腸内細菌叢の組成は、前臨床アルツハイマー病の指標となる可能性がある

腸内細菌叢の組成は、前臨床アルツハイマー病の指標となる可能性がある

https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.abo2984

AURA L. FERREIRO HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-4022-2460, JOOHEE CHOI HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-6368-2470, [...], AND GAUTAM DANTAS HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-0455-8370 +17著者著者情報・所属団体
サイエンス トランスレーショナル メディシン
14 6月 2023
15巻700号
DOI: 10.1126/scitranslmed.abo2984
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要旨
アルツハイマー病（AD）の病態は、正常な認知から前臨床を経て、最終的には認知障害を伴う症候性ADへと進行すると考えられている。最近の研究から、AD患者の腸内細菌叢は、健常な認知正常対照者の腸内細菌叢と比較して、分類学的組成が変化していることが示唆されている。しかし、症候性ADの発症前の腸内細菌叢の変化に関する知見は限られています。臨床的共変量と食事摂取を考慮したこの横断研究では、164人の認知正常者のコホートにおいて、分類学的組成と腸内細菌機能を比較し、そのうち49人は初期前臨床ADのバイオマーカー証拠を示していた。前臨床ADの人の腸内細菌分類学的プロファイルは、前臨床ADの証拠がない人のそれとは異なっていた。腸内細菌組成の変化は、β-アミロイド（Aβ）およびタウの病理学的バイオマーカーと相関していたが、神経変性のバイオマーカーとは相関していなかったことから、腸内細菌は疾患プロセスの初期に変化する可能性があると考えられた。我々は、前臨床ADと関連する特定の腸内細菌分類を同定した。これらのマイクロバイオームの特徴を含めると、コホートのサブセット（164人中65人）でテストしたときに、前臨床AD状態を予測する機械学習分類法の精度、感度、特異度が向上した。前臨床AD神経病理学の腸内細菌学的相関は、AD病因の理解を深め、ADリスクの腸由来マーカーを特定するのに役立つかもしれない。
編集者の要約
アルツハイマー病（AD）患者は、腸内細菌叢が変化している可能性があり、これらの変化は疾患経過の初期に生じる可能性がある。今回、Ferreiroらは、前臨床AD（脳のアミロイドおよびタウ蛋白質の変化で示される）の人々の腸内細菌叢が、健常者のそれとは異なる組成であることを明らかにした。腸内細菌の分類は、前臨床ADのアミロイドおよびタウマーカーと相関していたが、神経変性のシグネチャーとは相関していなかった。特定の腸内細菌が前臨床ADと関連することが確認され、それらを含めることで機械学習による前臨床ADの状態予測が改善されました。-オーラ・スミス
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はじめに
ヒトの腸内細菌は、宿主の健康と幸福に影響を与える、組成的にも機能的にも多様な微生物群集を保有している（1、2）。これらのコミュニティには1012以上の細菌細胞が含まれ（2）、数千の分類群からなり、ヒトの生理学と代謝に多様な影響を与える経路の膨大なレパートリーをコードしています（1, 2）。腸内細菌の中には、出生時に哺乳類の免疫系を鍛えるものもあれば、生涯にわたって免疫調節活性を発揮するものもあります（3、4）。腸内細菌叢の異常は、疾患の状態と相関し、多様性の低下によって代表される細菌集団として定義され、多くの疾患と関連している（2、5-7）。腸の機能不全と異常な微生物含有量は、アルツハイマー病（AD）および潜在的に他の神経変性疾患の発症に寄与している可能性があります（8）。
ADの病態は、認知機能が正常で病気の証拠がない状態から、認知機能が正常で病気のバイオマーカーの証拠がある状態（前臨床AD）、そして症状のあるADへと進むと考えられています。これらの移行は、ポジトロン断層撮影（PET）イメージングや脳脊髄液（CSF）アッセイで病原性β-アミロイド（Aβ）およびタウ蛋白を検出し、CSFアッセイや磁気共鳴画像（MRI）で神経変性のマーカーを確認することに基づいている（9）。アミロイド・タウ・神経変性（AT(N)）マーカーの組み合わせは、臨床的認知症評価（CDR）スコアが異常になる時点と定義される症状発現のかなり前に神経病理が起こることを示唆しています（10）。
AD発症の進化における腸内細菌の役割を示唆する証拠がいくつかある。認知機能の正常な健康な人の便サンプルと比較して、症状のあるAD患者はバクテロイデーテスの相対量が増加し、ファーミキューテスの相対量が減少しており(6)、これは他の慢性炎症状態に見られるアンバランスである(11)。腸内細菌叢の変化は、リン酸化タウ181（p-tau-181）やAβ（Aβ42/Aβ40比によって測定）など、ADのCSFマーカーの存在と相関している（6）。ADの症候性患者における便の細菌組成の変動は、腸上皮細胞におけるP-糖タンパク質経路の調節不全を伴っており（5）、この変化は腸の炎症と臓器の恒常性の乱れに寄与している（5）。また、ADの症候性患者では、循環中のリポ多糖の濃度が上昇しており（12）、これはおそらく腸内細菌由来であると考えられる。ADの動物モデルでは、腸内細菌叢を操作することでAβの沈着が減少し、神経機能が改善する（13、14）。最後に、野生型マウスの腸内細菌は、レシピエントマウスにおけるAD病理を減少させる（15）。
現在のAT(N)基準では、腸内細菌異常は考慮されていない。しかし、ADの症状が現れる前に微生物群集の変化を同定することで、現在のマーカーよりもアッセイしやすい微生物由来のマーカーを用いてAT(N)の枠組みを強化することができるかもしれない(16-20)。腸内細菌異常症の初期の兆候と前臨床ADマーカーとの組み合わせは、ADの進行を遅らせる可能性のある腸内細菌指向の治療法に将来的に役立つかもしれません（21、22）。
ここでは、臨床的共変数と食事データを考慮して、前臨床ADの認知正常者がADに関連した腸内細菌異常症を有する可能性があるかどうかを調べるために、前臨床ADの認知正常者とそうでない人を対象としたナイトアルツハイマー病研究センター（ADRC）コホート（23-25）を調査しました。便サンプルの特定のマイクロバイオーム特性が、前臨床ADの状態または確立されたADバイオマーカーと相関するかどうかを調べ、マイクロバイオーム特性が、健常者と前臨床ADの人を区別するために設計された機械学習分類器の性能を改善できるかどうかを判断しました。
結果
健常者と前臨床AD患者の腸内細菌叢におけるグローバルな違い
Knight ADRCコホートの既存の縦断研究（26～28）から募集した参加者（68～94歳、45％男性）は、2019～2021年に便サンプルを提出し、平均2150万リードの深度で配列決定した。参加者は、PETイメージング、MRIイメージング、CSFサンプルを得るための腰椎穿刺、便サンプリング、瀉血、および3年ごと（65歳未満）または年ごと（65歳以上）のCDRスケール（10）の記入を含む臨床および認知テストを受けた（図S1）（27、28）。便のサンプリングからAβとタウの定量化のためのPETイメージングまたは腰椎穿刺までの平均間隔は、それぞれ2.4年と2.8年、直近のCDR評価から3.8ヶ月であった。すべてのサンプリング間隔を、前臨床ADの状態に応じてまとめた（表S1）。我々は、前臨床AD状態をCDR 0およびAβ陽性と定義し、Aβプラーク陽性は、11C Pittsburgh compound B（PiB）-PET標準化取り込み値比（SUVR）>1.42に対応するCentiloid > 16.4と定義した（29、30）。11名の参加者はPETによるAβデータが得られず、その場合、Aβ陽性はCSF Aβ42/Aβ40比<0.0673と定義した（31、32）。同様に、健康状態は、CDR 0およびセントロイド≦16.4またはCSF Aβ42/Aβ40比≧0.0673と定義された。これらの基準を用いて、164名の参加者に健康状態（n = 115）または前臨床AD状態（n = 49）を割り当てた。年齢、肥満度、アポリポ蛋白ε4（APOE ε4）キャリア、糖尿病、高血圧の違いを確認し、これらを変数として線形回帰モデルや機械学習モデル、分散分析（ANOVA）に組み込んだ（表1）。また、前臨床ADの状態を定義するために使用したバイオマーカーに応じて、便の採取からPETイメージングまたは腰椎穿刺によるCSFサンプルの取得までの時間間隔を変数として含めた（表S1）。食生活が腸内細菌叢の組成に与える影響（33）を考慮するため、食事行動によって分類学的なシフトが急速に（24時間以内に）（34）引き起こされる可能性があることから、便と一致した24時間の食事記録から参加者の栄養プロフィールを評価した（図S2）。その結果、全体的なカロリー摂取量、カロリー源の分布、主要な栄養素群（炭水化物、脂質、総食物繊維など）または特定のビタミンやミネラルの摂取量において、健康群と前臨床AD群の間に有意差は認められなかった（図S2）。
