温かく湿った環境：室内環境からの強固なリパーゼ産生菌

温かく湿った環境：室内環境からの強固なリパーゼ産生菌
クリスティー・タナー、クリスチャン・アベントロット、マヌエル・ポルカー
doi: https://doi.org/10.1101/148148
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00001021
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要旨
リパーゼは、バイオテクノロジーの分野で重要な役割を果たす生体触媒である。我々は、強力なリパーゼ活性を有する微生物株を単離することを目的として、家庭内の2つの極限環境（好熱性サウナと食器洗浄機のフィルター）に生息する細菌群集を分析した。走査型電子顕微鏡により、サウナと食器洗浄機のサンプルにはそれぞれバイオフィルムを形成する微生物と散在する微生物が確認された。16S rRNA分析に基づく培養非依存的アプローチにより、サウナ試料にはProteobacteriaが、食器洗い機用フィルターにはProteobacteria, Firmicutes, Cyanobacteria, Actinobacteriaが大量に存在することが示された。48菌株を分離し、トリブチリンを主な炭素源とする培地で脂肪分解活性を調べた結果、5菌株を選択し、さらなる特性解析を行った。これらの菌株はすべてBacillus属に属し、pH6.5および1-2%NaClで最適な脂肪分解ピークを示し、その活性は幅広いpH（11.5まで）およびNaCl添加濃度（4％まで）で非常に強固であることが証明された。選択された菌株の熱、pH、塩に対する堅牢性は、これらの菌株の貴重な特性であり、高い耐性を持つバイオ洗剤として期待される。本研究は、産業界への応用が期待されるBacillus属の室内環境からの分離に関する最初の報告である。

はじめに
過去10年間、室内環境に関する研究プログラムの結果、分類学的および生態学的に興味深いデータマトリックスが増加している[1, 2]。特に、最近報告されたコーヒーメーカーや冷蔵庫の細菌群のように、多くの場合、潜在的な病原性細菌が繁殖している、頻繁に使用される家庭内の場所に注目が集まっている [3, 4]。室内環境は、自然環境を模倣したものであり、しばしば極端な環境であることを強調することが重要です。例えば、冷蔵庫はツンドラ地帯とほぼ同じ寒さなので、寒冷適応菌が豊富です。一方、ソーラーパネルなど、太陽にさらされた人工の平らな表面には、砂漠のようなバイオセノシスが豊富に生息しています[5]。したがって、屋内の極限環境に近い場所で生物探索を行うことは、あまり検討されていないものの、有望なスクリーニング戦略であり、新規または改良されたバイオテクノロジーへの応用が期待できる細菌株が得られる可能性があります。

実際、医学的な意義はもちろんのこと、室内微生物群の調査を進めるもう一つの理由は、産業的意義の高い酵素、特に新規の生体触媒の探索である [6]。よく知られている（自然の）先例としては、好極性細菌であるThermus aquaticusの発見があります [7]。その耐熱性Taqポリメラーゼにより、20世紀末のポリメラーゼ連鎖反応の革命的な発展が可能になりました。

現在利用可能な酵素の中で、エステラーゼは有機溶媒中で安定であり、加水分解から合成へと酵素反応を自由に反転させることができるため、特に工業的プロセスに適している[8]。また、リパーゼは、新しい生体高分子材料やバイオディーゼルの生産、あるいは治療薬、農薬、化粧品、香料などのファインケミカルの合成など、バイオテクノロジーの応用に重要な生体触媒として注目されている[9]。また、他の多くの加水分解酵素が特定の基質の対極を代謝することしかできないのに対し、立体選択性を持つ酵素はエナンチオマーやエナンチオトピック基を認識することができる[10]。

極端な温度や振動する温度の環境は、食器洗い機や洗濯機のような様々な工業的条件下で使用できる、幅広い温度間隔で活性を持つエステラーゼを発見する機会として、特に興味深い。最近、好熱性細菌Thermogutta terrifontisから新しい有望なエステラーゼが発見された。この酵素は、80℃で1時間培養しても95%まで活性を維持する[11]。また，Stenotrophomonas maltophilia 由来の低温活性・耐溶剤性リパーゼも報告されており，5℃で 57% の活性を保持し，純粋な有機溶媒中でも 50% 以上の活性を保持している [12]．工業的な可能性を秘めた好極性酵素の例としては、高温（65℃）、pH10までで活性が実証されたGeobacillus sp.の熱好アルカリ性エステラーゼ [13] や、水の氷点下でも50%の活性を維持したPseudoalteromonas arcticaの低温適応型エステラーゼ [14] などがあります。

