乳児の腸内細菌叢に関連する細菌に対するパルミチン酸カルシウムの影響

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微生物学オープン第10巻第3号e1187
原著論文
オープンアクセス
乳児の腸内細菌叢に関連する細菌に対するパルミチン酸カルシウムの影響

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mbo3.1187

Lu Wang, Gabriela Bravo-Ruiseco, Randolph Happe, Tao He, Jan Maarten van Dijl, Hermie J. M. Harmsen
https://doi.org/10.1002/mbo3.1187
引用 4
Lu WangとGabriela Bravo-Ruisecoが筆頭著者である。
概要
セクション

要旨
乳児用調製粉乳に哺乳類の脂肪の代わりに未変性の植物油を使用すると、乳児の腸内で難溶性の石鹸であるパルミチン酸カルシウムの形成が促進される。この研究は、パルミチン酸カルシウムが細菌の増殖を阻害し、細菌の細胞外皮の厚さを減少させ、電子輸送に関与する膜タンパク質の機能を阻害することを示している。

詳細不明
概要
粉ミルク栄養児と母乳栄養児の腸内細菌叢の発達は異なることが知られている。これは、乳児用調製粉乳（IF）に哺乳類の脂肪の代わりに未変性の植物油が使用され、乳児の腸内で難溶性の石鹸であるパルミチン酸カルシウム（CP）の形成が促進されることに関連している可能性がある。ここでは、CPが乳児の腸内細菌に及ぼす可能性のある影響を試験管内で調査した。CPを添加した培地で培養し、乳児の腸内で優勢ないくつかの細菌種の増殖を分析した。高感度代表としてFaecalibacterium prausnitziiを、走査透過型電子顕微鏡、膜染色、ガスクロマトグラフィー、微生物燃料電池実験によって詳細に分析した。試験したすべての細菌のうち、いくつかのビフィズス菌とF. prausnitziiの増殖は0.01 mg/mlのCPで減少し、Bifidobacterium infantisは完全に増殖を停止した。CPはF. prausnitziiの細胞外皮の厚さを減少させ、細胞膜の脂肪酸と電子輸送に関与する膜タンパク質の機能を阻害した。CPはビフィズス菌とフェカリス菌の増殖を阻害した。このことから、IFにおける脂肪の修飾は、乳児期の重要な有益菌のコロニー形成をサポートすることによって、粉ミルクで育てられた乳児の腸内細菌叢の発達に有益である可能性が示唆される。このことを確認するためには、今後の臨床研究が必要である。

略号
CFU
コロニー形成単位
CP
パルミチン酸カルシウム
EET
細胞外電子伝達
FISH
蛍光in situハイブリダイゼーション
IF
乳児用調製粉乳
MFC
微生物燃料電池
SSL
ステアロイル乳酸ナトリウム
STEM
走査型透過電子顕微鏡
1 はじめに
母乳は新生児に推奨される栄養である。しかし、母乳を与えられない新生児には、乳児用調製粉乳（IF）が良い代替栄養となる。重要なことは、栄養の種類が腸内細菌叢の組成に影響することが知られており、異常な細菌叢の発達は、喘息や1型糖尿病などの疾患と関連していることである（Harmsen & Goffau, 2016）。母乳栄養の乳児は、より複雑なビフィズス菌の多様性を示し、離乳後は、粉ミルク栄養の乳児よりも酪酸産生菌の存在量が高いことが以前に観察された（Stewart et al.、2018；Roger et al.、2010；Yasmin et al.、2017）。このことから、母乳とIFの違いに関心が集まっている。その違いの一つは、母乳中にヒト乳オリゴ糖が存在し、乳児の腸内のビフィズス菌集団を強く刺激することである（Moore & Townsend, 2019）。現在では、腸内細菌叢に対する母乳の効果を模倣するために、IFに様々なオリゴ糖が添加されることが多い。