健康前臨床試験ADP番号11549年齢（年）、平均（SD）77.02 (5.80)78.96 (4.51)0.039 性別（%）男性49 (42.6)24 (49.0)0.562 教育年数、平均（SD）16.42 (2.26)16.69 (2.53)0.49 レース（%）ブラック18 (15. 7）1（2.0）0.034白人96（83.5）48（98.0）その他1（0.9）0（0.0）体格指数、平均（SD） 28.81（5.03）26.73（5.19）0.018APOE4（%） e4+26（22.6）23（46.9）0.003 活動的うつ状態（%） 3（2.6） 1（2. 0)1アルコール依存症(%)7 (6.1)1 (2.0)0.481 自己免疫疾患†(%)11 (9.6)5 (10.2)1 がん(%)6 (5.2)2 (4.1)1 心臓血管疾患 (%)14 (12.2)6 (12.2)1 糖尿病 (%)22 (19.1)1 (2.0)0.008 高コレステロール血症 (%)69 (60. 0）25（51.0）0.373高血圧症（%）74（64.3）23（46.9）0.057肝臓病（%）7（6.1）3（6.1）1甲状腺疾患（%）21（18.3）10（20.4）0.917タバコ使用（過去又は現在）（%）51（44.3）24（49.0）0.709
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表1. ADの前臨床状態によって層別化された検便時の参加者の人口統計学。
P、スチューデントのt検定（連続変数）またはカイ二乗検定（カテゴリカル変数）。関節リウマチ、ループスなど。
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糞便メタゲノム配列解析を行い、微生物分類群の相対量を種レベルでプロファイリング（MetaPhlAn3）（35）、さらに微生物パスウェイ（HUMAnN 3.0）（図S1、S3）（35）。健常対照者のFirmicutes/Bacteroidetes比は7.30、95%信頼区間（CI）［4.31、10.30］、前臨床ADの比は5.98、95% CI［3.90, 8.06］ で、この2群間に有意差はなかった（図1Aおよび図S3A）。同様に、分類群またはパスウェイで計算したα（サンプル内）多様性（図S3C）も、グループ間で同様であった。一方、サンプル間UniFrac距離（36）を用いた主座標分析（PCoA）では、前臨床状態による腸内分類学的プロファイルのグローバルな違いが示された［P = 0.036, Permutational ANOVA (PERMANOVA); P = 0.046, PCoA1 coordinate on AD status, Benjamini-Hochberg-adjusted］（Fig.1B および table S2）。PCoA2に沿った順序付けでは二項構造が観察され、これは分類学的なα多様性と関連していることがわかった（P = 0.006, PCoA2 > 0とPCoA2 ≤ 0のサンプルの豊かさを比較するStudentのt検定）；しかしこのコホートのα多様性はAD状態とは関連していなかった。PERMANOVAの結果、主座標の正準解析（CAP）（37）が行われ、候補の説明変数（「制約」）が、制約のない序列内のサンプル座標の分散を説明する能力についてテストされた；前臨床AD状態は、有意な多変量の、すなわち、コホートの分類学的な違いを説明した、 前臨床ADの状態は、コホートにおける有意な多変量、すなわち分類学的差異を説明した（P = 0.040, PERMANOVA; P = 0.0004, P = 0.0003, CAP1およびCAP2座標のAD状態による一元配置分散、それぞれベンジャミニ・ホックバーグ調整）（図1CおよびテーブルS3）。Bray-Curtis非類似度メトリックを用いた微生物経路プロファイルのPCoA順序付けにCAPを適用すると（図S3D）、サンプル座標はCAP2軸に沿ってADステータスによって有意に異なる（P = 0.036、ADステータスによるCAP2座標の一元配置分散）（図S3E、表S4とS5）。これらのデータは、認知障害が明らかになる前のADの初期に、ヒトの腸内細菌叢が変化する可能性を示唆している（5, 6）。
図1. 健常者とAD前臨床患者には、それぞれ異なる腸内細菌叢のプロフィールがある。
(A）前臨床ADの状態によって層別化した属レベルの分類学的（MetaPhlAn3）バープロットを積み重ね、門レベルで色分けして示す。(B）MetaPhlAn3の分類学的プロファイルから、重み付けされていないUniFrac距離のPCoAを算出した。年齢、APOE ɛ4キャリア状態、糖尿病、肥満度、高血圧、およびPETイメージングまたはAβ定量化のための腰椎穿刺から便採取までの経過時間を考慮しても、グローバルなマイクロバイオーム組成は健常者と前臨床AD者の間で異なっていた（P = 0.039, PERMANOVA; table S2）。また、健常者と前臨床ADのサンプルの座標は、PCoA軸1に沿って異なっていた（P = 0.046, Student's t test）。(C) (B)のPERMANOVAと同じ条件を用いて、MetaPhlAn3の分類プロファイルから、重み付けされていないUniFrac距離での対応するCAP順序を算出した（前臨床AD状態 P = 0.038, PERMANOVA; table S3）。また、CAP1軸とCAP2軸に沿ったサンプル座標は、ADの状態によって異なっていた（P = 0.001, Student's t test）。楕円は、グループセントロイドの周りの95％信頼区間を表す。*P < 0.05および*P < 0.01。P値はBenjamini-Hochberg法を用いて調整した。
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腸内細菌叢のプロファイルはAβやタウと相関するが、神経変性とは相関しない
腸内細菌叢のプロファイルが、前臨床ADの特定の特徴と相関しているかどうかを、ペアワイズ・スピアマン相関分析を用いて判断した。腸内細菌叢の概要指標、具体的には微生物の分類学的および経路的プロファイルの順序付けによるPCoA軸1および2と、センチロイドスケール（40）を用いてPETイメージング（38、39）で測定したAβプラークの量、およびCSFサンプルにおけるAβ42/Aβ40の比（41、42）を比較しました。腸内細菌叢の概要測定は、PETイメージングによるタウの量（43）およびCSFサンプル中のp-tau-181の量（44）とも比較された。また、神経変性の皮質シグネチャーであるCSF中の総タウ（t-tau）（41）や海馬の体積（45）で測定した神経変性や、脳白質高濃度化で測定した血管損傷とも比較した（図2A）。さらに、これらの腸内細菌叢の測定値が遺伝的リスク因子と関連しているかどうかを検討した： APOE ε4キャリアステータスおよび多遺伝子リスクスコア(46)。
図2. 腸内細菌叢のプロファイルは、Aβおよびタウと相関するが、神経変性とは相関しない。
(A）マイクロバイオーム要約指標（緑）とADバイオマーカー（青、Aβ、紫、タウ、オレンジ、神経変性、茶、血管損傷、灰、遺伝的リスク因子）のペアワイズ・スピアマン相関を示す。有意な相関を示し（P < 0.05, Benjamini-Hochberg adjusted）、円の大きさはP値に反比例している。挿入値はスピアマン相関である。WMH、白質過敏症。(B）腸内細菌由来の軸に対するADバイオマーカーの線形回帰。具体的には、PET Aβ、PET タウ、または皮質厚（神経変性の指標）を、MetaPhlan3分類学的プロファイル（上段および中段）またはHUMAnN 3.0 機能経路プロファイル（下段）由来のPCoAサンプル座標に回帰させる。ソースPCoA座標は、図1Bおよび図1Dによる。S3Dによる。P＜0.1、ANOVA、Benjamini-Hochberg-adjusted。ANOVAは、腸内細菌叢の要約機能（PCoA軸）の追加により有意に改善された分散の説明を決定するために、バイオマーカー～Aβ状態を回帰するヌルモデルに対して、バイオマーカー～Aβ状態を回帰するモデルを比較する。回帰モデルおよびANOVAは、表S6からS8に要約されている。
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AβプラークのPET画像は、PCoA1経路プロファイルと相関し（ρ = -0.21, P = 0.015, Benjamini-Hochberg adjusted）（図2A）、この結果は線形回帰モデルで支持された。これらのモデルはさらに、PET Aβプラークと分類学的プロファイルのPCoA2との関連を明らかにした（P = 0.080 taxa PCoA2、P = 0.052 pathways PCoA1、PCoA軸座標と前臨床AD状態の間の相互作用を含むモデルを、前臨床AD状態を唯一の予測因子とする無効モデルと比較して、テストしたすべてのモデルでBenjamini-Hochberg調整したANOVA）（図2B、表S7とS8）。PETタウは、分類学的プロファイルのPCoA2（ρ = 0.23, P = 0.014, Benjamini-Hochberg調整）および経路プロファイルのPCoA1（ρ = -0.18, P = 0.040, Benjamin-Hochberg調整）と相関があった（図2A）。PETタウと分類学的プロファイルのPCoA軸との相関は、線形回帰モデル（P = 0.080 taxa PCoA1, P = 0.018 taxa PCoA2, ANOVA, Benjamini-Hochberg-adjusted） によって支持された（図2B、表S6とS7）。このコホートにおけるAβ陰性でタウ陽性（18F-fortaucipir imaging probe > 1.22）の人の割合は16.3％であり、これは同等のコホートについて以前に報告された割合と同様だった（47、48）。
