ポリアミン代謝はHIV感染者の口腔粘膜におけるT細胞機能障害に影響を与える

哉百名


ポリアミン代謝はHIV感染者の口腔粘膜におけるT細胞機能障害に影響を与える

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9873639/

S. S. マハリンガム、S. ジャヤラマン、[...], およびP. パンディヤーン

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要旨
免疫細胞における代謝の変化は、免疫反応の生理的および病態生理学的な結果に寄与している。本研究では、非感染者とHIV感染者のタンパク質発現、トランスクリプトーム、唾液メタボロームプロファイルを比較することにより、HIV感染者の口腔粘膜にポリアミン代謝の擾乱を見出した。ヒト扁桃オルガノイドのin vitro感染モデルを用いたメカニズムの研究から、HIVがT細胞に感染するとポリアミン合成も増加し、その量はcaspase-1, IL-1β, ornithine decarboxylase-1の活性に依存することが明らかになった。HIV-1は、オルニチンデカルボキシラーゼ-1を含むポリアミン合成中間体の発現を高めるとともに、機能不全制御性T細胞（TregDys）/Tヘルパー17（Th17）細胞の比率を上昇させた。カスパーゼ-1とポリアミン合成中間体を阻害すると、TregDysの表現型が反転し、ポリアミン経路がHIV-1感染時のT細胞の機能変化に直接関与していることが示された。最後に、口腔粘膜のTregDys/Th17比率およびCD4過活性化は、HIV+患者の唾液中のプトレシンレベルと正の相関があり、唾液中のプトレシンレベルが上昇していることが判明した。このように、HIV感染時に異常に増加するポリアミン合成の役割を明らかにすることで、慢性的なウイルス感染が、異なるT細胞エフェクタープログラムとTreg機能不全を引き起こすメカニズムを明らかにすることができた。

課題用語 抗菌反応、疾患メカニズム、レトロウイルス
はじめに
ウイルスがどのように免疫細胞の代謝状態を変化させるのか、また、ウイルス慢性感染時に持続する免疫機能不全の背後にある正確なメカニズムは、これまで十分に解明されていない重要な課題である。免疫細胞の多様性、機能、可塑性を支配する組織微小環境は、抗ウイルス反応や炎症シグナルを制御することを考えると、効果的で的を射たアプローチを考案するには、組織特異的免疫学を包括的に理解することが必要である。抗レトロウイルス薬併用療法（cART）の時代において、HIV感染は全身性の炎症、粘膜免疫細胞の持続的な機能不全、生物学的老化および関連する併存疾患のリスクの増加によって特徴づけられる。HIVとともに生きる人々（PLWH）は、世界人口のうち〜3770万人［3020〜4510万人］を占め、PLWHの併存疾患に対する現在の治療法はなく、生活の質が著しく損なわれている1。PLWHでは、歯周炎、口腔カンジダ症、がんの有病率が高いことが確認されていますが、その背景にあるメカニズムについてはあまり研究されていません2,3。口腔粘膜Tヘルパー（Th）の調節障害および活性化は、PLWHにおけるtoll like receptor（TLR）およびNLR family pyrin domain containing（NLRP）3駆動のインフラマソームシグナルの増強、FOXP3+Tregsレベルの上昇およびそれらの機能不全と一致する4。HIV感染に伴うThの制御異常には、PD-1hiIFN-γ+FOXP3+CD4+マーカーで定義される機能不全FOXP3+細胞（TregDys）が濃縮されていることを我々は以前に明らかにしている。PD-1とIL-1βの高発現はTregDysの誘導と増殖に寄与しているが、PLWHにおける全体的なTh調節異常の正確なメカニズムは不明である。ポリアミン合成は基本的なプロセスの一つであり、Thサブセットの機能的な運命を決定することが最近明らかにされている5-7。オルニチン脱炭酸酵素（ODC-1）は、ポリアミン生合成経路の律速酵素であり、L-オルニチンを最初のポリアミンであるプトレシンに変換し、その後、スペルミジンとスペルミンに変換される8。スペルミジンは、T細胞受容体（TCR）活性化時に発現が上昇し、Th細胞でのサイトカイン発現を制御する真核生物翻訳開始因子5A（EIF5A）の低分子化過程で基質として作用する5。EIF5Aの低分子化は、特定のリジン残基の翻訳後修飾であり、デオキシヒプシン合成酵素（DHPS）とデオキシヒプシン水酸化酵素（DOHH）の2つの酵素による連続したステップが必要である。これらのポリアミン合成経路の構成因子は、Thの活性化、サイトカインの発現、細胞の忠実性を変化させることが最近明らかにされた5。

本論文では、HIVによるポリアミン代謝の変化が、PLWHの口腔粘膜におけるTh17とTreg細胞サブセットの間のバランスを傾けるメカニズムに寄与していることを示す。我々の以前の研究では、HIV感染時のTregDysサブセットの特徴を明らかにし、TregDysの誘導と拡大には、カスパーゼ-1活性とIL-1βの放出が必要であることを示した4。今回我々は、Th17細胞の増殖抑制とThバランスのTregDys表現型への偏向には、ODC-1を介したポリアミン合成とEIF5Aの低活性化が必要であり、これらはHIV感染時にも増強されることを見出した。ODC-1とポリアミンは、HIV感染という状況下ではTh17細胞の頻度を直接的に制御することはない。しかし、N1-guanyl-1,7-diaminoheptane（GC7）、スペルミジン類似体を用いてODC-1活性およびEIF5A低活性化を阻害すると、in vitroのHIV感染時のTregDysの頻度が減少することが示された。外因性ポリアミンの添加は、アンフィレグリン（AREG）のアップレギュレーションとTregDysの増殖も誘導した。PLWHにおいて重要なことは、Treg/Th17比の増加およびCD4の過活性化が、口腔粘膜のポリアミンプトレスシンのアップレギュレーションと正の相関があることであった。以上より、ポリアミン代謝が、ウイルス性疾患におけるTh調節障害および慢性炎症の主要な決定因子であることが明らかになった。

