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食品用金属酸化物ナノ粒子曝露による腸内細菌集団、ブラシボーダー膜機能および形態の変化


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食品用金属酸化物ナノ粒子曝露による腸内細菌集団、ブラシボーダー膜機能および形態の変化(Gallus gallus)In Vivo

https://www.mdpi.com/2076-3921/12/2/431



ジャクリーン・チェン
1,
ニコライ・コルバ
1,
アルバ・ガルシア=ロドリゲス
2,3,
クラウディア・N・H・マルケス
3,
グレッチェン・J・マーラー(Gretchen J. Mahler
2と
エラド・タコ
1,*
1
コーネル大学食品科学部、411タワーロード、イサカ、ニューヨーク州14853、米国
2
ビンガムトン大学バイオメディカル工学科(4400 Vestal Parkway East, Binghamton, NY 13902, USA
3
ビンガムトン大学生物科学部、4400 Vestal Parkway East, Binghamton, NY 13902, USA
*
通信の宛先となる著者
アンチオキシダント 2023, 12(2), 431; https://doi.org/10.3390/antiox12020431
受理された: 2023年1月19日/改訂:2023年2月3日/受理された: 2023年2月7日 / 発行:2023年2月9日
(本論文は特集「サプリメントと酸化ストレス」に属しています)
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バージョン情報
アブストラクト
食品添加物の金属酸化物ナノ粒子(NP)のうち、二酸化チタン(TiO₂)と二酸化ケイ素(SiO₂)は食品着色料や固結防止剤として一般的に使用され、酸化亜鉛(ZnO)と酸化鉄(Fe₂O₃)はそれぞれ抗菌剤や着色剤として添加されていて、微量栄養補助食品として使用することができる。NPの摂取が消化管の健康と発達に及ぼす潜在的な障害を解明するため、このin vivo研究では、Gallus gallus(ブロイラー鶏)の羊水内投与を利用して、生理的関連濃度の食品用金属酸化物NPが、in vivoでブラシ境界膜(BBM)機能、腸の形態、腸内微生物集団に及ぼす影響を評価しました。以下の処理を1mL注入した6つのグループを利用した:非注入、18MΩ DI H2O; 1.4 × 10-6 mg TiO2 NP/mL, 2.0 × 10-5 mg SiO2 NP/mL, 9.7 × 10-6 mg ZnO NP/mL, および 3.8 × 10-4 mg Fe2O3 NP/mL (n = 10 per group). 孵化後、血液、盲腸、十二指腸を採取し、ミネラル(鉄、亜鉛)代謝、BBM機能、炎症関連タンパク質遺伝子発現、BBM形態分析、腸内細菌叢の相対存在量を評価した。食品添加物NPは、ミネラルトランスポーター、BBM機能性、炎症性サイトカイン遺伝子発現を変化させ、腸内BBMの発達に影響を与え、腸内細菌集団の組成シフトを引き起こしました。食品用TiO₂およびSiO₂ NPは腸の機能に悪影響を及ぼす可能性があること、食品用ZnO NPの暴露効果は腸の発達をサポートするか、腸の損傷による代償機構と関連していること、食品用Fe₂O₃ NPは腸の機能性と健康に変化をもたらす可能性はあるものの、鉄強化用のオプションとなりうることがわかったこと、がその結果である。
キーワード
摂取、ナノ毒性、微生物叢、鉄、ブラシボーダー膜

グラフィカルアブストラクト

  1. はじめに
    ナノ粒子(NP)は、食品および農業産業で広く使用されているため、一般的に摂取されていますが、胃腸(GI)の発達に与える影響はよく理解されていません[1,2,3,4]。食品産業において、NPは、食品の食感、風味、色、安定性、保存性(抗菌活性)を高めるというユニークな特性により利用されている。さらに、NPは栄養素の生物学的利用能を高めるために利用されており、Fe2O3およびZnO NPは、従来の強化剤と比較して、相対的な生物学的利用能が高く、解離が速く、有機的特性への影響が少ないことが判明しています[5, 6].また、NP は、包装の柔軟性やガスバリア性を向上させるために、食品包装の用途にも使用されており、そのため食品マトリックスに移行する可能性があります [7,8,9]。農業分野では、新規農薬(すなわち、肥料や殺虫剤)の開発や、食品や水中の栄養素や汚染物質を特定するためのセンサーの開発に、NPが使用されています [10,11]。これまでに数多くの研究が、ナノメートル領域の食品用金属酸化物を実証し、多くの食品消費者製品にその存在を検出してきた [12,13,14,15]。食品、水、および環境を通して、人間がNPにさらされることは避けられないため、GIの健康と発達に対するNPの影響を理解することが重要である。
    摂取後、NPはGI管と相互作用し、GI管の生物学的特徴とNPの物理化学的特性は、GI管の健康と発達に対するNPの効果に影響を与えることができる[3,7]。GI管の異なる区画ではpHが変化し、これがNPの凝集と表面化学に影響を与える可能性があります[16]。小腸は、栄養素の消化・吸収の重要な部位として機能するだけでなく、分泌・免疫の保護機能としても機能する [17] 。杯細胞によって産生され、ムコ多糖類と糖タンパク質からなる粘液層は、内腔細菌に対する物理的バリアを提供し、パネス細胞や腸細胞から分泌される抗菌ペプチドやタンパク質を上皮の近くに集中させる [17,18]。さらに、このムチンは、ミネラルの消化に寄与する腸内細菌叢を収容し、上皮細胞と相互作用して効果的な腸のバリアを維持する[19,20,21]。NPの摂取により起こりうる結果としては、NPが血液に入り込み、他の臓器に到達する吸収、粘膜への沈着、腸内細菌叢の調節などがあり、これらは正常な腸の生理・代謝・免疫機能の維持に重要な役割を果たす [22,23]. したがって、食品由来のNPの摂取が消化管機能に及ぼす影響については、さらなる精査が必要であり、NPの評価は、微生物叢の組成、腸の機能性、および炎症状態に対するこの摂動の影響を考慮する必要がある。
    TiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3 NPなどの多くの食品添加物NPは、主にそのサイズに関連する物理化学的特性、凝集、凝集レベル、および溶解速度(イオン放出)に起因して、微生物と異なる挙動および相互作用をすることが報告されている[24,25,26]。それぞれのNPは異なる分子組成を示すが、それぞれのNPのタイプに応じて、同様の毒性戦略が仮定され、説明されてきた。活性酸素種(ROS)を介した毒性は、TiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3 NPを含むin vitro NP細胞毒性の主要なメカニズムであると考えられており、場合によっては、DNA損傷や遺伝毒性との関連も報告されている [27,28,29]. しかし、NPクラスター間の機械的相互作用による細胞膜の完全性の障害は、TiO2およびSiO2細胞毒性のもう一つの主要なメカニズムであると考えられ、これらのタイプの食品グレードNPは、酸化ストレス誘発性の変化によりタイトジャンクションプロテインの分布を変化させた [30,31,32]. ZnOおよびFe2O3 NPの細胞毒性メカニズムもまた、媒体への溶解と密接に関連している。ZnOとFe2O3は両性分子であるため、溶液のpHによって異なる挙動を示し、酸性溶液ではイオンを放出しやすい[7]。いくつかの研究では、ZnO NPの主要な細胞毒性および抗菌メカニズムとして、培地中のZn2+の放出が提案されており、アミノ酸代謝、酵素系破壊、不活性輸送阻害に大きな影響を及ぼすとされています[33]。
    腸上皮のin vitroモデルを用いた我々のこれまでの研究により、TiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3 NPにさらされると、腸上皮細胞の機能が変化し、炎症が引き起こされることが示されている[7,14,34,35,36]。TiO2 NPは、大腸菌と乳酸菌ラムノサスの存在下で、ムチンの厚さを減少させ、中性および酸性ムチンを増加させることによって粘液層に悪影響を与え、潜在的な病的状態に導くことが示されている[36]。Guoら(2017)は、TiO2 NPがブラシボーダー膜(BBM)酵素機能、鉄(Fe)および亜鉛(Zn)栄養輸送、腸内アルカリホスファターゼ活性、およびタイトジャンクション機能を著しく変化させ得ることを実証しました[35]。SiO2 NPは、グルコース輸送を増加させ、腸の栄養吸収を減少させ、栄養輸送タンパク質の遺伝子発現レベルを著しく変化させ、活性酸素と炎症性シグナルを誘導することがin vitroで示された[34]。ZnO NPは、in vitroで消化中に溶解する可能性が高いことが示されましたが、ZnO NPは、細胞の微絨毛表面を変化させることによってグルコース吸収とミネラル吸収にマイナスの影響を与えることが分かりました[14]。さらに、我々の以前のin vitro研究では、BBM酵素活性は、in vitro消化されたTiO2、SiO2、ZnO、およびFe2O3 NPへの曝露後に調節され、自然に存在する腸内細菌叢、大腸菌またはL. rhamnosusが存在すると、食品添加物NP曝露によって影響を受けたBBM酵素活性の一部は、金属酸化物NPの細菌吸着によって改善されることがわかりました[7]。
    確立された in vivo の Gallus gallus モデル [37,38,39] において、化学グレードの TiO2 および SiO2 NP の生理学的関連用量が腸の機能と健康に悪影響を及ぼす可能性があることを以前に証明したが、これは以前の in vitro 研究の結果と一致する [40]. G. gallusモデルは、食事のミネラル含有量操作に敏感であるため、以前からミネラルバイオアベイラビリティの評価に利用されており、ヒトの食事のミネラルバイオアベイラビリティおよび吸収のモデルとして機能することができます [38,39,41,42]. さらに、ヒトとG. gallusの間には、ミネラル輸送に関与する腸内BBMタンパク質に85%以上の遺伝子相同性がある[43]。最後に、G. gallusは複雑な腸内細菌叢を持ち、宿主の遺伝、環境、食事に大きく直接影響され、G. gallusとヒトの腸内細菌叢は門レベルで大きく類似している [20,44,45].
    今回のin vivo研究では、食品グレードのTiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3 NPのヒトへの投与量が、腸の健康、機能、および微生物集団に与える影響を評価しました。食品添加物であるNPをヒトが摂取することにより、広く暴露されるため、本研究では、食品グレードのNPを利用して、NP暴露が腸の機能性に与える影響を調査しました。本研究は、G. gallusの胚期を用いたin vivo試験で、化学グレードのTiO2、SiO2、ZnO NPが腸の健康と機能に及ぼす影響を評価した、前回のin vivo試験に続くものです [40]. 生理的に適切な用量のTiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3 NPが、無毒かつ非濃度依存的に試験したほとんどの消化酵素の活性を変化させることが判明した以前のin vitro結果に基づき、我々は、ヒトに関連する用量への曝露のみに注目した [7,14,34,35]. 本研究では、羊水内投与法を利用し、G. gallusの生体内で、ミネラル状態のバイオマーカーの十二指腸遺伝子発現、BBMの消化吸収能力、免疫機能、および炎症の評価を通じて、食品グレードのTiO2、SiO2、ZnOおよびFe2O3 NPのBBM機能に対する影響をヒト関連用量で評価およびスクリーニングしました。副次的な目的は、健康を促進する集団(ビフィドバクテリウム属とラクトバチルス属)と潜在的な病原性細菌(大腸菌とクロストリジウム属)の相対的な存在量を定量化することによって、これらの食品用金属酸化物NPが食道細菌集団に与える効果を評価することでした。食品用NPは、BBMの機能性と発達に悪影響を及ぼし、腸内細菌の集団を変化させると仮定する。

  2. 材料と方法
    2.1. ソニッケーターのキャリブレーションと臨界送出ソニケーションエネルギーの決定
    BRANSON Sonifier® SFX550(Branson Ultrasonics, Danbury, CN, USA)は、超音波エネルギーの印加によるNP凝集体の破壊を促進するために使用された。同じレベルまたは振幅(%)設定で動作する2つの異なる機器が、同じ懸濁液に著しく異なる有効音響パワーを与えることがあるため、機器の校正が必要です[46]。超音波処理装置の校正は、正確な電力印加と送達超音波エネルギー(DSE)の報告を確実にするため、熱量測定法を用いて実施しました(詳細な方法については補足資料をご覧ください)。したがって、我々のNPを分散させるために選択された最終的な操作設定は以下の通りであった: 振幅の10%で2分間、供給電力は7.33ワット、供給超音波エネルギーは87.9ジュール/mLである。
    2.2. 食品グレードのナノ粒子の調製と線量測定