この分析に含まれるマイクロバイオームの指標は、神経変性マーカーと有意に相関していなかった（図2、表S6～S8）。神経変性は、前臨床ADのAT(N)の枠組みでは、Aβやタウのバイオマーカーの出現よりも後の出来事と考えられている（49）。認知症の臨床症状の発症前にPET画像で測定されるAβ斑の増加は、症候性ADへの進行の大きなリスクと関連すると考えられている（50）。
特定の腸内細菌叢の特徴は、前臨床ADの状態と関連している
前臨床ADの状態に関連する特定の分類群および微生物経路を特定するために、分類群または微生物経路の存在量データに負の二項回帰モデルを当てはめた。PERMANOVAおよびCAP解析と同様に、前臨床ADの状態に加えて、年齢、APOE ε4キャリア状態、肥満度、糖尿病、高血圧をモデル変数とし、さらにAβ陽性を定義するために使用するバイオマーカーに応じて、便の採取からPETイメージングまたはCSFサンプリングのための腰椎穿刺までの時間間隔を加えた（図3および図S4）。モデル係数の大きさによって、前臨床ADの状態に最も関連する種は、Dorea formicigenerans（係数=0.661、95% CI [0.659、0.662]、P < 0.001；回帰分析によるすべてのP値は、ベンジャミン・ホッチバーグ調整）、オシリバクター sp. 57_20 （係数= 0. 512, 95% CI [0.510, 0.514], P < 0.001), Faecalibacterium prausnitzii (coefficient = 0.298, 95% CI [0.297, 0.298], P < 0.001), Coprococcus catus (coefficient = 0. 190, 95% CI [0.187, 0.192], P < 0.001), Anaerostipes hadrus (coefficient = 0.163, 95% CI [0.163, 0.164], P < 0.001) （図3、AおよびB）である。これらの分類群は、ADの前臨床状態に関するRandom Forest分類法でも重要な特徴として同定されたため、ここで強調した（図4および図S3B）。Ruminococcus lactarisは、前臨床AD状態（係数 = 0.028, 95% CI [0.026, 0.029], P < 0.001）と関連していたが、Methanosphaera stadtmanaeは、健康状態（係数 = -0.240, 95% CI [-0.243, -0.236], P < 0. 001）；両種はRandom Forest分類器でも重要な特徴として同定されたが（図4および図S3B），可視化のためのフィルタリング基準（25人以上の参加者で検出または係数の大きさ≧0.15；データファイルS2）を満たさなかったため，ここには含まれていない。このコホートにおいて健康状態と最も関連する13種の腸内細菌種のうち7種がBacteroides属に属していた（図3）。
図3. 腸内細菌叢データに負の二項モデルを当てはめると、AD前臨床状態と関連する種が特定された。
(A）健常者またはAD前臨床状態と有意に関連する上位の種のモデル係数（左）および有病率（右）を示す。サンプルの少なくとも15%で検出された腸内細菌種を示し、Benjamini-Hochberg調整によるP値は係数<0.05、係数の大きさは>0.15であることを示した。エラーバーは係数のSEを表し、表示されない場合もある。分類係数は、参加者の年齢、APOE ɛ4キャリア状態、糖尿病、肥満度、高血圧、および予測因子としてPETイメージングまたはAβ定量化のための腰椎穿刺から便採取までの経過時間を追加した負の二項回帰モデル（MaAsLin2で実装）から得られたものである。(B) 前臨床AD（上段）または健常状態（下段）と最も関連する10の分類群のモデル係数による相対存在量。すべての回帰モデルの結果は、データファイルS2に掲載されています。
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図4. 腸内細菌叢の特徴は、AD状態に対するRandom Forest分類法の性能を向上させる。
AT(N)バイオマーカーとADの遺伝的危険因子の組み合わせで、腸内細菌叢の特徴がある場合とない場合のRandom Forest分類モデルの性能を比較した。(A）（B）および（C）で報告された各ランダムフォレストモデルに含まれる特徴の概要。特徴量に含まれるものは、斜線を引いたセルで示される。特徴を選択した腸管分類を含むモデル、含まないモデルを比較（各モデルの下部と上部）。特徴のラベルは、データ/バイオマーカーの種類によって色分けされている（緑：腸内細菌、青：Aβ、紫：タウ、オレンジ：神経変性、茶：血管損傷、灰：遺伝的リスク因子、黒：臨床共変量）。モデル「Aβを含むすべてのバイオマーカー」を除き、他のモデルはAβバイオマーカー（PET Aβ、CSF Aβ42/Aβ40比）を除外した。右余白に記載したモデル略号： CCは臨床的共変量、AはAβ、Gは遺伝学。欠損データはモデルトレーニングの前にインプットされ、fig. S5にまとめられている。S5. 最も欠測が多かったのは、PETタウ（20.7％）であった。BMIは体格指数、WMHは白質高濃度。(B）特徴選択された腸内細菌叢を含むか含まないランダムフォレストモデルの性能指標（グレーは微生物叢の特徴なし、緑は特徴選択された分類群の相対存在量を含む）。箱ひげ図は、訓練コホートの100個のランダムな分割で訓練されたモデルの保持された検証コホートに関する性能指標をまとめたものである。平均値はボックスプロット内で "X "で示されている。P < 0.01およびP < 0.001。ANOVAとTukey's post hoc testの両方で多重比較のためにボンフェローニ調整された。(C) 各モデルに含まれる特徴の重要度。100個のトレーニングパーティション（黒）で平均化し、オプションで各反復でランダムクラスラベルシャッフルを行い、ヌル分布を生成した（ピンク）。エラーバーはSDを表す。7つの分類学的特徴は緑色でハイライトされている。***P < 0.001. Benjamini-Hochberg調整によるStudentのt検定（表2、図S5、S6参照）。
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AD前段階の状態と最も強く関連する微生物経路には、アルギニンおよびオルニチンの分解に関与する経路が含まれていた（係数 = 0.967, 95% CI [0.954, 0.979]; 0.625, 95% CI [0.615, 0.635]; それぞれP < 0.001）（ 図 S4）．健康状態と最も関連する経路は、グルタミン酸分解（係数 = -0.992, 95% CI [-1.00, -0.98], P < 0.001）であった（図S4.） これらの回帰分析における有意な特徴のモデル係数は、データファイルS2に照合されている。
腸内細菌叢の特徴は、前臨床ADの状態に関する分類器の性能を向上させる
この分類法は、年齢、APOE ε4キャリア、肥満度、糖尿病、高血圧などの基本的な人口統計と臨床的共変量に基づいて訓練されます、 また、Aβ（PET Aβ、CSF Aβ42/Aβ40比）、タウ（PETタウ、CSF p-tau-181）、神経変性（CSF t-tau、皮質サイン、海馬体積）、血管損傷（白質高濃度体積）、遺伝（APOE ε4キャリアステータス、多因子リスクスコア）を組み合わせた。また、正規のADバイオマーカーを持たないモデルにおいて、腸内細菌叢の特徴の寄与を検証した。前臨床ADの定義にはAβ陽性が不可欠であり、脳や髄液中のAβ量を知ることは、便マーカーが持つ潜在的な相対的価値を低下させる。我々は、神経画像や腰椎穿刺を必要とする標準的なADバイオマーカーを利用できない場合、腸内細菌叢の特徴による予測性能が注目されるだろうと合理的に考えた。このアプローチによる予測性能の上限を明らかにするために、人口統計学的データと臨床共変量に加えて、Aβ、タウ、神経変性、遺伝的リスクのカテゴリーで利用可能なすべてのADバイオマーカーを含むモデルをテストしました（図4A）。次に、これらのモデルからADバイオマーカーのカテゴリーを合理的に除外した。まずAβマーカーから始め、次に遺伝を除くすべてのADバイオマーカー、そしてすべてのバイオマーカーを除外し、人口統計学と臨床共変量のみを残した（図4A）。また、神経変性/血管とタウのバイオマーカーの異なる組み合わせを含むモデルも評価した（図S6）。各モデルの予測性能を、腸内細菌叢の特徴（種の相対存在量）なしとありで比較した。
コホートは、同年齢層の独立した非認知障害者集団におけるAβ陽性の有病率（32.1%、95% CI [27.8, 36.4] ）（51）を反映して、訓練コホート（n = 99、前臨床期）と検証（n = 65、前臨床期）コホートにランダムに分割した（図S1）。訓練コホートの分類学的存在量データを、各反復で新しいシードを用いてBorutaアルゴリズム（52）を100回適用する反復的特徴選択に供し、100回の反復のうち少なくとも25回で選択された分類群を特定した。これにより、健常者とAD前駆症状のサンプルを分類するための重要な特徴として7つの候補分類子が特定され（図4および図S6）、これらはトレーニングおよびテストに保持されました。欠損したバイオマーカーデータは、k-nearest neighbor法を用いてインプットされ、図S5にまとめられている。S5. PETタウは最も欠損率が高く（20.7%）、他のバイオマーカーはすべて欠損率が11%未満であった。