もう一つの違いは、IFの製造過程で、乳脂肪が植物油に置き換えられることが多いことである。どちらの脂肪もトリグリセリド、つまり脂肪酸とグリセロールのエステルであるが、重要な違いがある（Havlicekovaら、2015）。母乳のトリグリセリドでは、主要な飽和脂肪酸であるパルミチン酸の約60％がsn-2（またはβ-）の位置でエステル化されている（Innis et al.） 対照的に、標準的なIFに含まれるトリグリセリドは、パルミチン酸の13%しかsn-2位にエステル化されておらず、ほとんどのパルミチン酸はsn-1位とsn-3位にエステル化されている。しかし、植物油を改質したIFの中には、sn-2位にパルミチン酸が50%程度含まれるトリグリセリドもある（Yaronら、2013）。消化されると、sn-2位にエステル化されたパルミチン酸はモノアシルグリセロールの形で吸収される。しかし、sn-1およびsn-3位のパルミチン酸は腸内に放出され、カルシウムなどのミネラルと結合して不溶性の石鹸、特にパルミチン酸カルシウム（CP）を形成する可能性がある。このような石鹸は硬い便の原因となり、カルシウムや脂肪酸の吸収を低下させる（Maniosら、2020；Havlicekovaら、2015）。便の硬さの変化は、CPの形成が腸内細菌叢に影響を及ぼす可能性を示唆している。したがって、IF中のsn-2エステル化パルミチン酸が乳児の腸内細菌叢の組成、特に乳酸菌とビフィズス菌のレベルに影響を及ぼす可能性が提唱された（Yaronら、2013）。その結果、抗炎症作用があることからプロバイオティクスの可能性があると考えられているFaecalibacterium prausnitziiのような、後期酪酸産生菌が影響を受けるかもしれない（Goffau et al.）

CPが乳児の腸内細菌に及ぼす影響については、これまでほとんど知られていなかった。本研究では、その存在量と腸内細菌叢の発達における重要な役割に基づいて、乳児の腸内細菌パネルを選択した。初期にコロニー形成するビフィズス菌とバクテロイデス属、そして後期にコロニー形成するF. prausnitziiを含む、これらの選択した細菌の増殖特性に対するCPの影響をin vitroで調べることを目的とした。さらに、ビフィズス菌、F. prausnitzii、Bacteroides thetaiotaomicron間の相互作用がCPによってどのような影響を受けるかを調べた。

2 実験セクション
2.1 菌株
本研究で使用した細菌株は、培養コレクション（ATCC、DSMZ、NIZO）および我々の地元の菌株コレクション（Dept. of Medical Microbiology, UMCG, Groningen, Netherlands (MMB)）から入手した。乳児の腸内細菌叢組成（Pannarajら、2017；Yangら、2019）に基づき、以下の細菌株を選択した： F. prausnitzii A2-165（DSM 17677）；F. prausnitzii ATCC 27768；F. prausnitzii HTF-F（DSM 26943）；Bifidobacterium longum spp. longum MMB-01（B.longumと称する）；Bifidobacterium longum spp. infantis ATCC 15697（B.infantisと称する）；Bifidobacterium longum spp. infantis）；Bifidobacterium breve MMB-ENR0374；Bifidobacterium bifidum MMB-02；Bifidobacterium dentidum ATCC 27678；Bifidobacterium adolescentis NIZO B659；Bacteroides fragilis DSM2151； Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741; Lactobacillus acidophilus DSM 20079; Ruminococcus gnavus MMB-ENR0435; Collinsella aerofaciens MMB-03; Escherichia coli ATCC 29522。

2.2 生育条件
菌株はYCFAG培地（Lopez-Siles et al.、2012）に植菌し、嫌気条件下（80% N2、12% CO2、8% H2）、37℃で培養した。細菌増殖に対するCPの影響を測定するため、YCFAG培地に異なる濃度のCPを添加した。この目的のために、1.0gのCP（Cayman Chemical）を20mlのプロピオン酸（Sigma）に溶解した。その後、溶解した CPをろ過し、滅菌したYCFAG培地に添加した。

2.3 単培養および共培養における細菌増殖へのCPの影響
単培養では、各菌株の50μl一晩培養液を用い、異なる濃度のCPを添加したYCFAG培地5mlに接種した。共培養実験では、2種類の菌株の組み合わせ（F. prausnitziiとB. longum属、またはF. prausnitziiとB. thetaiotaomicron）を用い、一晩培養したF. prausnitzii、B. longum属、および／またはB. thetaiotaomicronの等しい数のコロニー形成単位（CFU、1×107細胞）を、5 mlのCP添加YCFAG培地に接種した。増殖は600nmの光学密度（OD600）を測定することにより分光光度法でモニターした。増殖実験はすべて3連で行った。

2.4 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）による共培養実験中の細菌の定量化
共培養のサンプルは、接種後の異なる時点で採取した。FISHは、Harmsen (Harmsen et al., 2002)が記述した手順に従って行った。実験手順の詳細は付録に示した。