研究成果
口腔歯肉粘膜のRNA配列解析と唾液メタボローム解析により、PLWHにおけるアルギニン経路とポリアミン経路の調節異常が明らかになった。
口腔粘膜の転写プロファイリングと唾液のグローバルなメタボロームプロファイリングを用いて、我々はまず、非感染対照者に対するcART治療PLWHの代謝変化を同定しました。代謝物プールの大きさの変化に関連する遺伝子発現の変化を注釈する複合的な計算機手法を用いて、トランスクリプトームとメタボロミクスのデータセットを結合させました。遺伝子と代謝物の関連は、MetaboAnalyst と Metascape を用いてパスウェイにマップされました。代謝物の同定には、Compound Discoverer 3.1 SP1 と MZmine2 ソフトウェアを使用しました。MS1とMS2のスペクトルは、m/z = 0.1の質量公差でマッチングされました。生データを取得し、m/z値とイオンシグナルの保持時間に基づいてCompound Discoverを使用してアライメントを行った。ESI-またはESI+の両方からのイオンをマージし、多変量解析のためにSIMCA-Pプログラム（バージョン14.1）にインポートした。さらに、DecoID (DecoID v0.3.0) を用いてデータ処理を行い、キメラ MS2 スペクトルのデコンボリューションと同定率の向上を図った。代謝物の同定は、Metabolomics Standards Initiative9 に従って、レベル 2 の信頼度で行いました。代謝物の変化は、Log2FC = 1, p < 0.05 の閾値に達した場合に、有意であると判断しました。これらの代謝物および遺伝子リストを用いて、非感染対照群（A群；n = 26）と比較してHIV感染（B群；n = 40）により有意に変化するパスウェイを検討した。エンリッチメント解析の結果、HIV感染に伴う口腔内の代謝のリプログラミングが広く行われていることが示唆された。Partial Least-Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) および Variable Importance in Projection (VIP) スコアプロットを補足図1に示す。代謝物クラスには、アミノ酸、エネルギー代謝物、脂質、糖質が含まれていた。これらの変化は、アミノ酸の利用（アルギニン、プロリン、トリプトファン、分岐鎖アミノ酸）、アラキドン酸代謝、炭水化物の利用を含む濃縮パスウェイヒットの上位に反映されている（図1A, B）。活性化した免疫細胞は、増殖、分化、サイトカイン分泌などのエフェクター機能をサポートするために、グルコース利用をアップレギュレートすることが以前から示されている10。そこで、PLWHにおける解糖系遺伝子の発現の変化を、対照群と比較して検討した。phosphofructokinase（PFKFB3）を含む解糖系フラックスを制御する酵素は、HIV感染により強く発現が上昇する（Log2FC 2.68, p = 1.15 × 104）（補足図2）。低酸素誘導因子1（HIF-1）αやDNA損傷誘導性転写産物4タンパク質（DDIT4）など、低酸素反応や解糖反応、グルコース欠乏に対する反応のいくつかの転写調節因子も、PLWHでは歯肉粘膜で濃縮されていた。興味深いことに、PLWHではグルコースも増加し、その直下の中間体であるグルコース6-リン酸やフルクトース6-リン酸は健常対照者と比較して減少していた（補足図3）。しかし、PLWHでは解糖系代謝物、TCA代謝物、乳酸に有意な変化は認められなかった（補足図3）。アラキドン酸はまた、炎症反応を促進する重要な脂質メディエーターである11,12。我々のトランスクリプトームおよびメタボロームデータセットは、このパスウェイのヒットを有意に濃縮していた（補足図2）。そこで、口腔粘膜におけるエイコサノイドとロイコトリエンの産生に関与する酵素と代謝産物について検討した。アラキドン酸は、エイコサノイドである5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (5-HPETE) および 12-hydroxyeicosatetraenoic acid (12-HETE) 13 と共に唾液中で有意に増加する (p = 0.049) 。5-HPETEと12-HETEの増加は、トランスクリプトーム解析で検出されたアラキドン酸5-リポキシゲナーゼ（ALOX5）とCYP4F3という生合成酵素のアップレギュレーションとも一致している。さらに、PLWHでは、トリプトファン/キヌレニン経路の異常も検出された。この経路はトリプトファンを消費して、免疫細胞機能を制御するキヌレニンなどの分子を産生する14。キヌレニンはまた、アリール炭化水素受容体のリガンドとして機能し、その活性化によりTregの分化が促進されます15。トリプトファン異化作用とキヌレニン濃度の上昇は、我々が以前にPLWHで示したTregの濃縮と一致すると考えられるが4、我々はPLWHの口腔粘膜でキヌレニナーゼの発現上昇、キヌレニン濃度の中等度低下、唾液中のトリプトファン濃度の上昇など逆の傾向を認めた（補足図2）。

Fig.
Fig.
歯肉免疫細胞のトランスクリプトームおよびフローサイトメトリー解析と連動した唾液メタボローム解析。
パスウェイ濃縮解析のデータをもとに、口腔粘膜の免疫活性化に関連すると考えられる他のパスウェイについてさらに検討した。さらに、メタボロミクス計算ツール MetaboAnalyst と DecoID16 を用いて、制御異常遺伝子と関連代謝物（Log2FC cutoff =1）を対応付け、アミノ酸代謝の変化を引き起こす遺伝子と代謝物の関係を検討した。この解析から、アルギニンを含むアミノ酸の生産と利用に関与する、HIV感染によって変化する主要なノードが同定された（図1C）。対照群（A群）とPLWH群（B群）の年齢依存的な変化を明らかにするために、年齢に基づいて層を分けました（A1、B1 60歳未満、A2、B2 60歳以上）。HIV感染者は、年齢層別化とは無関係に、5-オキソプロリナーゼ（OPLAH、Log2FC = -1.64, p = 0.016）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（GPT2、Log2FC = -1.64, p = 0.007）などのグルタミン酸利用または生成に関わるいくつかの酵素の著しい発現低下を示した（図1C）。GPT2の発現低下は、ピルビン酸からアラニンの生成に影響を与え、この酵素の活性の変化と一致する。PLWHの唾液では、アラニンレベルが有意に上昇し、ピルビン酸が減少していた。興味深いことに、HIV感染者は唾液中のアルギニンが増加する一方で、シトルリンのプールサイズは健常対照者と比べて減少していた（Fig.1C）。このことから、一酸化窒素とオルニチンの経路を調べることにした。ポリアミン合成に関与する2つの酵素、スペルミジン／スペルミンN（1）-アセチルトランスフェラーゼ（SAT1）およびオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC-1）を含むいくつかの酵素がPLWHで転写の増加を示している。ポリアミンの前駆体であるオルニチンもPLWHでは減少しているが，ODC-1，ポリアミンのプトレシンとプトレシンの下流のEIF5A転写は健常対照と比較して上昇しており，口腔粘膜の微小環境下でポリアミン合成が増加している可能性が示唆された（図1C）．最近，ODC-1がThサブセットの運命に影響を与えることが示された5,17ことから，HIVによる代謝状態の変化がPLWH4の口腔粘膜におけるTreg/Thの調節異常に影響を与える可能性があると考えた．PLWHにおけるODC-1およびEIF5A転写物のアップレギュレーション（図1C）と一致して、フローサイトメトリー解析でも、非感染対照と比較してPLWH個体のCD4+T細胞でこれらのタンパク質の発現が高まっていることが明らかになった（図1D-G；ゲート戦略；補足図4）。全体として、HIV感染者の口腔粘膜は、ポリアミン代謝が粘膜におけるT細胞機能の変化にどのように関係しているかについて重要な洞察を与えてくれた。

HIV-1感染によるTreg/Th17比の偏り
次に、PLWH4におけるHIVによるTregの機能障害は、ポリアミン経路が関与している可能性が想定された。我々は、in vitroでTCR活性化したヒト扁桃オルガノイド培養物（HTOC）の口腔リンパ系を採用した5。まず、非極性化および非感染HTOCの異なるTCR刺激CD4+サブセットにおけるODC-1の発現を検討した。ODC-1は、TCR活性化細胞で発現が増加し、in vitroで極性化したTh1およびTh2細胞で高発現するが、Th17細胞およびTregsでは減少することが知られている5-7。CD25+活性化細胞 vs 非活性化細胞、IFN-γ+ Th1細胞 vs IFN-γneg 非 Th1細胞、ROR-γt+IL-17A+ Th17細胞 vs ROR-γtnegIL-17Aneg 非 Th17細胞で比較検討した。TCR刺激HTOCにおけるCD4+CD25+FOXP3+Tregs vs CD4+CD25+FOXP3neg non Tregs、およびCD4+CD25+FOXP3+PD-1+IFN-γ+ TregDys、 vs CD4+CD25+FOXP3+PD-1 negIFN-γneg non TregDys、. CD25+細胞、Th1、Th17、およびTregは、対応する細胞と比較してより高いODC-1レベルを発現した（補足図5）。最近の研究5と一致し、Th1細胞はTregやTh17細胞よりもODC-1の発現が増加した。また、TregDysはnon TregDysに比べて有意に低いODC-1を発現していることが示された。これらのデータは、CD4+ T細胞サブセット間のポリアミン代謝の明確な違いを示唆し（補足図5）、HIV感染の文脈におけるCD4+ T細胞のポリアミンを調べる根拠となった。以前に示したように、約3-7%のHIV-GFP+細胞が、これらの培養物のHIV感染時に観察された4,18。HIV-1感染は、IFN-γおよびIL-17A+エフェクターThサブセットの著しい枯渇を引き起こし、機能不全のPD-1+IFN-γ+FOXP3+細胞（TregDys）の誘導と拡大をもたらす4,18。粘膜の健全性におけるTh17細胞の役割が知られており、急性SIV感染における粘膜のTreg/Th17比の調節異常が以前から証明されていたため19、我々はHIV-1感染HTOCにおけるTreg/Th17比を調査した。使用したマーカーがODC-1発現に関連するサブセットを区別したため（補足図5）、HTOCのTh17細胞の同定にも同じものを採用した。HIVと抗レトロウイルス剤（ARI）単独の影響を評価するために、これらの対照培養を行った。患者のHIV感染と抗レトロウイルス治療を模倣するため（図1）、HIV感染後24-36時間後にARIエファビレンツを添加し、6-7日間ARIで細胞を膨張させた。これまでの知見4,18と同様に、Tregは著しい細胞死を示し、ARIであるefavirenzで回復した（図2A、上）。HIV感染時のTregDysの拡大がARI存在下でも持続することを確認した後（図2A、下）、CD4+T細胞におけるROR-γt、CCR6およびIL-17Aの発現を測定することにより、Th17細胞の頻度を評価した。Thサブセットの細胞数も、これらの培養で測定した（補足図6A）。その結果、HIV-1感染によりTh17細胞は著しく減少し、HIV感染後のARI処理ではin vitroで回復できないことがわかった（図2B, C）。この2つのサブセットの頻度の変化は、HIV感染時にTregDys/Th17比の著しい上昇をもたらし、ARI治療後も持続していた（図2D）。これらの結果から、ARI存在下でのHIV感染時のポリアミンの役割を明らかにすることが求められた。