各モデル（選択した7つの分類群の有無）を、トレーニングコホートの100個のランダムなサブセット（各反復で80％またはn＝79）に対して、それぞれのケースで10倍のクロスバリデーションを使用してトレーニングしました。この100回の繰り返しの後、モデルを検証コホートに対してテストした。検証コホートに対して行われた予測の精度、感度、特異度を照合した（図4B、図S6B）。予想外なことに、Aβを含むすべてのバイオマーカーでトレーニングした包括的モデル（「All」、図4A）では、腸内細菌群の特徴によって、分類精度が小さいながらも有意に向上した（平均値の差 = 0. 014, 95% CI [0.013, 0.015], P < 0.001, ANOVA with Tukey's post hoc test, additionally Bonferroni-adjusted across models) と特異度 (0.047, 95% CI [0.043, 0.052], P < 0.001) が向上しました（表 2）。PET AβとCSF Aβ42/Aβ40を省略した場合（「All - A」）、選択した分類群を含めると、特異度（0.119、95% CI [0.093, 0.145], P < 0.001）が大幅に向上したが、精度や感度は向上しなかった（図4Bと表2）。感度を犠牲にして分類学的特徴を追加することで精度または特異度が向上するというこのパターンは、神経変性/血管、タウ、遺伝的バイオマーカーの様々な組み合わせを含む他のモデルでも維持された（図S6Bおよび表S9）。一方、遺伝学を除くすべてのADバイオマーカーを省略したモデル（「CC + G」；図4A）、またはADバイオマーカーを併用したモデル（「CC」）では、分類学的特徴を含めると予測精度が大幅に向上した（CC + G: 0.048, 95% CI [0.042, 0.055]; CC: 0.075, 95% CI [0.067, 0. 083]; 各ケースでP < 0.001）、予測値の感度（CC + G: 0.046, 95% CI [0.036, 0.056]; CC: 0.117, 95% CI [0.105, 0.128]; 各ケースでP < 0.001 ）、またモデル CC + Gの場合は予測値の特異性（0.053, 95% CI[0.026, 0.080], P = 0.002 ）が示されました（図 4 B）。
モデルメトリックマイクロバイオームデータなし選択した分類群を含む選択した分類群を含む-マイクロバイオームデータなしMeanSDMeanSD平均値の差CI 95% lowerCI 95% upperPAllバイオマーカーAβAccuracy0. 9850.0040.9990.0060.0140.0130.0155.77 × 10-13Specificity0.9480.0130.9960.0190.0470.0430.0525.77 × 10-13AβSpecificity0.4130.1070.5320.0740.1190.0930 以外のすべてのバイオマーカー。 1458.44 × 10-13臨床共変量＋遺伝子バイオマーカー精度0.7060.0240.7550.0230.0480.0420.0555.77 × 10-13感度0.9170.0360.9630.0360.0568.38× 10-13 特性 0.9170.0330.0460.0360. 1960.0960.2490.0990.0530.0260.0800.002 臨床共変量のみ精度0.6740.0360.7500.0190.0750.0670.0835.77 × 10-13 感度0.8500.0510.9670.0240.1170.1050.1285.77 × 10-13
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表2. 腸内細菌叢の特徴を組み込んだ後のRandom Forest分類器の性能の向上。
腸内細菌叢の特徴（選択されたMetaPhlAn3分類群）の有無にかかわらず、ADバイオマーカーのサブセットでトレーニングしたRandom Forestモデルの平均精度、感度、特異度が示されている。各モデルは、トレーニングコホートの100個のランダムなサブセットでトレーニングされました。検証コホートに対するこれら100のモデルの平均パフォーマンスメトリクスが示されている。モデルは、すべてのANOVA（グループ：選択された分類群（MetaPhlAn3）を含むマイクロバイオームデータなし）において、ボンフェローニ調整後に有意なANOVA P値を保持している場合に含まれます。対応する平均値の差と95％信頼区間（CI）を報告する。P値： 各モデルのANOVA後のTukeyのポストホックテスト、Bonferroni法を用いて追加調整した（図4および表S9参照）。
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ADバイオマーカー（Aβ、タウ、神経変性/血管、遺伝）のカテゴリーが増えるほど、分類学的特徴を含めることで得られる精度の向上は大きくなり（Spearmanのρ = 0.975, P = 0.005） 、確立したADバイオマーカーのデータが少ないほど、前臨床ADの指標としての微生物特徴の有用性が増すことが示唆されました。これらのモデルにおける特定の特徴の重要性を、クラスラベルシャッフルデータで学習させたヌルモデル（ピンク色の分布；図4C）における重要性と比較すると、参加者の年齢（モデルCC + GおよびCC）およびAPOE ε4キャリアステータス（CC + G）とともに、7分類学の特徴のうち6つが重要であると確認されました。
考察
ADの有病率は、平均寿命が延びるにつれて世界的に増加し続けているが（53）、治療法はまだ確立されていない（14）。脳内のAβ斑の最初の沈着から障害の最初の臨床症状までの間に少なくとも10年の間隔が存在することを示唆する多くのデータがある（9）。この期間は、バイオマーカー（例えば、PETイメージング中のPiBまたは18F-florbetapir（AV45）ラジオリガンドによって検出されるAβプラーク、Aβ42、Aβ40、タウのCSFアッセイなど）により疾患の進行を予測できる前臨床ADの概念（9）の基礎を形成している（54）。AD病態の分子的特徴を早期に発見することは、効果的な治療を実施する上で依然として重要である(55)。
我々は、ADの前臨床期（Aβバイオマーカー値は異常だが認知機能障害は生じていない疾患進行の時点）において、異なる腸内細菌叢のプロファイルが存在するかどうかを検討した。便から容易に測定できるAD前臨床期の腸内細菌叢シグネチャーは、ADリスクの早期スクリーニング手段を強化し、AD進行のこの重要な段階におけるコホートの募集を改善する可能性があります。我々は、ADの前臨床段階において、異なるマイクロバイオーム組成と微生物の機能的可能性を見出した。さらに、腸サンプルのPCoA座標は、PETのAβおよびタウバイオマーカー（バイオマーカーカスケードの中で最も早い段階）と相関していたが、神経変性のマーカーとは相関していなかった。腸の特徴とAD早期病態の決定的な分子的特徴との関連は、補完的な早期進行予測マーカーとしての有用性を強化する。
回帰モデルにおいて、前臨床ADの状態に最も関連する微生物経路（l-アルギニン、l-オルニチン、4-アミノブタン酸分解）は、生成物としてコハク酸を共有しています。コハク酸は、主にトリカルボン酸サイクルの中間体として知られているが、腸内で生成される細菌代謝物でもあり、肥満（56）や炎症性腸疾患（57）と関連し、腸主導の炎症がAD発症と関連する免疫調節（58-61）としてますます評価されている（62）。さらに、コハク酸は短鎖脂肪酸（SCFA）であるプロピオン酸の主要な前駆体であり、ADの有症状者、およびADマウスモデルにおいて、健常対照者と比較して上昇することが以前に判明しています（63）。健常者と最も関連性の高い経路（l-グルタミン酸分解V）は、酢酸SCFAを生成する。酢酸SCFAは、in vitroでAβ凝集を抑制し（64）、マウスで認知障害を防ぐ（65）だけでなく、ヒト集団でAβ SUVR上昇と関連する（66）ことが観察されている。
回帰モデルでAD前段階の状態と有意に関連した分類群のうち、Alistipes、Barnesiella、Odoribacterは、以前にADの症状を持つ個人で発見されている（5）。また、Bacteroidesは、前臨床AD群と健常者群でそれぞれ異なる種（Bacteroides intestinalisとBacteroides caccae）が高い関連性を示し、種レベルでの関連性の重要性が浮き彫りになりました。また、健常者とAD患者との間で、BacteroidetesとFirmicutesの比率に有意な差は認められませんでしたが、これは健常者とAD患者との比較(6)とは対照的です。BacteroidetesとFirmicutesの比率を、前臨床ADから症候性ADへと進行するにつれて縦断的に把握することで、この指標が症候性ADで出現するかどうかを明らかにするのに役立つと思われます。Methanobrevibacter smithiiは、前臨床ADと関連しており、ADのマウスモデルにおいてAβプラークの沈着と神経炎症を抑制したSCFAである酪酸の糞便濃度（67）と負の相関があった（68）。