2.5 FM 4-64 による F. prausnitzii の染色
Faecalibacterium prausnitzii A2-165 を、0.003、0.006、0.01、0.02 mg/ml CP 無添加または 0.02 mg/ml CP 添加の YCFAG 培地中で、37℃で 16 時間培養した。100μlの培養アリコートを集め、8000gで4分間遠心した。細胞ペレットを200μlのFM 4-64膜色素溶液（5μg/ml）と共に室温で10分間インキュベートした。その後、10μlの細胞懸濁液を2%アガロースパッドでコートしたスライドにマウントし、Nikon EOS500カメラを搭載したLeica落射蛍光顕微鏡で撮像する前に、スライドを暗所で15分間保持した。蛍光強度は、ImageJソフトウェア（Version 1.51n; National Institutes of Health, USA）を用いて、顕微鏡写真1枚につき25個の細胞について測定した。

2.6 細菌細胞膜の脂肪酸組成
Faecalibacterium prausnitzii A2-165を、0.003または0.01 mg/ml CP無添加またはプロピオン酸無添加のYCFAG培地で16時間培養した後、プロピオン酸または0.03 mg/ml CPで2時間処理した。脂肪酸組成は、Muskiet (Muskiet et al., 1983)の記載に従ってガスクロマトグラフィーで測定した。詳細は付録を参照。

2.7 走査透過型電子顕微鏡（STEM）
0.003 mg/ml または 0.01 mg/ml CP を添加しない、あるいは添加した F. prausnitzii A2-165、およびプロピオン酸を添加しない YCFAG を 0.03 mg/ml CP で 2 時間処理した後の F. prausnitzii A2-165 の細胞構造の変化を調べるため、外部スキャンジェネレーター（ATLAS、Fibics、カナダ） を装備した Zeiss Supra55 SEM を用いて STEM 画像を撮影した。大面積スキャンにより、1つのデータセットで多数のバクテリアを分析することができた。サンプル調製は、Silva (Silva et al., 2014)が記載したプロトコルに基づき、若干の修正を加えた。詳細は付録を参照。

2.8 微生物燃料電池（MFC）実験
Faecalibacterium prausnitzii A2-165をYCFAGで16時間培養した後、0、0.003、0.01、0.03 mg/ml CPで2時間培養した。MFC実験は、Khan（Khan, Browne, et al., 2012）が以前に記述したとおりに行った。詳細は付録を参照。

2.9 統計分析
統計解析はGraphPad Prism version 5 (GraphPad Prism, San Diego, CA, USA)を用いて行った。有意性を評価するために、対応のないt検定（両側検定）を行った。P値＜0.05を有意とみなした。

3 結果
3.1 乳児の腸内細菌の増殖に対するCPの影響
母乳栄養児とミルク栄養児では腸内細菌叢の組成が異なり、CPの形成に関係している可能性がある（Yao et al.） CPが腸内細菌叢にどのような影響を与えうるかを調べるため、乳児の腸内細菌の代表的な優占菌パネルを用いてin vitro増殖実験を行った（表1）。図1は、異なるCP濃度におけるF. prausnitziiの増殖曲線を示している。F. prausnitzii A2-165（図1a）の増殖は0.01 mg/ml CPで阻害され、それ以上のCP濃度では増殖が観察されなかった。F. prausnitzii ATCC 27768（図1b）およびF. prausnitzii HTF-F（図1c）の増殖は0.003 mg/ml CPで阻害され、0.06 mg/mlでは増殖が観察されなかった。同様に、B. breveとB. bifidumの増殖は0.01 mg/mlのCP濃度で阻害されたが、0.03 mg/mlのCPではこれらの細菌は全く増殖しなかった（表1）。B. longumの増殖も0.01 mg/ml CPで影響を受けたが、この菌は0.06 mg/ml CPで増殖しなくなった。対照的に、B. infantisの増殖は0.01 mg/ml CPですでに停止しており、この細菌が試験した他のビフィズス菌よりもCPに対して感受性が高いことを示している。B. thetaiotaomicronの増殖は0.06 mg/ml CPでしか停止しなかったが、C. aerofaciens、E. coli、L. acidophilus、B. dentidum、B. adolescentis、R. gnavusは0.06 mg/ml CPでも増殖した（表1）。これらのデータは、様々な乳児腸内細菌の増殖がCPによって異なる影響を受けることを示している。

