スズメ目鳥類におけるほぼ（？

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スズメ目鳥類におけるほぼ（？

Nearly (?) sterile avian egg in a passerine bird

https://academic.oup.com/femsec/article/100/1/fiad164/7480268?searchresult=1&login=false

マルティン・ティエシッキー, ルーシー・シュミエドヴァー, テレザ・クラジジングロヴァー, メルセデス・ゴメス・サムブラス, ペトラ・バウエロヴァー, ヤクブ・クライジンガー, ミハエル・ヴィンクラー
著者ノート
FEMS Microbiology Ecology, 100巻, 1号, 2024年1月, fiad164, https://doi.org/10.1093/femsec/fiad164
発行

2023年12月19日
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見解

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要旨
脊椎動物の個体発生初期において、マイクロバイオームは消化管の発達、免疫、生存に影響を及ぼす。鳥類の卵は、(1)最初は無精卵であり（無精卵仮説）、(2)排卵後に殻の水平移動によってコロニー形成されるか、(3)母卵管からの垂直移動によって細菌が最初に播種されると考えられている。しかし現在までのところ、鳥類の胚における腸内細菌叢形成にこれらのメカニズムが寄与していることを示す実証的データはほとんどない。我々は、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定と微生物特異的qPCRアッセイを組み合わせた方法論的に高度な手法を用いて、放し飼いの鳥類であるシジュウカラ（Parus major）の卵内容物（0日目；E0-egg）、13日目の胚性腸（E13）、およびメスの糞便のマイクロバイオームを調査した。メタバーコーディングの結果、鳥類の卵は（ほぼ）無精卵であるが、胚発生の過程でやや豊富なマイクロバイオームを獲得することが明らかになった。qPCRで対象とした3種類の潜在的病原性細菌のうち、E0卵（陰性対照でも検出）、E13腸、雌のサンプルで検出されたのはDietziaのみで、これは垂直移行の可能性を示しているのかもしれない。家禽類とは異なり、パセリ類では孵化前に腸内の主要な細菌コロニー形成は起こらないことが示された。細菌バイオマスの少ないサンプルを用いた研究では、環境汚染を注意深くチェックするプロトコルが重要であることを強調する。
卵マイクロバイオーム、胚、消化管微生物叢、スズメ目鳥類、病原性細菌、無菌卵
問題のセクション
研究論文
はじめに
腸内細菌叢は宿主の生理学において最も重要な役割を果たしており、栄養素の消化（Bäckhed et al. 2005）、消化管（GIT）、および免疫系の調節（Ost and Round 2018）、腸-脳軸のシグナル伝達（Strandwitz 2018）、さらには疾患の発症（Honda and Littman 2012）にまで影響を及ぼす。微生物学で最も不可解で議論されている問題の1つは、腸内細菌叢が動物の出生前／孵化後に形成されるのかどうかということであるが、これを検証するのは方法論的に困難である。初期の次世代シーケンシング（NGS）研究では、出生前の胚への母体マイクロバイオームの伝達は、ヒトを含む動物において普遍的である可能性が示唆されていたが（Funkhouser and Bordenstein 2013など）、これらの研究は現在、環境汚染の増加とシーケンシングのアーティファクトに苦しんでいると考えられている（Eisenhofer et al.） 現在では、ヒトの胎盤と胎児は生理的条件下では無菌であり、新生児の腸は出生後にのみコロニー形成されると仮定されている（Walker et al.2017、de Goffau et al.2019、ただしKennedy et al.2023を参照）。最近の研究の中には、胎児の腸内に乏しく、存在量の少ない微生物群集が存在することを証明するものもあるが（Rackaityteら、2020年、Biら、2021年、Mishraら、2021年）、これらの結果は、サンプリング手順中の汚染にも悩まされている可能性が高いとして、Kennedyら（2023年）による最近の群集レビューでは疑問視されている。鳥類の卵も最初は無精卵なのだろうか、それともメスが卵の中に細菌を沈殿させて胚マイクロバイオームの初期発達を促すのだろうか？初期の細菌コロニー形成者はGITと免疫系の発達を形成し、孵化後のヒナの微生物群集の生存と構成に影響を与える可能性があるため、これは関連した質問である（Hansen et al.） しかし、卵の微生物コロニー形成源と胚微生物叢の発達のタイミングは、鳥類ではまだ十分に理解されていない。
鳥類の初期腸内細菌叢の起源を説明するために、相互に非排他的な3つの仮説が提唱されている。無菌卵仮説（1）は、鳥類の卵は最初に雌の生殖管内で無菌的に形成されると仮定している（Roto et al.） そのためには、雌の卵管内に細菌が存在しないか、宿主の卵管生理的フィルターが存在し、発育中の卵への細菌のコロニー形成を防いでいる必要がある（Lee et al.） 無精卵仮説は、培養に基づく研究の時代に特に影響力を持ったが（Roto et al. 2016に総説あり）、最近では16S rRNA遺伝子のメタバーコーディングによって卵の微生物群集がいくつか検出されている（下記参照）。鳥類の卵は、いくつかの物理的（クチクラ、結晶卵殻、殻膜；Liongら 1997、Lunam and Ruiz 2000、D'Alba and Shawkey 2015）および化学的メカニズム（例えば、溶菌活性を有する抗菌ペプチド；Mann 2007、Gantoisら 2009、Cuperusら 2013）によって十分に保護されており、侵入微生物にとって敵対的でない環境を作り出している。したがって、GITの主要な微生物コロニー化は孵化後にのみ起こりうる。しかしながら、代替案として、卵の保護にもかかわらず、(2)母体の生殖管で形成される間に垂直移動によって、および/または(3)産卵後に環境から水平的な殻を越えて移動することによって、細菌が卵をコロニー化する可能性が提案されている(Pedroso 2009, Roto et al. 2016)。
垂直移行の場合、細菌は主に雌の卵管から発育中の卵に移行し、肛門内で受動的に上昇するコロニーに由来するか、マクロファージや樹状細胞によって雌のGITから直接能動的に輸送されると考えられている（Gantois et al.） 特にサルモネラ菌のような病原体については、経口感染した鶏が汚染卵を産むという垂直伝播が示唆されている（Kellerら 1995, Gantoisら 2009, Pedroso 2009）。しかし、このような垂直伝播の頻度は一般的に非常に低い（例えば、卵白から検出されるサルモネラの場合、通常0％～4.5％だが、研究によっては20％に達することもある。） 同様の低い垂直移動頻度は、NGSメタバーコーディングを用いた家禽類（Lee et al.2019）や鳥類（Trevelline et al.2018）の常在細菌叢でも最近示唆されている。
細菌の水平経殻移動は、細菌が卵殻孔を通して卵の層着後にのみコロニー形成すると仮定している（Bruce and Drysdale 1994）。したがって、胚の腸内微生物群集は、巣の環境から移動してきたバクテリアによって確立され（Van Veelen et al. 2018, Lee et al. 環境中のナイセリア菌など一部の細菌は、オオヒシクイ（Anser albifrons; Hansen et al. 2015）の卵で卵殻を貫通し、胚死亡を引き起こすことが記録されている。卵と比較して、ニワトリ胚は、古典的な顕微鏡法（Kizerwetter-Świda and Binek 2008）と、最近では16S rRNA遺伝子のメタバーコーディング（Ding et al.） これらはPseudomonas、Janthinobacterium、Acinetobacter、Stenotrophomonas、Meganomonasなどの分類群で占められており、主にメスの卵殻、GIT、肛門に由来すると考えられる（Lee et al.）
例えば、放し飼いの種と飼育下の種、あるいは前社会的発生様式と他家的発生様式を持つ種の間で、細菌卵コロニー形成のレベルは種によって異なる可能性がある。しかし、異なるNGS研究の結果を解釈する際には注意が必要である。例えば、すべてのNGS研究が様々な種類のネガティブコントロール（抽出、増幅など）を適切に統合しているわけではなく、またPCRの複製で増幅を行っているわけでもない。ニワトリの研究（例えば、Dingら2017、2022、Leeら2019）とは対照的に、Grondら（2017）は、2羽の北極圏のヒヨドリの胚性GITにおいてごくわずかな微生物叢（陰性対照と有意差なし）しか明らかにしなかった。このことは、鳥類の卵内容物と胚性GITの微生物叢組成において観察された顕著な違いが、種間の違いによるものなのか、それとも方法論の違いによって結果が偏っている可能性もあるのかという疑問を提起している。したがって、異なるコロニー形成メカニズムが野鳥の胚微生物叢の確立にどの程度寄与しているかは、まだ解明されていない。
本研究では、野生鳥類において、卵が初期に無精卵であるかどうか（すなわち無精卵仮説の検証）と、胚発生中にどのように細菌コロニー形成が起こるか（検出された場合）（垂直移動 vs. 水平的な細菌殻通過移動）を同時に調査した。我々は、シジュウカラ（Parus major）の卵内容物と胚GITの微生物プロファイルを分析するために革新的なアプローチを採用した。2018年の繁殖期に、チェコ共和国のプラハで繁殖している放し飼いのシジュウカラ集団の57の巣から合計240の微生物サンプルを収集した。我々は、微生物組成の自然変動を覆い隠すサンプルの汚染物質を明らかにするために、特異的なqPCRアッセイとともに、方法論的に改良された16S rRNA遺伝子メタバーコードアプローチを採用した。我々の目的は、(i)産卵直後（胚0日目、E0）の卵内容物の初期微生物相を調べ、卵が初期無精卵であるかどうかを判定すること、(ii)孵化直前（胚13日目、E13）の卵内容物の初期微生物相と胚性GIT微生物相）および繁殖成雌（母体）の糞便微生物相を比較し、異なるコロニー形成メカニズムを評価することであった。特に、宿主のフィットネスに悪影響を及ぼす可能性のある病原性細菌に注目した。E13の後期に細菌を検出する能力を検証するため、E0卵にエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）を接種し、E13まで生きたまま追跡した。
材料と方法
サンプリングデザインとサンプル採取
サンプリングは、EUのチェコ共和国プラハのはずれにある落葉樹林（50˚08′12.4″N, 14˚27′57.2″E；調査地の詳細についてはTěšickýら2021, 2022を参照）の人工巣箱で繁殖している自由生活シジュウカラ個体群を対象に、2018年4月と5月の繁殖期間中に実施した。合計で、卵の中身のマイクロバイオームを採取するために52個の卵（E0-egg）、E13胚の腸を採取するために118個の卵（操作されていない、E13-nat、およびEnterococcus菌が操作された卵、E13-Ent、後述）、および34個の母体雌の糞便サンプルを採取した（異なるカテゴリーのサンプル数については、Supporting Information 1（SI1）の表S2を参照）。全体として、これらのサンプルは58の巣を代表しており、そのうち18の巣から完全なサンプルセットを入手することができた。繁殖時期は巣箱の定期的な点検（約2～7日間隔で、孵化予定日に合わせる）によって決定した。産卵順に基づき、巣箱内の全卵に永久マーカーで番号を付けた。