Fig.
Fig.
HIV感染によりThの調節異常が起こり、ARI投与後もその状態が持続する。
HIV-1は、ARI存在下でもCD4+ T細胞においてODC-1、NLRP3、EIF5A、EIF5A hypusinationおよびポリアミン合成をアップレギュレートしている
ポリアミン代謝を調べるために、まず、in vitroでのHIV-1感染時のODC-1の発現に注目した。HIV感染後24-36時間後にARIを添加し、6-7日間細胞を膨張させた。PLWH口腔粘膜におけるODC1およびEIF5aのmRNAレベルの上昇と一致して、HIV感染細胞はARI存在下でこのタンパク質のレベルが高いことを見出した（Fig. 3A）。次に、ODC-1活性の下流で起こるEIF5Aの発現とその低増殖を測定した（Fig.3B）。HTOC中のHIV-1感染CD4+細胞では、EIF5Aとhypusinated EIF5Aの両方の発現が有意に上昇した（図3C, D）。HIF-1α は代謝チェックポイントタンパク質であり、TCR- 経路や PI3-K 経路などの非低酸素刺激によって誘導され、その結果、炎症性疾患の発症にお いて多様な機能を発揮する20。PLWHにおいてHIF-1a mRNAの発現が増加していること（補足図2）、Th系統の機能制御におけるHIF-1αとポリアミンの役割が知られていること5-7,21から、HIF-1αがポリアミン代謝と関連している可能性が推測された。しかし、我々の結果は、HIV-1がin vitroのCD4+ T細胞においてHIF-1αの発現をアップレギュレートしないことを示した（補足図6B）。ポリアミンの蛍光測定は、細胞内ポリアミンがHIV感染培養物のCD4+ T細胞でも有意に上昇することを示した（図3E）。HIV感染培養物の上清中のポリアミンレベルを測定することにより、細胞内ポリアミンの増加は、細胞外培地への輸出の減少によるものではないことを確認した（補足図7）。以上の結果から、HIV感染後、ARI存在下で増殖するTh細胞は、ポリアミン生合成を亢進させることが明らかとなった。口腔粘膜リンパ扁桃培養物におけるこれらの知見は、治療中のHIV+患者の口腔粘膜で観察されるポリアミン代謝の上昇を再現した（Fig.1A）。

Fig.3
図3
HIV-1は、ARI治療後もCD4+ T細胞においてODC-1、EIF5A、EIF5A hypusinationおよびポリアミン合成をアップレギュレートする。
HIV-1活性化カスパーゼ-1とIL-1βがCD4+T細胞におけるODC-1のアップレギュレーションに必要である。
我々と他の者による以前の研究は、急性および慢性HIV感染中のCD4+ T細胞におけるNLRP3シグナルの増強、カスパーゼ-1の活性化およびIL-1β発現の上昇を実証している4,22,23. ODC-1がマクロファージにおけるNLRP3発現を制御する能力24、およびNLRP3がカスパーゼ-1を活性化する機能25に基づいて、我々は、HIV感染HTOC CD4+T細胞においてもNLRP3がアップレギュレートされているかもしれないと仮定した。我々は、HIV-1感染が、ARI存在下で膨張するHTOC CD4+T細胞において、NLRP3を有意に誘導することを確認した（補足図8）。次に、NLRP3/IL-1βシグナルが、ARI存在下でのHIV誘発ODC-1アップレギュレーションに関与しているかどうかを調査した。IL-1βは、TCRで刺激されたCD4+T細胞におけるODC-1のアップレギュレーションを促進した（図4A）。さらに、ODC-1の発現は、CD4+ T細胞上のIL-1Rα（CD121）の発現と有意に相関し、IL-1βシグナル伝達阻害剤であるアナキンラによって減少した（補足図9、図4B、C）。ODC-1の誘導におけるカスパーゼ-1を介したIL-1βの切断と活性化の機能をさらに解明するために、我々はカスパーゼ-1阻害剤であるVX-765とアナキンラを採用した。TCR刺激したHTOCから精製したCD4+細胞に、阻害剤の存在下または非存在下でHIV-1を感染させ、感染後24-36時間後にARIで処理した。フローサイトメトリー解析により、VX-765とアナキンラの両方が、HIV-1感染細胞におけるODC-1の発現を有意にダウンレギュレートすることが明らかになった(Fig. 4D)。NLRP3阻害もHIF-1α阻害も、HIV感染培養物におけるODC-1発現またはTregDysの増加を直接的に調節しなかった（補足図10A、10B）。Caspase-1およびIL-1β阻害は、Treg頻度には影響を及ぼさなかったが、TregDys頻度を有意に減少させた（図4E、補足図11）。一方、VX-765によるCaspase-1阻害はTh17細胞頻度を部分的に回復させたが、IL-1βの遮断はHIV-1媒介のTh17損失には影響を与えなかった（補足図11、図4F）。さらに分析すると、Th17細胞の損失は、HIV-1によって引き起こされた細胞死によるものであり、ARIによって部分的にしか回復しないことがわかった（補足図12）。Th17細胞の消失にカスパーゼ-1が関与していることから、細胞死はパイロプティックであることが示唆された。これらのデータは、HIV感染時、カスパーゼ-1が、1) ODC-1のアップレギュレーションによるIL-1β放出とTregDysの増加、2) pyroptotic cell deathによるTh17細胞の喪失に重要であることを示す。カスパーゼ-1とIL-1βが一緒になって、HIV感染時のTregDys/Th17の偏りを駆動している（図4G）。これらのデータは、カスパーゼ-1とIL-1βが、HIV-1によって引き起こされるポリアミン経路の異常、細胞死メカニズム、Th運命の変化の接点に位置していることを示唆している。

図4.
図4
HIV-1活性化カスパーゼ-1およびIL-1βはCD4+T細胞におけるODC-1発現に必要である。
HIV感染によって誘導されるTh異常はODC-1に依存する
ODC-1活性がHIV-1によるポリアミン合成とTreg調節異常の根底にあることを確認するため、Difluoromethylornithine (DFMO) (ODC-1 inhibitor I), N-(4-Pyridoxyl)-Ornithine(BOC)-OMe (POB) (ODC-1 inhibitor II) および ODC-1 shRNA lentiviral particleを用いた ODC-1 阻害存在または不在の状態でHTOC CD4+T細胞へ感染させた。ポリアミン蛍光測定法を用いて、まず、ODC-1阻害が細胞内ポリアミンを減少させることを確認した（図5A）。EIF5A の低分子化を促進する ODC-1 の活性の要件と一致して、ODC-1 の阻害は HTOC の HIV-1 感染 CD4+ 細胞における EIF5A および低分子化 EIF5A の両方の発現を著しく低下させた（図 5B, C、補足図 13）。予想通り、ARIはTregレベルを感染していない状態に回復させたが、ODC-1阻害はさらにTregを中程度に減少させた（図5D、上、5F）。HIV-1感染によりTregDysの頻度が増加する一方で、ODC-1活性の阻害によりTregDysは感染していない培養液のレベルまで著しく減少した（図5D、下、F）。ODC-1の阻害は、HIVによるTh17の枯渇には影響しなかったが（図5E、F）、CD4 T細胞におけるTregDys/Th17比を感染していないときのレベルまで有意に回復させた（図5G）。これらの知見は、HIV-1によって引き起こされる細胞内T細胞ポリアミンレベルの濃縮とTh運命の偏向にODC-1が必要であるという考えを強化するものであった。