前臨床ADの状態はAβ負荷によって定義されるため、分類学的特徴によって得られるRandom Forest分類器の予測性能の向上は、より入手困難なAβ変数がモデルに含まれる場合、その大きさはわずかであった（モデルAの平均精度と特異度はそれぞれ1.4と5.0％の向上）。一方、人口統計学、臨床共分散、遺伝学のみで学習したモデル（CC + G）では、分類学的特徴を含めることで、平均精度と特異度がそれぞれ6.8%と27.1%向上したのに対し、人口統計学と臨床共分散のみで学習したモデル（CC）では、分類学的特徴を含めることで平均精度と感度に11.2%と13.7%の改善が見られた。腸内細菌叢の特徴は、前臨床ADの状態を確認するためのCSFまたはPET Aβアッセイのフォローアップの候補者を特定するための早期スクリーニング手段を強化する可能性があります。特徴選択後のモデルに含まれる分類学的特徴（D. formicigenerans、Oscillibacter sp. 57_20、F. prausnitzii、C. catus、A. hadrus、M. stadtmanae、および R. lactaris）のすべてが、負の二項回帰分析で前臨床ADまたは健康状態と有意に関連すると識別されました。この一致は、これらの分類群がAD前臨床期のマーカー候補であることを裏付けるものである。これらのうち、F. prausnitzii、Oscillibacter sp. 57_20、D. formicigeneransは、モデルCC + GおよびCCにおいて、最も重要な3つの分類学的変数としてランクされた。D. formicigeneransはムチンを分解し、多発性硬化症の患者において炎症性の役割を果たす可能性がある(69)。オシリバクター属は、マウスの高脂肪食の状況下で、大腸上皮の完全性の低下と相関していた（70）。一方、Oscillibacter sp. 57_20は、最近の大規模コホート型マイクロバイオームワイド関連研究（PREDICT 1）において有益なスコアを獲得した（71）。同様に、F. prausnitziiは一般的に抗炎症性常在菌と考えられており（72）、AD認知症患者と比較して、非AD患者で濃縮されていることが知られている（5）。これらの矛盾は、疾患における腸内細菌叢の潜在的な役割を考える際に、宿主や環境の状況、疾患のステージ、株特有の影響の重要性を浮き彫りにしている（73、74）。F. prausnitziiゲノムのインシリコ解析により、平均塩基同一性が90％未満である2つの系統群（75）と、高度のゲノム可塑性が明らかになった（76）。さらに最近、メタゲノムからゲノムを組み立てるアプローチにより、22のFaecalibacterium類似の種レベルのゲノムビンが同定され、Faecalibacterium属内の機能的可能性と抗炎症表現型の多様性はまだ十分に解明されていないことが示唆された。F. prausnitziiが介在する保護効果の菌株特異性は、最近、ADのマウスモデルで実証された(77)。
全体として、本研究で報告した腸内細菌と前臨床ADの状態やADマーカーとの関連は、神経変性疾患における腸管神経免疫軸の存在を支持するものである（8）。今回、このような関連性が前臨床ADで確立されたことを報告し、これらの微生物種のうち少なくとも数種を因果関係の連鎖に位置づける可能性が示されました。しかし、より広範な前臨床ADコホートでこれらの関連を検証し、因果関係を評価し、これらの関連が症状のあるADに及ぶのか、あるいは疾患の進行に伴う他の腸内細菌群や免疫の特徴によって継承されるのかを明らかにするためには、さらなる調査が必要である。また、これらの関連性の特異性を、AD以外の認知症患者コホートで検証する必要がある。ADの前兆腸内細菌叢シグネチャーは、便は容易に入手できる分析物であり、配列決定コストは低下し続けているため、早期スクリーニング手段の入手しやすさと感度を向上させることによって、現在のAT（N）フレームワークを補完する可能性がある（78）。血漿Aβ42/Aβ40、p-tau-217、ニューロフィラメントライトなどの血液バイオマーカーは、障害のない高齢者集団における認知機能低下やその後のAD認知症の予測バイオマーカーとして浮上している（79）。便の分析は、画像診断技術へのアクセスにおける不公平感を軽減する可能性があり（80）、その取得は、腰椎穿刺による髄液の取得よりもはるかに低侵襲である。便は自宅で採取できるため、便を使用することで、特に医療機関へのアクセスが悪い人々において、地域検査プログラムのカバー率を高めることができる（81）。ADリスクの早期発見が改善されれば、神経変性や認知機能低下が始まる前のAD進行の重要な時期における研究への参加者が増え、この進行を阻止する治療法の開発に役立つ可能性がある。ADの重症度や進行に対する腸の影響を支配するメカニズムは完全には解明されていないが、このような取り組みにより、ADの病態を逆転または改善する腸内細菌主導の介入が可能になる可能性がある（82）。例えば、最近の研究では、健康な参加者から採取したF. prausnitziiの特定の菌株が、脳アミロイドーシスのマウスモデルにおいて認知障害を軽減した(77)。同様に、ADの5xFADマウスに、腸内微生物によるマンナンオリゴ糖調節SCFA産生を食事で補充すると、神経炎症が抑制され、認知障害が緩和された（68）。第2相ランダム化試験において、オリゴマン酸ナトリウム（海藻由来のオリゴ糖）はADの認知機能の転帰を改善した（22）。
本研究には重要な限界があり、さらなる調査が必要な領域が明らかである。まず、神経画像検査、血清・髄液検査、便採取の間隔を考慮すると、便採取時の参加者の真のバイオマーカー濃度が、これらの分析で使用したバイオマーカー値と異なる可能性があることである。我々のコホートにおけるADの進行速度は、バイオマーカー値が3年間（83）（Knight ADRC参加者が神経画像診断、血清およびCSF評価を受ける間隔）の間に大きく変化しないと予想されるが、この推定は集団レベルであり、特定の参加者がバイオマーカー値の変節点を通過した可能性がある。同様に、成人の腸内細菌叢の組成は一般に安定しているが（84、85）、活動、投薬、加齢などの環境要因の変化に応じて摂動しやすい（86-88）。今後の研究では、バイオマーカー評価と検便を同期させ、参加者の縦断的なサンプリングを行うことで、マイクロバイオーム組成の参加者内の自然な変動を考慮することができるようになる。さらに、前臨床ADの状態は、その個人が必ずしも症候性ADに進行することを意味するものではない。時間的に一致した神経画像、生物学的評価、認知評価、および便サンプリングによる参加者の長期縦断的追跡により、軽度認知障害または症候性ADに進行した個人を特定することができる。また、腸内環境の特徴によって、認知機能障害への移行が予測されるか、あるいは認知機能障害の進行が抑制されるかが判断されます。第二に、便メタゲノムシークエンスは、株レベルの分解能を含む腸内細菌叢の分類学的組成と機能的可能性に関する豊富な情報を提供するが、こうした調査は、サンプリング時に活発に発現している微生物遺伝子のレパートリーを測定するメタトランスクリプトミクスや、腸内に存在する生物活性小分子をプロファイルするメタボロミクスなど、より幅広いマルチミクス手法によって強化されるであろう。特に、SCFAや二次胆汁酸塩など、神経変性疾患に関与するとされる代謝物を測定し、分類学的組成データとの相関分析を行えば、ADにおける特定の腸内分類群の役割に関するメカニズム的仮説を強化できる。同様に、全身および腸管炎症のマーカーや腸管透過性など、腸の健康状態を臨床的に測定することで、前臨床期のADに関連する腸内細菌異常や機能障害についての理解を深めることができます。また、長期的な測定により、ADに関連する腸管機能障害にマイクロバイオーム異常が先行するのか、あるいはその逆なのかを明らかにすることができる。
要約すると、我々はADの前臨床段階における腸内細菌叢の全体的および特異的な差異について報告した。さらに、腸内細菌叢の特徴を追加することで、前臨床ADの分類法の精度、感度、特異性が向上することを実証した。便中のマイクロバイオームマーカーは、前臨床ADの早期スクリーニング手段を補完し、ADの進行における腸の潜在的役割について有望な仮説を生み出すかもしれません。最後に、微生物的にリスクのある集団は、臨床的なADへの進行を阻止するための腸に直接作用する介入の新しい機会を開く可能性がある。
材料と方法
研究計画
この横断的観察研究の目的は、健康な参加者（n = 115）と前臨床ADの参加者（n = 49）の腸内細菌叢プロファイルの違いを明らかにし、腸内細菌叢の特徴とADバイオマーカーの相関を明らかにすることであった。なお、症状のある参加者は除外した（CDR > 0）（10）。解析の対象としたADバイオマーカーは、PETイメージング（Centiloidスケール）(40, 89)から、データの有無に応じて11C PiBまたはAV45を用いて算出した脳Aβプラーク、あるいはPiBとAV45の両方が利用可能な場合は、最新の値を使用しました。その他のバイオマーカーとしては、PET画像で測定したタウ（43）、CSFのAβ42/Aβ40比（41、42）、CSFのp-tau-181とt-tau（41、44）、MRIの白質高濃度体積、海馬体積、皮質サイン（45）などがあった。さらに、多遺伝子リスクスコア（46）およびAPOE ε4キャリア状態も含めた。この便研究の参加者は、セントルイスのワシントン大学医学部（WUSM）にあるKnight ADRCの既存の縦断的コホート研究（26～28）から募集した。Knight ADRCのコホートは、PET、MRI、腰椎穿刺による髄液採取、3年ごとの採血、3年ごと（65歳未満の参加者）または年1回（65歳以上の参加者）の臨床・認知検査などの評価を受けている（27、28）。バイオマーカーおよび臨床指標は、各参加者の直近の神経学的および認知学的評価から得られたものを使用した。神経学的および認知的評価と便の採取との間の経過時間は、表S1に要約されている。便サンプルの処理は、ADの状態について盲検化されて行われた。すべての参加者が同一の手順を受けたため、グループランダム化は行われなかった。サンプルサイズは事前に決定していない。
参加者