    食品グレードのTiO2(Fiorio Colori, AromataGroup, Milan, Italy)、SiO2(Spectrum Chemical Mfg. Corp., New Brunswick, NJ, USA)、ZnO(Spectrum Chemical Mfg. Corp., New Brunswick, NJ, USA)、Fe2O3(Town End, Leeds, UK)が本研究で用いられた。これらの添加剤は、Garcia-Rodriguezらによって以前に特徴づけられた[7]。NP製剤は、OECD(経済協力開発機構)およびNIST(米国国立標準技術研究所)[46,47]によって確立されたプロトコルに基づいて調製および分散された。簡単に説明すると、20mLのシンチレーションバイアルで、10mgのNP粉末を10mLの滅菌18MΩ DI H2Oに溶解し、連続モードで10%の振幅で2分間超音波処理した。直径1/2インチのディスラプターホーンを備えたプローブソニケーター(BRANSON Sonifier® SFX550, Emerson Electric Co., St. サンプルの加熱を避けるため、各NPの1 mg/mLを含むシンチレーションバイアルは、超音波処理中に氷浴に置かれた。ディスラプターホーンは、NP調製の前後に、50%エタノール溶液を5分間超音波処理することにより滅菌した。生理学的に適切なNP濃度は、in vitroでの過去の結果に基づき、現実的なヒトのNP摂取曝露を模倣するために本研究のために選択された。in vivoモデルは、実際のヒトの摂取濃度でのNPの摂取が、腸の健康、機能、および微生物集団に及ぼす潜在的な影響をモデル化するために選択された。TiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3 NPを滅菌した18 MΩ DI H2Oで連続希釈(1:10)し、それぞれ1.4 × 10-6 mg/mL, 2.0 × 10-5 mg/mL, 9.7 × 10-6 mg/mL, 3.8 × 10-4 mg/mL NPとなるように調整しました。すべての溶液の浸透圧は、VAPRO Vapor Pressure Osmometer(Wescor, Logan, UT, USA)を用いて測定し、浸透圧<320 mOsmを確保し、溶液注入時の鶏胚の脱水を防いだ。食品グレードのNPの処理量は、表1にまとめたように、現実的なヒトのNP摂取量[7]から外挿した1.4 × 10-6 mg TiO2 NP/mL, 2.0 × 10-5 mg SiO2 NP/mL, 9.7 × 10-6 mg ZnO NP/mL および 3.8 × 10-4 mg Fe2O3 NP/mL NPだった。
    表1. 生理学的に関連するナノ粒子(NP)用量は、mg/mLおよびNP/cm2で表されるin vitro研究および今回のin ovo研究で使用された実際のヒトの摂取量から外挿されたものです。
    In vitroでは、4つのNPの生理学的関連用量は、NPの1日のヒト摂取量、NP密度、および食品グレードNPの以前に測定されたサイズ[7]を考慮して策定されました。簡単に説明すると、TiO2 NPの1日の摂取量は、1食あたり1011~1013粒子と推定された[7]。小腸の総表面積が約2×106 cm2であることを考慮すると、1013個の粒子を摂取すると、小腸は生体内で106個/cm2の粒子にさらされることになる[48]。SiO2 NPの場合、成人は1日に約35mgの微細(0.1~1μm)または超微細(100nm未満)のケイ酸塩を摂取することが判明しており、ヒト小腸管は約108粒子/cm2にさらされることになる[34]。ZnO NPについては、私たちのグループは、缶から食品マトリックスに放出されるZnの含有量(10 mg)を調査し、107粒子/cm2の生体内線量に相当する[14]。最後に、Fe2O3 NPの濃度は、肉の普通部位(200 g)の鉄含有量(0.1% v/w)から推定され、これは小腸への104粒子/cm2の線量に相当します[49]。表1は、このin ovo実験と以前のin vitro実験[7]の大きさの一致した線量の順序を示しています。胚17日目のニワトリの小腸の表面積は10cm2と推定された[46]。
    2.3. 食品グレードのナノ粒子の特性評価
    透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、4種類の食品用NP(TiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3)の一次粒子径と形態を測定した。18MΩの滅菌DI H2O中の10μLのNP懸濁液(0.1mg/mL NP)を400メッシュの銅製TEMグリッド(Ted Pella Inc.、Redding, CA, USA)の上面に分注し、乾燥させた。JEOL JEM-2100F (JEOL, Peabody, MA, USA) を用いてランダムな視野のTEM画像を撮影し、Image Jソフトウェアで処理して100個のNPの直径を測定した。4つのNPすべての流体力学的サイズを、Nanosight(Malvern Panalytical Ltd., Malvern, UK)とNanoparticle Tracking Analysisソフトウェア(NTA)を使用して測定した。NTAは、光散乱とブラウン運動特性の両方を利用して、液体懸濁液中のサンプルのNPサイズ分布を得るものである。ゼータ電位は、Zetasizer Nano ZS90(Malvern Panalytical Ltd., Malvern, UK)を用いたレーザードップラー電気泳動(LDE)により評価した。サンプル(0.1mg/mL)の測定は、金メッキベリリウム銅電極(DTS1070)を備えた使い捨てのポリカーボネート製折り返しキャピラリーセルで行い、サンプル充填前に18MΩ滅菌DI H2Oでリンスしてダスト汚染を除去した。TiO2, SiO2, ZnO, Fe2O3 NPに使用した屈折率は以下の通りである: それぞれ、2.42、1.46、1.95、3.32である。試料は、装置チャンバー内で120秒間平衡化し、25℃で測定した。3つの独立した実験(n = 3)を分析した。
    2.4. 動物、羊水内投与、および組織採取
    肥沃なコーニッシュクロスブロイラー鶏の卵(n=60)を入手し(Moyer's Chicks, Quakertown, PA, USA)、Cornell University Animal Science poultry farm incubatorで最適条件[50]でインキュベートした。Cornell University Institutional Animal Care and Use Committeeは、すべての動物プロトコルを承認した(IACUC #2020 -0077、承認日:2020年9月20日)。羊水内投与手順は、既述の通り実施した[40,51,52,53]。主に水、ショートペプチド、ミネラル[54,55]からなる羊水は、17日目から胚によって自然かつ経口的に消費され、ハッチによって完全に消費されるので、注入後すぐに完全に消費される羊水に投与した溶液[38]の、関心のある異なるシステムに対する影響をテストできる [40,53,56,57].