E0卵の自然微生物相組成を調べるため、産卵後1日以内に1クラッチにつき1個（N = 52）の産卵したての卵を採取し、実験室に運んだ。そこで層流バイオセーフティキャビネット（Jouan MSC 12, ThermoFisher Scientific, Carlsbad, USA）内で、コンタミネーションを防ぐため、卵表面を96%エタノールとDNA除去剤で洗浄した。その後、インスリンシリンジ（B Braun, カタログ番号 9151125, Melsungen, Germany）で卵殻を穿刺し、卵内容物全体、すなわち～200～300 µlを無菌的に吸引した。その後、サンプルをPCR-cleanクライオチューブ（Simport社、カナダ）に入れ、-80℃で深部凍結保存した。
胚性GIT（E13-nat）の自然微生物叢組成を調べるため、1クラッチあたり1個または2個のE13卵を採取した（N = 66）。微生物相が巣間よりも巣内でより類似しているかどうかを評価するため、合計25のクラッチから巣あたり2個のE13卵を採取した。E0卵に存在する推定細菌が我々の方法で確実に検出できることを確認するため、産卵後2日以内に卵のサブセットにE. faecium（参照株： NCIB 11181；Probiotics Lactiferm Basic 5、Chr. Hansen、Hørsholm、デンマーク、カタログ番号L-0265）を産卵後2日以内に注入した。具体的には、107コロニー形成単位（高用量）または104コロニー形成単位（低用量）濃度のE. faeciumをクラッチあたり1個目の卵（同等の結果が得られたため、これらをまとめてE13-Entと分類、N=56、「結果」のセクション参照）に10μl注入し、対照となる2個目の卵（E13-PBS）にはPBS（Sigma Aldrich、カタログ番号D5652-50 L、N=53）を10μl注入した。操作後、処理した卵は注入部位を瞬間接着剤で密封し、巣に戻し、すべてのE13卵が回収されるE13までE13-natとともに培養した（in ovoアプリケーションの詳細についてはSMMO 3、タイムラインとサンプルデザインのスキームについては図1、方法論の概要については図2を参照）。採取した E13 卵は実験室に運ばれ、インキュベーター（Brinsea Octagon 20 Advance Incubator, Brinsea Products Inc, Titusville, USA）で恒温恒湿（37.5℃、60%）に保たれた。バイオセーフティキャビネット内で、胚を無菌的に卵から取り出し、無菌シャーレ（ThermoFisher Scientific社製、カタログ番号101IRR）に置いた。その後、胚を断頭し、腸（砂肝と肛門の間のGIT部分）を採取し、RNA later（Qiagen社製、カタログ番号76106、ドイツ・ヒルデン）にて-80℃で凍結保存した。E13-Ent卵23個とE13-PBS卵29個から組織サンプルを採取することに成功したが、これは胚死亡によるもので、それぞれ元の数の41.1%と54.7%であった。
図1.
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シジュウカラ研究のスケジュールと実験セットアップ。E0-卵-胚0日目（E0）に採取した卵の内容物、E13-ナット-操作していない卵の腸内サンプル、E13-エント-腸球菌処理卵の腸内サンプル、E13-PBS-対照のPBS注入卵の腸内サンプル、F-巣齢7日目から15日目（D1-D15）の間に採取した雌の糞便サンプル。軸上のEとDはそれぞれ胚発生日とヒナ発生日を示す。
図2.
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シジュウカラ研究における卵内容物、胚腸、雌の糞便サンプル中の微生物プロファイルを測定する手順の概略図。(1) 異なる種類の生物学的サンプルを野外で採取した： (1)異なる種類の生物学的サンプルを野外で収集した：胚 0 日目の E0-卵内容物サンプル、非操作卵の E13-nat-E13 腸内サンプル、Enterococcus 処理卵の E13-Ent-E13 腸内サンプル、対照の PBS 投与卵の E13-PBS-E13 腸内サンプル、および F-雌成虫の糞便サンプル。(2)分離陰性対照(INC)を含めて細菌DNAを抽出した。16S rRNA遺伝子DNAの微生物遺伝子型を決定するために、(3)プロトコール1、P1（無クロロプラスト増幅プライマー）、プロトコール2、P2（ユニバーサル細菌プライマー）の2つのプロトコールを適用し、16S rRNAアンプリコンライブラリーを調製した。このライブラリーの塩基配列を決定し(4)、その後(5)バイオインフォマティクス解析と細菌の分類学的割り当てを行った。(6) 両方のテクニカルデュプリケートで一貫して存在するアンプリコン配列バリアント（ASV）のみを保持した。(7)潜在的な汚染物質を除去し、(8)異なる生物学的サンプルタイプにおける特定のASVの存在量に基づいて、さらに(9)シーケンスデータを統計的に解析した。これらの結果に基づき、(10) 潜在的な病原性細菌（クロストリジウム、ディエチア、コリネバクテリウム）を検出するための特異的プローブベースのqPCRアッセイを開発した。(11)qPCRアッセイの感度を高めるため、前増幅のネガティブコントロール（pre-NTC）を含む細菌ユニバーサルプライマーで鋳型DNAを前増幅した。 (12)次に、これらの前増幅DNA鋳型とqPCRのネガティブコントロール（qPCR-NTC）を用いてASV特異的qPCRを行った。 (13)qPCRから得られた陽性サンプルは、さらに独立した増幅（ステップ11と12の繰り返し）によって検証した。括弧内の数字はサンプルごとのテクニカルレプリケート数に対応する。
母親の微生物叢を記述するために、我々はまた、以前に記述した方法論（Kropáčková et al. 簡単に説明すると、巣立ちから7～14日目の鳥をミストネットで捕獲した。捕獲後すぐに新鮮な紙袋に入れ、約15～20分間飼育した。15～20分間。その後、滅菌した微生物綿棒（minitip FLOQSwabs, Copan, Italy）で糞便サンプルを採取し、RNAとともに-80℃で保存した。また、足根長および体重を測定し（足根長と体重の比として標準化体重を後で算出するため）、血液および羽毛サンプルを採取した（本研究には含まれない）。鳥の年齢は、第一燕尾と第二燕尾の羽色の違い（Svensson and Baker 1992）と鳴き声の記録から評価した。最後に、すべての鳥にプラハ国立博物館チェコ鳥類標識センターの固有コ ードを持つアルミニウム・リングを装着した。調査はチェコ共和国および欧州連合の適用法のもとで実施された。実験はプラハ市役所環境保護局（許可番号S-MHMP-1061728/2010/OPP-V-790/R-235/Bu）およびチェコ共和国環境省（許可番号22003/ENV/16-1009/630/16）の承認を得た。成鳥の捕獲と鳴き声の許可は、プラハ国立博物館のチェコ鳥類鳴禽センターから得た。
DNA分離
コンタミネーションのリスクを最小限に抑えながら微生物DNA抽出の効率を最大化するため、まず5種類の細菌DNA抽出キットの比較を行った（詳細はSI1のSupplementary Material and Methods Online 1(SMMO 1)を参照）。最終的に、DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen、カタログ番号47016）のみを用いて、層流バイオセーフティキャビネット内でいくつかの変更を加えながら、すべての微生物DNAサンプルを抽出した（SI1のSMMO 2を参照）。DNA分離効率を最適化するため、水平アダプター付きボルテックス（カタログ番号13000-V1-24；MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, USA）を用いて最大速度で10分間ホモジナイズし、抽出したDNAを溶出バッファーで55μlに溶出した。出発材料として以下のものを使用した： (1)E0卵の場合、ホモジナイズした卵内容物200 µlを滅菌水200 µlと混合したもの（ペレット形成を防ぐため）、(2)E13胚の場合、腸内サンプル、(3)雌成虫の場合、全糞便サンプル。異なる生物学的サンプルタイプ間の交差汚染を避けるため、各サンプルタイプは、クリーンな分子作業の原則（サンプル間汚染のリスクを最小化する汚染除去手順と操作）に厳密に従いながら、別々に抽出した。また、ヌクレアーゼを含まない水（卵内容物の希釈に使用したものと同じバッチ）を用いた分離陰性対照（INC）を、卵内容物サンプル（N = 7）、胚サンプル（N = 16）、雌の糞便サンプル（N = 3）の各サンプルタイプごとに別々に処理した。
微生物メタバーコーディング
我々のメタバーコーディング手法は、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域の増幅に基づくものであった。プライマーターゲット配列で異なる微生物相を検出する確率を最大化し、プライマーと増幅キットの選択の影響を最小化するために、卵内容物と胚サンプルの両方で2つの異なるプロトコルを使用した。これらの問題は、低細菌バイオマス研究において特に重要であると考えられる。プロトコル1（P1）では、非クロロプラスト増幅プライマー335F（CADACTCCTACGGAGGC）および769R（ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC）（Dorn-In et al. 2015）とKAPA2G Robust PCR Kit（Kapa Biosystems、カタログ番号KK5005、米国ウィルミントン）を併用することで、より特異的なASV増幅が可能となった。プロトコル2（P2）では、ユニバーサル細菌プライマーS-D-Bact-0341-b-S17（CCTACGGGNGGCWGCAG）およびS-D-Bact-0785-a-A-21（GACTACHVGGTATCTAATCC）（Klindworth et al. 2013）と、プルーフリーディング活性を有するKAPA HIFI Hot Start Ready Mix（Kapa Biosystems、カタログ番号07958935001）を併用することで、より多様なASVを増幅することができた。どちらのプライマーも部分的に重複する領域を増幅する。食餌由来の葉緑体配列の割合が高いため、葉緑体なし増幅プライマーのみで実行した雌糞便サンプルを除き、すべてのサンプルを両方のプロトコルの組み合わせで増幅した（Kropáčková et al.） いずれのプライマーセットも、Nextera™ DNA Sample Prep Kit（Illumina®-Compatible、カタログ番号GA09115、サンディエゴ、米国）をマルチプレキシングするための10 bpオリゴヌクレオチドでタグ付けした。各サンプルおよびプライマーセットについて、微生物プロファイルの一貫性を確認するために技術的に二重にPCRを行った（PCR条件の詳細についてはSI1の表S1を参照）。クロスコンタミネーションを防ぐため、異なる生物学的試料を異なるプレートで増幅した。1プレートあたり2種類のネガティブPCRコントロール（以下、PCRテンプレートコントロールなし、NTC；RNAフリー水；カタログ番号760011596、Qiagen）を用いた。その後、すべてのPCR産物を1.5%アガロースゲルで測定し、GENOSOFTソフトウェア（VWR International, Belgium）を用いてゲルのバンド強度からPCR産物濃度を評価した。サンプルは濃度に応じていくつかのプールに分けられ、SPRIselect常磁性ビーズ（Beckman Coulter Life Sciences, USA）で精製された。PCRの非特異性を除去するために、520-720 bpの範囲のPCR産物を1.5% Agarose Cassettes, dye-free, int. 標準品（Pippin Prep, 250 bp-1.5 kb, カタログ番号 341CDF1503, Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany）を用いた。その後、Qubit dsDNA BR Assay Kit（ThermoFisher Scientific、カタログ番号Q32850）を用いて、Qubit Fluorometer（ThermoFisher Scientific）で精製プールの濃度をチェックし、等モル濃度でプールした。最後に、得られたアンプリコンライブラリーを、Central European Institute of Technology（CEITEC、ブルノ、チェコ共和国）において、MiSeq Illuminaプラットフォームを用い、2×300bpペアエンドリードとv3ケミストリー（Illumina）を用いて塩基配列を決定した。E0卵および胚性GITサンプル（すなわち低細菌バイオマスサンプル）は、雌の糞便サンプル（すなわち高細菌バイオマスサンプル）とは異なるシーケンスランでシーケンスされた（メタデータについては、Supporting Information 2（SI2）のTable S1を参照）。