図5
図5
HIV-1感染に伴うTh細胞制御異常はODC-1活性に依存している。
HIV感染を介したポリアミン合成はODC-1に依存する
HIV感染に伴うCD4+細胞におけるポリアミン合成におけるODC-1の役割をさらに明らかにするために、ODC-1阻害の有無にかかわらず、細胞における特定のポリアミンの標的評価を実施した。我々は、方法26に記載されているように、LC-MSを用いて細胞溶解物中のプトレスシン、スペルミン、スペルミジン、カダベリンおよびサーモスパーミンの定量を行った。HIV-1は、ARIの存在下および非存在下の両方でプトレスシンレベルを有意に上昇させた。ARIは、HIV感染培養物中のプトレスシンを部分的に減少させた（図6A）。スペルミジンとスペルミンもHIV感染時に有意に上昇したが、ARIによりほぼ非感染時のレベルにまで回復した（Fig.） カダベリンはHIV感染による影響を受けなかった（Fig.6D）。重要なことは、ODC-1を阻害するとHIVによるプトレスシン、スペルミジン、スペルミンの細胞内増加が著しく減少することであり、HIV-1感染時にポリアミンレベルを高めるODC-1の機能が重要であることがわかった（図6A-C）。

図6
図6
HIV-1感染に伴うポリアミンの増加は、ODC-1活性に依存している。
HIVによるTregDys/Th17比の歪みはポリアミン合成を必要とし、外来ポリアミンはTh調節異常を引き起こす
次に、ポリアミンの濃縮とEIF5Aの低活性化が、HIVによるTregDys/Th17比率の上昇に寄与しているかどうかを検討した。HIV-1感染とは無関係にポリアミンとEIF5A低活性化の影響を裏付けるために、外因性の塩酸プトレシン、スペルミジン、DHPS阻害剤であるGC7を添加した。ODC-1阻害と同様に、GC7も、HIV感染HTOC CD4培養において、TregおよびTregDys頻度を急激に減少させたが（図7A、上下、図7Cの最初の2パネル）、Th17枯渇は回復しなかった（図7B、図7Cの3番目のパネル）。外因性ポリアミンは、TregDysの頻度を劇的に増加させたが、非感染培養物におけるTh17細胞の比率を抑制しなかった（図7A、B；最後の2パネルおよび図7C）。外因性ポリアミンは、HIV-1ほど劇的にTregDys/Th17比率を増加させなかったが、有意に増加させた（図7C、最後のパネル）。外因性ポリアミンは、TregDys頻度を増加させるだけで、Treg頻度の増加やTh17比率の低下は見られなかったが、それでもTregDys/Th17比率を有意に増加させることが示された。非Treg、Treg、TregDysの生存率を詳しく調べると、ODC-1阻害は細胞死を引き起こすことがわかった（補足Fig.14）。しかし、ODC-1阻害およびGC-7は、TregまたはTregDysよりも非Tregにおいて有意に多くの細胞死を引き起こした。同様に、スペルミジンも非Tregにおいて生存率の低下を引き起こしたが、TregやTregDysでは起こらなかった。これらのデータは、これらの阻害剤がTregDysの細胞死を引き起こすことによって、TregDysを減少させないことを示している。さらに、外因性ポリアミンはTregやTregDysの生存率を変化させなかったことから、ポリアミンが単にTregDysの生存率を上昇させるという可能性は否定された。ポリアミンとGC7は、自食作用のある細胞死に関与していることから27、さらにCD4+ T細胞における自食作用タンパク質である微小管結合タンパク質1A/1B軽鎖3B（LC3B）の発現を測定した。HIV感染、ARI、ODC-1阻害剤I、スペルミジンはタンパク質レベルに変化を与えなかったが、GC7で処理した細胞はLC3Bレベルの上昇を示した（補足図15）。さらに、オートファジー封鎖阻害剤であるLY294002を用いて、ODC-1阻害とGC7がHIV感染時のオートファジー細胞死とは独立してTregDys比率を低下させることを見出した（Supplementary Fig.） これらのデータから、ポリアミンとEIF5A阻害によるTregDys細胞への自己貪食非依存的作用とHIV-1感染時のHTOCにおけるTregDys/Th17比率の有意な上昇を浮き彫りにすることができた。

図7
図7.
HIVによるTregDys /Th17 ratioの歪みはポリアミン合成を必要とする。
ポリアミンの外因性添加によりEIF5Aの発現が上昇し、EIF5Aの低活性化によりTregDys細胞の誘導とその増殖が起こる。
ポリアミンのTh細胞への影響をさらに裏付けるために、我々は、非感染CD4+T細胞におけるODC-1、EIF5A、およびhypusinated-EIF5Aの発現を評価した。ポリアミンは、CD4+ T細胞において、EIF5A、およびhypusinated-EIF5Aの発現を増強したが、ODC-1の発現を有意に低下させた（Fig. 8A-C）。HIV感染時に合成されるポリアミンや外来ポリアミンが、すべてのCD4+細胞においてFOXP3+PD-1+IFN-γ+TregDysを誘導するか、あるいは一般にIFN-γを増強するかを決定するために、非Treg CD4+細胞におけるIFN-γの発現を検討した。我々が以前に示したように、HIV感染は実際に非Treg CD4+細胞のIFN-γを減少させ、ARIは部分的にIFN-γ+細胞を回復させた（補足Fig.17）。ODC-1阻害もGC7も非トレグにおけるIFN-γ発現に影響を与えず、HIV感染時にCD4+T細胞におけるIFN-γを調節することなく、TregDys頻度を減少させることが示された。これらの結果をさらに裏付けるように、スペルミジンはむしろ非感染の非Treg CD4+細胞におけるIFN-γをダウンモデュレートした。これらのデータは、ポリアミンがFOXP3+細胞のIFN-γをアップレギュレートすることによって、TregDysを誘導しないことを示している。それどころか、すべてのPD-1+IFN-γ+CD4+細胞（Th1様細胞）を詳しく調べると、HIV-1感染と外因性スペルミジンが、それらの細胞にFOXP3発現を誘導した（Supplementary Fig.18）．ODC-1ブロッキングとGC7は、HIV-1感染時のFOXP3発現誘導を抑制した。以上のことから、HIV感染時に上昇するポリアミンは、CD4+細胞のIFN-γを阻害し、あるいはIFN-γ+CD4+細胞の細胞死を引き起こしTh1様細胞の制御異常を引き起こす可能性があるようである。さらに、これらのTh1様細胞の一部でFOXP3を誘導し、TregDys細胞やTh不応性を促進する。我々は以前、TregDysが特徴的にAmphiregulin（AREG）を高レベルで発現していることを示したが4、今回、ポリアミンがTregにおいてAREGを中程度だが有意に上昇させることを明らかにした（図8D）。また、ポリアミンはTregDysの増殖を促進し、KI-67の発現を増加させた（Fig. 8E）。これらのデータから、過剰なポリアミンがTh不和を引き起こし、IFN-γ+ CD4+細胞のダウンモジュレーション、制御不能なTh1様細胞におけるFOXP3の誘導、およびTregDys細胞の増殖を含む機能が明らかにされた。これらの結果は、HIV感染時のODC-1発現抑制におけるポリアミンの潜在的なネガティブフィードバックループ効果も明らかにした（Fig.8A）。