例えば、Candida antarctica 由来の寒冷適応型リパーゼ B は、還元剤を用いてリパーゼのアミノ基を酸化多糖類に化学結合させることにより、熱安定性と活性を向上させた [15]。

屋内の極限環境における生物探索により、これまで知られていなかったエステラーゼやその他の酵素を保有する新たな脂質分解性微生物株が発見される可能性がある。本研究では、好熱性サウナと食器洗い機という2つの高温の家庭環境に生息する微生物群に注目しました。その結果、48菌株を分離し、その多くがリパーゼ産生菌であることを明らかにした。さらに、そのうちの5株について、バイオテクノロジーへの応用が期待される強固なリパーゼ活性を示す菌株の特性解析を行った。

材料と方法
2.1. サンプリング
環境試料は、サウナと食器洗浄機から採取した。サウナは、バレンシア（スペイン）の共同プール内にある公営の施設で、温度約45℃、相対湿度100％に設定されているため、サンプリングのための特別な許可は必要なかった。サウナのアルミニウム製ベンチの下にあるバイオフィルム状の塊を滅菌した50mLファルコンチューブに採取し、必要な時まで-20℃で保存した。食器洗い機サンプルは、家庭用シーメンス製食器洗い機（この研究の共著者の一人であるMPの所有物）、モデルsm6p1sのフィルターから採取された。サンプルは、滅菌ブラダーでフィルターの内面を引っ掻くことによって得られ、得られたバイオマスは、必要とされるまで-20℃で保存された。

2.2. 走査型電子顕微鏡観察
バイオマス試料を0.2μmメンブレンフィルター（Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Cork, Ireland）上に、パラホルムアルデヒド2％-グルタルアルデヒド2.5％を用いて固定した。mlをフィルターに通して2回プレスした。フィルタをMilli-Q水（Merck Millipore Ltd，Tullagreen，Cork， Ireland）で洗浄し、エタノールで脱水した（徐々に濃度を上げる）。脱水した試料を孔径30μmのマイクロポーラスカプセル（Ted Pella Inc.）に入れ、絶対エタノール中に浸漬した。臨界点乾燥は、オートサムドライ814（Tousimis社製）を用いて行った。乾燥後、銀導電塗料TAAB S269によってSEMスタブ上に試料を設置した。スタブは、走査型電子顕微鏡Hitachi S-4100で観察した。

2.3. Ion Torrent による 16S-rDNA 解析
PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, USA) を用いて、サウナおよび食器洗浄機サンプルからDNAを回収した。DNAの品質は、Nanodrop-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)を用いて分析した。超可変16S-rDNA領域V1〜V3からの500bp長の断片を、ユニバーサルプライマー28F（5′-GAG TTT GAT CNT GGC TCA G-3′）および519R（5′-GTN TTA CNG CGG CKG CTG-3′）を用いて増幅した。得られたアンプリコンの品質は0,8% (w/v) アガロースゲルで確認した。アンプリコンは、3M酢酸カリウムとイソプロパノールで沈殿させた。DNAプール100 ngを用い、アンプリコン融合法（Ion Plus Fragment Library Kit, MAN0006846, Life Technologies）を行い、シーケンスライブラリを構築した。両ライブラリー（SaunaおよびDishwasher）は、クローン増幅の前にAgilent2100バイオアナライザー（Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA, USA）で定量された。エマルジョンPCRは、Ion PGM Template OT2 400キットを用いて、メーカー提供のユーザーガイド（MAN0007218, Revision 3.0 Life Technologies）に従い、記述したとおりに実施した。ライブラリーは、Life Sequencing S.L. (Life Sequencing,Valencia, Spain) の Personal Genome Machine (PGM) (IonTorrentTM, Life Technologies) 上の Ion 318 Chip v2 で、Ion PGM Sequencing 400 kit を用い、製造者のプロトコル (publication number MAN0007242, revision 2.0, Life Technologies) に従って配列決定された。短いリード（<100bp）と低品質リード（<q15）は、シーケンシングセンターでのシーケンシング時に除去された。得られた配列は、MOTHURソフトウェア[16]を用いて系統解析を行った。アンプリコンはGreengenesデータベースの16S-referenceにアラインメントされた。分類はk-merアルゴリズムを用いて行われた。類似性パーセントが80%未満のものは破棄された。

