メタノゲン菌と硫化水素産生菌は、異なる腸内細菌プロファイルと過敏性腸症候群のサブタイプを導く

https://journals.lww.com/ajg/Fulltext/2022/12000/Methanogens_and_Hydrogen_Sulfide_Producing.29.aspx

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米国消化器病学会公式ジャーナル｜ACG

機能性腸疾患
メタノゲン産生菌と硫化水素産生菌は、異なる腸内細菌プロファイルと過敏性腸症候群のサブタイプを導く
Villanueva-Millan, Maria J. PhD1; Leite, Gabriela PhD1; Wang, Jiajing PhD1; Morales, Walter BS1; Parodi, Gonzalo BS1; Pimentel, Maya L. BS1; Barlow, Gillian M. Mathur, Ruchi MD1,2; Rezaie, Ali MD, MS1,3; Sanchez, Maritza BS1; Ayyad, Sarah BS1; Cohrs, Daniel MD1; Chang, Christine RN1; Rashid, Mohamad MBChB1.などです。Hosseini, Ava MPH1; Fiorentino, Alyson BS1; Weitsman, Stacy MS1; Chuang, Brennan1; Chang, Bianca MD3; Pichetshote, Nipaporn MD4; Pimentel, Mark MD1,3
著者情報
アメリカン・ジャーナル・オブ・ガストロエントロジー 117(12):p 2055-2066, December 2022. | DOI: 10.14309/ajg.0000000000001997
OPEN
SDC
指標
要旨
はじめに
過敏性腸症候群（IBS）には、下痢優勢型（IBS-D）および便秘優勢型（IBS-C）のサブタイプがある。我々は、呼気検査と便のマイクロバイオームシークエンシングを組み合わせ、IBSサブタイプの潜在的な微生物ドライバーを同定した。

方法
2件の無作為化対照試験（NCT03763175およびNCT04557215）のIBS-CおよびIBS-Dの被験者を対象とした。ベースラインの呼気の二酸化炭素、水素（H2）、メタン（CH4）、硫化水素（H2S）濃度をガスクロマトグラフで測定し、ベースラインの便のマイクロバイオーム組成を16S rRNA配列決定で分析した。微生物代謝経路は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesコレクションデータベースを用いて解析した。

結果
IBS-C群では呼気中のCH4が高く、腸内細菌の多様性、便中のメタン生成細菌（主にMethanobrevibacter）の相対存在度（RA）、および便中のMethanobrevibacter smithiiの絶対存在度の高さと相関があった。IBS-D群では、呼気中のH2が高く、微生物の多様性が低いことと相関し、呼気中のH2Sが高く、FusobacteriumやDesulfovibrio属を含むH2S生成細菌のRAが高いことと相関した。 主なH2生成細菌はこれらの異なるマイクロタイプで異なり、IBS-C/CH4+ではRuminococcaceaeとChristensenellaceae（これはMethanobacteriaceae RAと相関した）のRAが高く、IBS-DではEnterobacteriaceae RAが高く、このことは、MethanobacteriaceaeとChrisnenelloが高いこと、そして、IBMでは、RBSの方が高いことを示している。最後に、微生物代謝経路解析の結果、IBS-C/CH4+ではメタン生成とメタン生成補因子F420の生合成に関連するKyoto Encyclopedia of Genes and Genomesモジュールが濃縮され、一方、IBS-Dでは硫酸還元経路などH2S生成に関連するモジュールが濃縮されていることが判明した。

結論
IBS-CとIBS-Dの呼気ガスパターンには、M. smithiiなどのメタン生成菌とFusobacteriumやDesulfovibrio属などのH2S生成菌による異なる腸のマイクロタイプが存在することが明らかになった。

はじめに
過敏性腸症候群（IBS）は、全世界で10人に1人が罹患していると推定されており、北米での有病率は11.8％～14.0％である(1)。IBSの患者は腹痛、腹部膨満感に苦しみ、便の形態や頻度に変化が生じ、それが少なくとも6ヶ月間続きます(2)。IBSは、優勢な便のパターンにより、便秘型（IBS-C）、下痢型（IBS-D）、便秘と下痢の混合型（IBS-M）の3つのサブタイプに分類されます。

