SARS-CoV-2：アプタマーの応用

SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）は、特定のターゲットに高親和性を持つ核酸分子（アプタマー）を選択するための方法です。この技術は1980年代に開発され、生物学的ターゲット、例えばタンパク質や小分子、さらには生体細胞や組織に特異的に結合するアプタマーを同定するために用いられます。

SELEXプロセスは、次のステップで構成されています：

1. **ライブラリの構築**：ランダムな核酸配列（DNAまたはRNA）の大規模なライブラリが合成されます。このライブラリには、理論的には数十億から数兆もの異なる配列が含まれています。

2. **バインディングと分離**：このライブラリを目的のターゲットに結合させます。結合した核酸はターゲットに固定されているか、または遠心分離によって未結合の核酸から分離されます。

3. **エルーション**：結合した核酸をターゲットから解離させます。

4. **増幅**：結合した配列はPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を使って増幅されます。RNAアプタマーの場合は、逆転写とPCRが必要です。

5. **反復**：増幅された核酸は新しいライブラリとして再度ターゲットに結合させるために使用されます。この過程は多数回繰り返され、各サイクルでより高親和性を持つ配列が選択されるようになります。

この反復プロセスを通じて、最終的には非常に特異的で高親和性のアプタマーが得られます。このアプタマーは、治療、診断、生物化学的研究ツールとして使用することができます。SELEXの利点は、高い特異性と親和性を持ちながら、熱安定性が高く、体内での分解が難しいアプタマーを生成できる点です。また、自動化と高速化が可能で、様々なタイプのターゲットに適用できる汎用性の高い方法です。

ChatGPT4に聞いてみた

Systematic evolution of ligands by exponential enrichment - Wikipedia
からの要約のような気もするが・・・

日本語解説が手っ取り早い

ja (jst.go.jp)

で、Covid-19への治療トライ

Razi, Niayesh, Weizhong Li, Maxinne A. Ignacio, Jeffrey M. Loube, Eva L. Agostino, Xiaoping Zhu, Margaret A. ScullとJeffrey J. DeStefano. 「Inhibition of SARS-CoV-2 infection in human airway epithelium with a xeno-nucleic acid aptamer」. Respiratory Research 24, no. 1 (2023年11月7日). https://doi.org/10.1186/s12931-023-02590-4 .

【背景】 COVID-19パンデミックの原因物質であるSARS-CoV-2は、ウイルススパイク糖タンパク質が細胞受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）に結合することで細胞内に侵入する。SARS-CoV-2を標的とする有効な抗ウイルス薬がないことから、我々は以前、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（SELEX）を利用し、ウイルス受容体結合ドメインとACE2との相互作用をブロックできるフルオロアラビノ核酸（FANA）アプタマーR8-9を選択した。
【方法】 ここで、さらにFANA-R8-9をin vivoでの感染を再現した状況で侵入阻害剤として評価した。
【結果】 我々は、FANA-R8-9が細胞株においてスパイクを持つ偽ウイルス粒子の取り込みを阻害することを証明した。次に、ヒト気道上皮（HAE）とSARS-CoV-2ウイルスのin-vitroモデルを用いて、FANA-R8-9を接種時または数時間後に添加すると、ウイルス感染が有意に減少することを示した。これらの結果はR8-9の配列に特異的であり、アプタマーを作るために利用された異種核酸に特異的ではなかった。重要なことは、FANA-R8-9がHAE培養分泌液中で安定であり、明白な細胞毒性作用を示さないことである。
【結論】 以上の結果から、FANA-R8-9は特定のSARS-CoV-2亜種による感染を効果的に阻止することが示唆され、アプタマー技術が呼吸器粘膜における他の臨床的に関連性のあるウイルスを標的とするために利用できる可能性が示された。

序文要約 written with ChatGPT4

この段落は、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）とそれが引き起こすCOVID-19に対する新しい治療法としてのアプタマーの開発について説明しています。SARS-CoV-2は社会に甚大な影響を与え、約7百万人の死亡者と7億5千万以上の感染者を出しました。ワクチン接種、ウイルスの自然進化、監視、改善された治療プロトコルにより、パンデミックは大幅に減少しましたが、未だに毎週何十万もの感染が報告されています。現在の薬物療法やワクチンはCOVID-19を緩和するには至ったものの、ウイルスの進化が不確かなため、新たな治療法やワクチンの継続的な研究が必要です。

アプタマーは、高い親和性を持ってターゲットに結合する短い核酸ベースの配列で、SELEX（系統的なリガンドの指数増殖による進化）というプロセスを使用して生産されます。これらは、ウイルスの細胞内への侵入をブロックするか、特定のウイルスを診断試験で検出する可能性があります。既に、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の一部であるS1タンパク質に結合し、S1の受容体結合ドメイン（RBD）と宿主細胞の受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との相互作用をブロックするDNAアプタマーがいくつか報告されています。この相互作用をブロックすることで、現在の中和抗体療法がSARS-CoV-2の感染をブロックするのと同様に、ウイルスの細胞への侵入を防ぎます。