    胚発生17日目に、生存胚を持つ卵の重量を測定し、ほぼ同等の重量分布を持つ6つのグループ(n = 10)にランダムに割り振った。6つの処理群は以下の通りである: 注射なし、18 MΩ DI H2O、1.4 × 10-6 mg TiO2 NP/mL、2.0 × 10-5 mg SiO2 NP/mL、 9.7 × 10-6 mg ZnO NP/mL および 3.8 × 10-4 mg Fe2O3 NP/mL. 1mLの溶液(卵1個あたり)を、滅菌した21ゲージ針を使って羊水に注入した。注入前後の注入部位の滅菌には70%エタノールを利用し、部位の封止にはセロハンテープを使用した。その後、卵を孵化カゴに入れ、同じインキュベーター内の各場所に各処理グループが均等に配置された。孵化後(21日目)、以前に記載されたように[40,42,58]、鳥の体重を測定し、CO2暴露により安楽死させた。血液はヘパリン処理したチューブ(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)で採取した。小腸、盲腸、胸筋、肝臓を入手し、別々の無菌クライオバイアル(Simport, Beloeil, Canada)に保存した。組織サンプルは、液体窒素で直ちに凍結し、分析まで-80℃で保存した。
    2.5. 血液ヘモグロビンの定量化
    血中ヘモグロビン濃度は、QuantiChromTM Hemoglobin Assay (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)を用いて、製造者の説明書に従って測定した。
    2.6. エネルギー状態の測定としてのグリコーゲン濃度分析
    大胸筋および肝臓のグリコーゲン量解析は、既述の通り実施した[53,59,60,61]。詳細な方法論は、補足資料に記載されている。
    2.7. 全RNAの単離とリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)
    これらの手順は、以前に説明したように行われ[40,42,53,59]、使用したプライマーは表2に示す通りである。詳細な方法論は補足資料に記載されている。
    表2. リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)プライマー配列。
    2.8. 微生物サンプルの採取、セカルコンテントDNAの単離、16s rDNAのポリメラーゼ連鎖反応による増幅
    これらの手順は、以前に説明したように実施した[40,42,62]。詳細な方法論は、補足資料に記載されている。
    2.9. 十二指腸組織形態学的検査
    腸の形態分析は、以前に記載されたように十二指腸切片で行った [53,56,59] 。切片は、新鮮な4%(v/v)緩衝ホルムアルデヒドで固定し、脱水、洗浄後、パラフィンに包埋した。切片を連続的に切り出し(厚さ5μm)、スライドガラスに載せた。切片をキシレンで脱パラフィンし、段階的なアルコール系列で再水和し、アルシアンブルー/ペリオディックアシッドシッフで染色した。以下の変数(図1に示す)を光学顕微鏡(EPIX XCAPソフトウェア、Olympus、Waltham、MA、USA)で測定した:絨毛の高さと幅、クリプトの深さ、杯細胞の直径、絨毛とクリプト内の杯細胞の種類と数、クリプトあたりのパネス細胞数、パネス細胞幅。処理群ごとに5つの生物学的サンプル(n = 5)、生物学的サンプルごとに4つのセグメントを分析した。1セグメントあたり、無作為に選んだ10個の絨毛と陰窩を分析した。細胞サイズの測定とカウントは、1セグメントあたり無作為に選択した10個の絨毛および/または陰窩でカウントした(生物学的サンプルあたり40個の複製物)。絨毛の表面積は、以前に記載されたように計算された[63]。
    図1 (A)正常な小腸の組織形態学的描出。腸細胞は小腸絨毛の中にあり、杯細胞は腸細胞内の青い細胞である(赤丸)。クリプト絨毛の軸は、軸の位置を示す黄色のバーで表現されています。次の変数が測定された:絨毛表面積(黒で描かれている)および陰窩深度(緑で描かれている)。(B)正常な小腸の陰窩の組織形態学的描写。パネス細胞(黄色矢印、錐体形状)は、自然腸管免疫とホメオスタシスに重要な役割を担っている。以下の変数を測定した:杯細胞直径(赤)およびパネス細胞直径(緑)。杯細胞直径の測定例で示された杯細胞のタイプは、酸性杯細胞:この研究で見つかった優勢な杯細胞タイプを表しています。
    2.10. 統計解析
    結果は、表およびヒートマップにおいて、平均値±平均値の標準誤差(n≧5)で示される。グラフとヒートマップの作成には、Microsoft Excel(Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA)を利用した(カラースケールを用いた条件付き書式設定に基づく)。分布の正規性を評価するために、Shapiro-Wilk検定を利用した。結果は、治療グループ間の差を比較するために、ポストホックダンカンテストを伴う一元配置ANOVAによって分析され、結果はp < 0.05で統計的に有意とみなされた。統計解析は、Rバージョン4.0.4ソフトウェアで行った。

  3. 結果
    3.1. 食品グレードの金属酸化物ナノ粒子の特性評価
    TEM、NTA、DLS、およびLDE技術を利用して、4種類の食品グレードNPの特性を完全に把握し、in ovoシステムにおけるNPの挙動と生体内変換を理解しました。0.1mg/mLのNP懸濁液のTEM画像を撮影し、各食品グレードのNPの乾燥状態の形状を示しました(図2A-D)。4種類の食品用NP調製物すべてにおいて、一次NPが相互作用してクラスター状に付着しているのが確認され、凝集現象が発生しています。画像処理プログラム(ImageJ)を使用して、食品用TiO2、SiO2、ZnO、およびFe2O3 NPの一次粒子サイズをおおよそ測定したところ、それぞれ120、21、203、および92 nmであった(図2E)。NTAは、水和した状態のNPサイズ(流体力学的サイズ)を測定するために使用されました。
    図2. 食品用ナノ粒子(NP)の特性評価。乾燥状態のTiO2 NP(A)、SiO2 NP(B)、ZnO NP(C)、Fe2O3 NP(D)の透過型電子顕微鏡(TEM)画像。TEM画像から測定した一次粒子径(nm)の周波数ヒストグラム(A'-D')。動的光散乱を用いたNanoSightナノ粒子追跡分析(NTA)技術で測定した水和NPの粒度分布(a-d)。各NPの一次粒子径(nm)、流体力学的サイズ(nm)、多分散性指数(PdI)、ゼータ電位値(mV)、電気泳動移動度(μm-cm/V-s)の平均をまとめた表(E)。データは平均値±SEMで示した。
    予想通り、4つの食品グレードのNPはすべて、滅菌した18MΩナノピュアH2Oに懸濁したときにわずかに凝集し、平均して211nm(TiO2 NP)、264nm(SiO2 NP)、225nm(ZnO NP)および301nm(Fe2O3 NP)の動径サイズになった。また、多分散性指数(PdI)を算出した。これはキュムラント分析から算出されたサイズ分布の広さを表す無次元尺度であり、値は0から1の範囲で、<0.05は非常に単分散、<0.08はほぼ単分散、0.08から0.7の中間の多分散、>0.7は非常に多分散である。したがって、TiO2 (PdI = 0.09) とSiO2 NP (PdI = 0.04) は、ZnO (PdI = 0.38) とFe2O3 NP (PdI = 0.48) よりも単分散であることが示された。この傾向は、水和NPの粒度分布グラフ(図2a〜d)に明確に表れている。
    最後に、NPのゼータ電位(mV)と電気泳動移動度(μm-cm/V・s)を、電界印加下で液体溶液中に浮遊する粒子の安定性と移動度を測定するレーザードップラー電気泳動法(LDE)を用いて測定しました。ゼータ電位値が高いほどNP分散液は安定であり、±30mVが水系における最良の安定値であることを考慮すると、4種類の食品用NPはいずれも中位から良好な安定値を示した(図2E)。さらに、TiO2 (-22 mV) とSiO2 NP (-26 mV) の両方が負に帯電していることがわかったが、ZnO (25 mV) とFe2O3 NP (19 mV) はともに正の表面電荷を呈した。食品用TiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3 NPの電気泳動移動度は、それぞれ-1.73, -2.04, 1.96, 1.49 μm-cm/V-s であった。
    3.2. グロス生理学的パラメータ
    体重、盲腸重量、盲腸-体重比に投与群間の有意差は認められなかった(表3)。
    表3. 全群における体重、盲腸重量、盲腸:体重比 1.