IBSの病因はまだ不完全にしか解明されていませんが、腸内細菌叢の役割を示唆する文献が増えつつあります(3)。しかし、具体的な知見は研究間で一貫していません。これは、IBSが異質であることや、異なるIBSのサブタイプをまとめていることに起因しているのかもしれません。にもかかわらず、一貫した所見として、呼気試験と小腸培養試験の両方を対象とした最近の大規模なメタ分析に基づく、小腸細菌過剰増殖（SIBO）とIBS-Dサブタイプとの関連性がある（4）。SIBOの診断は呼気検査での水素（H2）の増加の有無に基づいており（5）、これまでの研究でIBS-D被験者の80％以上にSIBOが存在することが判明している。しかし、新たなデータにより、腸内細菌が産生する別のガス、硫化水素（H2S）も下痢症に関与している可能性が示唆されています。H2Sはガストランスミッター（ガス状の情報伝達物質）であり、消化管（GI）の炎症や粘膜修復など、体中の多くの機能に関与している(6)。しかし、硫酸還元菌（H2Sを産生する）の増加は、大腸がんや持続的な下痢を伴う潰瘍性大腸炎（7,8）と関連があると言われています（9）。さらに最近では、臨床的に有意な閾値は下痢の程度に依存するが、呼気検査でのH2S濃度の上昇がIBS-Dと関連する可能性があることが分かってきた(10,11)。

SIBOはIBS-Dで報告されているが、IBS-Cとの関連はない。IBS-Cでは、メタン生成の亢進とメタン生成菌による腸内コロニー形成（現在では腸内メタン生成菌過繁殖（IMO）と呼ばれている）が関連しており、IBS-Cの腸内マイクロバイオームはIBS-Dとは異なることがデータから示唆されている(12)。メタン生成菌は細菌ではなく古細菌であり、他の2つの領域である細菌および真核生物と比較して、細胞核を持たず、明確な細胞壁構造を持つ第3の生命領域である(13)。腸内では、ほとんどのメタン生成菌が従属栄養細菌であり、従属栄養細菌が生成した水素を利用してメタンを生成している(14)。興味深いことに、メタン（CH4）は、動物モデルにおける腸管通過の遅延や、メタン生成IBS被験者における運動指数の上昇に直接関連し（15）、便秘を引き起こす可能性がある（3,16）。

これらの知見は、腸内細菌叢の変化がIBS全体では一様でないことを示しています。むしろ、異なる微生物組成（マイクロタイプ）が、IBSの表現型の違いを説明する可能性がある。このようなマイクロタイプを特定することで、IBS全般における微生物の病態メカニズムの可能性をより明確に定義できるかもしれない。本研究では、3ガス（H2、CH4、H2S）呼気試験と便のマイクロバイオームシークエンシングを組み合わせて、IBSの臨床表現型の潜在的な微生物ドライバーを同定することを目的とする。

方法
被験者の募集
2つの無作為化対照試験からの被験者を本研究に組み入れた。両試験のベースライン呼気ガスおよび便サンプルを使用した。IBS-Cの被験者は臨床試験（clinicaltrials.gov NCT03763175）で募集された。IBS-CはRome IV基準(17)に基づいて診断された。最近抗生物質を使用した場合、排便の25％以上に緩い便または水様便の既往がある場合、下剤または浣腸の乱用、骨盤底機能障害、肥満手術、消化管の一部を切除する手術の既往がある場合は被験者が除外された。

2番目の試験は、Rome IV基準に基づいてIBS-D（NCT04557215）の被験者を募集した（17）。被験者は、最近の抗生物質使用歴、既知の胃腸疾患、腸の手術、骨盤底機能障害がある場合は除外された。両試験ともCedars-Sinai Institutional Review Boardの承認を得ており、すべての被験者が書面によるインフォームドコンセントを提供した。

呼気検査
両試験において、被験者は二酸化炭素（CO2）、H2、CH4、H2Sを測定できるシステム（Gemelli Biotech, Raleigh, NC）を用いてベースライン（介入前）のラクチュロース呼気試験を受けた。呼気試験結果の解釈は、呼気試験に関する北米コンセンサス（5）およびACG Clinical Guideline for SIBO（12）に準拠した。H2 呼気試験陽性は、90 分以内にベースラインから 20 ppm 以上上昇したものと定義した。CH4 呼気試験陽性は、試験中のどの時点でも測定値≥10 ppm と定義された。H2Sはコンセンサスやガイドラインで議論されておらず、閾値は下痢の重症度に依存するため、呼気試験全体にわたるH2Sレベルを分析した。