配列データのバイオインフォマティクス処理と微生物分類群の同定
サンプルはまず脱多重化され、プライマーはskewerソフトウェア（Jiang et al.） dada2（Callahan et al.2016）を用いて、低品質配列（リードあたりの予想エラー数が2未満）をフィルタリングし、品質フィルタリングしたfastqファイルをノイズ除去し、各サンプルの各アンプリコン配列バリアント（ASV）のリードカウントを表すアバンダンス行列を作成した。uchime (Edgar et al. 2011)とgold.fnaデータベース(https://drive5.com/uchime/gold.fa)を用いて、キメラ配列を同定し、アバンダンスマトリックスから削除した。わずかに異なる16S rRNA遺伝子領域を増幅する2つの異なるプライマーセット（P1とP2；SI1の表S1）を用いて得られたASV配列を、DECIPHER Rパッケージ（Wright 2015）を用いてアラインメントし、アンプリコン間でオーバーラップする領域のみを保持した。トリミング前の平均アンプリコン配列長は、P1が413bp（中央値＝416bp、最小値＝389、最大値＝439）、P2が425bp（中央値＝427bp、最小値＝352、最大値＝450）であり、トリミング後は404bp（中央値＝411bp、最小値＝352bp、最大値＝416bp）であった。このトリミングステップ後の同じ配列を1つのASVとみなした。ASVは、RDP分類器（80％信頼閾値、Wang et al. 2007）およびSILVA SSU参照データベース（v. 138; 2019年12月リリース; Quast et al. 2013）を用いて、最も低い区別可能な分類学的レベルに分類学的に割り当てた。すべてのダウンストリーム解析から、「Chloroplast」、「Mitochondria」、「Eukaryota」に分類された、またはどの細菌門にも割り当てられていないすべてのASVを除外した。また、シーケンス数が少ないサンプル（シーケンスアーチファクトがある50リード未満、または統計解析に不十分なリード数が少ない）もすべて除外した。
異なるサンプルタイプとプロトコルについて、各サンプルのASV割合に基づいて計算したBray-Curtis非類似度に基づくProcrustean解析を用いて、技術的重複間の微生物プロファイルの一貫性を評価した（Kreisinger et al.） 使用したプロトコルにより、E0卵、INCまたはNTCは、雌および胚サンプルよりもPCR技術的重複の一貫性が低かった（SI1の表S6）。次に、あるサンプルの技術的重複の両方に一貫して存在しないASV（推定コンタミネーション、シーケンスおよびPCRアーティファクト）を除去した。重複のないサンプルからは、1つのサンプルに存在し、他の重複サンプルには存在しないASVをすべて除外した。重複サンプルのリードカウントは、後のすべての解析でマージされた。
重要なことは、Decontamパッケージ（Davis et al. 2018）を用いて、INCおよびNTCサンプルでの有病率がすべてのシジュウカラサンプルと比較して高い、および／またはメタゲノムDNAの濃度が低いサンプル（PCR産物濃度で測定）でより有病率が高い、推定汚染ASVを同定し、その後除去したことである。分析は卵・胚サンプルとメスの糞便サンプルについて別々に行った。最後に、これらのフィルタリングされたメタバーコーディング結果を、Salterら（2014）、Eisenhoferら（2019）、およびStinsonら（2019）によって編集された、最も一般的に汚染されるASVのリストと比較した。
配列データの統計解析
負の二項分布およびランダム効果としてサンプルの同一性を用いた一般化線形混合効果モデル（GLMM）を用いて、RalstoniaおよびEnterococcus（Decontamによって同定されなかった推定汚染物質、後述）を除外した後、サンプルの種類およびPCRプロトコール間のASVリッチネス（すなわち、各サンプルで検出されたASVの数）の変動を比較した（RパッケージglmmTMB）。細菌リードを含まないサンプルペア（卵および胚サンプルでは比較的一般的）ではコミュニティの非類似度を計算できないため、標準的なベータ多様性解析（PCoA順序解析やPERMANOVA解析など）を行うことができなかった。さらに、実験グループ間およびPCRプロトコル間の個々のASVの存在量のばらつきを調べる差分存在量解析を行った。これらの解析は負の二項分布の混合モデルに基づいており、各サンプルの各ASVのリード数を応答変数とし、実験グループとPCRプロトコルを予測変数とした。サンプル間のシークエンス深度の違いを考慮するため、各サンプルのリード数をオフセットで対数変換（1増加）したものも含めた。モデルの収束を改善するため、少なくともサンプルの5%で検出されたASVのサブセットについて存在量の差分解析を実施した。多重検定による偽陽性を避けるため、得られた確率値に基づいて偽発見率（FDR; Benjamini and Hochberg 1995）を計算し、FDRが0.05未満の結果のみを有意とみなした。
microecoパッケージを使って、異なる生物学的サンプルタイプとPCRプロトコルの間のASVと属の重複を示すベン図（Liu et al. 雌の糞便微生物叢が、偶然に予想されるよりも自分の卵や胚の微生物叢と類似しているかどうかを調べるために、Wilcoxon検定を用いて、雌の糞便微生物叢と自分の卵（E0-egg）／胚（E13-nat）対外国の卵（E0-egg）／胚（E13-nat）の微生物叢の間のJaccard非類似度とBray-Curtis非類似度の差を比較した。この分析は、PIと、RalstoniaとEnterococcusを含むデータセット（NE0-egg = 47, NE13-nat = 66, NF = 30）のみについて行った。また、Wilcoxon検定を用いて、同じ巣の胚が異なる巣の胚よりも微生物組成が類似しているかどうかを調べた。Jaccard非類似度は、存在量行列の希薄化（N = 51配列/サンプル、すなわちデータセット中の最小リード数）の後に計算した。Bray-Curtis非類似度は相対的ASV存在量に基づいて計算した。すべての統計解析はRソフトウェアv.4.1.1（R Core Team 2017）を用いて行った。
潜在的病原性細菌の定量的PCRスクリーニング
メタバーコードの結果に基づき、ASV特異的プローブベースの16S rRNA遺伝子（DNA）qPCRアッセイを開発し、卵内容物および胚中の潜在的病原性細菌を検出した。(1)E0卵およびE13-natサンプル中にASVが存在すること、(2)いずれのINCおよびNTCからもASVが検出されないこと、(3)ASVが実験用プラスチックや化学物質の汚染物質として過去に報告されていないこと（文献調査に基づく）、そして最後に(4)ASVが動物の消化管または泌尿生殖管の潜在的病原体として知られていること（病原体は宿主の生理機能や体力により大きな影響を与える）。選択したASVの塩基配列が、INCまたはNTCで検出された他のASVと類似している場合、潜在的な汚染物質とともに非特異的に増幅されることのない、より異種のASVバリアントのみを標的とするqPCRプライマーとプローブを設計しました。これらの基準に従って、（i）コリネバクテリウム（Barbosa and Palacios 2009, Risely et al. 2018）、（ii）クロストリジウム（Tsiodras et al. 2008, Benskin et al. 2009）、（iii）ディエチア（Koerner et al. 2009, Olowookere et al. 2022）の3種類のqPCRアッセイを設計しました。
qPCRアッセイの感度を高めるため、すべてのサンプルをバクテリアユニバーサルプライマー（Klindworth et al.2013；P1と同じ）を用いて30サイクル前増幅したが、高忠実度で正確なポリメラーゼPlatinum SuperFi PCR I Master Mix（ThermoFisher Scientific、カタログ番号12351）を用いた、詳細はSI1の表S5を参照。プラスチック表面へのDNAの結合を最小限にするため、結合性の低いプラスチックを使用し、0.1ng/μlのtRNAキャリアー（すなわちスパイクウォーター、Qiagen、カタログ番号1068337）をストック溶出DNAの入った各チューブに1μl加えた。前置増幅はテクニカルトリプリケートで行い、クロスコンタミネーションのリスクを最小化するため、異なる生物学的サンプルタイプは異なるプレートで行った。各プレートには3つのネガティブプリアンプリコントロール（NTC-pre-amp；スパイクウォーター）が含まれていた。前置増幅されたPCR産物をスパイク水で3倍に希釈し、ASV特異的qPCRの鋳型として使用した（PCR条件についてはSI1の表S5を参照）。
ASV特異的qPCRは、Luna Universal Probe qPCR Master Mix（New England Biolabs, Inc., カタログ番号 E3006, Ipswich, Massachusetts, USA）を用い、Light Cycler 480（Roche Applied Science）を用いて、384ウェルプレートフォーマット（Roche Applied Science, カタログ番号 04729749001）で、メーカー指定の条件（SI1の表S5）で実施した。すべてのアッセイはテクニカルトリプリケートで行い、テクニカルトリプリケートから前増幅したDNAを独立した単複製qPCRの鋳型として使用した（qPCRではテクニカルトリプリケート間の再現性が高いため可能）。DNA配列標準（IDT, gBlocks Gene Fragments; SI1の表S4、109～101の連続希釈）をqPCR効率の推定に使用した（クロストリジウムのE = 1.995、コリネバクテリウムのE = 1.989、ディエツィアのE = 1.835）。さらに、各プレートにはテンプレートフリーのネガティブコントロール（スパイクウォーター；NTC-qPCR）3種とNTC-pre-amp（前述の通り）3種も含まれていた。
各3連プレートについて、LightCycler 480 SW 1.5（Roche Applied Science）に実装されている二次微分法（second derivative Max）を用いて平均Cp値を算出した。Cp <36の場合、陽性とみなされた。これは、前増幅（gBlock標準曲線を用いて決定）後のDNA分子が約1-10個に相当する。しかし、非常に低い鋳型濃度ではPCR増幅の確率が高いことが予想されるため、3連サンプルのうち少なくとも1つが陽性（Cp値＜36）であったすべてのE0卵および胚性GITサンプルを、独立したもう1回の前置増幅とqPCRで再評価した（サンプルあたり合計6テクニカルレプリケートが得られた）。最後に、少なくとも2/6複製でCp値が36未満であり、同時に両方の独立したqPCRランで陽性が確認された場合のみ、サンプルを陽性と定義した（手順の概要は図2を参照）。前増幅ステップのため、qPCR の結果を半定量的に解釈するには、1 反応あたりの細菌 DNA 量が～1～10 分子に達するサンプルの複製数を決定する必要がありました（gBlocks 標準に基づいて推定）。元の測定qPCRデータはSI2の表S2にある。