    3.3. ヘモグロビン濃度およびグリコーゲン濃度
    平均ヘモグロビン濃度は、NI群と比較して、食品用NP処理群およびH2O注入群で有意に減少した(p<0.05、表4)。胸筋グリコーゲン量は、コントロールと比較して、TiO2 NP処理群およびSiO2 NP処理群で増加した(p < 0.05)。肝臓のグリコーゲン量については、処理群間で有意差はなかった。
    表4. ゲニステイン曝露1後の血中ヘモグロビン濃度(g/dL)および大胸筋グリコーゲン濃度(mg/g)。
    3.4. Fe、Zn、ブラシボーダー膜機能、および炎症関連タンパク質の十二指腸遺伝子発現量
    3.4.1. 鉄・Zn関連蛋白質
    鉄の取り込みを担うタンパク質(図3)について、十二指腸シトクロムb(DcytB)遺伝子発現は、コントロールと比較すると、すべての食品用NP曝露群で有意に上昇した(p<0.05)。二価金属トランスポーター1(DMT1)の発現は、NIコントロールと比較して、TiO2およびSiO2 NP暴露でアップレギュレートされた。ZnOおよびFe2O3 NPの暴露は、NIおよびH2Oコントロールと比較して、有意なDMT1発現の変化をもたらさなかった。NIコントロールと比較した場合、SiO2、ZnO、Fe2O3 NP曝露によりフェロポーティンの発現が有意にアップレギュレートされた。細胞内のZnの取り込み(図3)、輸送、貯蔵に関連するタンパク質については、Zn輸送タンパク質1(ZIP1)の遺伝子発現は、NIコントロールと比較して、食品グレードのNP曝露で有意にダウンレギュレーション(p < 0.05)されました。また、Znトランスポーター1(ZnT1)の遺伝子発現は、コントロールと比較して、食品グレードのNP曝露により有意にアップレギュレーションされた(p < 0.05)。
    図3. 栄養トランスポーター、ブラシボーダー膜機能タンパク質、および炎症性サイトカインの十二指腸遺伝子発現に対する食品用ナノ粒子(NP)の羊水内投与の影響。遺伝子発現は、18Sハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。数値は平均値±SEM、n = 6. 遺伝子ごとに(同じ列で)、青はより低い遺伝子発現レベルを、赤はより高い遺伝子発現レベルを表す。 a-c 遺伝子ごとに(同じ列で)、同じ文字で示されていない処理群は、一元配置分散分析およびポストホックダンカン検定に従って有意に異なる(p < 0.05). NI = 非注射。DcytB、十二指腸チトクロームb;DMT1、二価金属トランスポーター1;ZIP1、亜鉛輸送タンパク質1;ZnT1、亜鉛トランスポーター1;SGLT1、ナトリウム-グルコース共輸送体1;SI、スクラーゼイソマルターゼ;MUC2、ムチン2;NF-ΚB、核因子カッパBサブユニット1;TNF-α、腫瘍壊死因子-アルファ;IL8、インターロイキン8.
    3.4.2. BBMの機能性、ムチン産生、炎症性蛋白質
    Sodium-glucose cotransporter 1(SGLT1)の発現は、コントロールと比較して、SiO2 NP存在下で上昇した(図3、p < 0.05)。ムチン2(MUC2)の発現は、コントロールと比較して、NP曝露により有意に上昇した(p < 0.05)。インターロイキン8(IL8)の発現は、SiO2 NPの存在下で、コントロールと比較して上昇した(p < 0.05)。スクラーゼ・イソマルターゼ(SI)、核内転写因子(NF-κβ)、腫瘍壊死因子(TNF-α)の遺伝子発現は、食品用NP曝露群と対照群を比較すると、有意差は見られなかった。
    3.5. 腸内細菌の世代および種レベルの分析
    TiO2 NP曝露により、日和見菌または潜在的な病原性細菌であるClostridium属の相対存在量は、NIコントロール、SiO2、Fe2O3処理群と比較して有意に減少した(p < 0.05, Figure 4)。病原性の可能性がある大腸菌は、ZnOおよびFe2O3曝露群と比較して、TiO2曝露で有意に減少した(p < 0.05、図4)。ビフィドバクテリウム属とラクトバチルス属の相対量には、処理群間で有意な差は見られなかった。
    図4. 孵化日のセカル属(ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス、クロストリジウム)および種レベルの細菌集団(大腸菌)に対する食品用NPの羊水内注射の影響。値は平均値±SEM、n = 5で示される。 a,b 細菌カテゴリーごとに、文字が同じでない処理群は、一元配置分散分析およびポストホックダンカン検定(p < 0.05)に従って有意差がある。NI = 非注入。
    3.6. 十二指腸絨毛、クリプトの深さ、ゴブレット細胞、パネス細胞の形態学的解析
    TiO2およびZnO NPの曝露により、他のすべての処理群と比較して、絨毛表面積が有意に減少した(p < 0.05, 表5)。一方、Fe2O3およびSiO2 NP曝露は、NIおよびH2O対照と比較して、絨毛表面積の有意な差異をもたらさなかった。ZnOおよびFe2O3 NP曝露群の陰窩深度は、他のすべての処理群と比較して、有意に減少した(p < 0.05)。TiO2およびSiO2 NP曝露は、NIおよびH2Oコントロールと比較した場合、クリプト深度が有意に減少し(p<0.05)、ZnOおよびFe2O3 NP曝露グループと比較した場合、クリプト深度が有意に増加(p<0.05)しました。
    表5. 実験用食品グレードNP溶液の羊水内投与が十二指腸小腸絨毛および陰窩の深さに及ぼす影響 1.