便サンプルの採取と評価
両試験とも、ベースライン（介入前）の便サンプルは自己採取し、直ちに冷蔵保存した後、実験室に輸送した。IBS-C試験では、CH4陽性の被験者のみが便サンプルを提供した。実験室に到着後、アリコートをOMNIgene GUTチューブ（DNA Genotek, ON, Canada）に移し、DNA抽出前に室温で保存した。便の形態は、Bristol Stool Form Scale (18)に従って分類された。

便の DNA 抽出
DNA抽出は、MagAttract PowerSoil DNA KF Kit（Qiagen）を用いて、先に述べたように若干の修正を加えて行った(19)。抽出した DNA は KingFisher Duo 自動システム（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いて精製し、DNA 純度および濃度は NanoDrop One spectrophotometer（ThermoFisher Scientific）を用いて決定した。

IBS-CおよびIBS-D被験者の便中メタン生成アーキアの定量的ポリメラーゼ連鎖反応による決定
IBS-CおよびIBS-D被験者の便中の2種のメタン生成古細菌、Methanobrevibacter smithiiおよびMethanosphaera stadtmanaeの濃度は、それぞれの種のRNAポリメラーゼのβサブユニット（rpoB）遺伝子を標的とするプライマーおよびプローブを用いた定量ポリメラーゼ鎖反応（qPCR）により測定された（20）。アッセイはApplied Biosystems社（Custom TaqMan Gene Expression Assays）により最適化されたものであった。リアルタイムqPCRは、QuantStudio 6 Flex System（Thermo Fisher Scientific）を用いて以下のように実施した。20×Custom TaqMan Gene Expression assay solution（Thermo Fisher Scientific）1μL、TaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific）10μL、PCR grade water 7μL、鋳型DNA（25 ng/μL）2μLを50℃2分、95℃2分、95℃1秒と60℃20秒を40サイクル行い、以下の手順で実施した。M. smithii株培養物およびLeibniz Institute Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Braunschweig, Germany) の M. stadtmanae DSM 3091から同じプロトコルでDNAを抽出し、qPCR標準として10倍連続希釈による標準曲線を作製した。

ライブラリーの調製と16S rRNAの塩基配列決定
16S 配列決定および解析プロトコルの詳細は、Supplement Digital Content に記載されている（補足情報、https://links.lww.com/AJG/C678 を参照）。

統計解析
記述的分析は、平均値±SDで示した。カテゴリー変数はχ2検定またはFisher exact検定で、連続変数はt検定またはMann-Whitney U検定で2群間比較した。3群以上の比較はone-way ANOVAまたはKruskal-Wallisで解析した。変数間の相関は Spearman rank correlation coefficients で解析した．統計分析は、SPSS 24.0 (SPSS, Chicago, IL), SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC), RStudio (RStudio, Boston, MA), および GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, La Jolla, CA) を使用して実施した。グラフの作成はGraphPad Prism 9.02 (GraphPad Software)を用いて行った。有意性はP < 0.05とした。

結果
被験者の人口統計学
合計171人のIBS患者が対象となった（IBS-D 47人、IBS-C 124人）。被験者のデモグラフィックと臨床的特徴をSupplement Digital Contentに示す（Supplement Table S1、https://links.lww.com/AJG/C678 参照）。IBS-C被験者のうち、58名（47％）がCH4陰性（IBS-C/CH4-）、66名（53％）がCH4陽性（IBS-C/CH4+）でIMO（5）であるとみなされた。合計8人のIBS-D被験者（17％）がCH4陽性であった。IBS-C/CH4+被験者は、IBS-D（P = 0.037）およびIBS-C/CH4-（P = 0.029）被験者よりも有意に高齢であった。性分布や体格指数に群間差は確認されなかった（補足表S1参照、https://links.lww.com/AJG/C678）。

すべてのベースライン便サンプルの便形態は、Bristol Stool Form Scaleを用いて評価された。IBS-D群では、IBS-C/CH4+群（3.2±0.88）に比べ、平均スコアが有意に高く（4.7±1.27）、緩く、より水っぽい便を示した（P < 0.0001 ）。