qPCRデータを用いて、陰性対照（INC、NTC-qpCR、NTC-pre-amp）よりもコリネバクテリウム（Corynebacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、ディエチア（Dietzia）の出現頻度が生物学的サンプルにおいて高いかどうかを統計的に検定した。全複製数に対する陽性複製数（Cp < 36）の比率を従属変数、生物学的サンプルの種類を独立変数とし、準二項分布による一般化線形モデル（GLM）を適用した。アッセイ（すなわち与えられたASV）と生物学的サンプルタイプ（ここではE0-nat、E13-nat、F）の組み合わせごとに別々のモデルを構築した。ただし、与えられたASVが独立したqPCRによってどのサンプルでも確認されなかった場合は除く（例えば、E0-natとE13-natのClostridiumまたはCorynebacteriumの場合；SI3のすべてのモデルM1-5を参照）。プロットはggplot2（Wickham 2016）、boot（Canty and Ripley 2021）、およびgeffectsパッケージ（Lüdecke 2018）を用いて作成した。すべての統計解析は、ソフトウェアR、v.4.1.1（R Core Team 2017）を用いて行った。
結果
微生物データのフィルタリングと一般情報
配列決定された合計857サンプル（生物学的重複を含む）から、855サンプルの配列を取得し、1996 026リードを取得し、合計1382 ASVを同定した。様々なバイオインフォマティクスフィルタリングステップを適用し、コンタミネーションの影響を排除することで、後の解析に含まれるサンプル数とASVの多様性の合計は大幅に減少した。このパターンは、細菌バイオマスの少ないサンプルで特に顕著であった。異なるサンプルタイプにおける個々のフィルタリングステップの効果については、図S2およびSI1の表S2A～S2Eを参照。第一に、得られた配列数が非常に少ない（50リード未満）サンプルをすべて除外し、解析に含まれるサンプルの割合を9.59%（n = 773）、全リードの0.01%減少させた。 第二に、重複間で一貫性のないASVを削除し、ASVの数を急激に減少させた（1370 ASV中152 ASV）。このステップでは、解析に使用したリード数には弱い影響しか与えませんでした（9.81%減少）。これは、全データセットの重複に一貫性のない低存在ASVが多数存在することを示しています。第三に、各生物学的サンプルについて、重複配列からフィルターされた配列を組み合わせ、416サンプルをさらなる解析のために残した。
さらに、特定のサンプルの汚染にも注意を払った。RのDecontamパッケージを使用して、胚および卵含有物サンプルで12個、雌の糞便サンプルで2個の汚染の可能性のあるASVを統計的に除去し（完全な分類については図S1およびSI1の表S7を参照）、リードカウントの4.84%低下を説明した[すべてのフィルタリングステップについては図S2およびSI1の表S2を参照]。特に低細菌バイオマスのサンプルはRalstonia属が多く、合計でリードの30.1%を占めた。これはまた、すべてのサンプルタイプに分布する唯一のASVでもあった（SI1の図S9AおよびSI2の表S3A）。この所見と、Ralstoniaがプラスチックや溶液の一般的な汚染物質として知られている（Ryan and Adley 2014）という事実から、Decontam分析では検出されなかったが、我々のサンプルはこの細菌に汚染されていたことが示唆される。さらに、手順を清潔に保つためのあらゆる努力にもかかわらず、in ovo処理に使用したE. faeciumが他の胚サンプルの一部（特にE13-PBS；SI1の図S4、S5）を交差汚染した可能性がある。したがって、以降のすべての解析では、ラルストニアと腸球菌の有無にかかわらず、控えめに結果を示した。RalstoniaとEnterococcusを除外すると、リード数が1,711,376から401,089へと大幅に減少した）。最終的なデータセットでは、合計128個のASVが残り、塩基配列を含む191サンプルにのみ発生し、そのうちE0-eggに属するリードは1236個（フィルタリング前の全データセットのリード数の0.06%）のみ、E13-natに属するリードは45 488個（2.28%）のみ、女性の糞便サンプルに属するリードは272 337個（13.64%）のみであった。このことは、E0-eggおよびE13-natサンプルではPCRサイクル数が増加しているにもかかわらず、E0-eggおよびE13-natサンプルの両方に含まれる細菌配列はごくわずかであることを示している。
2つのメタバーコードプロトコルを用いて得られた微生物叢組成に関する結果は、概して非常に一貫していた。P1データにはシーケンスのアーティファクトが少ないため、ここでは主にP1アプローチの結果を示し、比較のためにP2の結果およびRalstoniaとEnterococcusの結果をSIで提供する。ただし、データの比較が必要な場合や、P1とP2の結果に食い違いがある場合は、本文でも強調している。
卵内容物、胚、雌の微生物プロファイル
実験群はASVの濃度に有意差があった（GLMM：ΔD.F. = 4, χ2 = 70.021, P < 0.0001）。P1プロトコールよりもP2プロトコールで、より高いASVリッチネスが認められた（GLMM: 推定値 [± S.E.] = 0.30187 ± 0.08769, ΔD.F. = 1, χ2 = 11.989, P < .0001, 図3）。Tukey post hoc comparisationsによると、メスの糞便サンプルはE13-nat. E0-eggとE13-Entは、E13-PBSを除く他のすべてのカテゴリーと比較して有意にリッチネスが低く、そのリッチネスはE13-natと差がなかった。存在量の差分析によると、3つのASV（Methylotenera属、Mycobacterium属、Shingomonas属）がE13-nat群で有意に多く、1つのASV（Xanthobacteraceae科）がE12-PBS群で多かった（図S1およびSI1の図S3）。PCRプロトコール間で存在量が有意に異なるASVはなかった。
図3.
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バイオリンプロットを用いた生物学的サンプルタイプ間のアンプリコン配列バリアント（ASV）の豊富さの比較。つのPCRプロトコルの結果を示す（P1とP2、詳細は「方法」のセクションを参照）。バイオリンプロット内の黒い水平線は中央値を示す。プロット上部の小文字はTukeyポストホック検定による群間の有意差を示す。2つのグループの文字が異なる場合、そのグループは平均ASVリッチネスにおいて有意に異なる（P < .05）。視覚的な目的のためだけに、Y軸は平方根でスケーリングされている。
卵（E0-egg）では、52サンプル中、フィルタリングしてRalstoniaを除外した後、十分な配列（サンプルあたり平均154.5リード）を持っていたのは8サンプルだけで、一方、大半（84.6％）のサンプルは生物学的に信頼できる細菌配列を含んでいなかった（P1を用いて得られたデータ；SI1の表S2A-S2Eおよび図S4、S5）。全体として、検出されたASVはわずか11個で、サンプルあたりの平均ASVは2.38個でした（SI1の表S2D、S2E）。E0卵サンプルで最も多く検出されたASVのうち、キサントバクテリウム科、クチバクテリウム属、マイコバクテリウム属は少なくとも5サンプルで検出され、スフィンゴモナスは2サンプルで検出された（表1；図4；SI1の図S4～S7）。クロストリジウムは E0 卵 1 サンプルで検出された。P2 では P1 と同様の ASV 数（15 検体）が検出されたが、ディエチア（1 検体）とコリネバクテリウム（3 検体）の 2 種類の推定病原体が検出された。
図4.
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シジュウカラの卵および胚サンプルにおける細菌分類群の相対量（A）は、両プロトコル（P1およびP2）および（B）において、汚染の可能性のあるラルストニアおよび交差汚染のある腸球菌を除外する前、（B）はP1のみ除外した後。最も豊富な属（相対存在量＞1%）のみを示す。より少ない属は「その他」のカテゴリーに含まれる。異なる増幅プロトコール（P1とP2、詳細は「方法」のセクションを参照）の結果を示す。E0-胚0日目の卵内容物サンプル、非操作卵からのE13-nat-E13腸内サンプル、腸球菌処理卵からのE13-Ent-E13腸内サンプル、コントロールのPBS注入卵からのE13-PBS-E13腸内サンプル、F-雌の糞便サンプル（P1のみで増幅）。RalstoniaおよびEnterococcus排除後のP2における相対量については、図S1およびS5（SI1）を参照。図4（A）および（B）の高解像度画像（個々のサンプルID付き）は、それぞれ補足情報5（A）および（B）にある。
表1.
シジュウカラの卵内容物（E0-egg）および胚性腸サンプル（E13-nat）で見つかった細菌属のリスト。RDP分類器（Wang et al. 2007）およびSilva参照データベース（Quast et al. 2013）に基づき、可能な限り属への分類学的割り当てが最も低いものを示す。全サンプルタイプにおける全アンプリコン配列変異（ASV）および属の完全なリストについては、表S3AおよびB、補足情報SI2)を参照のこと。E0-egg-胚0日目の卵内容物サンプル（N = 47）、E13-nat-胚13日目の胚腸サンプル（N = 66）、INC-分離の陰性対照（N = 26）、NTC-PCRの陰性対照（N = 12）。IDは指定されたASVの固有のコードを示す。プロトコル1（P1；詳細は方法を参照）の特定の分類群の存在は、陽性サンプルの数で示す。Decontam-Decontamによる統計解析で明らかになった属を示す（Decontam解析で明らかになったすべての汚染ASVの完全なリストは、補足情報SI2の表S7を参照）。一般的な汚染物質として過去に報告された属を引用する： [1] Salterら（2014）、[2] Eisenhoferら（2019）、[3] Stinsonら（2019）。E0-eggおよびE13-natサンプルでのみ同定され、陰性対照では同定されなかった属は灰色でハイライトされている。
IDGenusE0-eggE13-natINCNTCDecontamPublished contaminantsASV_106351174–901–120010ASV_11627Arachidicoccus0100ASV_10629Beijerinckiaceae0110ASV_10711Bradyrhizobium0220[1], [2], [3]ASV_10591Brevundimonas0300[1], [2]ASV_10053Burkholderia–Caballeronia–Paraburkholderia0100[1], [2]ASV_11823Clostridium_sensu_stricto_11100[2]ASV_10865Craurococcus–Caldovatus0100[1]ASV_11235Cutibacterium7531Yes[3]ASV_10844Devosia1000[1], [2]ASV_9381Enhydrobacter1210[1], [2]ASV_12311Enterococcus0900[2]ASV_9291Haliangium0100ASV_9636KCM-B-1120010ASV_12263Lactococcus1000ASV_9652Legionella0200ASV_10652Methylobacterium–Methylorubrum1010Yes[1], [2], [3]ASV_10100Methylotenera02030YesASV_11228Microlunatus0010ASV_11070Mycobacterium51981YesASV_11257Nocardioides0100ASV_10567Novosphingobium0100[1], [2], [3]ASV_9747Pseudomonas11540[1], [2]ASV_9388Psychrobacter0100[1]ASV_9841Ralstonia4766200[1], [2], [3]ASV_10991Rhodococcus0510Yes[1], [3]ASV_10372Sphingomonadaceae1100ASV_10397Sphingomonas22440Yes[1], [2], [3]ASV_12175Staphylococcus1100Yes[2]ASV_10329Stenotrophomonas0400[1], [2]ASV_12264Streptococcus0010Yes[1], [2]ASV_10170Tepidimonas0200ASV_10678Xanthobacteraceae7020