表1. 優勢な乳児腸内細菌の増殖aに対するパルミチン酸カルシウムの影響
種 パルミチン酸カルシウム濃度（mg/ml）
0 0.003 0.01 0.03 0.06
F. prausnitzii A2-165 1.53 (0.02)b 1.50 (0.01) 1.12 (0.01) 0.05 (0.02) 0.05 (0.02)
F. prausnitzii ATCC 27768 0.37 (0.04) 0.32(0.02) 0.30 (0.02) 0.21 (0.02) 0.13 (0.01)
F. prausnitzii HTF-F 0.78 (0.16) 0.78 (0.02) 0.15 (0.01) 0.06 (0) 0.06 (0)
B. infantis 1.07 (0.02) 0.90 (0.05) 0.08 (0.04) 0.05 (0.02) 0 (0)
B. bifidum 1.16 (0.03) 1.09 (0.04) 0.68 (0.03) 0 (0) 0 (0)
B. longum 1.63 (0.06) 1.41 (0.03) 0.93 (0.05) 0.61 (0.04) 0.05 (0.01)
B. breve 1.26 (0.05) 1.28 (0.01) 0.53 (0.05) 0.03 (0.01) 0 (0)
B. dentidum 1.68 (0.07) 1.63 (0.04) 1.63 (0.03) 1.60 (0.02) 1.59 (0.03)
B. adolescentis 1.28 (0.02) 1.22 (0.05) 1.24 (0.04) 1.24 (0.01) 1.2 (0.03)
B. thetaiotaomicron 1.96 (0.03) 1.73 (0.02) 1.61 (0.01) 1.08 (0.04) 0.02 (0.01)
B. fragilis 1.40 (0.02) 1.32 (0.02) 1.17 (0.02) 0.78 (0.03) 0.60 (0.04)
アシドフィルス菌 1.92 (0.03) 1.94 (0.02) 1.88 (0.04) 1.87 (0.05) 1.86 (0.04)
大腸菌 1.15 (0.04) 1.09 (0.05) 1.19 (0.01) 1.15 (0.04) 1.17 (0.02)
R. gnavus 1.89 (0.06) 1.82 (0.02) 1.77 (0.05) 1.69 (0.03) 1.53 (0.05)
C. aerofeaciens 1.93 (0.03) 1.78 (0.03) 1.43 (0.02) 1.27 (0.03) 1.15 (0.04)
a 細菌の増殖は、OD600を測定することにより分光光度計でモニターした。
b 値（SD）は、異なる日に行った3回のOD600測定の平均値。
詳細は画像に続くキャプションに記載
図1
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3.2 FM 4-64によるF. prausnitzii A2-165の染色におけるCPの影響
CPがF. prausnitziiの細胞膜の完全性に影響を与えるかどうかを評価するために、細菌をFM 4-64で染色した。増殖曲線の結果から、F. prausnitziiは0.03 mg/ml CPでは増殖できなかったため、この実験では5種類の培地で37℃、16時間培養した： 0.003、0.006、0.01、0.02 mg/ml CP無添加のYCFAG培地、または0.01、0.02 mg/ml CP添加のYCFAG培地である。図2aは、F. prausnitziiの細胞膜が、CPの存在とは無関係に、FM 4-64で完全に染色されたことを示している。しかし、細胞あたりの蛍光強度の測定値は、CP濃度の増加とともに減少し、0.01 mg/ml以上のCP濃度で有意に減少した（p = 0.023）。このことは、CPが細菌膜のFM 4-64染色に影響を与え、膜の崩壊または膜組成の変化のいずれかが原因であることを示している。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図2
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3.3 F. prausnitzii A2-165細胞膜の脂肪酸組成に対するCPの影響
F. prausnitziiの細胞膜に対するCPの影響を調べるため、0、0.003、0.01 mg/mlのいずれかのCPを添加したYCFAG培地で細胞を16時間増殖させた。0.03mg/mlのCPでは増殖が観察されなかったので、別の方法として、プロピオン酸無添加のYCFAG培地で増殖させた後、プロピオン酸で2時間処理した細胞（コントロール）または0.03mg/mlのCPで2時間処理した細胞を分析に含めた。膜抽出後、脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで分析した。図3は、CPなしで生育したF. prausnitziiの膜中の主な脂肪酸が、C14:0（ミリスチン酸）、C15:0（ペンタデシル酸）、C16:0（パルミチン酸）、C17:0（マルガリン酸）、C18:0（ステアリン酸）であることを示している。C14:0、C15:0、C17:0の濃度は、CP濃度が0.01 mg/mlまで上昇すると16時間の増殖で減少したが、C16:0の濃度は上昇した。0.03mg/mlのCPで2時間処理した細胞の脂肪酸レベルは、0.01mg/mlのCPで16時間増殖させた細胞のレベルと同様であった。これは、CPがF. prausnitzii膜の脂肪酸組成に強く影響することを示している。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図3
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3.4 F. prausnitzii A2-165の細胞形態に対するCPの影響
CPがF. prausnitziiの細胞形態に影響を与えるかどうかを調べるために、この細菌を0、0.003、または0.01 mg/mlのCPを添加したYCFAG培地、およびプロピオン酸無添加のYCFAG培地で16時間培養し、その後0.03 mg/mlのCPで2時間処理した。その後、細胞の形態をSTEMで観察した。最も顕著に検出された変化は、細胞エンベロープの厚さの減少であった。図2b,cに示すように、CP濃度を0から0.03 mg/mlに増加させると、細胞被膜の厚さはそれぞれ36.2 nmから16.1 nmに減少した。F. prausnitziiを0.03 mg/mlのCPで処理し、細菌の増殖を停止させた場合（図1a）、細胞外皮の厚さは有意に減少した（p < 0.0001；図2c）。これは、CPがF. prausnitziiの細胞外皮構造に影響を与えることを示している。