参加者は、2019年7月から2021年10月までセントルイスのWUSMのKnight ADRCで行われた既存の縦断コホート研究（26-28）から、主に、前臨床ADを有する可能性のある個人の登録を意図的に目指すAdult Children Study（ACS）から本研究に募集した（26、27）。ACSの参加資格は、健康であること、登録時に45～64歳であることに加え、（i）ADに罹患することなく70歳を超えて生きた両親を持つこと、または（ii）80歳までにADを発症した両親を持つことのいずれかです。全参加者の遺伝的リスクデータは、表1（APOE ε4キャリア状態）またはデータファイルS1に記載されている。既存のKnight ADRCコホートからの登録者が、ランダム化された方法でこの研究への登録のためにアプローチされた。参加者は68歳から94歳までであった。すべての参加者は無症状で、直近（平均3.8カ月以内）のCDRが0であった。前臨床ADは、CDR＝0かつAβ陽性と定義された。Aβ陽性は、Centiloid > 16.4と定義され、Centiloidは、入手可能または最新の撮影により、PiB SUVRまたはAV45 SUVRから計算されました。PET Aβバイオマーカーが利用できない場合（n = 11人）、Aβ陽性はCSF Aβ42/Aβ40比<0.0673と定義した（31、32）。健康とは、CDR=0かつAβ陰性（センチロイド≦16.4またはCSF Aβ42/Aβ40比≧0.0673）であると定義した。CDRの評価は、確立された採点ルール(10)に従って、資格を有する臨床医が行った。認知症の診断基準は、National Institute on Aging-Alzheimer's Association Work Groupの勧告(90)に準拠した。CDR=0以外の除外基準は、Knight ADRCへの参加について以前に説明した通りである（28）。
研究プロトコルはWUSM Institutional Review Boardによって承認され、すべての参加者は研究目的のために臨床および遺伝子情報を使用することに書面によるインフォームドコンセントを提供した。人口統計学的データ、バイオマーカー、および遺伝子データは、2022年2月22日に抽出された。臨床メタデータは、2022年5月3日に抽出された。データは2022年3月1日から2023年1月18日まで分析された。
臨床的評価
すべてのCDRスコアは、CDRの使用に訓練を受けた経験豊富な臨床医による評価から得られたものである。CDRは、認知症があるかどうかを判断し、ある場合はその重症度を段階的に判定するために使用される。グローバルスコアを使用する場合、CDRが0であれば「認知的に正常」であり、CDRが0.5であれば「非常に軽度」、CDRが1であれば「軽度の認知症」をそれぞれ示す（91）。本研究では、すべての参加者のCDRは0であった。
その他の臨床的メタデータ（人口統計および健康情報、肥満度、糖尿病、高血圧、薬物使用歴など）は、WUSM Knight ADRCにおける既存の縦断的コホート研究（26-28）の評価プロトコルに基づき、経験豊富な臨床医が参加者および傍系とのインタビューを行い、認知評価に加え、全米アルツハイマー病調整センターの統一データセットプロトコル（92、93）による臨床メタデータを取得する。
APOE ε4 の状態および多遺伝子リスクスコア
登録時にDNAサンプルを採取し、Illumina 610チップまたはOmniExpressチップを用いて遺伝子型判定を行った。ジェノタイピングの方法は以前に発表されたものである（94）。この解析でAPOE ε4の個人への影響を制御するために、APOE状態は遺伝子型から二値変数に変換された。参加者は、APOE ε4対立遺伝子を少なくとも1コピー持っているか（「APOE ε4陽性」）、対立遺伝子のコピーを持たないか（「APOE ε4陰性」）である。多遺伝子リスクスコアは、chr19（95）のAPOE領域を除外して、Kunkleステージ1およびステージ2の複合要約統計量を用いて、ゲノムワイドのP値閾値（5.0×10-8）で算出した。リスクスコアの算出にはPRSice-2を用い、デフォルトのクランピングパラメーター（--clump-p 1; --clump-r2 0.1; --clump-kb 250）を適用した（96）。
MRIの取得
画像処理は、3.0 Tesla Trio Siemens Biograph mMR（ドイツ、エアランゲン）または 3.0 Tesla Siemens TIM Trio（ドイツ、エアランゲン）スキャナを用いて実施した。Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiativeのプロトコルを用いて、高解像度3次元矢状T1磁化準備-高速勾配エコー解剖学的画像を取得しました： Siemens Biograph mMRでは、繰り返し時間（TR）＝2300 ms、エコー時間（TE）＝2.95 ms、フリップ角＝9°、176スライス、取得行列＝240 x 256、ボクセルサイズ＝1 mm x 1 mm x 1.2 mmという走査パラメータ、Siemens TIM Trioでは、TR＝2400 ms、TE＝3.16 ms、フリップ角＝8°、176スライス、取得行列＝256 x 256、ボクセルサイズ＝1mm x 1 mm x 1mmという走査パラメータが採用されています。T1強調スキャンはFreeSurfer 5.3でセグメンテーションした。これまでの研究で、側頭（下、中、上）、頭頂（下、上）、内嗅皮質、楔前部、海馬が、疾患の影響を最も受け、最も早く変化する領域であることが確認されている（45）。コホート全体に対する左半球と右半球の体積をそれぞれZスコアに変換し、それらを平均して "ADシグネチャー領域 "を得ました。ADシグネチャー領域は、ADによる脳容積の萎縮を簡潔に表現する要約指標を作成します（45）。
AβとタウのPETイメージング
画像検査は、Knight ADRCによってベースライン時およびその後3年ごとに取得された。PET画像は、以前に記載された方法論（97、98）を用いて、MRIから2年以内（平均＝0.6±1.2年）に取得された。PETデータは、FreeSurfer version 5.3 (Martinos Center for Biomedical Imaging, Charlestown, MA, USA) Desikan-Killianyアトラスを用いて定義した関心領域を用いるPET Unified Pipeline (github.com/ysu001/PUP) で処理した。データは、小脳灰色を基準としてSUVRに変換され、幾何学的伝達行列の枠組みの一部として領域拡散関数を計算することによって部分体積が補正されました。PET Aβイメージングは、11C PiBまたはAV45のいずれかを用いて行われた。定量化のためのタイムウィンドウは、PiBでは注入後30～60分、AV45では50～70分であった。これら2つの異なるトレーサーの測定値を調和させるために、センチロイドが使用された(40)。
PETによるタウイメージングは、18F-fortaucipir（AV1451）を用いて行われ、SUVRは注射後80～100分のウィンドウで計算された。FreeSurferバージョン5.3のセグメンテーションに基づき、扁桃体、内嗅皮質、下側頭、外側後頭領域の算術平均として定義されていたタウ障害の要約尺度が、各参加者のために計算された（43）。
CSFの採取と分析
CSF（10～20ml）は、22ゲージのSprotte脊髄針（Geisingen, Germany）を用いた腰椎穿刺により採取した。腰椎穿刺は、訓練を受けた神経科医が一晩絶食した後、午前中に行った。CSFはポリプロピレンチューブに500μlずつ分注し、目に見える血液の混入がないようにした。採取後、サンプルは静かに反転させ、-80℃で凍結した。CSF Aβ42、Aβ40、t-tau、およびp-tau-181は、自動化学発光酵素免疫測定法（LUMIPULSE G1200, Fujirebio, Malvern, PA, USA）（32）を用いて、以前に説明したように測定した。CSF Aβ42/Aβ40比は、この研究のために計算した。
便の採取
便サンプルは、確立されたコミュニティサンプル取得プロトコル（99、100）に基づき、2019年12月20日から2021年10月12日まで収集した；サンプルは、標準化された指示および収集材料で参加者の自宅で作成し、同日、商業宅配業者によって断熱パッケージでWUSMに輸送し、その時点でサンプルを冷凍し（-80℃）、細菌DNA抽出の処理までバーコード実績下で分注した。
フードログと栄養分析
24時間分の食事記録アンケートが、便収集キットと一緒に送付された。参加者は、検便前の24時間に摂取したすべての食品、飲料、およびあらゆるサプリメントを自己申告した。記入欄には、食事の時間と種類、食品、量、ブランドまたはレストラン、調理法、調味料が含まれていた。食べ物の記録は、登録された免許を持つ管理栄養士が処理し、Food Processor Nutrition Analysisソフトウェア（ESHA Inc.、Salem、OR）に入力しました。このツールは、米国農務省（USDA）のAgricultural Research Service Food and Nutrient Research Database for Dietary StudiesおよびUSDA SR-Legacyの栄養データベースを包含する146,000以上の食品項目のデータベースと食品エントリーを照合し、各参加者の24時間便適合栄養プロファイルを生成するために使用された。これらのプロファイルには、総カロリー摂取量、大栄養素グループ別のカロリー摂取量、必須栄養素（例：炭水化物、総食物繊維、ビタミン、ミネラル）の1日推奨摂取率（% RDV）が含まれていた。RDVは、参加者の性別と年齢をもとにソフトウェアで決定されました。
メタゲノムシークエンス