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胚性GIT（E13-nat）では、66サンプルのうち、すべてのフィルタリングステップ後に十分な配列を有していたのは31サンプルのみであり（サンプルあたり平均1467.4リード）、53.03％のサンプルは配列を有していなかった（表S2A-S2EおよびSI1の図S4、S5）。胚E13-natサンプルでは、E0卵よりもASVの多様性が高く、合計49個のASVが存在し、サンプルあたりの平均ASVは4.39個であった（表S2D、SI1のS2E）。このうち、28個のASVがE13-natに固有であったが、これらは全リードのわずか2.3%しかカバーしていなかった（図S9A、属レベルの比較についてはさらにパネルB-Eを、またP2についてはSI1を参照）。E13-natサンプルは、Sphingomonas属、Mycobacterium属、Methylotener属、Pseudomonas属（10サンプル以上で検出）、さらにCutibacterium属、Stenotrophomonas属、Enhydrobacter属、Legionella属、Blastocatellia属、Brevundimonas属、Tepidiomonas属（2サンプル以上で検出。） クロストリジウムはE13-natのサンプル1つから検出された。さらに、P2法を用いて、2つの推定病原体であるDietzia（2検体）とCorynebacterium（1検体）を再び検出することができた。E13-natサンプルで検出された合計49個のASVのうち、9個のASVがE0卵と共通しており、その中にはCutibacterium、Mycobacterium、Spingomonasなどの最も一般的な属が含まれていた（表1；図S9A、さらに比較のためにB-Eも、SI1）。
E. faeciumを実験的に注入したE0卵（E13-Ent）由来の胚性GITサンプルは、適用した用量にかかわらず、予測通りEnterococcus属が優勢であった（SI1の図S4、S7）。このことは、我々の16S rRNA遺伝子メタバーコードアプローチが、たとえ細菌が卵内に少量（E. faeciumの低用量である1000コピー以上）しか存在しない初期状態であっても、細菌の検出に対して高感度であることを示している。コントロールのE13-PBSサンプルはE13-natサンプルと同様のASV組成を含んでいたため、in ovo処理もE13のマイクロバイオームに影響を与えなかった（図4AおよびB；SI2の表S3）。コンタミネーションがないように努めたにもかかわらず、いくつかのE13-PBSサンプルで腸球菌が大量に検出された。
雌の糞便サンプルは一般に、E0-eggおよびE13-natサンプルよりもサンプルあたりのリード数がはるかに多かった（SI1の表S2A-S2E）。合計で、30個の雌の糞便サンプルには49個のASVが含まれ、そのうち34個のASVは糞便に特有のものであった（これは全配列の28.7％をカバー、SI1の図S9A）。雌の個体間変動が大きく（SI1の図S5、S8A、S8B）、他のすべての生物学的サンプルタイプと比較して分類学的に異なる構成が観察された（図4）。最も一般的な分類群では、マイコプラズマ、クロストリジウム、エシェリヒア、ラクトコッカス、ディプロリケッチア科、またはウレオプラズマが検出された。E0卵サンプルと雌サンプル間で共通するASVはわずか6種（Clostridium属、Devosia gracialis属、Lactococus属、Mycobacterium属、Sphingomonas属など）、E13-natサンプルと雌サンプル間で共通するASVは9種（Mycobacterium属、Rhodococcus属、Sphingomonas属など）であった（SI2の表S3A、S3B、SI1の図S9A）。
巣内および巣間の微生物群集の類似性
メスの糞便微生物相は外国産の卵と比較して、自分の卵（E0-egg）の微生物相との類似性は見られなかった（Jaccard W = 154, P = 0.726、Bray-Curtis W = 152, P = 0.741）。一方、メスの糞便微生物叢とその巣の胚の微生物叢（E13-nat）の間の類似性は、偶然に予想されるよりも部分的に高かったが、Jaccard（W = 39 346, P = 0.086）では非有意的であり、Bray-Curtis（W = 36 823, P = 0.368）では有意ではなかった。同じ巣内のE13-natは、異なる巣間のE13-natよりも微生物組成が似ていなかった（JaccardではW = 21 862, P = 0.021、Bray-CurtisではW = 35 762, P = 0.125）。
潜在的病原性細菌のqPCR検出
16S rRNA遺伝子のメタバーコードとは異なり、52個のE0卵サンプルのいずれにも、特異的qPCRアッセイによってコリネバクテリウムとクロストリジウムが検出されなかった（NGSとqPCRの結果の比較についてはSI1の表S8を参照）。一方、ディエツィア菌はqPCRによって4つのE0卵サンプルから検出された（7.62%）。しかし、ディエツィアはINCでも検出され、E0卵におけるその頻度は、E0卵データセットにおけるどのタイプの陰性対照とも統計的な差はなかった（サンプルタイプ： P = 0.318、モデル1、SI3のM1、モデルの詳細についてはSI1の図S10Aを参照）。
また、評価した66個のE13-natサンプルのいずれからもコリネバクテリウムとクロストリジウムは検出されなかった。ディエチア菌はわずか2検体（2.66%）で検出された。全体として、ディエツィア陽性率はE13-natデータセットでは陰性対照（特にINC）と統計的な差はなかった（サンプルタイプ：P = 0.154、M2、SI3；図S10BおよびSI1）。
メスの糞便では、コリネバクテリウム（サンプルの25.00％）、クロストリジウム（90.63％）、ディエチア（90.63％）のすべてが検出された。しかし、さらなる統計的検定では、クロストリジウムとコリネバクテリウムのみが、陰性対照と比較して糞便検体で有意に高い陽性を示した（検体の種類： P=0.004、M3およびP=0.042、M4、SI3；それぞれSI1の図S10CおよびS10D）であったが、Dietziaは検出されなかった（サンプルタイプについて：P=0.103、M5、SI3；図S10EおよびSI1）。細菌バイオマスの低いサンプル（すなわちE0-eggおよびE13-nat）とは異なり、メスのNGSで明らかになったほぼすべてのクロストリジウム陽性サンプル（すなわち91.66%）は、より感度の高いqPCRでも確認され、細菌バイオマスの高いサンプルでは、両方の方法で一貫した結果が得られたことが示された（SI1の表S8）。
考察
本研究では、2種類の16S rRNAベースのメタバーコードプロトコルと特異的なqPCRアッセイを組み合わせて、自由生活するシジュウカラにおける卵内容物、胚性腸、およびメス（母親）の糞便のマイクロバイオームについて記述した。重要なことは、これまでの鳥類研究とは異なり、増幅の偏りやクロスコンタミネーションの可能性を最小化するために、PCRをテクニカルレプリケートで行い、低細菌バイオマス試料と高細菌バイオマス試料のシーケンスランを別々に準備したことである。鳥類を対象としたいくつかの先行研究（Ding et al. 2017、Trevelline et al. 2018など）とは対照的に、我々の結果は、卵の微生物叢コミュニティはごくわずかで一貫性がなく、潜在的な汚染物質の割合が高いことを明らかにした。胚サンプルでは、より多くの細菌性ASVが存在したが、それでもこれらはしばしば潜在的な汚染物質であった。E0卵とE13-natのサンプルでNGSメタバーコーディングによって検出された3つの病原性ASV（コリネバクテリウム、クロストリジウム、ディエチア）のうち、ディエチアだけがE0卵とE13-natでqPCRによって確認された。
E0-eggサンプルは、フィルタリング後に配列のないサンプルの割合が高いこと、増幅前PCRサイクル数が増加したにもかかわらずサンプルあたりの平均ASVとリード数が低いことから明らかなように、微生物叢の痕跡はごくわずかであった。E0卵の微生物群集は、Xanthobacteraceae、Cutibacterium、Mycobacterium、Sphingomonasで占められていた。しかし、E0卵から同定されたほぼすべてのASVは陰性対照（INCおよび/またはNTC）からも検出され、そのほとんどは実験材料の頻繁な汚染物質としても知られている（汚染物質の詳細リストについては後述の考察および表1を参照）。さらに、この結果から、同じ巣の卵のE0微生物叢は、異なる巣の卵のE0微生物叢よりも類似していないことが示された。NGSの結果をqPCRで検証したところ、ディエチアとは異なり、コリネバクテリウムもクロストリジウムもどのE0卵サンプルからも検出されなかった。したがって、この結果はE0期のシジュウカラ卵の微生物相はごくわずかであることを示唆している。このことは、(i) E0卵とNTCおよびINCサンプルの間に明確に区別できる微生物相が存在しないこと、(ii) 技術的重複の一貫性がないこと、(iii) ASVの存在量および多様性が低いこと、(iv) 汚染の可能性のある物質の割合が高いこと、によって裏付けられている。我々のデータで垂直移行の可能性を支持する唯一の例外は、陰性対照でも見られたが、メスの糞便と卵および胚サンプルで一貫して同定されたディエチアである。したがって、産みたての卵に細菌が存在する可能性を完全に否定することはできないが、E0卵にはほとんど細菌が存在せず、これは無菌卵仮説と一致する。我々の結果とは対照的に、韓国産ニワトリのE0卵白では多様な細菌群集が報告されており、Pseudomonas（全リードの65％）、Janthinobacterium、Burkholderiales、Flavobacterium、Stenotrophomonas、Acinetobacter、Enterobacteriaceae、Comamonadaceae、Xanthomonadaceaeが優勢であった（Lee et al.） 陰性対照とは異なる卵白中の微生物群集は、4種のスズメ目でも報告されているが、合計11個の卵のみという非常に小さなデータセットであった（Trevelline et al.） これらの研究間でE0期卵の微生物群集が異なるということは、種間変動が大きいことを示すか、複製や陰性対照がない場合にシーケンスデータの確率的変動に対する制御が不十分であることを反映している可能性がある。