呼気中H2濃度の上昇は、IBS-Dに特徴的であった。
H2の曲線下面積（AUC）は、すべてのIBS-C被験者と比較して、IBS-Dでより高かった（P = 0.02、図1a）。さらに、IBS-D被験者の53.2％がH2に基づいてSIBO陽性であり（5）、IBS-C被験者の30.1％と同様であった（P = 0.02）。IBS-Cでは、IBS-C/CH4-被験者の35.09%がH2 SIBO陽性であったのに対し、IBS-C/CH4+被験者では25.76%であった（図1b）。IBS-Dでは、IBS-C/CH4+と比較して有意に多くの被験者がSIBOに陽性であった（P = 0.0009、図1b）。

F1
図1: IBS-DとIBS-C被験者の呼気検査結果。(a)呼気H2のAUC。(b)H2に基づくSIBOの陽性率。(c) H2Sに対するAUC。(d) CH4に対するAUC。データは平均値±SDで示した。Mann-Whitney U 検定による統計解析。AUC、曲線下面積、IBS、過敏性腸症候群、IBS-C、便秘優勢、IBS-D、下痢優勢、SIBO、小腸菌過繁殖。
各群の完全な呼気ガスプロファイルも探索した（補足図S1、図S2、https://links.lww.com/AJG/C678 参照）。呼気H2動態は、IBS-D被験者とIBS-Cサブカテゴリーとの間で顕著に異なっていた（補足図S2A、https://links.lww.com/AJG/C678 を参照されたい）。H2デルタ値（ラクツロース摂取120分後 vs 摂取前レベル）は、IBS-D被験者 vs IBS-C/CH4- (P = 0.038) および IBS-C/CH4+ (P = 0.016, Supplementary Fig. S2B, https://links.lww.com/AJG/C678 参照)で有意に高値であった。ラクツロース摂取後15分までに、H2濃度はIBS-D vs IBS-C/CH4+被験者ですでに高く（P = 0.037、補足図S2A、https://links.lww.com/AJG/C678）、呼気試験中のすべての時点において有意に高いままだった（Table 1）。

T1
表1: IBS-D群、IBS-C/CH4-群、IBS-C/CH4+群間の呼気試験中のH2、CH4、H2Sレベルの比較
呼気検査でのH2SレベルもIBS-Dに特徴的であった
H2SのAUCもIBS-DではIBS-Cの全対象者に対して高かった（P = 0.002、Figure 1c）。H2Sレベルは0分（P = 0.002）、15分（P < 0.0001）、30分（P = 0.011）、75分（P = 0.037）でもIBS-D vs IBS-C/CH4+ 対象で有意に高かった（補足図 S2C, https://links.lww.com/AJG/C678, Table 1参照）。

呼気CH4値の上昇はIBS-Cにより特徴的であった
CH4のAUCは、IBS-C/CH4+群（P < 0.0001）に牽引されて、すべてのIBS-C被験者対IBS-D（P = 0.002, Table 1, Figure 1d）において高かった。CH4の動態もIBS-C被験者とIBS-D被験者で異なっており（補足図S1、図S2、https://links.lww.com/AJG/C678）、呼気試験中のすべての時点でIBS-C/CH4+対IBS-D被験者でCH4レベルが高かった（P < 0.0001, 補足図S2D、https://links.lww.com/AJG/C678, 表1を参照）。

IBS-DおよびIBS-C/CH4+被験者の呼気ガス間の関連性
IBS-DおよびIBS-C/CH4+の被験者では、呼気H2 AUCは呼気H2S AUCと正の相関があったが（R = 0.22, P = 0.045, Figure 2a）、呼気CH4 AUCとは逆相関であった（R = -0.47, P < 0.0001, Figure 2b）。呼気中H2S AUCとCH4 AUCの間には関連性は認められなかった（P = 0.9）。

F2
図2.：プールされたIBS-DおよびIBS-C/CH4+被験者における呼気H2、H2SおよびCH4間の関連性。(a) H2 と H2S の AUC 間の関連性。(b)H2とCH4のAUC間の関連性。AUC、曲線下面積、IBS、過敏性腸症候群、IBS-C、便秘優性、IBS-D、下痢優性。
腸管由来のメタン生成アーキオンは呼気CH4濃度と関連している
IBS-C/CH4+被験者42名とIBS-D被験者40名から、ベースラインの便サンプルを提供してもらった。IBS-C/CH4+被験者のうち、88.09%がメタン生成菌M. smithiiを検出できたのに対し、IBS-D被験者では17.94%であった（P < 0.0001 ）。M. stadtmanaeは便中にあまり存在せず、IBS-C/CH4+の10%とIBS-Dの7.69%でのみ検出可能であった（P = 1）。M. smithiiの絶対量は、呼気試験中の時点にかかわらず呼気CH4値と正の相関があったが、呼気試験中に到達した最大CH4値を用いるとより高い相関係数が得られた（R = 0.516, P < 0.0001）．M. smithii絶対量も105分（R = -0.375, P = 0.008）および120分（R = -0.332, P = 0.02）において呼気H2レベルと負の相関を示した（補足表S2参照, https://links.lww.com/AJG/C678）。