Fig.8
図8
ポリアミンの外因性添加によりEIF5Aの発現が上昇し、EIF5Aの低活性化によりTregDys細胞の誘導とその増殖が起こる。
PLWHの口腔粘膜におけるTregDys/Th17比の上昇とポリアミンレベルの関係
HIV+患者の口腔粘膜では、Thの活性化に寄与するTregDys（CD38+HLADR+CD4+T細胞）の頻度が有意に高いが4、Th17細胞の運命はこれまで評価されていない。HTOC CD4+T細胞をin vitroでHIV感染させた結果（図2）から、HIV+患者の口腔粘膜では、cART療法後でもTh17細胞も減少している可能性があると仮定した。この考えを検証するために、口腔歯肉粘膜のCD3+CD4+CCR6+ROR-γtの発現で定義されるTh17細胞の頻度を評価した。健常対照者のCD4+細胞の約25%がTh17表現型に適合していたが、HIV+患者ではTh17細胞の約11%しか認められなかった（Fig.9A）。in vitro HIV感染の結果と一致して、PLWHは未感染の対照者よりもTh17細胞の割合が減少していることが分かった（Fig.9B）。次に、このコホートにおける既報4 TregDysの割合に基づいて、TregDys/Th17比をプロットした。この結果、PLWHの口腔粘膜では、TregDys/Th17比が有意に増加していた（図9C）。ODC-1の発現はTregDys/Th17比と相関しなかったが（補足図19）、唾液中のプトレシンレベルは有意に上昇し（図8D）、口腔粘膜のTreg/Th17比やThの過活性化と有意な正の相関を示した（図8E）。以上より、PLWHの口腔歯肉粘膜細胞から得られたこれらの知見は、HTOC HIV感染症から得られた結果を裏付け、慢性ウイルス感染症における粘膜Th運命の決定と持続的な免疫過活性化におけるポリアミン経路の異常の役割を強調するものであった。

図9.
図9
HIV+患者は、口腔粘膜の唾液プトレシンと相関する歪んだTregDys/Th17比率とCD4+T細胞の過活性化を有する。
考察
メタボロミクス、トランスクリプトミクス、フローサイトメトリー、および機能的アプローチを用いて、本研究は、慢性ウイルス感染中の粘膜T細胞機能に対する過剰ポリアミンのプリオトロピック効果を明らかにした（図版要旨；補足図20）。我々は、PLWHの口腔粘膜で起こり、治療後も持続するメタボロームおよびトランスクリプトームの変化の統合的マッピングを行った。細胞代謝は、免疫細胞の増殖能とエフェクター機能の両方を制御する主要な因子である28。唾液の代謝物と口腔粘膜細胞のトランスクリプトミクスを同時に解析したところ、感染に反応して変化するいくつかの重要な経路が同定された。PLWHのHIV感染治療を受けている口腔粘膜では、過剰なプトレスシンがThサブセットの変化およびCD4の過活性化の転化と相関していた。HTOC培養物を用いて、我々はまた、HIV-1がCD4 T細胞のポリアミンをアップレギュレートし、in vitroでTregDysの誘導と二次増殖をもたらすことを発見した（図6およびand8E）。我々は、その後のHIV-1感染と細胞死をARIでブロックしても、プトレスキンやTregDysの誘導・増殖が正常化しないことを見出した。このことは、ARIがTh機能障害を完全には回復させないという我々の以前の知見と一致する4。

アミノ酸代謝は、個々の代謝物レベルでも、トランスクリプトーム解析と組み合わせた場合でも、有意に濃縮されていた。特に、窒素代謝の変化は、唾液中のオルニチンレベルの低下とプトレシンの増加に伴って発生するポリアミン合成に関与する酵素の発現の増加で明らかになった。ポリアミンは、細胞増殖、タンパク質翻訳、ストレス応答などを制御するポリカチオンである29,30。また、ポリアミンの過剰発現やEIF5Aの過剰発現は、がんと関連している31。ポリアミン-EIF5A軸は、HIV+患者のがん素因だけでなく、一般的な粘膜機能不全に広く関与している可能性があるが、本研究ではTh機能不全における役割のみに焦点を当てた。最近の研究では、ポリアミンとその関連代謝物がTh細胞応答を制御することが示されている5,6,17,32。CD8+T細胞がODC-1をアップレギュレートし、ポリアミン生合成を増加させることはよく知られており、その細胞溶解機能に必要であることが知られている33。HIV患者の唾液中で顕著な発現上昇を示すプトレシンとアルギニンは（図1C）、リンパ球混合培養におけるCD8+T細胞の細胞溶解機能の発現を抑制することが示されている34。ポリアミン生合成もまた、T細胞の活性化を促進することが以前に示されている35。これは、MYCによって誘導されるグルタミンおよびグルコース利用における変化に依存しているが、我々はPLWHにおいてこれらの経路における変化を観察していない。今回の我々の知見は、ポリアミンが粘膜の病原性Th炎症の一因であると位置づける一方で、過剰なポリアミンがCD8+T細胞の機能や腫瘍形成に及ぼす影響については、まだ不明である。

PLWHにおける全体的な粘膜免疫機能障害は、口腔粘膜の脂質およびトリプトファン代謝の変化においても明らかであった。アラキドン酸から炎症性脂質が合成されることは、組織炎症の特徴である36。HIV感染者では、アラキドン酸そのものと、2つの炎症性エイコサノイド、12-HETEと5-HPETEの両方が著しく増加する。これらの炎症性脂質のレベルの変化は、それらを合成する酵素（CYP4F3およびALOX5）の転写の変化にも反映されている。12-HETEの産生は炎症部位での酸化ストレスにつながり37、これがウイルスによる病態を悪化させる可能性がある。また、アラニンアミノトランスフェラーゼ（GPT2）は、HIV感染時に著しく低下する（図1C）。この酵素は、アラニンからα-ケトグルタル酸へのアミノ基の転移を触媒し、ピルビン酸やグルタミン酸を生成する。外因性アラニンの取り込みはT細胞の活性化に必須であり38 、HIV感染時のアラニン利用障害は口腔粘膜のエフェクター機能の低下をもたらす可能性がある。これらの経路の変化は、HIV+患者の粘膜免疫系における重要な変化を示唆しているが、慢性ウイルス感染時にここで述べたシグナル伝達成分の文脈におけるこれらの経路の正確な役割は、まだ明らかにされていない。

摂取された食物および常在細菌叢もまた、ポリアミンの重要な供給源である39。PLWHのポリアミンの原因として、口腔内細菌の異常が関与している可能性は興味深く、今後の研究によって明らかにされる予定である。ポリアミン-EIF5A-ヒプシン軸の異常は、マクロファージやT細胞におけるTCAサイクルの再配線、ミトコンドリア呼吸、エピジェネティックな再モデリングを調節することが示されている5,40。しかし、我々の結果は、HIV+患者の口腔粘膜において、ポリアミンの濃縮はTCAサイクルの調節異常と一致しないことを示していた（補足図1、2）。ポリアミンを介したTregDysの蓄積が、制御異常のあるT細胞の増殖に加えて、サイトカイン遺伝子座のエピジェネティックな修飾を伴うかどうかは、まだわからない（Graphical Abstract; Supplementary Fig.）

我々の研究では、ポリアミン生合成の上流経路に着目し、カスパーゼ-1を介したIL-1βの放出が、HIV-1に誘導されたTh細胞におけるODC-1のアップレギュレーションの中心的イベントであると同定した（図4）。これらの結果は、ODC-1活性を誘導するIL-1の能力と一致する41,42。他の非Treg CD4+細胞4よりもTregDysにおけるIL-1受容体の高い発現（図4）は、IL-1βを介したODC-1のアップレギュレーションが、HIV感染時にTregDys細胞を促進する理由を説明するかもしれない(図5D)。このように、カスパーゼ-1とIL-1β経路は、ウイルス感染時のポリアミン代謝依存性免疫不全に影響を与える中心的存在であるようである（補足図20）。様々な扁桃腺CD4+サブセットにおけるODC-1発現解析は、非感染設定におけるTregDysにおけるタンパク質の最小発現を示した（補足図5）。HIV-1感染時のTregDys誘導および増殖の促進におけるODC-1-ポリアミン-EIF5A低分子化軸の支配的役割を考えると、TregDysにおけるODC-1の発現レベルの上昇を期待した。ODC-1レベルの低下は、過剰なポリアミンがTregDysにおけるODC-1の分解または抗酵素結合をもたらす負のフィードバック機構によるものかもしれない43 (Fig. 8A). PLWHのTh17、Treg、TregDysにおけるODC-1、EIF5A、Hyp-EIF5Aの発現を明らかにし、ODC-1-ポリアミン-EIF5A低増殖と自動調節ループがウイルス感染時にTh細胞にどのように影響するかを完全に理解するには、さらなる研究と新鮮な臨床試料が必要である。