潜在的な汚染のリスクは、低細菌バイオマスサンプルにおける重要な問題である（Salter et al.2014, Eisenhofer et al.2019）。サンプルの汚染は、サンプルが採取された環境、DNA抽出キット、PCR化学物質やプラスチック、ウェットラボの手順、あるいは異なるサンプル間の交差汚染など、さまざまな経路に由来する可能性がある（Eisenhofer et al.） ヒトの胎盤や胎児が無菌であるかどうか（Perez-Muñoz et al. 2017）、現在も議論が続いている（Aagaard et al. 2014）ため、汚染リスクを評価する非常に慎重なプロトコルが適用されている（de Goffau et al. 2019）哺乳類の研究とは対照的に、鳥類ではこうした注意点が取り上げられることはほとんどなかった。例えば、ニワトリの卵および胚の微生物叢に関する先行研究では、陰性対照が含まれていなかったり（Ding et al. 2017, 2022）、あるいはそれらの種類や数が不十分であったり（Akinyemi et al. 2020）して、微生物叢プロファイルに関する推論が制限されている（ただし、Grond et al. 2017およびLee et al.） 当然のことながら、ニワトリ胚サンプルで最も豊富な分類群であるHalomonas（Ding et al. 2017）は、後にDNA分離キットの生理食塩水緩衝液の汚染物質として指摘された（Lee et al.） 本研究は、複数のプロトコルまたは技術的重複に基づくアプローチを採用することにより、鳥胚における細菌のリクルートを記述した最初のものである。これらの手段と様々なバイオインフォマティックフィルタリングステップを取り入れることで、低細菌バイオマスにおいて重要である可能性のあるPCR増幅バイアスを検出し、環境汚染物質または交差汚染物質に由来する可能性の高い多くの一貫性のないASVを除去することができた。最初のデータセットは1382個のASVで構成されていましたが、技術的に一貫性のない重複や同定された汚染物質を含むサンプルを除去した結果、128個のASVに減少しました。このような手段を用いなかった研究では、ニワトリのASVの多様性は最大で1桁高いことが確認されている（Akinyemi et al.2020、Ding et al.2022）。にもかかわらず、文献調査に基づいて特定された汚染可能性のあるASVがいくつか見つかりました。これまでの微生物研究で報告されている汚染ASVは、土壌や水に生息する細菌や窒素固定によく関連する細菌がほとんどであった（Salter et al.） これらの既知の汚染物質（Salter et al. 2014, Eisenhofer et al. 2019, Stinson et al. 2019）のうち、我々はE0卵およびE13ナットサンプルにおいて、Pseudomonas、Ralstonia、Rhodococcus、Sphingomonas、およびStenotrophomonasなどを同定した。特にRalstoniaはDNA分離キットの一般的な汚染物質で、20 nmのバクテリアフィルターでさえ通過する（Sundaram et al. プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）やストレプトコッカス（Streptococcus）のような他の汚染物質は、ヒト皮膚関連菌として一般的である（Byrd et al. 私たちのE0-eggおよびE13-natサンプルで観察されたASVの大部分は推定汚染物質であるが、それらのいくつかは成鳥のGITで明らかにされている（例えば、MycobacteriumおよびPseudomonas; Kropáčková et al.） したがって、鳥類の卵におけるこれらの菌の出現は、極めて推測の域を出ないと結論づけるにとどまる。さらに、同定された属の中には、Mycobacterium属の一部（Primm et al. 2004）やPseudomonas属の一部（Kerr and Snelling 2009）のように、ヒトの日和見病原体であることが知られているものもある。残念ながら、私たちの16S rRNA遺伝子メタバーコードアプローチでは、ほとんどのASVを属以下の分類学的レベルで区別することはできませんでした。一方、一部のASVの潜在的な病原性は、種や株に特異的である可能性もあります（Pan et al.）
E0-eggと比較すると、胚性腸（E13-nat）のマイクロバイオームはわずかに一貫性があり、ASVの多様性とサンプルあたりのリード数が高かったが、データクオリティフィルタリング後のサンプルの53.03%には配列が含まれていなかった。E13-natサンプルで検出された49のASVのうち、9つのASVがE0卵と共有されており、その中にはCutibacterium、Mycobacterium、Spingomonasといった最も一般的な属が含まれていた。しかしやはり、ステノトロフォモナス、レジオネラ、ブラストカテリア、テピディオモナスを除くE13-natの全属が陰性対照でも検出された。シジュウカラE13-natサンプルで検出された属および高次分類群のうち、9属がニワトリ胚にも生息していた： シュードモナス（Pseudomonas）、スフィンゴモナス（Sphingomonas）、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）、ロドコッカス（Rhodococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ブルホドリアレス（Burhkhodriales）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）である（Ding et al. ニワトリ胚とシジュウカラ胚の間でこれらの少数の属が共有されているにもかかわらず、全体的な存在量と分類学的多様性はシジュウカラの方がはるかに低かった（Ding et al.） 一方では、シジュウカラの胚はニワトリの胚よりも発達していないことから、これは種間差を反映している可能性があり、他方では、結果の違いは使用したNGSプロトコルの違いにも起因している可能性がある（上記参照）。したがって、我々の結果は、NGSとqPCRプロトコルを組み合わせて、孵化直前の2羽の北極圏の超前社会性ヒヨドリであるハマシギ（Calidris alpina）とイソシギ（Calidris pusilla）の胚性GITでごくわずかな微生物相しか検出しなかったGrondら（2017）の結果とよりよく対応しており、確率的群集はクロストリジウムとガンマプロテオバクテリアの優位性に偏っていた。
メタバーコード解析の結果、E0-eggとE13-natの両方から病原性の可能性があるコリネバクテリウム属、クロストリジウム属、ディエチア属が検出され、部分的にメスの糞便サンプルからも検出された。シークエンシングとは異なり、コリネバクテリウムとクロストリジウムはE0卵とE13-natの両方でqPCRによって検出されなかった。重要なことは、qPCRによってE0卵の7.69％とE13-natサンプルの3.03％でディエツィアが検出されたことである。このことは、ディエチアが非常に低い頻度で垂直伝播している可能性を示唆している。同様に、家禽（ニワトリのサルモネラ菌など；Keller et al. 1995、Gantois et al. 2009、Pedroso 2009）と野鳥（オオヒシクイのネセリアなど；Hansen et al. 2015）の両方で、感染した母親から卵への病原性細菌の垂直伝播が示唆されている。E0卵サンプルにはほとんど微生物叢が見られなかったが、E13-nat（E0卵サンプルとの重複は限定的）にはやや多様な微生物叢が見られたことから、E13-natにおける細菌の殻移動は垂直移動よりも強い影響を及ぼすと考えられるが、シジュウカラではまだまれである。先に述べたように（Kropáčková et al. 2017a）、メスの糞便マイクロバイオームには豊富な細菌群集が見られた。しかし、これらが分類学的にE0-eggおよびE13-natサンプルのものとは大きく異なっていたことから、本来の胚性ASVは孵化後に他のASVに置き換わるか、あるいは成体ではごく微量で検出できない量しか存在しないことが示唆されるかもしれない。従って、我々の結果は、パセリ類ではGMは主に孵化後に形成されることを示唆している。このことは、巣立ち期におけるスズメのGMの高い個体発生動態からも支持される（例：Kreisinger他 2017、Teyssier他 2018、Chen他 2020）。
結論
16S sRNA遺伝子のメタバーコーディングと標的qPCRを組み合わせた我々の研究において、シジュウカラではほぼ無精卵のみであることが明らかになった。その結果、胚形成期における垂直移動よりも殻を越えて移動する細菌の役割がより強く支持され、一部の（すべてではない）シジュウカラ胚において単純で低濃度の細菌群集が形成されていることがわかった。しかし、いずれの効果も弱いものであったことから、シジュウカラ類の腸内細菌叢はほとんどが孵化後に形成されることが示唆された。パセリ類とニワトリの腸内細菌叢形成の違いが、種特異的な生活史的特徴によるものなのか、あるいは研究間の方法論上の注意点によるものなのかを明らかにするためには、鳥類の系統を超えたさらなる慎重な調査が必要である。我々の研究は、シークエンシングデータにおける確率的ノイズやコンタミネーションを除去するために、技術的なPCRの重複や内部コントロールを用いることの重要性を強調している。本研究の結果は、胚性腸内により豊富な微生物群集が存在する可能性のある生物種（例えばニワトリ）を対象としたさらなる研究により、鳥類の卵に含まれる細菌が生存しているかどうか（例えば死菌／生菌を標識することにより）、代謝的に活性であるかどうか（例えばメタトランスクリプトミクスやRT-qPCRにより）を明らかにし、それらが免疫遺伝子発現に与える影響を評価すべきであることを示している。これは、ハイスループット培養とMALDI-TOFによる菌種同定を組み合わせた微生物カルチュロミクス（Lagier et al.） 個体発生初期におけるGIT微生物叢の確立のメカニズムを解明することは、鳥類における親の影響についての理解を深め、宿主と微生物の進化生態学の基礎知識だけでなく、疾病伝播のリスクを最小化する動物衛生学的および獣医学的対策の両方に貢献することができる。
データへのアクセス
オリジナルのメタデータを含むすべての補助データは、Supporting Information（SI1-5。）
SI1 - 補足方法、図および表（メイン・サプリメント）
SI2 - メタバーコードおよびqPCRサンプルのメタデータ、アンプリコン配列変異体（ASV）および属のメタバーコード存在量表
SI3 - 一般化線形モデル（GLM）の詳細
SI4 - European Nucleotide Archiveに保存されている個々のサンプルのアクセッション番号
SI5AおよびB - 個々のサンプルIDを記載した図4AおよびBの高解像度画像
シーケンスデータは、European Nucleotide Archiveのプロジェクト・アクセッション番号PRJEB61256で入手可能です。個々のサンプルのアクセッション番号はSI4に記載されている。
著者貢献
Martin Těšický（概念化、データキュレーション、形式的解析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、ソフトウェア、検証、可視化、執筆 - 原案、執筆 - 査読および編集）、Lucie Schmiedová（形式的解析、調査、方法論、ソフトウェア、可視化、執筆 - 査読および編集）、Tereza Krajzingrová（資金獲得、調査、執筆 - 査読および編集）、 Mercedes Gomez Samblas（方法論、監修、執筆-校閲・編集）、Petra Bauerová（調査、執筆-校閲・編集）、Jakub Kreisinger（概念化、形式分析、方法論、ソフトウェア、監修、視覚化、執筆-校閲・編集）、Michal Vinkler（概念化、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、監修、執筆-原案、執筆-校閲・編集）。
倫理的承認
本研究は、チェコ共和国および欧州連合の適用法に基づき実施された。実験はプラハ市役所環境保護局（許可番号S-MHMP-1061728/2010/OPP-V-790/R-235/Bu）およびチェコ共和国環境省（許可番号22003/ENV/16-1009/630/16）の承認を得た。成鳥の捕獲と鳴き声の許可は、プラハ国立博物館のバード・リンギング・センターから得た。
謝辞
フィールド採集を手伝ってくれたDan DivínとJiří Eliáš、分子遺伝学解析の手伝いと助言をしてくれたDagmar Čížková、Anna Bryjová、Zuzana Świederskáに感謝する。また、ナタリー・セーラムの言語修正にも感謝する。
利益相反
著者らは利益相反がないことを宣言する。
資金提供
本研究はカレル大学（助成金番号GAUK 1158217、UNCE 204069、START/SCI/113、登録番号CZ.02.2.69）の支援を受けた。CZ.02.2.69/0.0/19_073/0016935）およびInstitutional Research Support（番号260684/2023）の支援を受けた。計算資源は、チェコ共和国教育・青年・スポーツ省(MEYS CR)が支援する大規模研究・開発・革新基盤プロジェクト(Projects of Large Research, Development and Innovations Infrastructures)内のプロジェクト「e-Infrastruktura CZ」(e-INFRA LM2018140)から提供された。本論文で紹介した科学的データの入手に協力いただいたNCMG研究基盤（MEYS CRの資金によるLM2015091）の支援を受けたCEITECのCF Genomicsに謝意を表する。
参考文献
Aagaard