100～200mgの凍結便をDNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN, Germantown, MD, USA）の入力として使用し、ゲノムDNAを抽出した。DNA収量は、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて測定した。サンプルあたり合計0.5 ngのゲノムDNAを使用して、Nextera Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) を用いて配列決定ライブラリを作成した(101). ライブラリを等モル濃度でプールし、NovaSeq 6000（2×150塩基対）でシーケンスし、サンプルあたり平均2150万リード（SD、850万；最小、700万；最大、5800万）を得た。リードはシーケンシングバーコードでデマルチプレックスした。イルミナ（Nextera-PE）アダプターを除去し、Trimomatic v0.38（102）を用いて、ILLUMINACLIP: Nextera-PE.fa:2:30:10:1:TRUE, LEADING:10, TRAILING:10, SLIDINGWINDOW:4:20 および MINLEN:60 というパラメータでリードを品質フィルターしトリミングした。hsref38 (103)に対してDeconSeq v0.4.3で汚染されたヒトリードを除去し、bbtools v38.26 (sourceforge.net/projects/bbmap/) の repair.sh でペアエンドリペアを行いました。
処理したリードは、MetaPhlAn3 v3.0.7 (35)の入力として、クレード特異的マーカー遺伝子を用いてサンプルごとの分類学的相対量を決定し、HUMAnN 3.0 v3.0.0a4 (35) でメタゲノムを機能的にプロファイリングするために用いた。レアファクション解析のために、リードを段階的にサブサンプリングし（1億から2000万）、MetaPhlAn2で再解析を行った。Rパッケージphyloseq v1.38.0 (104)を用いて、カウント変換された分類学的存在量データに基づいてサンプルのアルファ多様性（豊かさ）を推定し、Benjamini-Hochberg調整によりすべてのサブサンプリング深度間でペアワイズWilcoxon検定が行われました。読み取り閾値は、より高い読み取り閾値と比較して、サンプルのアルファ多様性に有意差がない最低読み取り閾値と定義した。経験的に決定されたリード閾値（500万リード）を通過したサンプルは、下流の分析に残された（n = 164）。
統計解析
統計解析はR v4.1.3で行い、可視化は特に指定がない限りggplot2 v3.3.5で作成した。健常者と前臨床AD群間の人口統計学的または臨床的共変量の差は、Studentのtまたはカイ二乗検定によって決定した。グループ間の栄養摂取量の差は、すべての比較においてBenjamini-Hochberg補正を行い、各栄養成分（図S2）について個別にStudentのt検定でテストした。MetaPhlAn3およびHUMAnN 3.0の出力とサンプルのメタデータを使用して、phyloseqオブジェクトを生成した（phyloseq v1.38.0）．MetaPhlAn分類学データベースの系統樹は、MetaPhlAn githubリポジトリ（mpa_v30_CHOCOPhlAn_201901_species_tree.nwk）から取得し、サンプル間UniFrac距離（36）を計算するためにMetaPhlAn3 phyloseqオブジェクトに組み込みました。木はiTOL v6.5.8 (105)を用いて可視化した。
phyloseq estimate_richness関数を用いて、カウント変換された分類学的および経路の存在量（それぞれMetaPhlAn3およびHUMAnN 3.0出力）からサンプルのアルファ多様性（豊かさおよびシャノン多様性指数）を計算した。低存在のMetaPhlAn3分類群（サンプル間の平均相対存在度≦0.1%）およびHUMAnN 3.0パスウェイ（サンプル間の平均相対存在度≦0.01%）は、下流分析の前にフィルターで除外しました。Phyloseqで呼び出されたVegan v2.5.7は、MetaPhlAn3データについては重み付けされていないUniFrac距離、HUMAnN 3.0 パスウェイデータについてはバイナリBray-Curtis dissimilarities（106）を使用して、PCoAおよびCAP（37）に使用されました。有意なグループ差は、vegan v2.5.7に実装されているadonis2関数（用語を順次追加する）を用いて、サンプル間距離または非類似度を用いてPERMANOVAで検定した。PERMANOVAに含まれる用語は、年齢、APOE ε4キャリア状態、糖尿病、肥満度、高血圧、便採取からAβバイオマーカー取得までの間隔、Aβ（前臨床AD）状態、の順であった。CAP分析における制約条件（PERMANOVAに含まれる同じ項）の有意性は、vegan v2.5.7（anova function）に実装されているANOVAによって検定した。主座標のグループ差は、Benjamini-Hochberg法を用いてP値を調整した一元配置のANOVAで評価した。
ADバイオマーカーと腸内細菌叢の特徴の一対のスピアマン相関は、Rパッケージ corrplot v0.92 (107) を用いて可視化し、Benjamini-Hochberg調整後のP < 0.05 の相関のみを示すようにフィルターにかけた。分類学的（MetaPhlAn3）またはパスウェイ（HUMAnN 3.0）の存在量データの順序からPCoA軸に対するADバイオマーカー（PET Aβ、PETタウ、皮質サイン）の固定効果線形回帰分析は、lmおよびaov関数（stats v4.1.3）を使用して実施した。モデルの概要は表S6から表S8に記載されている。線形回帰モデルは、それぞれのヌルモデルに対するANOVAが、テストしたモデル全体で調整されたBenjamini-Hochberg-adjusted P < 0.1をもたらす場合、統計的に有意であるとみなされた。
前臨床ADの状態と有意に関連する特定の分類群および経路を特定するために、MaAsLin2 v1.10.0 (108) を使用して、2種類のデータについて個別にカウント変換された存在量データに負の二項モデルをあてはめた。分類群およびパスウェイの相対的な存在量はカウント変換後も保持されるため、正規化パラメータは "NONE" に設定された。残りの MaAsLin2 実行パラメータは、standardize = "TRUE", min_abundance = 0 (存在量の低い分類群またはパスウェイをすでにフィルタリングしたため), min_prevalence = 0, transform = "NONE" (MaAsLin2 モデル実行の外でカウント変換したため）, analysis_method = "NEGBIN, and max_significance = 0.05 に設定した。つまり、有意な特徴は、Benjamini-Hochberg調整したP < 0.05であることが必要であった。固定効果には、年齢、APOE ε4 キャリア状態、糖尿病、肥満度、高血圧、便採取から Aβバイオマーカー取得までの間隔、Aβ（前臨床 AD）状態が含まれた。可視化のために、164サンプル中25サンプル以上（コホートの15％）で観察され、適合係数の大きさが0.15を超えるもののみを含むように、有意な特徴を追加でフィルタリングした。
AD前臨床状態に関するRandom Forest分類の訓練とテストは、caret v6.0.86で実施した。カテゴリー変数である性別、人種、高血圧、糖尿病、APOE ε4の状態は数値化されたものである。データは、VIM v6.1.0を用い、k = 5のk-nearest neighbor法を用いてインプットした。データの欠落は、特徴別および特徴の組み合わせ別に図S5にまとめている。S5. 次に、AT(N)または血管障害（白質増多量）＋遺伝子バイオマーカーのカテゴリーによってデータを組み合わせ的にサブセットした（図4Aおよび図S6Aのモデル定義）。人口統計学的変数である年齢、性別、人種、学歴（年）、および臨床的共変量である体格指数、高血圧、糖尿病は、すべてのモデルで予測因子として含まれ、採便から神経学的評価までの時間間隔も同様とした。コホートは、訓練コホート（n = 99）と検証コホート（n = 65）に60：40でランダムに分割した（caretパッケージのcreateDataPartition関数、ランダムシード = 42）。トレーニングコホート内では、Boruta (v7.0.0) (52) の特徴選択パイプラインを各反復で新しいシードを用いて100×適用し (set.seed = 1:100) 、各反復で maxRuns = 500として、分類群存在量データに対して特徴選択を実施した。この中から、100回の繰り返しのうち、少なくとも25回で選択された分類群を特定した（n = 7分類群）。連続変数はzスコア化した（caret preProcess関数の "center "と "scale "メソッド）。次に、これらの特徴選択された分類群を含むか、または除外して、Random Forestモデルをトレーニングした。各モデルは、訓練コホートの100個のランダムなサブセット（80％；n = 79、seed = 1100）に対して、それぞれのケースで10倍のクロスバリデーションと「Accuracy」テスト指標を用い、mtry（各ツリーノードでランダムにサンプリングする変数数）のデフォルトパラメータntree = 500とsearch = "grid "で訓練しました。これら100のモデルは、保持した検証コホートの前臨床状態を予測するために適用された。特徴選択された分類群を含む、または含まないモデルの予測性能は、性能指標として保持された精度、感度、特異度を用いて比較した。分類学的特徴を含めることで学習済み分類器の性能が向上するケースを特定するため、各モデル（All、All - A、CC + G、CC、CC + NT、CC + GT、CC + GN、CC + N、および CC + T）と性能指標（精度、感度、特異度）のペアについて、一元配置分散分析を使用して選択した分類群の有無を比較して性能を評価した。ボンフェローニ調整によるP < 0.05のモデル-性能指標ペアを考慮し、比較はTukeyのテストを用いて再テストし、ボンフェローニ調整の第2ラウンドにかけた（stats v4.1.3のaovおよびTukeyHSD関数）。特定の特徴の重要性を評価するために、各反復で訓練コホートのクラスラベルをランダムにシャッフルしてモデルを再トレーニングした。得られた特徴の重要度のヌル分布は、Studentのt検定と多重仮説検定のためのBenjamini-Hochberg調整により、対応する経験分布と比較された。統計解析のためのRコードとデータは、https://doi.org/10.5281/zenodo.7964088 で入手できます。
