5遺伝子が機能するマウスで我々の結果を検証することが極めて重要であろう。
しかしながら、前述のように、バクテリオファージと細菌との相互作用は評価されていない。さらに、これらの新規バクテリオファージがヒトの生物学的変化やヒト細胞との直接的相互作用に寄与する遺伝子を持つかどうかを決定するためには、さらなる機能解析が必要である。ビロームの濃縮技術の発達に伴い、粘膜ビロームのショットガンメタゲノミクスが実現可能になってきている。大腸新生物における重要なOVUとウイルス属の発見は、腺腫-癌のシークエンスに沿った粘膜ビロームの変化を探索し、一貫した変化が観察されるかどうかを比較するための将来の方向性を提供する。ビローム解析、特に真核生物のウイルス解析に特化したバイオインフォマティクスツールの開発も重要である。最近では、VIBRANTのようなツールが、混合微生物配列からウイルスを回収するのに非常に役立っている。しかし、VIBRANTはバクテリオファージのみを同定することができ、真核ウイルスは同定することができない。したがって、大腸新生物の腸内ビロームの理解を深め、既知のウイルスやウイルス性暗黒物質がどのように大腸新生物の発生に関与しているのかについてのメカニズム的洞察を得るためには、ビロームの濃縮・抽出技術やビローム解析ツールの改良に継続的に取り組む必要がある。
要約すると、我々の解析は、大腸新生物の発生とともにウイルスプロファイルの変化が、大腸発がんの促進に重要な役割を果たしている可能性を示している。このことは、大腸癌の予防と治療のための新規治療法の開発への洞察を与える。
材料と方法
4.1. 研究デザインとサンプル収集
この動物実験(18/153A)はUNSW動物倫理委員会の承認を得た。16匹のマウスをAnimal Resources Centre (Canning Vale WA 6970 Australia)からBiological Resources Centre (BRC)を経由して購入した。マウスは12週齢でBRC St Georgeに到着した。到着後7日間、検査と馴化を行った。体重測定は1週間に1回繰り返した。週1回のマウス体重測定中に、排便により便サンプルが採取された。
馴化期間後、雌雄各4匹のA/Jマウスに毎週8mg/kgのAOMまたはPBSを6週間腹腔内注射し、マウスの大腸を大腸内視鏡検査で隔週モニターした。各マウスの大腸内視鏡検査において、異なる時点で少なくとも1対の内視鏡的に正常な組織と腫瘍組織を生検した。組織はホルマリン固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色し、病理学者が盲検で検査した。0週目、10週目、12週目、14週目、20週目および24週目の便サンプルを下流解析に供した。腫瘍の数は大腸内視鏡ビデオの解析により算出し、腫瘍の大きさは公表されたプロトコール [25]に従って、腫瘍が占める結腸内腔の直径に基づいてスコア化した。
4.2. DNA 抽出およびショットガンメタゲノムシークエンシング
PSP® Spin Stool DNA Kit（ThermoFisher, MA, USA, #IVK1038110300 ）を用いて、製造元の説明書に従って便検体から DNA を抽出した。簡単に説明すると、Qiagen TissueLyser II（Qiagen, MD, USA #85300 ）を用いて便を機械的に溶解した。不純物の除去後、DNAを溶出し、Qubit dsDNA HS Assay Kit（Life Technologies, MA, USA #Q32853 ）とQubit Fluorometer（Life Technologies, MA, USA）を用いて濃度を測定した。
ショットガンメタゲノムシークエンサーのためのライブラリー調製は、Nextra DNA Flex Library Prep (Illumina, CA USA, #20018705 )を用い、メーカーの指示に従って行った。ライブラリーは、Ramaciotti Centre for Genomics（UNSW、シドニー、オーストラリア）のNovaSeq 6000 Sequencing System（Illumina, CA USA, #20012850 ）でシーケンスした。
4.3. メタゲノム配列解析と分類