K
,
Ma

J
,
アントニー

KM
ら
胎盤にはユニークなマイクロバイオームが存在する
.
Sci Transl Med 5月号
.
2014
;
21
:
237

65
.
Google Scholar
ワールドキャット

アキンエミ

FT
,
丁

J
,
周

H
他
ニワトリの胚発生過程における腸内細菌叢の動的分布
.
Poult Sci
.
2020
;
99
:
5079

90
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

Bäckhed

F
,
レイ

レ
,
ソネンバーグ

JL
ら
ヒト腸内における宿主-細菌相互作用
.
科学
.
2005
;
307
:
1915

20
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

バルボーザ

A
,
パラシオス

MJ
.
南極鳥類の健康：寄生虫、病原体、病気のレビュー
.
Pol Biol
.
2009
;
32
:
1095

115
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

ベンジャミニ

Y
,
ホッホバーグ

Y
.
偽発見率のコントロール：多重検定への実用的で強力なアプローチ
.
J R Stat Soc
.
1995
;
57
:
289

300
.
Google Scholar
ワールドキャット

ベンスキン

CMWH
,
ウィルソン

K
,
ジョーンズ

K
他
野鳥における細菌性病原体：感染頻度とその影響に関する総説
.
生物学雑誌
.
2009
;
84
:
349

73
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ビ

Y
,
Tu

Y
,
張

N
他
マルチオミクス解析により、子羊胎児の腸内にマイクロバイオームが存在することが明らかになった。
.
腸
.
2021
;
70
:
853

64
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ブルース

J
,
ドライスデール

EM
.
鳥類卵の経殻感染BT-微生物学
. In：
ボード

RG
,
フラー

R
(編）、
鳥卵の微生物学
.
ボストン
:
シュプリンガー
,
1994
,
63

91
.
Google Scholar
Googleプレビュー
ワールドキャット
コパック

バード

AL
,
ベルカイド

Y
,
セグレ

JA
.
ヒト皮膚マイクロバイオーム
.
Nat Rev Micro
.
2018
;
16
:
143

55
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

キャラハン

BJ
,
マクマーディ

PJ
,
ローゼン

MJ
他
DADA2：イルミナアンプリコンデータからの高分解能サンプル推論
.
Natメソッド
.
2016
;
13
:
581

3
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

カンポス-セルダ

F
,
ボハナン

BJM
.
ニドバイオーム：新生児のマイクロバイオームアセンブリを理解するためのフレームワーク
.
トレンド生態進化学
.
2020
;
35
:
573

82
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

キャンティ

A
,
リプリー

BD
.
boot: ブートストラップ R (S-Plus) 関数
.
CRAN
,
2021
.
クーペラス

T
,
クーレンス

M
,
ファン・ダイク

A
ら
鳥類の宿主防御ペプチド
.
比較免疫学
.
2013
;
41
:
352

69
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

ダルバ

L
,
ショーキー

医学博士
.
鳥類の卵における抗菌防御のメカニズム
.
J Ornithol
.
2015
;
156
:
399

408
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

デイビス

NM
,
ディエム

P
,
ホームズ

SP
他
マーカー遺伝子およびメタゲノミクスデータにおける汚染配列の簡単な統計的同定と除去
.
マイクロバイオーム
.
2018
;
6
:
1

14
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ド・ゴッファウ

MC
,
ラガー

S
,
ソヴィオ

U
他
ヒト胎盤にはマイクロバイオームが存在しないが、潜在的病原体を含む可能性がある
.
ネイチャー
.
2019
;
572
:
329

34
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

丁

J
,
戴

R
,
楊

L
他
ニワトリにおける腸内細菌叢の遺伝と確立
.
Front Microbiol
.
2017
;
8
:
1

11
.
Google Scholar
パブコメ
ワールドキャット

丁

P
,
劉

H
,
トン

Y
他
ニワトリ胚における卵黄微生物叢の発達的変化と腸内微生物叢の初期コロニー形成におけるその役割
.
動物
.
2022
;
12
:
1

15
.
Google Scholar
ワールドキャット

ドーン・イン

S
,
バシッタ

R
,
シュヴァイガー

K
ら
植物DNAを多く含むサンプルにおける、最適化されたいわゆるユニバーサル細菌プライマーによる細菌DNAの特異的増幅
.
J Microbiol Methods
.
2015
;
113
:
50

6
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

エドガー

RC
,
ハース

BJ
,
クレメンテ

JC
ら
UCHIMEによるキメラ検出の感度とスピードの向上
.
バイオインフォマティクス
.
2011
;
27
:
2194

200
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

アイゼンホーファー

R
,
ミニッチ

JJ
,
マロッツ

C
ほか
低微生物バイオマスのマイクロバイオーム研究における汚染：問題と提言
.
トレンド微生物学
.
2019
;
27
:
105

17
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ファンクハウザー

LJ
,
ボーデンシュタイン

SR

母親は一番よく知っている：母親の微生物感染の普遍性
.
PLoS Biol
.
2013
;
11
:
1

9
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

ガントワ

I
,
デュカテル

R
,
Pasmans

F
他
サルモネラ腸炎菌による卵汚染のメカニズム：総説
.
FEMS Microbiol Rev
.
2009
;
33
:
718

38
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

グロンド

K
,
ランクトット

RB
,
ユンポネン

A
ほか
北極圏のシギ・チドリ類における腸内細菌叢の採用と定着
.
FEMS Microbiol Ecol
.
2017
;
93
:
1

9
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

ハンセン

CM
,
マイクセル

BW
,
ヴァン・ヘマート

C
他
北極圏で営巣するガチョウの胚死亡率と微生物感染の関連性
.
Appl Environ Microb
.
2015
;
81
:
5583

92
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

ホンダ

K
,
リットマン

DR
.
感染症と炎症におけるマイクロバイオーム
.
Annu Rev Immunol
.
2012
;
30
:
759

95
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

チェン

CY
,
陳

CK
,
陳

YY
他
母親の腸内微生物は、巣を介したスズメのヒナにおける腸内細菌叢の初期形成を形成する
.
マイクロバイオーム
.
2020
;
8
:
1

13
.
Google Scholar
パブコメ
ワールドキャット

姜

H
,
レイ

R
,
丁

SW
他
Skewer：次世代シーケンサーペアエンドリード用の高速で正確なアダプタートリマー
.
BMC Bioinf
.
2014
;
15
:
1

12
.
Google Scholar
ワールドキャット

ケラー

LH
,
ベンソン

CE
,
クロテック

K
他
サルモネラ・エンテリティディスのニワトリの生殖管および形成卵、産みたて卵へのコロニー形成。
.
感染免疫
.
1995
;
63
:
2443

9
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ケネディ

KM
,
ド・ゴッファウ

MC
,
ペレス・ムニョス

ME
他
胎児マイクロバイオームの疑問が示す低バイオマス微生物研究の落とし穴
.
ネイチャー
.
2023
;
613
:
639

49
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

カー

KG
,
スネリング

AM
.
緑膿菌：常に存在する手強い敵
.
J Hosp Infect
.
2009
;
73
:
338

44
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

カイザーヴェッター

M
,
ビネック

M
.
ニワトリ胚および孵化したばかりのニワトリの細菌叢
.
J Anim Feed Sci
.
2008
;
17
:
224

32
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

クリンドワース

A
,
プルエッセ

E
,
シュヴァー

T
他
一般的な16SリボソームRNA遺伝子PCRプライマーの古典的および次世代シークエンシングに基づく多様性研究のための評価
.
核酸研究
.
2013
;
41
:
e1
-.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ケルナー