3.5 微生物燃料電池
Faecalibacterium prausnitzii A2-165は、フラビンとチオールからなる細胞外電子シャトルを用いて、代謝的に生成された電子を酸素に移動させることができるため、この偏性嫌気性細菌は上皮細胞から酸素が流入するニッチで増殖することができる（Khan, Browne, et al.） この細胞外電子輸送（EET）は、グルコースとリボフラビンを用いた微生物燃料電池で測定することができ、グルコース発酵によって生成された電子はリボフラビンを介して陽極に移動する。CPがEETのような必須プロセスを阻害するかどうかを調べるため、燃料電池の実験を行った。この目的のため、F. prausnitzii A2-165をYCFAG中で16時間培養し、その後0、0.003、0.01、0.03 mg/mlのCPで2時間インキュベートした。その後、細菌をグルコースを含む燃料電池に移した。CP処理にかかわらず、リボフラビン添加5分後に電流を測定したところ、リボフラビンを介したアノードへのEETが起こった。しかし、最大電流はCP濃度が高くなるにつれて減少し、特にF. prausnitzii A2-165を0.03 mg/ml CPに曝露した場合であった（図2dおよび表2）。また、最大電流に達するのに必要な時間は、CP濃度が高くなるにつれて長くなった。特に、最大電流〜26.5 mAを発生させるのに、非処理菌では〜11分かかったのに対し、0.03 mg/ml CPで処理した菌では〜37分かかった（表2）。このことは、F. prausnitziiをCPに暴露するとEETが阻害されることを示しており、EETに必要な膜タンパク質の機能が損なわれていることを示唆している。