IBS-DとIBS-Cは、それぞれ異なる便の微生物学的特徴によって特徴付けられる
便サンプル（IBS-C/CH4+被験者42人およびIBS-D被験者40人）も16S rRNA配列決定に使用された。ノイズ除去および低品質リードの除去後、合計3,780,543リードを分類学的解析のために保持した（平均46,104リード/被験者）。Chao1, Simpson index, Shannon indexの3種類の指標を用いて、微生物のα多様性解析を行った。Chao1は存在量に基づく推定値、Simpson indexは一般的または支配的な種をより重視する（すなわち、種の均等性に敏感）、Shannon indexはすべての種（希少種を含む）がサンプルに含まれると仮定する（すなわち、種の豊かさに敏感）(21)。このアルファ多様性解析により、IBS-C/CH4+とIBS-Dの被験者では、便の微生物組成がより多様で豊富になることが明らかになった（Chao1、P = 1e-05、Simpson index、P = 0.0002、およびShannon index、P = 0.0002）。 0002；およびShannon index, P = 6e-06）（図3a-c）。主成分分析（PCA）プロットでは、異なる微生物シグネチャーが得られた（非計量多次元尺度法、順列多変量分散分析［PERMANOVA］P < 0.001） （補足図S3、 https://links.lww.com/AJG/C678 を参照）。興味深いことに、呼気CH4 AUCが高いほど、便の微生物α多様性が高い（Shannon index R = 0.582, P = 1.83e-8, Simpson index R = 0.427, P = 8.7e-5, 図3d）のに対し、呼気H2 AUCが高いほど便のα多様性が低い（R = -0.216, P = 0.05, 図3d）ことが相関していることがわかった。

F3
図3: IBS-DおよびIBS-C/CH4+被験者の便の微生物α多様性指標（a）Chao1、（b）Simpson指数、および（c）Shannon指数。(d) 微生物α多様性指標と呼気のH2、H2S、CH4との関連性（Spearman R）。青のグラデーションは正の相関、赤のグラデーションは負の相関を示す。色は相関係数の範囲を示し、円の大きさは各範囲内の係数を示す（Spearman R）。***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05。IBS、過敏性腸症候群、IBS-C、便秘優勢、IBS-D、下痢優勢。
IBS-C/CH4+とIBS-Dの被験者間の微生物プロファイルの違いは、より高い分類レベルでも明らかであった。IBS-Dと比較して、IBS-C/CH4+の便中では古細菌門ユリアルコータの相対存在度が高かった（fold change [FC] = 8.16, false discovery rate [FDR] P = 2.39E-8 ）。細菌分類については、Firmicutes門のRAがIBS-C/CH4+ vs IBS-Dで1.27倍高く（FDR P = 0.04）、Tenericutes、Lentisphaerae、Synergistetes門のRAもIBS-C/CH4+ vs IBS-Dで高かった（FC = 3. 47, FDR P < 0.0001; FC = 1.74, FDR P = 0.006; FC = 2.09, FDR P = 0.02, それぞれ）（補足図S4参照, https://links.lww.com/AJG/C678）. 一方、Bacteroidetes (FC = 1.39, FDR P = 0.02), Fusobacteria (FC = 5, FDR P = 4.43E-9), Proteobacteria (FC = 1.55, FDR P = 0.02), Epsilonbacteraeota (FC = 2.2, FDR P = 0.02) のフィラではRAは1.5であった。 5, FDR P = 3.82E-3), Spirochetes (FC = 5.91, FDR P = 4.43E-9) がIBS-D被験者とIBS-C/CH4+で高かった（補足図S4参照, https://links.lww.com/AJG/C678）.