RJ
,
グッドフェロー

M
,
ジョーンズ

AL
.
ディエツィア属：既知および新興の日和見主義病原体の新たな住処
.
FEMS免疫医学微生物学
.
2009
;
55
:
296

305
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

クライジンガー

J
,
クロパチュコヴァー

L
,
ペトルジェルコヴァー

A
ほか
長距離渡り鳥の糞便微生物叢構造における時間的安定性と世代間移動の影響
.
フロント微生物学
.
2017
;
8
:
1

19
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

クロパチュコヴァー

L
,
ペシュマノヴァー

H
,
ヴィンクラー

M
他。
自由生活する鳥類、シジュウカラ（Parus major）における口腔内細菌叢と糞便微生物叢の変動
.
PLoS ONE
.
2017a
;
12
:
e0179945
.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0179945
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

クロパチュコヴァー

L
,
Těšický

M
,
アルブレヒト

T
他
スズメ類における消化管細菌叢の多様化と系統性は、生態学的分岐では説明できない。
.
Mol Ecol
.
2017b
;
26
:
5292

304
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ラジェ

JC
,
デュブール

G
,
ミリオン

M
他
ヒト微生物叢の培養とカルトロミクス
.
Nat Rev Micro
.
2018
;
16
:
540

50
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

リー

SW
,
ラ

TM
,
リー

HJ
ら
ニワトリ卵管内の微生物群集の特徴とニワトリ胚腸内細菌叢の起源
.
科学雑誌
.
2019
;
9
:
1

11
.
Google Scholar
パブコメ
ワールドキャット

ライオン

JWW
,
フランク

JF
,
ベイリー

S
.
共焦点走査レーザー顕微鏡を用いた卵殻膜の可視化とサルモネラ腸炎菌との相互作用
.
J Food Prot
.
1997
;
60
:
1022

8
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

リュー

C
,
崔

Y
,
李

X
他
Microeco: 微生物群集生態学におけるデータマイニングのためのRパッケージ
.
FEMS Microbiol Ecol
.
2021
;
97
:
1

9
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

リュデッケ

D
.
ggeffects: モデル出力から "ggplot "用の整然とした限界効果のデータフレームを作成する
.
GitHub
,
2018
.
ルナム

CA
,
ルイズ

J
.
卵殻の超微細構造解析：ブロイラーの孵化率および卵の生存率に対する個々の石灰化層およびクチクラの寄与
.
Br Poult Sci
.
2000
;
41
:
584

92
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

マン

K
.
ニワトリ卵白プロテオーム
.
プロテオミクス
.
2007
;
7
:
3558

68
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ミシュラ

A
,
ライ

GC
,
ヤオ

LJ
ほか
ヒトの発育初期における微生物曝露は、胎児の免疫細胞をプライミングする。
.
細胞
.
2021
;
184
:
3394

409.e20
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

オロヲ・オケレ

A
,
イブラヒム

イブラヒム
,
ロー

CI
他
ナイジェリアのヒト尿サンプルから分離された新規細菌種Bhargavaea massiliensis sp.
.
Curr Microbiol
.
2022
;
79
:
1

8
.
Google Scholar
ワールドキャット

オスト

KS
,
ラウンド

JL
.
微生物叢と哺乳類免疫のコミュニケーション
.
Annu Rev Microbiol
.
2018
;
72
:
399

422
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

パン

X
,
ヤン

Y
,
張

JR.

ヒト病原細菌の宿主特異性の分子基盤
.
緊急微生物感染症
.
2014
;
3
:
1
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

ペドロッソ

AA
.
卵と微生物叢はどちらが先か？
.
家禽インフルエンザの教授
.
2009
;
48
:
1

5
.
Google Scholar
ワールドキャット

ペレス-ムニョス

私
,
アリエッタ

MC
,
ラメール-テイト

AE
他
無菌子宮」と「子宮内コロニー形成」仮説の批判的評価：パイオニア乳児マイクロバイオーム研究への示唆
.
マイクロバイオーム
.
2017
;
5
:
1

19
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

プリム

TP
,
ルセロ

CA
,
ファルキンハム

JO
.
環境マイコバクテリアの健康への影響
.
Clin Microbiol Rev.
.
2004
;
17
:
98

106
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

クアスト

C
,
プルエッセ

E
,
Yilmaz

P
他
SILVAリボソームRNA遺伝子データベースプロジェクト：改良されたデータ処理とウェブベースのツール
.
核酸研究
.
2013
;
41
:
D590

6
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

Rコアチーム
.
R: 統計計算のための言語と環境
.
統計コンピューティングのためのRFoundation
,
オーストリア、ウィーン
,
2017
https://www.R-project.org/.
グーグル・スカラー
Googleプレビュー
ワールドキャット
コパック

ラカイティテ

E
,
ハルキアス

J
,
福井

EM
ら
子宮内のヒト腸内では、生菌のコロニー形成が非常に制限されている
.
自然医学
.
2020
;
26
:
599

607
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

リジー

A
,
ウェイト

DW
,
ウジュヴァリ

B
ほか
活発な渡りは、ヒヨドリ類における腸内細菌叢の特異的かつ一貫した変化と関連している。
.
J Anim Ecol
.
2018
;
87
:
428

37
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ロト

SM
,
クォン

YM
,
リッケ

SC
.
家禽の消化管の最適な発達とそのマイクロバイオームの確立への潜在的影響のためのin ovo技術の応用
.
フロント獣医科学
.
2016
;
3
:
1

13
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ライアン

MP
,
アドレー

CC
.
ラルストニア属：新興の世界的日和見病原体
.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis.
.
2014
;
33
:
291

304
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ソルター

SJ
,
コックス

MJ
,
トゥレック

EM
他
試薬と実験室の汚染は、シーケンスベースのマイクロバイオーム解析に決定的な影響を与える可能性がある。
.
BMC Biol
.
2014
;
12
:
1

12
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

スティンソン

LF
,
キーラン

JA
,
ペイン

MS
.
PCR試薬に含まれる汚染微生物DNAの同定と除去：低バイオマスマイクロバイオーム解析への影響 .
.
Lett Appl Microbiol
.
2019
;
68
:
2

8
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

シュトランドヴィッツ

P
.
腸内細菌叢による神経伝達物質の調節
.
脳の研究
.
2018
;
1693
:
128

33
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

スンダラム

S
,
アウリエンマ

M
,
ハワード

G
他
医薬品およびプロセスにおける微量生物負荷生物の除去のための膜ろ過の応用
.
PDA J Pharm Sci Technol
.
1999
;
53
:
186

201
.
Google Scholar
パブコメ
ワールドキャット

スヴェンソン

L
,
ベーカー

K
.
ヨーロッパスズメ目識別ガイド
. 第4版.
ストックホルム
:
英国鳥類学信託
,
1992
.
Google Scholar
Googleプレビュー
ワールドキャット
コパック

チェシッキー

M
,
クラジングロヴァー

T
,
Eliáš

J
他
縦断的にモニターされた自由生活するスズメ目鳥類における血漿中テストステロン濃度の経年変化と反復性
.
生態学
.
2022
;
198
:
53

66
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ティエシッキー

M
,
クラジングロヴァー

T
,
Świderská

Z
他
自由生活するシジュウカラにおける免疫老化と炎症老化の縦断的証拠
.
Exp Gerontol
.
2021
;
154
:
111527
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

テイシエ

A
,
レンズ

L
,
マティセン

E
他
鳥類宿主の発育初期における腸内細菌叢の多様性の動態：交雑飼育実験からの証拠
.
フロント微生物学
.
2018
;
9
.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01524
.
Google Scholar
ワールドキャット

トレベリン

イギリス
,
マクラウド

KJ
,
クヌーティー

SA
ほか
体外微生物群集：卵生鳥類とトカゲにおける腸内細菌叢の初期獲得メカニズムの可能性
.
Biol Lett
.
2018
;
14
:
3

6
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

チオドラス

S
,
ケレシディス

T
,
ケレシディス

I
他
野鳥に関連したヒト感染症
.
感染症
.
2008
;
56
:
83

98
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ヴァン・ヴェーレン

HPJ
,
サレス

JF
,
タイルマン

BI
.
鳥類卵殻のマイクロバイオームアセンブリと母体微生物叢の世代間キャリアとしての可能性
.
ISME J
.
2018
;
12
:
1375

88
.
Google Scholar
クロスレフ
パブコメ
ワールドキャット

ウォーカー

RW
,
クレメンテ

JC
,
ピーター

I
他
出生前の腸内マイクロバイオーム：私たちは胎内で細菌にコロニー形成されているのか？
.
小児肥満
.
2017
;
12
:
3

17
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

王

Q
,
ガリティ

GM
,
Tiedje

JM
他
ナイーブベイズ分類器によるrRNA配列の新細菌分類への迅速な割り当て
.
Appl Environ Microb
.
2007
;
73
:
5261

7
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

ウィッカム

H
.
Ggplot2： データ解析のためのエレガントなグラフィックス
.
ニューヨーク
:
シュプリンガー・フェアラーク
,
2016
.
グーグル スカラー
クロスレフ
Googleプレビュー
ワールドキャット
コパック

ライト

ES
.
DECIPHER: タンパク質の多重配列アライメントを改善するための局所的配列コンテキストの利用
.
BMC Bioinf
.
2015
;
16
:
1

14
.
Google Scholar
クロス
ワールドキャット

著者ノート
現住所： Institute of Vertebrate Biology, v.v.i., The Czech Academy of Sciences, Květná 8, Brno 603 65, Czech Republic および Institute of Paleonatomy, Domestification Research and History of Veterinary Medicine, Ludwig Maxmilian University of Munich, Kaulbachstr. 37 III, 80539 Munich, Germany
© The Author(s) 2023. FEMSの委託によりオックスフォード大学出版局が発行。
本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示非商用ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。このライセンスは、原著が適切に引用されていることを条件に、いかなる媒体においても非商用の再利用、配布、複製を許可するものです。営利目的の再利用については、journals.permissions@oup.com。
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