2.4. 微生物株の単離
細菌の培養には、Lysogenic broth (LB) および Reasoner's 2A (R2A) 寒天培地 [17] を使用した。サンプルはPBS-バッファーに懸濁し、ボルテックスしてLBとR2Aプレートに広げ、37℃と55℃で1日培養した。好熱菌と耐熱菌は摘出し、液体培養し、20 % Glycerol中で-70 ℃で保存した。

2.5. 脂肪分解活性と微生物の同定
トリブチリン含有培地は、リパーゼ産生微生物のスクリーニングに頻繁に使用される[18,19]。この化合物の分解により、他の濁った培地中のリポリティックコロニーの周りに明確なハローが発生するためである。凍結保存菌株のサンプル（1 μL）を、トリブチリン（10 mL/L）を主炭素源とする最小限の培地 [20]に直接スポットした。培養は4℃、20℃、37℃、46℃、55℃の各温度で行った。5 日間培養後，リパーゼ産生株の周囲のハローの直径を測定した。

2.6. 選抜菌株の 16S rRNA 配列決定
28Fおよび519Rプライマーを用いたコロニーPCRにより、選抜株の超可変16S-rDNA領域V1～V3を増幅し、バレンシア大学（スペイン）のシークエンスサービスによりサンガー法による塩基配列を決定した。これにより、選択された5つの分離株を属レベルで同定することができた。TU伸長因子（tufGPFとtufGPR）[21]、グループ特異的16S rRNA領域（B-K1/FとB-K1/R1）[22]、エンドグルカナーゼ遺伝子（ENIFとEN1R）[23]、グリコシルトランスフェラーゼ（Ba-G206FとBa-G1013R） [24]を増幅するためさらなるBacillus属プライマーを使用した。得られた配列はPregap4 (Staden Package, 2002)を用いて手動で編集し、低品質なベースコールを除去した。各単離株の最終的な配列は、NCBI BLASTツールを用いて配列データベースと比較された。

2.7. pHおよび塩条件を変化させた脂肪分解アッセイ
トリブチリン（10 mL/L）を添加し、pH を 6.5, 8, 9.5, 11.5 の範囲に調整した固体最小培地で、4 % NaCl を添加するかしないかで、5株のリパーゼ産生を試験し、その結果を示した。各株2マイクロリットルをpHと塩の組み合わせの培地にスポットし、4, 20, 37, 46, 55 °Cで5日間インキュベートした。培養後、ハローの直径を測定した。

リパーゼ産生に最適な条件を調べるため，各株2マイクロリットルをpHと塩の組み合わせ（pH 6.5, 8, 9.5 and 11.5; NaCl 0, 1, 2, 3 and 4 %）に添加した。プレートは37℃で5日間インキュベートした。アッセイは3連で行った。

1. 結果および考察
   3.1. 走査型電子顕微鏡による観察
   湿式サウナと食器洗い乾燥機のフィルターから得られたサンプルは、SEMによる観察から推測されるように、微生物が豊富であることが証明された（Fig 1）。サウナのサンプルでは、微生物のほとんどが、EPSでできたと思われる滑らかなマトリックスにほぼ完全に埋め込まれた、非常に密なバイオフィルムの形で存在していました（Fig.1A）。一方、食器洗い機のフィルターのサンプルでは、主に食品残渣と散在する微生物が存在していました（Fig.1B）。

図1.
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図1.
サウナ（A）と食器洗い機（B）の走査型電子顕微鏡写真
(A)と食器洗い機 (B) の走査型電子顕微鏡写真。サウナ (C) と食器洗い機 (D) の16Srアンプリコンシークエンスにより推定した分類群多様性。サウナ（C）サンプルは特にプロテオバクテリアが多く、食器洗い機フィルター（D）はファーミキューテス、シアノバクテリア、アクチノバクテリアも多く含んでいる。