    食品用NP処理では、H2Oコントロールと比較して、絨毛杯細胞径が有意に小さくなった(p<0.05)(表6)。酸性絨毛杯細胞数は、NI、H2O、Fe2O3 NP群と比較して、TiO2、SiO2、ZnO NP曝露群で有意に減少した(p<0.05)。中性絨毛杯細胞数には、群間で有意差はなかった。Fe2O3 NP処理群は、他のすべての群と比較して、混合絨毛杯細胞数が最も高く、TiO2およびZnO NP曝露群は、H2O対照と比較して、混合絨毛杯細胞数が有意に高かった(p < 0.05)。総絨毛杯細胞数は、NI、H2O、Fe2O3 NP群と比較して、TiO2、SiO2、ZnO NP曝露群で有意に低かった(p < 0.05)。
    表6. 実験用食品グレードNP溶液の羊水内投与による絨毛杯細胞径、杯細胞数、杯細胞タイプ1への影響。
    食品用NP処理群の陰窩ゴブレット細胞径は、H2O対照と比較して有意に低かった(p<0.05、表7)。Fe2O3 NP曝露群は、H2Oコントロールと比較して、全クリプト杯細胞数および酸性クリプト杯細胞数が有意に高かった(p < 0.05)。TiO2, SiO2, ZnO NP曝露群の全クリプト杯細胞数および酸性クリプト杯細胞数をNIおよびH2Oコントロールと比較した場合、有意差は認められなかった(表5)。グループ間では、中性陰窩ゴブレット細胞数に有意な差は認められなかった。NP曝露により、コントロールと比較して、クリプト杯細胞数の混合が有意に減少した(p<0.05)。
    表7. 実験用食品グレードNP溶液の羊水内投与によるクリプト杯細胞直径、杯細胞数、杯細胞タイプ1への影響。
    陰窩あたりのパネス細胞の平均数は、対照と比較した場合、すべての食品グレードNP処理群で有意に増加し(p<0.05)、TiO2 NP曝露は、他のすべての試験NPタイプに対する曝露に対して陰窩あたりのパネス細胞の平均数が最も高くなった(Table 8)。陰窩パネス細胞直径は、NIおよびH2Oコントロールと比較して、TiO2、SiO2、およびZnO NP曝露群で有意に増加した(p < 0.05)。Fe2O3 NP曝露では、NIコントロールと比較して、クリプトパネス細胞径は有意に増加しなかった。
    表8. 実験用食品グレードNP溶液の羊水内投与がクリプトあたりのパネス細胞およびパネス細胞直径に及ぼす影響 1.

  4. 考察
    NPは食品産業内で食品添加物として広く使用されており、TiO2およびSiO2 NPは食品着色料または固結防止剤として、ZnOおよびFe₃O₂ NPはそれぞれ抗菌剤および着色剤として添加され、微量栄養素サプリメントとして使用することができる。食品添加物のNP曝露がGI機能と発達に及ぼす影響はまだ不明であるため、本研究では、生理学的に適切な量の食品用NPの摂取による潜在的な影響をin vivoで評価することを目的としている。私たちが確立したG. gallusのin vivoモデルは、機能性食品や食品添加物を生理学的に適切な用量で摂取した場合の影響を解明するために以前利用されました[38,39,41,42]。このin vivoモデルにおいて、化学グレードのTiO2およびSiO2 NPは、腸の機能性と健康に悪影響を及ぼす可能性があることが以前に実証されている[40]。NPを含む食品は広く消費されているため、本研究では、化学グレードのNPに関する前回の研究を基に、一般的に利用されている食品グレードの金属酸化物NPの影響を評価する。本研究では、G. gallusモデルにおいて羊水内投与法を利用し、孵化直後の十二指腸BBMの発達と機能性(遺伝子発現と組織形態)および代表的な糞便微生物種の相対存在量に対する食品グレード金属酸化物NP(TiO2、SiO2、ZnO、Fe2O3)のヒト関連用量での影響を評価しました。これらの結果は、羊水内投与された食品グレードの金属酸化物NPが、BBMの機能遺伝子発現、腸の発達、およびセカール細菌集団に影響を与えたことを示しています。
    NPは、主にそのサイズ特有の物理化学的特性により、バルクや化学グレードの対応するものよりも環境との反応性が高いことがよく知られている[2]。これまでの研究では、化学的特性の異なる環境が、浸食、イオン放出、凝集・会合現象、タンパク質コロナ形成、引力・斥力など、NP懸濁液に大きな変化を引き起こすことが説明されています[64,65]。我々の以前の研究では、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)細胞培養液、ウシ胎児血清(FBS)、in vitro胃消化液などのタンパク質含有量の高いより複雑な溶液やpHの変化、食品マトリックスが凝集や溶解(イオン放出)などのNP物理化学変化に直接影響することを発見した[7,35,36]。これらの変化は、NPと生物との相互作用に劇的な影響を与え、最終的にNPはより危険な存在となる可能性がある。例えば、細胞培養液(DMEM+FBS)に懸濁したTiO2 NPの凝集はin vitroの上皮に構造的損傷を与える一方、細胞培養液中のZnO NPからのイオン放出は腸管由来細菌(e.g.)を障害した、 coli および L. rhamnosus)を障害し、in vitro 消化器ブラシボーダー酵素(例:腸アルカリホスファターゼ、アミノペプチダーゼ-N、スクラーゼイソマルターゼ)の活性を変化させた [7,31]. いくつかの人工NPに対するin vitro消化の影響に関する広範な調査によると、カスケード消化(唾液→胃液→腸液)のシミュレーションで、TiO2(0.42%)とFe2O3 NP(2.27%)が軽度の溶解を示した一方、SiO2とZnO NPは部分的に(65. 5%)および完全溶解(100%)を示したが、ZnOではなくSi4+イオンが腸相で再沈殿することが判明した[66]。したがって、毒性学的な観点から、NPの生体内変換は、曝露による潜在的な影響をさらに調査し、明らかにするために不可欠な要因である。ZnとFeのイオンコントロールは、以前のin vitro研究において、ヒト細胞の細胞毒性、細菌の生存率の統計的に有意な低下、ブラシボーダー膜(BBM)酵素活性の変化をもたらさなかった[7]ので、本研究ではこれらの条件を含めなかった。NPの環境または生物学的相互作用を調査する多くの研究では、一般的に市販のNP粉末から試験用懸濁液を調製するために超音波処理を利用しているため、研究間の再現性を促進するために、OECDおよびNISTガイドライン、およびNP超音波処理の標準化プロトコル(NanoGenotox)の両方に従った[47, 67,68] 。したがって、サンプルに供給される電力が7.32 Wである超音波処理手順の後、4つの食品グレードのNPはすべて、TEM、DLS、NTA、およびLDEによって完全に特性評価された。TiO2, SiO2, ZnO, Fe2O3 NPの一次粒子径はそれぞれ120, 21, 203, 92 nmであったが、NTAによってナノピュアH2Oサスペンション中のNPサイズを測定すると、値はわずかに増加した。ほとんどの金属酸化物NP(例えば、TiO2、ZnO、CeO、およびFe2O3 NP)は、ナノピュアH2Oおよび/または天然水性マトリックス中で水和すると、比較的大きなクラスターまたはアグロメレートを形成する[64,69]。この凝集はコロイド化学の原理と一致しており、NPが懸濁された水環境のイオン強度とpHに強く影響されると予想される[70]。Frenchら(2009)は、DLSにより、4~5 nmのTiO2 NPが、0.0165 Mという高いイオン強度に調整した水性懸濁液中で20~1000 nmの安定した凝集体を容易に形成することを示した[70]。本研究では、食品添加物のTiO2、SiO2、ZnO、およびFe2O3 NPを、低イオン強度と低緩衝能を示す滅菌ナノピュアH2Oに懸濁して超音波処理し、その流体力学的サイズもそれぞれ211、264、225、301 nmまで増加した。これは、超音波処理中の粒子の衝突や加熱が、形態、表面酸化物特性、表面電荷などのNPの特性に影響を与えたためと考えられる。さらに、多くの市販のNP粉末は高温の気相法で合成されており、液滴が他のものと完全にまたは部分的に合体し、より大きな一次粒子を形成する可能性があり、超音波処理で破壊するには強すぎることが多い [46].