HIV感染HTOC培養液の細胞およびサイトカインの変化の多くは、PLWHの口腔粘膜を再現しており、TregDysの濃縮、cARTで回復しないTh17の損失、プトレシンの増加という点でこれらの系に著しい類似性が見られた。しかし、急性HIV感染システムは、PLWHに見られるいくつかの特徴を完全に再現しているわけではない。例えば、1）cARTを受けているPLWHは、健常対照者と比較して、口腔粘膜におけるCD4+CD25+FOXP3+Tregsの頻度が増加することを示す。しかし、in vitroのHIV感染は、他のCD4+T細胞よりも程度は低いものの、CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞死を引き起こす。このカスパーゼ依存性の死はARIによって逆転されるが、Tregの比率は感染していない培養物を超えることはない。2) PLWHでは、ODC-1レベルはTreg/Th17比率と相関しないが（補足図19）、ODC-1阻害は培養物中のTreg/Th17比率を著しく減少させる、3) cART中のPLWHからのCD4+ T細胞はHIF-1α発現増加を示すが、試験管内感染はCD4+ T細胞中のHIF-1αをアップレギュレートしない。これらの相違のいくつかは、主に粘膜細胞、例えば歯肉に見られる上皮細胞の影響によるものであり、HTOCの培養物には見られないものである可能性がある。HTOCは、CD4+ T細胞の豊富なリンパ環境を提供するが、細胞死にも弱い短期培養細胞は、長期cART中のPLWHにおける粘膜CD4+ T細胞を完全に再現することはできないかもしれない。我々は、将来この懸念に対処するために、長期cART培養を確立している。阻害研究に関しては、薬理学的阻害剤により、短期間の初代培養でターゲットをブロックすることができるが、しばしばoff-target効果や細胞死効果があり、結果を混乱させることがある。これらの注意点を認識した上で、結果を慎重に解釈し、off-target効果については他のアプローチで検討した。また、結果は、患者からex vivoで得られた細胞からの裏付けデータと合わせて評価した。

Th17細胞に関しては、Wagnerら、ODC-1とSAT-1がTh17系譜のタンパク質を制御することを示した6。したがって、これらのタンパク質がPLWHにおいても発現上昇していることを考慮すると、ODC-1とSAT-1がTh17細胞の制御に重要な役割を果たすと予想された。しかし、これまでの知見と同様に、急性HIV-1によるカスパーゼ-1活性はTh17炎症性細胞死を引き起こし44、ODC-1/ポリアミン合成とは無関係であることがわかった。このように、パイロプトーシスの文脈におけるTh17の制御は、HIV感染に特有のものであり、他の環境におけるTh17偏光サイトカインや病原Th17細胞の文脈におけるin vitroのナイーブ細胞の分化とは大きく異なっている。ポリアミン軸とは無関係なHIV-1の支配的なパイロプトーシス作用は、HIV感染後にODC-1ブロッキングだけではTh17細胞を回復できない理由を説明するかもしれない（図5E）。NLRP3はHIV感染時にアップレギュレートされるが、ポリアミン代謝を制御することはない。しかし、ODC-1がNLRP3の発現を促進し、NLRP3の持続的な発現上昇がカスパーゼ-1活性およびIL-1βレベルのさらなる増強に寄与するかどうかは、まだ分からない。ポリアミン軸とは無関係なNLRP3の高発現も、慢性感染におけるTh17細胞死にさらに寄与している可能性がある（図版要旨；補足図20）。カスパーゼ-1阻害またはARIがTh17細胞を完全に回復させなかったことから、HIV-1もCD4+T細胞におけるIL-17Aサイトカインの転写制御に関与している可能性があると推測される。これらのデータは、cART治療後にもTh17細胞の割合が減少したことを説明するものでもある（Fig. 9A, B）。粘膜は、Tregの機能障害とTh17の機能障害のために二重の打撃を受け、バリアーの完全性の喪失と口腔内のディスバイオシスにつながる可能性があると推測したくなる。このように、IL-1βの増加を伴う慢性的なウイルス感染は、ポリアミン合成とTh運命決定の乱れを引き起こし、粘膜の病原性炎症をさらに加速させる可能性がある。以上のように、PLWHにおける免疫機能障害メカニズムの解明は、ウイルスが免疫系の多様性に影響を与え、粘膜のポリアミン代謝フラックスを操作することによって、慢性炎症に関与するプロセスについて、より深い洞察を与えてくれている。これらの知見は、ポリアミン代謝を標的とした免疫調節治療へのアプローチにつながる可能性もある。

研究方法
ヒト試料
ヒトサンプル（歯肉生検および唾液）は、University Hospitals Cleveland Medical CenterのInstitutional Review Boardが承認したプロトコルに従い、関連するすべての倫理規定4に従って、健常者およびHIV+（PLWH）コホートからインフォームドコンセントを得て入手した。参加者は男女とも登録された。歯肉生検と唾液を採取するために登録された参加者の特徴を補足表1に示す。歯肉生検はフローサイトメトリー用に新鮮な状態で処理した。口蓋扁桃は、University Hospitals Cleveland Medical Centerで行われた扁桃切除手術から、IRB承認のプロトコル（非ヒト研究）に従って、組織学組織調達施設を通じて入手した。歯肉組織と扁桃の単細胞懸濁液を、コラゲナーゼ1A消化（0.5mg/ml；Sigma C9891）、その後のFicoll-Paque PLUS（GE17-1440-02; Millipore Sigma）900gでの遠心分離、PBSによる洗浄によって調製した。扁桃細胞は HTOC 培養のために新鮮な状態で処理した。一部の扁桃細胞は、細胞培養またはフローサイトメトリー用のCD4細胞精製用に新鮮な状態で処理した。唾液サンプルは滅菌チューブに採取し、メタボローム解析およびELISA解析の処理まで-80℃で保存した。

HTOC 培養と HIV 感染
コラゲナーゼで消化した扁桃腺細胞を、24ウェルトランスウェル培養プレートの上ウェルに100万個/ウェルで懸濁し、HTOC培養をセットアップした4,45。これらは、少なくとも感染の24-36時間前に、α-CD3（1μg/ml）およびα-CD28（1μg/ml）TCR活性化抗体、TGF-β1（10ng/ml）およびIL-2（100U/ml）とともに3連ウェルにプレーティングした4,46。感染には、200μl容量の細胞に、複製コンピテントHIV X4-tropic NL43-GFP-IRES-NefまたはHIV-NLGNef (~1.7 ng) をスピノキュレートした。NL4-3バックボーンでGFPとNefをバイシストロン転写した組み換えウイルスと、指定の阻害剤4、47、48が使用された。確認実験は、X4-およびR5-トロピックウイルスを用いて行った48。R5-トロピックウイルスは、CCR5-トロピックHIV-1 ADAエンベロープ（NIH AIDS Reagent Program）を含むNL43構築物、NLAD8からNL43-GFP-IRES-Nef中のEnvを置き換えることにより作成した47，49．感染後24-36時間の初感染をさせた後、Efavirenz (ARI) (SML1284-1ML; Millipore Sigma; 50 nM)を培養物に添加した。その後、4〜7日間細胞を膨張させてから、フローサイトメトリーやその他のアッセイを実施した。細胞培養には、10％ヒト血清、100U／mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、25mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウムを添加した完全RPMI-1640（Hyclone）を使用した。細胞は、選択実験においてTCR活性化なしの培地で24-36時間休ませた。指示された場合、精製 CD4+T細胞をいくつかの実験に使用した。