3.2. Ion Torrentによる16S-rDNA解析
2つのサンプルの分類学的多様性を、「材料と方法」に記載したように実施したハイスループットシーケンスによって決定したところ、両サンプルの分類学的プロファイルが大きく異なることが分かりました（図1Cおよび1D）。サウナサンプルでは、プロテオバクテリアが圧倒的に多く、リードの90 %以上を占めた (Fig. 1C) 。そのうち、α-、β-、γ-プロテオバクテリアはほぼ同じ頻度で存在し、それぞれ割り当てられた配列の20 %以上を占めた。また、Bacteroidetes、Actinobacteria、Acidobacteriaは、1-5%の頻度で存在した。食器洗い機用フィルターは、Proteobacteria、Firmicutes（Bacilliが大半）、Cyanobacteria、Actinobacteriaが多く、その他の分類群が非常に少ないことが特徴である（図1D）。

これらの結果は、この2つの極限環境に関する過去の報告と一致している。Leeら[25]は、高温で乾燥したサウナの床を汚染している細菌群集を特徴づけ、Firmicutes、Gamma-proteobacteriaおよびBeta-proteobacteriaに富むことを証明した。Kimらによる64℃の乾燥サウナの別の報告では、Firmicutes、Gamma-proteobacteria、Beta-proteobacteria、Deinococciが最も頻繁に分類される集団であることが明らかにされています。また、Kimら[25]やLeeら[26]の研究では検出されなかったα-プロテオバクテリアも検出されましたが、前述のとおり、我々の試料はβ-プロテオバクテリアとγ-プロテオバクテリアに富んでいました。逆に、FirmicutesとDeinococciは、我々の16S rRNA分析では検出されなかったが、これら2つの既報では検出されていた。食器洗い機のサンプルに関しては、Savageらによる以前の報告[27]が、他の家庭用表面の中でも、食器洗い機のすすぎ洗い槽に存在する細菌を特徴づけています。その報告によると、食器洗い機の細菌集団は、Proteobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Actinobacteriaからなり、これは、我々が食器洗い機のフィルターで見つけた分類学的プロファイルと一致する。しかしながら、リンスリザーバーで検出されたEuryarcheotaとBacteroidetesは、本研究ではフィルターで検出されなかった[27]。

3.3. 培養株と溶菌活性のスクリーニング
LB および R2A プレート上で強い発育を示した菌株の中から無作為に選んだコロニーを再静置して菌株集とし，材料と方法に記載したように，トリブチリン含有培地で 5 日間増殖させた後にリパーゼ産生量のスクリーニングを行った。全菌株のリパーゼ産生量をFig 2Aに示す。ほとんどの株（サウナ株と食器洗い機株でそれぞれ 72 %と 79 %）がある程度の脂肪分解活性を示した。一般に，サウナ菌株はより広い温度範囲でリパーゼを生産することができ，46 ℃と 4 ℃の 2 つのケースで高い値を示している。少なくともこれらのケースでは，本アッセイで推測されるように，極端な温度ではリパーゼが産生されるだけでなく，十分に機能することが確認された。一方，食器洗い機の菌株は，より小さな温度範囲で脂肪分解活性を示し，ほとんどの場合，試験範囲内では37 ℃付近でしか認められなかった。興味深いことに、ハローの直径から推定される脂肪分解活性は、いくつかのサウナ菌株では 46 ℃で最大となったが、55 ℃で検出可能な脂肪分解を生じた菌株はなかった。

Fig 2.
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図2.
脂肪分解活性のヒートマップ。
(A）サウナと食器洗い乾燥機の分離株は、主に脂肪分解活性を持つ菌株を含んでいた。サウナ由来株は、より広い温度範囲で脂肪分解活性を示すことがわかった。サウナでは、S22とS23が最も広い温度範囲で脂肪分解活性を示した。食器洗い機では、ほとんどの試料が37℃で脂肪分解活性を示し、試料D3、D11、D18のみが2つの試験温度で脂肪分解活性を有していた。(B) サウナ (S22, S23) および食器洗い機 (D3, D11, D18) から抽出した菌株の、最小培地または 4 % NaCl を含む最小培地の異なる pH (6.5, 8, 9.5, 11.5) と温度条件 (4, 20, 37, 46, 55°C) における脂肪分解活性のヒートマップ。