表2. F. prausnitzii A2-165の16時間増殖後、異なる濃度のパルミチン酸カルシウムで2時間インキュベートした後の細胞外電子輸送量
パルミチン酸カルシウム濃度(mg/ml) 電流生成プロファイルのスパークライン 最大電流(SD)a (mA) 最大電流に達するまでの時間(SD) (min)
0 画像 26.47 (1.28) 10.5 (0.8)
0.003 画像 24.92 (0.06) 14.0 (0)
0.01 画像 24.56 (0.39) 27.0 (1.8)
0.03 画像 19.29 (1.77) 35.5 (1.8)
a 値は、異なる日に行った 2 つの実験の平均である。
3.6 CP存在下におけるF. prausnitzii A2-165と他の腸内細菌との相互作用
他の腸内細菌がCPの有害な影響を克服するためにフェカリス菌を助けることができるかどうかを調べるために、CPを添加したYCFAG培地で共培養実験を行った。B. longumとB. thetaiotaomicronは酢酸産生菌であるのに対し、F. prausnitziiは酢酸消費菌であるため、これらの実験に用いた（Sokol et al.） サンプルは接種後0、4、8、24時間に採取した。FISHで示したように、F. prausnitzii A2-165とB. longumの共培養はF. prausnitziiの増殖に影響を与えず、B. longumの存在にかかわらず、CP濃度の増加とともにF. prausnitziiの増殖は減少した（p > 0.05、図4a；24時間でカウントした数のみを示す）。対照的に、F. prausnitzii A2-165をB. thetaiotaomicronと共培養すると、F. prausnitziiの増殖は著しく促進された。F. prausnitziiを0.06 mg/ml CPに曝露した場合、単培養で1.1×107個の菌がカウントされ、これは接種時の菌数（1.1×107個）と同程度であった。B. thetaiotaomicronと共培養した場合、F. prausnitziiの菌数は1.8×107まで増加し（p < 0.01、図4b）、増殖に中程度の有益な効果を示した。B. thetaiotaomicronが産生する酢酸がF. prausnitziiの増殖およびCPに対する感受性に及ぼす重要性を評価するため、酢酸を含まないYCFAGで単培養および共培養実験を行った。FISHで示されたように、B. thetaiotaomicronが産生した酢酸はF. prausnitziiの増殖を強く刺激し、これは0.03 mg/mlのCPでも明らかであった（図4c）。このことは、B. thetaiotaomicronのような他の腸内細菌が、F. prausnitziiのような有益な腸内微生物に対するCPの有害な影響を緩和できることを示唆している。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図4
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キャプション
4考察
sn-1およびsn-3パルミチン酸を豊富に含む植物油混合物は、IFの主な脂肪源として一般的に使用されている。そのため、乳児の腸内のCP濃度が上昇する可能性がある。CPは水溶性が0.03mg/mlとほとんど溶けない石鹸であるため、粉ミルクで育てられた乳児の腸内での栄養吸収を妨げる可能性がある（Forsythら、1999）。従って、CPが硬便と関連し、カルシウムと脂肪酸の吸収を低下させることが以前に報告されている（Litmanovitzら、2013）。本研究は、CPが様々な著名な乳児腸内細菌のin vitro増殖を阻害することを初めて示したものである。また、B. infantis、B. breve、B. bifidumなどのビフィズス菌や、F. prausnitziiの3つの異なる菌株の増殖が、0.003または0.01 mg/mlの低濃度でもCPによって阻害されることも報告した。対照的に、大腸菌やB. thetaiotaomicronのような他の腸内微生物の増殖は、CPの影響を受けない。

乳児の腸内の正確なCP濃度は不明である（Jandacek, 1991）。食餌性脂肪の消化は乳化トリグリセリド液滴上で行われ、リパーゼが界面トリグリセリドをモノグリセリドと遊離脂肪酸に分解する。しかしながら、遊離中鎖脂肪酸や分岐鎖脂肪酸の局所的な高濃度は、カルシウム石鹸の沈殿を妨げる可能性がある。胆汁酸塩や低融点脂肪酸による石鹸の可溶化のような他の因子は、カルシウムと脂肪の吸収を促進する可能性がある（Jandacek, 1991）。我々は、以前に決定したパルミチン酸とカルシウムの濃度に基づいてCP量を概算した。母乳栄養児の場合、sn-1/3パルミチン酸濃度は16～48mg/g乾燥便重量で、カルシウム濃度は～20mg/gであった。一方、粉ミルク栄養の乳児では、パルミチン酸72～187mg/g、カルシウム32mg/gが報告されている（Bar-Yosephら、2016；Nowackiら、2014；Yaoら、2014）。これらの数値と～73％の便水分量から、母乳栄養児の腸内の最大CP量は～9mg/g湿便重量、粉ミルク栄養児では～23mg/gと推定される（Bar-Yoseph et al.） しかし、母乳脂肪にはCPの溶解度を高める中鎖脂肪酸や分岐鎖脂肪酸が多く含まれている。したがって、母乳栄養児の便中のCP濃度はより低い可能性がある。とはいえ、推定されたCP量は非常に高いため、ほとんどのCPは沈殿してしまい、乳児の腸内の実際の溶解濃度は、我々の研究で最も高い溶解CP濃度（0.03 mg/ml）に近づく可能性がある。重要なことは、低いCP濃度（0.01mg/ml）でも、一部の有益な腸内細菌の増殖を阻害したことである。ここで、一般的な食事用乳化剤であるステアロイル乳酸ナトリウム（SSL）が、ヒトの腸内細菌叢にIFと同様の影響を及ぼすことが注目される。Elmén（Elménら、2020）は、0.025％（w/v）という低濃度のSSLがすでにヒトの腸内細菌叢を変化させていると報告している。したがって、我々の知見は、母乳栄養児の腸内ではB. longumとB. infantisがより良好なコロニー形成者である一方、粉ミルク栄養児の腸内では大腸菌、クロストリジウム・ディフィシル、B. fragilisのグループメンバーにより多くコロニー形成されるという観察（Pendersら、2005年、2006年；Yasminら、2017年）を説明する一助となる可能性がある。母乳栄養児と粉ミルク栄養児の腸内のCP量が異なることを考慮すると、カルシウム石鹸の過剰形成が母乳栄養児と粉ミルク栄養児の腸内細菌叢組成の違いに寄与しているという仮説を立てた。これは画期的な概念である。というのも、哺乳瓶で育てられた乳児の腸内細菌叢を規則正しいものにしようとする現在の試みは、プロバイオティクスとフルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ヒトミルクオリゴ糖によるIFサプリメントに依存しているからである。対照的に、我々の結果は、sn-2パルミチン酸や長鎖（多）不飽和脂肪酸を豊富に含む改良脂肪がCPの形成を防ぎ、微生物叢を保護する可能性を示唆している（Jandacek, 1991; Forsyth et al.）