細胞培養試薬と阻害剤
細胞培養に使用したCD3 (HIT3a) とCD28 (CD28.2) のT細胞受容体 (TCR) 刺激抗体は、それぞれBD Biosciences と Thermofisher Scientific から購入した。リコンビナントTGF-β1は、R&D systemsおよびBioLegendから購入した。NigericinはInvivogen社から購入した。組換えIL-2、IL-1β、およびIL-33サイトカインは、BioBasic Inc.（Amherst、NY）から購入した。IL-1 受容体拮抗薬であるアナキンラは、HIV 感染中に追加され、NIAID, NIH の Su 博士から親切に贈られたものである。HIF-1α、ODC1、NLRP3阻害剤、Putrescine dihydrochloride（100μM）、およびSpermidine（1mM）も、示された場合、HIV感染中に添加された。CD4+細胞精製のために、CD4 T細胞キットをStem Cell Technologies (Vancouver, Canada)から購入した。コチニン、AREG、IL-1β、およびIL-6 ELISAキットは、Boster Bio（Pleasanton、CA）から得た。レンチウイルス導入は、最初のTCR活性化後1日目、およびHIV感染の1日前に、コントロールまたはODC-1 sh-RNAを用いて実施した。指示されたODC-1阻害剤、コントロール及びODC-shRNAレンチウイルス粒子は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。導入は、製造者の説明書に従って行った。HIF-1α阻害剤およびNLRP3阻害剤（MCC950）は、MedChemExpressから購入した。カスパーゼ-1阻害剤であるVX-765は、InvivoGen社から購入した。Putrescine dihydrochlorideとSpermidineはMillipore Sigmaから購入した。

蛍光色素抗体、染色、フローサイトメトリー
ROR-γt (AFKJS-9), IL-1β (CRM56), CCR6 (R6H1), IL-17A(eBio64DEC17), CD25 (M-A251), Ki-67 (SolA15), HIF-1α (Mgc3), CD4 (OKT4), CD45(HI30), CD8 (RPA-T8), IFN-γ (4S.B3), CD3 (RPA-T8), CD6 (R6H1)のフローサイトメトリ用抗菌剤とした。 B3）、FOXP3（236A／E7）、AREG（AREG559）、HLADR、およびphospho-caspase 1（Ser376）はすべてInvitrogen／Thrmofisher Scientificから購入されたものである。LC3B（IC9390R）およびNLRP3（768319）抗体は、R&D systemsおよびBIOSSから購入した。CCR6, CD279 (PD-1) (EH12.1), BCL-2(Bcl-2/100), IL-1R1(hIL1R-M1) 抗体はBD Biosciences社より購入した。ODC-1抗体はNovus Biologicals社から購入した。EIF5A抗体とAnti-hypusine抗体は、それぞれThermofisher ScientificとMillipore Sigmaから購入した。表面受容体は、まずPBS/BSAで染色し、固定と細胞内染色の前に生死生存率染色を行った。FOXP3および他の細胞内タンパク質については、FOXP3固定化-透過化セット（Thermofisher Scientific）を使用した。適切な未刺激、未染色、アイソタイプ、二次抗体単独、単一染色、FMOのコントロールがすべての予備実験および確認実験に含まれ、それに基づいて解析におけるゲートが決定された。また、組織細胞の追加対照として、PBMCを使用した。培養物は、細胞内サイトカイン染色の前に、最後の2時間にブレフェルジン-A（10μg/ml）を添加し、4時間PMA（50ng/ml）およびイオノマイシン（500ng/ml）で追加再刺激された。p-Caspase-1染色は、細胞を洗浄、固定し、Phosflow染色キット（BD Biosciences社製）を用いて、製造元のプロトコルにしたがって染色した。表面および細胞内染色に用いた一次抗体は、それぞれ1:50-1:200希釈で、または製造元の推奨希釈に従って使用した。二次ロバ抗マウスIgG- BV421（EIF5A染色用）および抗ウサギPE（ヒプシン染色用）などの適切なフローサイトメトリー二次抗体は、Jackson ImmunoresearchまたはInvitrogen/Thrmofisherから購入した。フローサイトメトリー用の二次抗体は 1:500-1:800 の希釈率で使用した。データ取得および解析には、BD Fortessa サイトメーター（BD FACSDiva ソフトウェア ver.7）および FlowJo 9.8 - 10.7.1 ソフトウェアバージョンを使用した。集団は、図の説明で特に指定しない限り、フローサイトメトリー解析中にリンパ球、一重項、生存、CD3+、およびCD8-またはCD4+細胞でゲートされた。

ポリアミンアッセイ
細胞溶解物および培養上清からのポリアミン含量を、製造業者のプロトコルに従って、市販のキット（BioVision #K475-100）を用いて、蛍光測定法により決定した。簡単に説明すると、感染後4-7日目に4ウェルから細胞（〜4×106）を採取し、100μlの氷冷したポリアミン溶解バッファーを用いてDounceホモジナイザーで15回しっかりとストロークして溶解した。得られたホモジネートを10,000×gで5分間、4℃で回転させた。~100μlのライセートと2μlのクリーンアップミックスを混合し、室温で30分間インキュベートした。細胞上清も同様にクリーンアップミックスとインキュベートした。クリーンアップ後、内容物を10 kD MWCO フィルター (Thermo Pierce™ Protein Concentrators PES #88513) に移し、10,000 × g、4 ℃で20分間スピンして高分子量タンパク質を除去した。得られた濾液を回収し、さらに分析するまで-80 ℃で保存した。10～20 μlの試料を96ウェル黒色平底プレート (BioVision M1355; Greiner Microlon plate) に分注し、ポリアミン測定用緩衝液で全量を50 μlに調製した。各ウェルにポリアミン酵素、ポリアミン現像液、希釈ポリアミンプローブを含む反応液50μlを添加した。同時に、反応ミックスから酵素を除くことでそれぞれのブランクウェルを維持し、37 °Cで30分間インキュベートした。SpectraMax i3X マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）を用いて、サンプルを535 nmで励起し、最終生成物を587 nmで蛍光的に読み取った。ポリアミン濃度は、SoftMax Pro 6.1 ソフトウェアを使用して、標準曲線から決定した。細胞内レベルを推定するために、ポリアミン濃度は、HIVによる細胞死といくつかの培養物における細胞数の減少を考慮して、アッセイライセートを得るために使用した生存細胞数で正規化された。最終結果はpM/cellで表される。

唾液中メタボローム解析
サンプル採取。サンプルは50 mLの滅菌済み遠心チューブに採取し、直ちに-80℃で保存した。ヒト唾液サンプルの100μl冷凍アリコートを、Creative Proteomics社により市販されている代謝物抽出液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）分析用に処理した。サンプルの調製。サンプル100μlを解凍し、新しいチューブに移し、200μlの80%メタノールで抽出し、30秒間ボルテックスした後、サンプルを-40℃で1時間保存し、30秒間ボルテックスし、10,000×g、4℃で15分間遠心分離した。最後に上清200 μlと内部標準物質DL-o-Chlorophenylalanine（1 mg/ml）5 μlをバイアルに移し、LC-MSで分析した。方法論の評価には、品質管理（QC）サンプルを使用した。各サンプルから同量の抽出液を得、混合してQCサンプルとした。QCサンプルは、同じサンプル調製手順で調製しました。

機器のセットアップ 分離はUltimate 3000LCにQ Exactive MS（Thermo社製）を組み合わせ、ESI-MS（ターゲットMS/MSモード）でスクリーニングを行いました。LCシステムは、ACQUITY UPLC HSS T3 (100 × 2.1 mm 1.8 μM)とUltimate 3000LCで構成されています。移動相は溶媒A（0.05%ギ酸-水）と溶媒B（アセトニトリル）からなり、グラジエント溶出（0-1.0 min, 95% A; 1.0-12.0 min, 95%-5% A; 12.0-13.5 min, 5% A; 13.5-13.6 min, 5%-95% A; 13.6-16 min, 95% A）により分析した。移動相の流速は0.3 ml-min-1であった。カラム温度は40 ℃に保ち、サンプルマネージャ温度は4 ℃に設定した。

ESI+およびESI-モードでの質量分析パラメータは以下の通りである。

ESI+: ヒーター温度 300 ℃、シースガス流量 45 arb、Auxガス流量 15 arb、スイープガス流量 1 arb、スプレー電圧 3.0 kV、キャピラリー温度 350 ℃、S-レンズ RF レベル 30%.