この最初のスクリーニングに基づき、5 つの菌株を選択し、さらに試験を行った。その中には、最も広い温度範囲での活性を持つ株が含まれていた。S22 と S23 は 55 ℃を除くすべての温度で活性を示し、D3、D11、D18 は 20 ℃と 37 ℃の両方で活性を示す食器洗い機サンプルであった。これら 5 種類の菌株のバイオテクノロジーの可能性（過酷な環境条件下でのリパー ゼ生産）を評価するため，分類学的に同定し，4%食塩添加および無添加の最小培地で，温度と pH 条件を変えてストレステストを実施した。リパーゼ活性は、温度、NaCl、pH条件を変えて試験し、結果をFig 2Bに示す。ここでも、サウナサンプルは幅広い熱安定性を示し、pH値が弱酸性から中程度のアルカリ性（6.5-9.5）、さらには4 % NaCl存在下（pH 8および9.5）でも中程度から大きなハレーションが見られた。興味深いことに，非常にアルカリ性の条件（11.5）では，高塩分と相まって，S22 と S23 のリパーゼ産生および活性の温度範囲が 20 °C から 46 °C まで増加した。しかし，一般に，塩を添加すると，標準培地と比較して，どの温度でもハローが小さくなった。

食器洗い機用フィルターから分離した菌株については、幅広いpH値に調整した最小限の培地（塩なし）を用いて、異なる温度で培養することにより、アルカリ性pH値における熱的範囲の広さと、ハロのサイズから推測される活性の強さの点で、脂肪分解能力のアルカリ性を明らかにした（Fig. 2B）。培地にNaClを添加すると、ハローが小さくなり、少なくともpH値が8-9.5の場合、熱活性の範囲が狭くなることがわかった。食器洗い乾燥機の3株では、4%添加のNaClと高pH（11.5）の組み合わせにより、熱活性の範囲が変化していることがわかった。少なくとも1つのケース（D11）では、4 %のNaCl添加により、無添加、pH11.5で観察された活性の低さが部分的に回復された。

さらに、TU伸長因子（tufGPプライマー）およびグループ特異的16S rRNA領域（BK-1プライマー）の配列決定により、D11株はBacillus megaterium（それぞれ99および100 %同一）、S22/S23株はBacillus pumilus（tufGPおよびBK-1プライマーの場合、それぞれ100および99 %同一）であると同定された。D3は完全には同定されず、Bacillus属、おそらくB. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. methylotrophicus, B. velenznesisとして残された。D18はB. cereus/B. thuringiensisと同定された。

3.4. 3.4. 選別した菌株の様々な pH および塩条件下での頑健性
アルカリ性および高塩分条件下でのライポリティクス活性の頑健性を明らかにするため、5菌株について、37℃、pHおよび塩分濃度の複合条件下で試験を行った。ライポライト活性の結果をFig.3に示す。

Fig.
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図3.
選択した5株（S22, S23, D3, D11, D18）のpH (6.5, 8, 9.5, 11.5), NaCl (0, 1, 2, 3, 4%) 条件下でのリポリティクス活性のサーフェスグラフ。
脂肪分解ハローの直径（cm）をY軸に、塩およびpH条件をそれぞれX軸およびZ軸に表す。ハローの大きさは各グラフの下部に示したようにグレーからダークグレーで表示している。

一般に、37 ℃で培養した場合、比較的平坦な3次元プロファイル（Fig 3）から推測されるように、すべての株が異なる塩およびpH条件下で非常に強固なリパーゼ活性を示したが、一般に極塩値（0%と4% NaCl）に向かってハロー直径が減少した。具体的には、D11 と D18（Fig. 3D、3E）が最も強固なリパーゼ産生能を有し、S22 と S23（Fig. 3A、3B）がそれに続く。一方、D3 (Fig. 3C) は最も頑健性が低く、pH 条件によって活性が変動し、塩依存性もさらに高かっ た。脂肪分解活性は、非常にアルカリ性の条件では検出されないが、pH 6.5 の 1% NaCl では非常に大きな (2.45 cm) ハローとなった。

また、S22 と S23 は 2%NaCl、D3, D11, D18 は 1%NaClの条件下で明確な至適ピークが観察され た。最適条件下で最も高い溶媒和活性を示したのはD3で、ハローの直径は最大2.45 cm、次いでS22とS23で、それぞれ直径は最大1.35 cmと1.40 cmであった。D11株とD18株は最も低い脂肪分解活性を示し、ハロの最大値はそれぞれ0.76と1.17であった。