バイオインフォマティクス解析は、社内のバイオインフォマティクス・パイプラインを用いて行った（補足図S4）。BBMap2パッケージ（https://sourceforge.net/projects/bbmap/ 2020年3月12日アクセス）のclumpify（パラメータdedupe）を用いて、ペアエンドfastqリードの重複をグループ化し、重複を除去した。Fastpを使用して低品質リードを除去し、デフォルトパラメータ[26]で低品質塩基が末尾にあるリードをトリミングした。ホストのコンタミネーションは、minimap2を用いてGRCm38マウスリファレンスゲノムにリードをマッピングすることで除去した[27]。汚染除去したペアエンドリードファイルは、MEGAHITv1.2.9（meta-sensitive pre-set）[28]を用いてアセンブルした。アセンブルされたコンティグはすべてVIBRANTの入力として取り込まれ、ウイルスコンティグ（VC）を同定した[29]。さらに、Kraken2によってウイルスとアノテーションされたアセンブルされたコンティグも抽出された[30]。VIBRANTとKraken 2から得られた5 kb以上のVCはマージされた。VCはCD-HIT-ESTを用いてクラスタリングし、95%の配列同一性、短い方の配列の90%のアラインメントカバレッジ、95%の長さの差のカットオフ（-c 0.95, -aS 0.9, -s 0.95）でOVUを生成した[31]。分類のアノテーションには、vConTACT2とKraken2の2つのツールを使用した[30,32]。Kraken2はkmerベースのアプローチを採用しており、配列中の各k-merは参照データベース中のそのk-merを含むゲノムの最小公倍数祖先にマップされる。配列の分類は、配列中の各k-merをデータベースに照会し、その結果得られた最小公倍数祖先（LCA）分類群のセットを使用して、配列の適切なラベルを決定することにより行われる[30]。Kraken2とは異なり、vConTACT2は、ユーザーから与えられたゲノムと参照データベースからタンパク質をクラスタリングすることにより、分類学的割り当てを行います[32]。クラスタ化されたOVUに対して、ウイルスクラスタ(VC)およびVCサブクラスタを参照ゲノムと比較することで分類情報を決定する。OVUが参照ゲノムと同じVCサブクラスター内にある場合、それらは同属である可能性が高い。OVUが参照ゲノムと同じVC内にあるが、同じサブクラスターにはない場合、2つのゲノムは属-亜科レベルで関連している可能性が高い[32]。この方法は新しいウイルスの発見を可能にするが、原核生物ウイルスまたは古細菌ウイルスのみを含む構築済みデータベースを使用するため、原核生物ウイルスにしか機能せず、属レベルまでしか割り当てられない。ビロームのより包括的なアノテーションを得るために、vConTACT2とKraken2の結果を統合した。vConTACT2には「ProkaryoticViralRefSeq201-Merged」データベースを使用し、デフォルト設定で実行しました[32]。Kraken2はkraken2メタゲノムウイルスデータベース[33]を用いて実行した。
4.4. 統計解析
Bowtie2を用いて生のシーケンスリードをOVUにマッピングし、各サンプル内のOVUの存在量を計算した[34]。OVUリードカウントはfragments per kilobase per million (FPKM) mapped readsで正規化した。10kb以上のOVUを多様性解析に用いた。α多様性はotuSummary [35]を用いてOVUレベルで計算し、グループ間の差異を判定するためにKruskal-Wallis検定、Dunn検定、ペアワイズWilcoxon検定を行った。β多様性はBray-Curtis指標を用いて計算した。統計的有意性はPERMANOVA検定（PERM = 999）で評価した。すべてのp値はBenjamini-Hochberg多重検定補正を用いて調整した。<0.05のp値は統計的に有意とみなした。多様性の計算はすべてRパッケージPhyloseqとVeganパッケージ[36,37]を用いて行った。すべてのプロットはRパッケージggplot2 [38]を用いてプロットした。
4.5. 存在量の差、相関分析、ネットワーク分析
AOMマウスとPBSマウスにおけるビロームの特徴に違いがあるかどうかを調べるために、線形判別分析（LDA）の効果量（LEfSe）を用いて、これらのモデルで濃縮されたウイルスを同定した。α値≦0.05を有意とみなし、効果量LDAスコアのカットオフは2とした[39]。OVU、時間、腫瘍の特徴（腫瘍の大きさ、腫瘍の数）の間の有意な相関を検出するために、RパッケージMaAslin2を用いて相関分析を行った[40]。低濃度OVU（FPKMカウント≦1000）は、週および腫瘍サイズとの相関分析から除外した。有意性のQ値閾値は0.05とした。さらに、分類されたウイルスと腫瘍の特徴との間の線形および非線形の関連性を明らかにするために、拡張局所類似度解析（eLSA）が用いられた[41]。局所類似度（LS）スコアの有意性は、1000回の並べ替えに基づく。LSスコアは、すべてのLSスコアを最大LSスコアの絶対値で割ることにより標準化した。標準化LSスコア≧0.4および≦0.4（腫瘍特性とのウイルス関連を除く）の相関、p値≦0.05、Q値≦0.1を有意とみなした。ELSAネットワークはCytoscape [42]を用いて可視化した。