ESI-: ヒーター温度300 °C、シースガス流量45 arb、Auxガス流量15 arb、スイープガス流量1 arb、スプレー電圧3.2 kV、キャピラリー温度350 °C、S-Lens RF Level 60%.

バイオインフォマティクスデータ解析では、多変量統計解析、単一変数解析、クラスター解析、差分代謝物の相関ネットワークなどを行った。統計的に有意な代謝物（FC > 1.5）は、RNAseqデータから得られた差分発現遺伝子と統合し、統合データはMetaboanalyst (https://www.metaboanalyst.ca/) とMetscape v3.1 plugin (https://cytoscape.org/) を介してCytoscape v3.8 で視覚化されました。

RNAシーケンスとメタボロームデータ解析
免疫細胞が濃縮された歯肉細胞は、勾配遠心法に基づいて上皮細胞を除去することで調製しました。3人の対照者のヒト口腔内上皮および粘膜固有層白血球（HOIL）サンプルをプールし、独立した3人のHIV+患者と比較した。RNA調製、配列決定、アライメントを行った（Novogene）4。 鎖特異的な全トランスクリプトーム配列決定ライブラリー調製には、NEB Next® Ultra™ RNA Library Prep Kitを使用した。HiSeq2500 with Illumina TruSeq V4 chemistry (Illumina, CA) を、インデックス付きRNA-seqライブラリのシーケンスに使用した（HTSeq v0.6.1）。125 bpペアエンドリードのFASTQファイルをTrimomatic (version 0.30)を用いて処理し、アダプター配列を除去した。トリミングしたFASTQデータを、GENCODE gtf file version 4 (Ensembl 78)を用いたSTAR (version 2.5)でヒトゲノムにアライメントした。独立した3人のヒトの遺伝子リード数データをR Package limma (version 3.26.8)で正規化し、unpaired t-testsで解析した。PLWHにおいて有意にアップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子は、メタボローム解析と合わせて解析されました。

LC-MSによるターゲットポリアミン定量
サンプル調製法 標準溶液 5種類のポリアミンの標準物質を10%アセトニトリルで連続的に希釈した標準溶液を調製しました。
サンプル溶液 独立した3つの実験から得られた細胞ライセートを別々に処理し、実行した。氷上解凍した各試料の上清40μLまたは各標準溶液に、20mMの塩化ダンシル溶液80μLとホウ酸緩衝液20μLを添加した。この混合物を40℃で30分間反応させた。

LC-MS分析 UPLC-MRM/MS分析は、Creative Proteomicsの商業サービス施設を用いて行った10。 得られた溶液の μL アリコートを C18 LC カラム (2.1 × 150 mm, 1.8 μm) に注入し、Agilent 1290 UHPLC システムと Agilent 6495B QQQ 質量分析計を正イオンモードで結合して UPLC-MRM/MS を実行し、0.5% の水溶液を使用しました。 水 (A) およびアセトニトリル (B) 中の 1 % の雲母酸を使用し、0.35 mL/min および 55 ℃でバイナリーグラジエント溶出 (15 分で 50 % から 100% B) を行いました。得られたデータは、入力細胞に対して正規化し、細胞当たりで表した。
統計解析
P < 0.05 を有意とした。P値の算出にはPrism 8 (GraphPad Software, Inc.)を使用した。ランダム分布についてはMann-Whitney検定を、2つ以上のグループ間の多重比較については1-way ANOVAを使用した。ボンフェローニt検定は、多重比較のためのポストホック検定として使用した。相関分析では、<0.05のアルファ値を有意とみなし、スピアマン（r）、単回帰（R2）を使用した。

報告書の概要
研究デザインの詳細については、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryをご覧ください。

補足情報
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報告書サマリー(95K, pdf)
謝辞
P.P.はR01DE026923 NIH/NIDCR fundingと3 R01-DE026923-04S1によって支援されました。HIVウイルス株の調製に協力したCFARウイルス学コアのJennifer Bongorno-Hurtに謝意を表する。

ソースデータ
ソースデータ(313K, xlsx)

著者による貢献
P.P.は研究のコンセプト立案、実験の設計と実施、データ解析、プロジェクトの監督を行った。L.P.S.とK.A.はメタボローム解析とトランスクリプトーム解析を行った。P.P.とL.P.S.は原稿を共同執筆した。F.F.とA.P.はヒト参加者の歯肉生検を提供し、R.A.は患者を本研究に紹介した。S.S.M.、N.B.、E.S.は、HTOC実験の実施、ELISAデータの解析、および議論に貢献した。E.S.は患者の同意を得て、唾液と血液を採取し、ELISAを実施した。S.J.は、患者の募集に関する事務処理とマスク下でのデータ評価について技術的な支援を行った。MMLは、患者の募集についてPPと協議し、科学的な議論に貢献した。

ピアレビュー
査読情報
Nature Communicationsは、この研究の査読に貢献した匿名査読者に感謝する。

データの入手方法
本研究で得られた対照群のRNA配列データは、GEO, NCBIデータベースにアクセッションコードGSE167211で寄託されている。本研究で得られたPLWHのRNA配列データは、NCBI Genotypes and Phenotypes (dbGaP) データリポジトリにアクセッションコード dbGaP Study Accession: phs002364.v1.p1 として登録されている。メタボロームLC/MSデータ、およびヒト（非同定）サンプルの処理済み代謝プロファイルと対応するメタデータは、Metabolomics WorkbenchリポジトリにアクセッションコードNMRD: ST002328で寄託されました。ソースデータは本論文に添付されています。

利害関係
著者らは、競合する利益を宣言していない。

脚注
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場を維持しています。

補足情報
オンライン版には、10.1038/s41467-023-36163-2で入手可能な補足資料が含まれています。

論文情報
Nat Commun. 2023; 14: 399.
オンライン公開 2023 Jan 25. doi: 10.1038/s41467-023-36163-2
PMCID: PMC9873639
PMID: 36693889
S. S. Mahalingam,1 S. Jayaraman,1 N. Bhaskaran,1,9 E. Schneider,1 F. Faddoul,2 A. Paes da Silva,3 M. M. Lederman,4,5 R. Asaad,5 K. Adkins-Travis,6 L. P. Shriver,6 and P. Pandiyancorresponding author1,7,8
1ケースウエスタンリザーブ大学歯学部生物科学科，クリーブランド，オハイオ州，44106 USA
2ケースウエスタンリザーブ大学歯学部一般歯科高度教育学科、Cleveland, OH 44106 USA
3ケースウエスタンリザーブ大学歯学部歯周病学教室、クリーブランド、オハイオ州44106米国
4ケースウエスタンリザーブ大学医学部感染症・HIV医学部（米国オハイオ州クリーブランド市
5大学病院クリーブランド医療センターAIDS臨床試験ユニット（クリーブランド、オハイオ州44106、米国
6ワシントン大学化学部、メタボロミクス＆アイソトープトレーシングセンター、セントルイス、ミズーリ州、63110 米国
7ケースウエスタンリザーブ大学医学部病理学教室、クリーブランド、オハイオ州44106米国
8Center for AIDS Research, School of Medicine, Case Western Reserve University, Cleveland, OH 44106 USA
9現住所 インド、チェンナイ、スリラマチャンドラ高等教育・研究所の生物医学部
P. Pandiyan, Email: ude.esac@622pxp.
corresponding authorCorresponding author.
Received 2022 Apr 25; Accepted 2023 Jan 18.
著作権 © The Author(s) 2023
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスのもとで許諾されており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製が許可されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法令上の規制で許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
Nature Communicationsの記事は、Nature Publishing Groupの好意によりここに提供されています。
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