    これまでの羊水内投与試験では、Fe十二指腸トランスポーター遺伝子のダウンレギュレーションはFe状態の改善と関連しており、Fe充足状態のため、Fe不足を補うメカニズムとして追加のFeトランスポーターは必要なかった [42,53]. これまでのin vivoおよびin vitroの研究と同様に、試験した食品グレードの金属酸化物NPの投与は、一般的にDcytB、DMT1、およびフェロポーティンを上昇させ、Fe不足の内腔および基底側条件を示唆した [37,40,56]. 細胞内のZnの取り込み、輸送、貯蔵に関連するタンパク質の発現については、ZIP1の遺伝子発現がNI対照と比較して食品添加物NP曝露で有意にダウンレギュレートされた(図3)。ZIP1のアップレギュレーションは、Znが豊富な条件と不足している条件に関連している。ZIP1は、Znが豊富な培地では細胞小器官に存在するが、Znが不足している場合は細胞膜表面にのみ存在する[71, 72]。ZnT1は腸細胞の基底側面に位置し、腸細胞内から循環にZn2+を排出する[72,73,74]。食品用NPの曝露により、ZnT1遺伝子の発現が対照群と比較して有意に上昇した。これは、ZnT1の発現上昇がNP投与と関連していた我々の以前のin vivoおよびin vitroの研究と一致している[14, 40]。ZnO NPは腸管内腔のような酸性条件下で可溶化し、生物学的に利用可能なZnを胚に供給することができ、ZnT1のアップレギュレーションとZIP1のダウンレギュレーションをもたらす [14,71,75]. さらに、食品添加物であるZnO NPの暴露は、炎症性遺伝子TNF-αとNF-κBの著しいアップレギュレーションをもたらした(図3)。核因子κβ(NF-κB)は、サイトカイン、活性酸素種(ROS)、細菌の代謝物など、細胞内外の様々な刺激によって活性化される転写因子である。NF-κBは刺激されると細胞核内に移動し、腫瘍壊死因子α(TNF-α)やインターロイキンなどの炎症性メディエーターの放出など、様々な生物学的機能に関与する[76,77]。TNF-αは免疫細胞の調節因子であり、インターロイキンは炎症における生理的役割と全身性の炎症状態における病理的役割を果たすサイトカイン群である。一方では、Zn代謝遺伝子発現の変化は炎症促進状態と関連しており、Zn吸収を増加させることが以前に示されている。他方では、Znの主要な標的はNF-κBであり、ZnはNF-κB活性を調節することができ、NF-κB発現はTNF-α発現と正の相関がある [40,56,78,79,80]. ミネラルトランスポーター発現の変化は、食品用NPの凝集に起因する可能性があり、NP凝集体は、GI管のin vitroモデルにおいてBBMに沈降することが観察され、NP処理条件では微絨毛が著しく少なく、BBM発達の低下を示している [7]. SGLT1遺伝子の発現は、食品添加物のTiO2およびSiO2 NPの曝露によって上昇した(図3)。以前の研究では、BBM機能遺伝子発現のアップレギュレーションは、G. gallus孵化子の腸の発達、消化能力、および微量栄養素(FeまたはZn)吸収増加の可能性の改善を示唆した[81]。しかし、化学グレードNP曝露に関する以前のin vivo研究では、BBM機能遺伝子の発現が増加し、著者は、腸の発達または腸の損傷による吸収改善への補償機構を示していると仮定した [40].