Bacillus属細菌は，これまでに耐熱性リパーゼを生産することが報告されている[28, 29, 30, 31]。今回分離・同定した Bacillus 属細菌については，耐熱 性リパーゼを生産することが知られており，中には極低 pH や極高 pH で安定なリパーゼもある。例えば，B. megaterium には耐熱性リパーゼが存在する（モノアシルグリ セロールリパーゼとカルボキシルエステラーゼ，Uniprot accession number: A0A0H4RCB5 および G2RXU5）。さらに，本種の耐熱性細胞外リパーゼが報告されており，50 ℃で 100 % の活性を保持し，アセトン，DMSO，イソプロパノールや還元剤の存在下で刺激される [32]．一方，B. cereus 属（Uniprot accession number: A0A0B5NXJ9; A0A090YL00; A0A0A0WM49）および B. subtilis 属には，いくつかの耐熱性リパーゼが知られている [33, 34]。Bacillus pumilus は耐熱性リパーゼでよく知られており，100 ℃まで耐熱性のあるリパーゼを含む，高温で完全または部分的に機能するリパーゼ[35, 36, 37, 38, 39]が多数報告されている。また，高温と高 pH または低 pH の両方で機能するリパーゼも報告されている [37, 38]。最後に，B. pumilus は，以前の報告で分析した 65 株のうち，最も効率的にリポ リトール酵素を生産する株として同定されている[39]。実際、本実験においても、分離株 S22 と S23 は最も高いリポレチン活性を示し、いずれも B. pumilus であることが確認された。

以上のことから、我々は家庭環境から強力なリポ酸酵素産生能を有するBacillus属細菌を複数同定し、このことは他の環境から分離した同属細菌に関する文献と一致している。また，分離菌株のリパーゼは，pH（6.5 - 11.5），温度（4℃ - 46℃）および塩（最大 4 % NaCl）の広い範囲で高い活性を示し，すべての測定が宿主生物内でその場観察されたことは特筆される点である。したがって，この条件下で細菌がリパーゼを生産できるだけでなく，これらのリパーゼは完全に機能していることがわかった。今後、リパーゼ抽出液をさらに試験することで、菌体生産による制限を受けない脂肪分解活性そのものの頑健性が明らかになると思われます。

本結果は，分離菌株がリパーゼ生産のための頑健なシャーシと して利用できる可能性を示唆しており，これらのリパーゼは頑健なバイオデ タージェントとして産業界で利用される可能性がある。上記の研究成果で述べたように，特に B. pumilus は非常に強い脂肪分解活性を示し，我々のデータでは，異なる pH，塩，温度条件に最も効率的に適応することから，注目される存在であると思われる。バチルス属のリパーゼで，広い範囲のpH，塩，温度で同時に効率よく作用するものは，これまで見つかっていなかったので，特に興味深い。本研究は、バイオテクノロジーへの応用が期待されるバチルス菌株の供給源として、家庭環境の可能性を初めて示したものである。

1. 4.結論
   本研究は、バイオテクノロジーに関連する頑健な酵素（ここでは頑健なリパーゼ）を生産する細菌株の同定を目的とした、極端な室内環境における初のスクリーニングである。その結果、幅広い温度、塩分、pH条件下で安定した脂肪分解活性を有する5菌株を分離することができたことから、このような家庭環境は頑健な酵素活性を同定するための有望な情報源であることが明らかとなった。これらの代謝能力は、堅牢なバイオ洗剤の成分として特に有用であると考えられる。さらに、この研究は、生態学的側面とバイオテクノロジーへの応用に焦点を当てた、人間に関連する室内微生物群に関する新しい見解の第一歩となるかもしれません。

S1 データ。サウナサンプルより分離したDNAのハイスループット16S rRNAシーケンスから得られた塩基配列。

S2データ。食器洗い機サンプルから分離したDNAのハイスループット16S rRNAシーケンスから得られた塩基配列。

どちらもリクエストにより提供可能。

謝辞
C. Vilanova と X. Baixeras には、電子顕微鏡による観察を手伝ってもらった。また、E. L. Jamesには、本論文のタイトル選定のインスピレーションを与えてくれたことに感謝の意を表する。

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