CP が腸内細菌の増殖に及ぼす有害な影響の根底にある可能性のあるメカニズムについて、F. prausnitzii A2-165を用いて調べた。細胞膜の染色、膜の脂肪酸組成の測定、STEMによる細菌形態のイメージングから、CPがF. prausnitziiの細胞エンベロープの完全性に影響を及ぼすことが明らかになった。この考えはMFC実験によって支持され、CP濃度を上げると細菌のEET能力が低下することが示された。これはCPがEET機構に影響を与えることを示しており、F. prausnitziiの増殖障害を説明するには十分である。しかし、B. fragilisのようにEETを実行できない細菌の増殖阻害が観察されたことから示唆されるように、CPはF. prausnitziiの細胞外皮における他の生理学的プロセスにも影響を与える可能性がある。

細菌の相互摂食は乳児の腸内細菌叢組成に影響を与える（Scott et al.） このような交雑摂食の相互作用では、酢酸が大腸の酪酸産生に重要である。さらに、Rios-Covian（Ríos-Covián et al.、2016）は、B. adolescentis L2-32との共培養がF. prausnitizii A2-165の増殖を刺激し、酢酸産生の減少と酪酸産生の増加を伴うことを報告している。F. prausnitizii A2-165の増殖はB. thetaiotaomicronに刺激されたが、B. longumには刺激されなかった。実際、B. thetaiotaomicronは酢酸がない場合でもF. prausnitiziiの増殖を刺激した。このことは、B. thetaiotaomicronによるF. prausnitiziiの増殖刺激とCPに対する保護が、酢酸以外の要因に基づいていることを示している。とはいえ、F. prausnitziiは単培養での増殖に酢酸を必要とするため、酢酸は重要である。このことは、細菌間の相互作用がF. prausnitziiの増殖に重要であり、石鹸毒性を克服するのに役立つことを示している。これは、B. thetaiotaomicronと大腸菌の存在がF. prausnitziiによるコロニー形成に影響を与えた動物実験を想起させる（Lopez-Siles et al.）

以上のことから、本研究は、CPが様々な乳児腸内常在菌の細胞エンベロープの構造と機能を損傷することにより、そのin vitro増殖を阻害することを示している。したがって、CPは出生後の腸内細菌叢の発達に影響を及ぼし、その結果、その後の人生において腸内細菌叢に関連した疾患の発症リスクをもたらす可能性がある。新生児の腸内細菌叢の発達に対するCPの潜在的影響を調査するために、異なる脂肪を含むIFを用いた今後の研究が必要である。

倫理声明
必要なし。

謝辞
L.W.はChina Scholarship Council（CSC）の奨学金、G.B.R.SはCONACyTの奨学金（566592）、および両者ともGraduate School for Medical Sciences of University of Groningen（フローニンゲン大学医学研究科）の支援を受けた。本研究の一部は、ZonMW助成金91111.006を受けたUMCG Microscopy and Imaging Center (UMIC)で行われた。電子顕微鏡撮影を手伝ってくれたJeroen Kuipersと、原稿の批評をしてくれたAlfred Haandrikmanに感謝する。

利益相反
申告なし。

著者貢献
Lu Wang： データキュレーション-リード, 形式分析-リード, 調査-リード, 方法論-リード, 可視化-リード, 原稿執筆-リード; Gabriela Bravo-Ruiseco：データキュレーション-リード, 形式分析-リード, 調査-リード, 方法論-リード, 可視化-リード, 原稿執筆-リード; Randolph Happe： 概念化-均等、資金獲得-均等、プロジェクト管理-均等、執筆-校閲・編集-均等; Tao He： 概念化-第一人者、資金獲得-第一人者、プロジェクト管理-第一人者、執筆-審査・編集-均等; Jan Maarten van Dijl： 監修-リーダー、執筆-査読および編集-リーダー; Hermie Harmsen： Hermie Harmsen：概念化-主要、データキュレーション-主要、形式分析-主要、資金獲得-主要、調査-主要、方法論-主要、プロジェクト管理-主要、監修-主要、執筆-査読および編集-主要。