    食品用金属酸化物NPの羊水内投与は、腸の発達に影響を与えた。食品添加物のTiO2、SiO2、ZnO NPへの曝露は絨毛表面積の減少をもたらし(表5)、消化酵素と吸収能力の低下を潜在的に示している [82] 。クリプト深度は、対照群と比較して、すべての食品添加物NP曝露群で有意に浅いことが判明した(表5)。NP曝露は、TiO2およびSiO2 NP曝露による腸管損傷の代償メカニズム、または栄養的に有益なZnOおよびFe2O3 NP曝露による腸細胞増殖の増加と関連していることが以前に示されていた[83、84および85]。同様に、Khajeh Bamiら(2018)は、42日間のZnO NP曝露により、G. gallusのクリプト深度が減少することを発見した[85]。これは、ブロイラーが食品グレードのZnOおよびFe2O3 NPを栄養上の利益のために利用していたことを示す可能性があり、SiO2およびTiO2 NP曝露(図3)と比較してIL8ダウンレギュレーションによって支持され、炎症性免疫応答のIL-8仲介による全身炎症のレベルの低下を示すことができる。
    小腸と大腸の主要な杯細胞ムチンはMUC2タンパク質で、腸内細菌と結合するゲル形成性の分泌性ムチンであり、栄養素の加水分解と吸収を促進することに関連している [36,57,86,87]. パネス細胞は、杯細胞が産生するムチンに抗菌ペプチドを分泌し、MUC2遺伝子発現はパネス細胞の数とサイズの増加と相関している[88]。MUC2遺伝子発現はNP曝露により有意に上昇したが、絨毛杯細胞直径はH2O注入対照と比較してNP処理に伴い有意に減少した(図3)。このことは、NP曝露により腸内細菌叢が変化し、腸粘膜表面にNPバイオフィルムが形成され、杯細胞のムチン産生能が阻害される可能性があり、MUC2の発現上昇は腸管障害を予防する代償機構である可能性がある[36]と考えられる。食品グレードのTiO2、SiO2、およびZn NPの暴露により、総絨毛杯細胞、特に酸性絨毛杯細胞の減少が観察され(表6)、十二指腸杯細胞による酸性腔ムチンの合成と分泌が減少することが示された[38,89]。食品添加物Fe2O3 NP曝露では、他の食品添加物NP処理群と比較して、総絨毛杯細胞数の有意な増加、酸性杯細胞の割合と混合杯細胞の増加の有意な増加が認められ、総絨毛酸性杯細胞はコントロールに対して維持されていた(表6)。このムチンは、腸上皮の保護バリアとしての機能に加えて、プロバイオティクス細菌の増殖、細菌代謝産物の増加、および上皮細胞機能の促進をサポートする生息地としても機能する[86,90]。
    これまでのin vitroおよびin vivoの研究により、金属酸化物への曝露は、GI細菌集団の存在量の組成シフトにつながることが示されている[91]。ZnOとFe2O3 NPは食品のミネラル強化に利用され、これらの潜在的に栄養価の高いNPへの曝露は、統計的に有意ではないものの、健康を促進する細菌、ビフィドバクテリウムの集団の増加をもたらした。さらに、食品添加物のZnOおよびFe2O3 NPの暴露は、MUC2遺伝子の発現の有意なアップレギュレーションとクリプトあたりのパネス細胞数の増加と関連しており、これは、酸性ムチン生産の増加に起因するビフィドバクテリウム属の増殖を助長する環境の提供に関連することができます[92、93]。潜在的な病原体であるクロストリジウム属菌と大腸菌は、食品用SiO2、ZnO、またはFe2O3 NPに曝露すると、H2Oコントロールと比較して増加しました(図4)。食品添加物であるSiO2、ZnO、またはFe2O3 NPの曝露によって得られた遺伝子発現は、炎症性サイトカイン発現、NF-κBおよびTNF-αの増加を示し(図3)、クリプトあたりのパネス細胞数が有意に増加し(表8)、これは、潜在的に日和見のクロストリジウム属およびおそらく病原性の大腸菌の存在量の増加と関連していると思われます(図4)。これまでの研究で、SiO2 および ZnO NP が抗菌特性を有することが示されているが、今回の研究では、投与量が少なすぎる、または NP が大きすぎる食品用 NP が使用され、抗菌性を発揮できなかった [7,34,40,94]. 食品添加物のTiO2 NP曝露は、グラム陽性菌(ビフィドバクテリウム属、ラクタセイバシラス属、クロストリジウム属)およびグラム陰性菌(大腸菌)の集団減少と関連しており(図4)、TiO2 NP曝露が腸内細菌叢異常につながり、有益なビフィドバシリウム属およびラクタセイバシラス属の存在量が減少することが以前発見されている[95,96]。孵化後及びヒトに相当する量の食品グレードのNPを用いた長期飼育試験における、腸内細菌叢の変化、腸の機能性、及び発達の変化を評価するための追加研究が必要である。試験された食品添加物であるNPの潜在的な危険性と有益性は、関連する潜在的な危険性と有益性がバランスする適切な用量を決定するためにさらに調査されるべきである。さらに、今後の研究では、NP曝露に関連する結果が、NP粒子そのものに関連するのか、NPイオンだけに関連するのかを明らかにする必要がある。

  5. 結論
    本研究は、摂取した食品用金属酸化物の種類が、生体内(G. gallus)の腸の発達と機能性、およびセカル細菌の量と存在に影響を与えることを実証した。その結果、食品添加物のTiO2およびSiO2 NPは、腸の機能性に悪影響を及ぼす可能性があることが示唆された。食品添加物ZnO NPの投与効果は、腸の発達をサポートする、または腸の損傷による代償機構に関連していた。さらに、食品添加物であるFe2O3 NPは、腸の機能性と発達を乱す可能性はあるものの、鉄分強化のための潜在的な選択肢であることが判明した。今回のNP羊水内投与の結果は、化学グレードおよび食品グレードのNPを同じ種類と濃度で用いたこれまでのin vivoおよびin vitroの研究と概ね一致しており、NP摂取による微生物叢組成や腸の機能性および発達への潜在的摂理を解明するための比較的迅速かつ低コストのスクリーニング方法としてのこれらの方法の使用が妥当であることが示された。しかし、マイクロスケールの粒子コントロールがないことは、本研究の限界である。本研究は、生理的に関連する濃度の食品用金属酸化物NPの摂取に関連する影響のベースラインを確立し、食品、水、および環境を通じてNPに人間がさらされることは避けられないことを考えると、細胞および組織の障壁を越えるNPの浸透など、食品用金属酸化物NP摂取の結果は、長期の動物飼育試験でさらに評価する必要があります。
    補足資料
    以下のサポート情報は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/antiox12020431/s1、表S1. 選択した設定または振幅に応じたBRANSON Sonifier® SFX550の出力(%); 図S1. TiO2 NPを参照NPとして用いた臨界DSE(J/mL)決定。(A) DLSによって測定されたTiO2 NPの流体力学的サイズ。(B)前回の測定値に対するサイズの倍率変化(%)。(C)最小の粒子凝集状態(nm)を達成するための超音波処理時間(秒)に沿って、与えられた超音波処理エネルギー(J/mL)を一覧にした表。
    著者からの寄稿
    概念化: A.G.-R.、G.J.M.、C.N.H.M.、E.T. Data curation: J.C.、N.K.、A.G.-R. 形式的な解析: J.C.、N.K.、A.G.-R. 原稿執筆-原案 J.C.、N.K.、A.G.-R.。執筆-レビューと編集: J.C., A.G.-R., N.K., G.J.M., C.N.H.M. and E.T. 資金獲得: G.J.M.、C.N.H.M.、E.T. プロジェクト管理: 全著者が最終原稿を批判的に検討した。すべての著者は、本原稿の出版版を読み、同意した。
    資金提供
    この研究は、米国国立衛生研究所の助成金番号1R01ES028788の支援を受けています。
    インスティテューショナル・レビュー・ボード声明
    本研究で使用した動物プロトコルは、ヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施され、倫理承認コード2020-0077によりコーネル大学機関動物ケアおよび使用委員会から承認されました。
    インフォームド・コンセントの記述
    適用外です。
    データの利用可能性に関する声明
    データは、合理的な要求があれば入手可能です。
    利益相反について
    著者らは利益相反のないことを宣言している。
    参考文献
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