謝辞
本研究に参加した被験者の時間と貢献に感謝するとともに、Knight ADRCのBiomarker、Clinical、Genetic、Imaging Coresのスタッフにも感謝する。さらに、Washington University in St.Louis School of MedicineのEdison Family Center for Genome Science and Systems Biologyのスタッフにも感謝する： B. Dee、K. Matheny、K. Pageには事務的なサポートを、J. Hoisington-LopezとM. L. Crosbyにはハイスループットシーケンスの技術サポートを、E. MartinとB. Koebbeには計算機サポートをお願いしました。また、McDonnell Genome InstituteのGenome Technology Access Centerには、ハイスループットシーケンスにおける技術的なサポートをいただいたことに感謝する。また、Dantas Labのメンバーには、有益な議論をしていただいたことに感謝する。
資金提供 本研究は、米国感染症学会財団（Microbial Pathogenesis in Alzheimer's Disease Grant 2020 to G.D.）、National Institute on Aging（P01 AG026276 to J.C.M.. およびR01 AG057680-01A1からB.M.A.とS.L.S.）、Brennan Fund（B.M.A.へ）、Riney Fund（B.M.A.）、ワシントン大学消化器疾患研究コアセンター（NIDDK P30 DK052574、バイオバンク コア、共同ディレクターP.I.Tへ）です。
著者の貢献 B.M.A.とG.D.が本研究の構想を練った。B.M.A.、G.D.およびA.L.F.は、方法論を開発した。A.L.F.はすべての解析と可視化を行い、原稿を執筆した。B.M.A.、G.D.、P.I.T.がプロジェクトの監督を行い、R.M.B.、R.T.、C.H.-Mがプロジェクトの管理を担当しました。P.I.T.、R.M.B.、C.H.-M.、I.M.N.は便サンプルの収集、受領、処理の調整を行った。A.L.F.、J.C.、J.R.はシーケンス用ライブラリーを準備した。T.L.S.B.は、神経画像診断を調整した。S.L.S.とR.M.B.は、臨床認知評価を調整した。S.E.S.とA.M.F.は体液バイオマーカー収集のコーディネートを行った。C.C.は遺伝子マーカーの収集をコーディネートした。D.M.H. と J.C.M. は Knight ADRC のコホート研究を監修した。L.S.は食べ物のログデータを処理し、栄養プロフィールを作成した。B.M.A., G.D., P.I.T., A.L.F., R.T., J.C., J.R., E.P.N., J.C.M., S.L.S. は資金獲得に貢献した。T.L.S.B., B.M.A., G.D., P.I.T., J.C., J.R., E.P.N., D.M.H., A.M.F., S.E.S., C.C., O.H.B., J.C.M., R.M.B., R.T., C.H.-M., I.M.N., L.S, and S.L.S. は原稿を修正しました。
競合する利益： G.D.は、細菌性病原体に対する抗菌薬併用療法を開発するViosera Therapeutics社の共同設立者、株式保有者、コンサルタント、科学諮問委員会メンバーである。G.D.は、Viosera Therapeuticsに譲渡された特許の共同発明者である。G.D.は、Pluton Biosciencesのコンサルタントおよび科学諮問委員会のメンバーであり、過去5年間はSNIPR Technologies Ltd.のコンサルタントを務めています。P.I.T.は、MediBeacon Inc.の株式保有者、コンサルタント、科学諮問委員会のメンバーであり、MediBeaconに譲渡された特許の共同発明者、AGA Center for Microbiome Research and Educationの科学諮問委員会の議長（有料）、テンプル大学の水系腸内感染に関するコンサルタント、UptoDateからのロイヤルティ受け取り、Inmunovaのデータ安全監視委員会の無給の委員である。D.M.H.はC2N Diagnosticsの共同設立者であり、科学諮問委員会のメンバーであり、Genentech、Denali、Cajal Neurosciences、C2N Diagnostics、Asteroidのコンサルティングを担当しています。ワシントン大学は、D.M.H.の研究室に対して、NextCure、Eli Lilly、Novartis、Ionis、およびDenaliから研究助成金を受け取っています。T.L.S.B.は、シーメンスから研究資金、Avid Radiopharmaceuticals、Cerveau、Life Molecular Imagingから技術サポートと材料を受け取っています。また、T.L.S.B.はシーメンス、イーライリリー、ロシュ、ライフモレキュラーイメージング、バイオジェン、エーザイから有償・無償のコンサルティングを受け、顧問の役割を担っています。A.M.F.は、Roche Diagnostics、Genentech、Diademの科学諮問委員会のメンバーであり、DiamiRとSiemens Healthcare Diagnostics Inc.のコンサルティングを行ったこともあります。S.E.S.は、C2N Diagnosticsがワシントン大学に提供したデータを分析し、エーザイの科学諮問委員会の委員を務めています。C.C.は、グラクソ・スミスクラインとエーザイから研究支援を受け、Vivid GenomicsとCircular Genomicsの諮問委員会のメンバーであり、株式を保有しています。J.C.M.は、Barcelona Brain Research Foundation Scientific Advisory Board、Native Alzheimer Disease-Related Resource Center in Minority Aging Research External Advisory Board、Cure Alzheimer's Fund Research Strategy Council、および Longer Life Foundation Board of Governorsのメンバーである。J.C.M.は以前、Diverse VCID (Vascular Contributions to Cognitive Impairment and Dementia) Observational Study Monitoring Boardのメンバーであった。
データおよび資料の入手 本試験に関連するすべてのデータは、論文または補足資料に記載されている。すべての図のソースデータは、データファイルS1～S4に記載されています。ショットガン・メタゲノミック・リードは、BioProject ID PRJNA798058でNCBI SRAに寄託されている。本研究で使用したソフトウェアパッケージは、フリーでオープンソースです。解析に使用したRスクリプトとデータは、https://doi.org/10.5281/zenodo.7964088、ダウンロード可能です。研究者は、Knight ADRC（https://knightadrc.wustl.edu/data-request-form/）にデータや資料を請求することができます。
補足資料
このPDFファイルには以下の内容が含まれています：
図S1～S6
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参考文献・注釈
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L. V. Hooper, D. R. Littman, A. J. Macpherson, Interactions between the microbiota and the immune system. Science 336, 1268-1273 (2012).
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クロスリファレンス
パブコメ
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