補足資料
図S1：分類されたウイルス属のスタックバープロット；図S2：OVUの平均存在量（FPKMカウント）プロット；図S3．図S3：重要な属の存在量（FPKMカウント）と週、腫瘍サイズおよび腫瘍数の散布図；図S4．データS1：AOM PBSマウスの特徴、データS2：異なるサンプル時間におけるOVU数とシャノン多様性の比較、データS3：異なるサンプル時間におけるβ多様性の比較：データS3：異なるサンプル時間におけるベータ多様性の比較；データS4：データS4：OVUレベルでの完全な差分存在量表；データS5：OVUの存在量、週および腫瘍の特徴間の相関分析；データS6：データS6：週、腫瘍サイズまたは腫瘍数と有意に相関するOVUのFasta配列；データS7：データS7：ウイルス属間およびウイルス属と腫瘍の特徴との相関。
著者貢献
構想、E.E.-O.、X.-T.J.およびH.C.H.Y.、方法論、H.Z.、S.K.、C.H.、K.Y.F.、A.P.、T.P.、J.B.およびE.K.A.M.、ウイルス解析パイプライン、X.-T.J、解析、Y.L.、執筆、Y.L.、監修・執筆・校閲・編集、E.E.-O.、X.-T.J.、H.C.H.Y. 著者全員が本原稿の出版版に同意している。
資金提供
E.E.O.、X.-T.J.およびH.C.H.Y.は、オーストラリア連邦政府からSt George and Sutherland Medical Research Foundationへの助成金を受けている。
施設審査委員会声明
動物実験プロトコルは、ニューサウスウェールズ大学の施設審査委員会（または倫理委員会）により承認された（プロトコルコード18/153A、承認日2018年11月29日）。
インフォームド・コンセント
該当なし。
データの利用可能性に関する声明
本研究の結果を裏付ける配列データは、主要アクセッションコードでNational Center for Biotechnology Information（NCBI）に寄託されている： PRJNA801109。
利益相反
著者らは利益相反がないことを宣言する。資金提供者は、本研究のデザイン、データの収集、分析、解釈、原稿の執筆、結果の公表の決定に関与していない。
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Li,Y.；Zhang,F.；Zheng,H.；Kalasabail,S.；Hicks,C.；Fung,K.Y.；Preaudet,A.；Putoczki,T.；Beretov,J.；Millar,E.K.A.；他。大腸がんモデルマウスにおいて、糞便DNAウイルスが大腸腫瘍の発生に関連する。Pathogens 2022, 11, 457. https://doi.org/10.3390/pathogens11040457
AMAスタイル
大腸癌のマウスモデルにおいて、糞便DNAウイルスが大腸新生物の発生と関連している。Pathogens. 2022; 11(4):457. https://doi.org/10.3390/pathogens11040457
シカゴ/トゥラビアンスタイル
Li, Yingshi, Fan Zhang, Huimin Zheng, Sanjna Kalasabail, Chloe Hicks, Ka Yee Fung, Adele Preaudet, Tracy Putoczki, Julia Beretov, Ewan K. A. Millar, and al. 「Fecal DNA Virome Is Associated with the Development of Colorectal Neoplasia in a Murine Model of Colorectal Cancer" Pathogens 11, no. 4: 457. https://doi.org/10.3390/pathogens11040457
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