この研究では、特に2’-フルオロ-アラビノ核酸（FANA）から作られたアプタマーであるFANA-R8-9に焦点を当てています。FANAは合成核酸で、糖、塩基、またはリン酸バックボーンが変更されています。DNAやRNAのアプタマーに代わるものとして、独自の構造を採用することができ、免疫原性が低く、分解に対する耐性が高いという利点があります。

ただし、FANA-R8-9がウイルス粒子の文脈でスパイク-ACE2の相互作用をブロックできるのか、また、FANA-R8-9が実際の呼吸器系の微小環境でSARS-CoV-2感染をブロックする機能を持つのかはまだ不明です。興味深いことに、人間の気道上皮（HAE）培養が空気-液体インターフェースで確立され、体内の気道上皮の形態と生理を再現し、粘液バリアの確立を含んでいます。これらの培養はSARS-CoV-2に感染しやすく、他の抗ウイルス薬の効果を

評価するために使用されてきました。研究では、FANA-R8-9がスパイクを持つ擬似ウイルス粒子の摂取を阻害するだけでなく、HAEシステムでのSARS-CoV-2感染もブロックすることを示し、粘膜微小環境における呼吸器ウイルスを標的とするXNAアプタマーの潜在的な有用性を示しています。

Discussion要約 written with ChatGPT4

この文章は、SARS-CoV-2ウイルス（新型コロナウイルス）に対抗する新しい治療戦略の開発について説明しています。これまで、免疫調節剤、モノクローナル抗体、レムデシビル、モルヌピラビル、ニルマトレルビルとリトナビルなどの抗ウイルス薬がウイルスの複製を抑制し、病気の重症化を緩和するために使用されてきました。しかし、ターゲットとなる抗ウイルス薬が存在しない他のウイルス感染症に対しても、SARS-CoV-2をブロックする新しい戦略の開発が非常に重要です。この文脈でアプタマー技術が注目されており、これは診断において有用であることが証明されており、ペグアプタニブ（Macugen）が2004年に加齢黄斑変性症の治療薬として承認された事例において臨床的成功も実証されています。ウイルス特有のターゲット（例えば、ポリメラーゼ、インテグラーゼ、ヘリカーゼ）に対するアプタマーも選ばれており、いくつかは抗ウイルス活性を示しています。

ただし、アプタマーは効率的に細胞内に入ることができません。そのため、細胞表面タンパク質との相互作用を介して改善されるか、細胞貫通ペプチドに結合されることでアプタマーの細胞への取り込みが向上されることがありますが、ウイルス表面タンパク質をターゲットとするアプタマーは抗ウイルス薬としてより実行可能であると考えられています。

最近、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質に対するいくつかのアプタマーが特徴づけられており、その多くはDNAで構成されていますが、ペプチド/DNAアプタマー、RNA/2'フルオロRNA混合アプタマー、そしてこの研究で使用されたFANA R8-9アプタマーなどの例外もあります。後者2つのXNA構成のアプタマーは、天然核酸アプタマーに対していくつかの利点を持っているかもしれませんが、これはまだ確定していません。特に、Vero細胞での擬似ウイルス感染の研究では、FANAのコントロール（固定されたFANAとFANA-IN-1.1）がDNAよりも抑制的であるが、FANA-R8-9よりは抑制的ではないことが示されました。しかし、これらのコントロールは擬似ウイルス物質に安定して結合せず、私たちのHAEアッセイでのSARS-CoV-2感染に有意な影響を与えませんでした。

FANA-R8-9は、ウイルスと混ぜて接種する前だけでなく、ウイルス感染後数時間しても感染を減少させることができました。HAEモデルが人間の気道を模倣している範囲内では、アプタマーを感染後に投与することでウイルスの拡散を防ぐことができ、COVID-19や他の呼吸器感染症を治療するためにアプタマーを使用する可能性が示唆されています。特筆すべきは、アプタマー治療後72時間で細胞病理学的な効果、顕著な形態的変化、または上皮バリアの完全性の損失は観察されなかったことです。これらのデータは驚くべきものではなく、FANA-R8-9がHAEモデルの上皮細胞に容易に取り込まれることは期待されていないためですが、FANAまたはFANA-R8-9が粘液バリアやその下にある細胞に与える影響は完全には特定されていません。

SARS-CoV-2のスパイクアプタマーは細胞培養における擬似ウイルスや生ウイルスの感染をブロックし、ACE2トランスジェニックマウスの呼吸器で有効であることが示されていますが、人間の生理をより密接に模倣するモデルでアプタマーを検討する必要があります。ここでは、私たちは以前の作業を拡張し、FANA-R8-9がスパイクを持つ擬似ウイルス粒子だけでなく、人間の気道上皮の生理学的に関連するモデルにおいてSARS-CoV-2感染をブロックする能力を持っていることを示しました。FANA-R8-9はウイルスに対して初期に選択されたが、データはFANA-R8-9がデルタ変異体に対しても効果的に感染を阻止することを示しています。実際、FANA-R8-9はデルタRBDに対してウィルスRBDよりもはるかに強い結合親和性を持っています。これは、FANA-R8-9がHAEアッセイでデルタに対してより有効であった理由を説明するかもしれませんが、FANA-R8-9は両方の株を有意に抑制しました。現在、オミクロンRBDおよびS1ドメインに対するFANAアプタマーを生成する作業が進行中です。