付録
方法
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）による共培養実験中の細菌の定量化
共培養のサンプルは、接種後の異なる時点で採取した。FISHは、Harmsen (Harmsen et al., 2002)が記述した手順に従って行った。簡単に言うと、各細胞懸濁液1mlを3mlの4％パラホルムアルデヒド溶液で4℃で一晩固定した。懸濁液の10µlアリコートをスライドに塗布し、96%(v/v)エタノールで10分間乾燥・固定した後、F. prausnitzii、B. longumおよびB. thetaiotaomicron用のオリゴヌクレオチドプローブFprau645、Bif164およびBac303をそれぞれ用いて、暗黒湿潤ストーブ中、50℃で一晩ハイブリダイズさせた。その後、細胞を洗浄し、Vecta Shield™（Vector Lab.、Burlingame、CA）でマウントした。蛍光細胞はLeica DMRXA epifluorescence microscope（Leica, Wetzlar, Germany）を用いてカウントした。

細菌細胞膜の脂肪酸組成
Faecalibacterium prausnitzii A2-165を、CP添加または無添加のYCFAG培地で16時間培養した。脂肪酸組成は、Muskiet (Muskiet et al., 1983)の記載に従ってガスクロマトグラフィーで測定した。培養液の10mlアリコートを10,000gで15分間、4℃で2回遠心分離し、増殖培地を除去した。細胞ペレットを50mM Tris. HCl（pH7.5）、150mM NaCl、5mM MgCl2、10％グリセロールを含む緩衝液に再懸濁し、FastPrep組織ホモジナイザーで0.2-0.3mmガラスビーズを用いて、6.5m/sで30秒間を5サイクル繰り返して破砕した。13,000gの遠心分離で膜を回収し、メタノール-塩酸溶液とヘキサンで膜をトランスエステル化し、トリメチルシリル化した。2μlのアリコートを、Model 7672 A自動注入システムを装備したHewlett-Packard Model 5880ガスクロマトグラフに自動注入した。この実験では、ノナデカン酸（C19:0）を内部標準として使用した。その後、異なる条件で増殖させた細胞について、各脂肪酸の相対量を算出した。

走査型透過電子顕微鏡（STEM）
CPで処理したF. prausnitzii A2-165の細胞構造の変化を調べるため、外部スキャンジェネレーター（ATLAS、Fibics、カナダ）を装備したZeiss Supra55 SEMを用いてSTEM画像を撮影した。大面積スキャンにより、1つのデータセットで多数の細菌を分析することができた。サンプル調製は、Silva（Silva et al. 5mlの一晩培養液を異なる濃度のCPで1時間処理した。各サンプル2 mlを2000 gで5分間遠心した。ペレットを0.1Mカコジル酸ナトリウムpH7.3中2%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒドで固定し、1%四酸化オスミウム/1.5%フェロシアン化カリウムで後固定した。その後、濃度の高いエタノールで順次脱水した。EPONで包埋後、超薄切片（80 nm）を切り出し、水中2％酢酸ウラニル、クエン酸レイノルズ鉛で造影した。STEMを用いて大面積スキャンを行い、ImageJ（Version 1.51n; National Institutes of Health, USA）を用いて、1画像あたり25個の細胞についてF. prausnitziiの細胞エンベロープの厚さを測定した。

微生物燃料電池（MFC）実験
Faecalibacterium prausnitzii A2-165をYCFAG培地で16時間培養した後、CPを添加または無添加、あるいは0.03 mg/ml CPで2時間培養した。MFC 実験は、Khan (Khan, Browne, et al., 2012)が以前に記述した方法で行った。簡単に説明すると、OD600が0.8の38ml培養液を2000gで15分かけて回収し、洗浄してリン酸カリウムグルコースバッファーpH7に再懸濁し、N2で連続的にフラッシュした37℃の陽極チャンバーに加えた。50mMのフェリシアン化カリウムを含む40mlの100mMリン酸カリウム緩衝液を陰極チャンバーに加えた。装置を5分間作動させた後、0.003gのビタミンB2を陽極チャンバーに加えた。CHI電気化学装置を用いて45分間回路を閉じた後、データを収集した。

公開研究
参考文献
文献の引用
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