ファミリーレベルでは、IBS-C/CH4+被験者の便微生物群は、IBS-D被験者と比較して、ファミリーMethanobacteriaceae (FC = 2.79, FDR P = 1.61E-6) およびMethanomassiliicoccaceae (FC = 2.08, FDR = 9.16E-3) からのメタン生成アーキアの高いRAによって特徴づけられた。メタノブレバクター属はIBS-C/CH4+とIBS-Dの間で高い値を示し（FC = 2.74, FDR P = 1.88E-5）、qPCRの結果を確認することができた。IBS-C/CH4+とIBS-Dの比較でRAが高い細菌ファミリーは、Anaeroplasmataceae (FC = 7.35, FDR P3.11E-12), Flavobacteriaceae (FC = 3.84, FDR P = 1.48E-5), Christensenellaceae (FC = 1. 91, FDR P = 1.88E-5) などであった。 91, FDR P = 1.91E-4), Enterococcaceae (FC = 2.92, FDR P = 2.16E-3), Ruminococcaceae (FC = 1.23, FDR P = 0.009) などである（補足表S3, https://links.lww.com/AJG/C678 を参照）。注目すべきは、IBS-C/CH4+被験者のメタノバクテリア科のRAが、これらの細菌科のRAと正の相関を示し、これらの微生物間の合成関係の可能性を示していることである（図4a）。最後に、メタノバクテリア科と最も重要な関連細菌科のRA（R > 0.25、図4a）は、呼吸CH4 AUCおよび高い便微生物多様性と相関していた（図4b）。

F4
図4.: (a) 古細菌科メタノバクテリ属の相対的存在量と相関する上位25の細菌科（スピアマン検定）。(b) 微生物α多様性（シャノン指数およびシンプソン指数）、呼気H2、CH4、H2S AUC、およびMethanobacteriaceaeに関連する細菌ファミリーの間の関連性。青の勾配は正の相関、赤の勾配は負の相関を示す。色は相関係数の範囲を示し、円の大きさは各範囲内の相関係数を示す（Spearman R）。***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05. (c) H2S産生細菌科Fusobacteriaceaeと相関のある上位25の細菌科（Spearman test）。AUC、曲線下面積。
IBS-D被験者の便中微生物の特徴は、Pseudomonadaceae（FC = 7.26, FDR P < 0.00001）、Spirochaetaceae（FC = 5.94、FDR P < 0.001）を含むいくつかのグラム陰性細菌ファミリーの高いRAであった。 94, FDR P = 5.91E-9), Fusobacteriaceae (FC = 5.23, FDR P = 3.75E-9), and Bacteroidaceae (FC = 1.81, FDR P = 4.18E-3) (Supplementary Table S3, https://links.lww.com/AJG/C678 参照)などであった。これらの細菌ファミリーのほとんどは、便の微生物多様性に負の影響を与えた（図4b）。注目すべきは、Fusobacteriaceae（H2S生成分類群を含む）とSpirochaetaceaeのRAが高い呼気H2S AUCと相関していたことである（それぞれR = 0.269, P = 0.017; R = 0.237, P = 0.035, Figure 4b）。また、FusobacteriaceaeのRAは、Enterobacteriaceae、Pasteurellaceae、Pseudomonadaceae、Bacteroidaceae、Vibrionaceaeなどグラム陰性菌を含むいくつかの科と正の相関があり（図4c）、これらの科間の関係の可能性が示唆された。一方、Fusobacteriaceae RAは、Ruminococcaceae、Methanobacteriaceae、Peptococcaceae、MethanomassiliicoccaceaeといったIBS-C/CH4+と関連した科と逆相関していた（図4c）。

属レベルでは、H2S産生属のFusobacterium (FC = 6.08, P = 3.75E-12) やDesulfovibrionaceae科の未知属 (FC = 3, FDR P = 4.58E-3) など、35種の既知および不明の属がIBS-D被験者の便中微生物相でIBS-C/CH4+と比べて高いRAを持っていた（補足表S3、 https://links.lww.com/AJG/C678 参照）。P値補正後のIBS-D被験者とIBS-C/CH4+被験者のDesulfovibrio属のRAに有意差はなかったが（P = 0.04, FDR P = 0.11），IBS-D 対 IBS-C/CH4+ ではいくつかの Desulfovibrio OTUのRAは高かった（FDR P < 0.05, Supplement Table S3, https://links.lww.com/AJG/C678 を参照）．

腸内細菌シグネチャーと予測されるパスウェイは、IBS被験者の呼気H2SおよびCH4と関連している
多くの微生物分類群のRAがIBS-C/CH4+被験者とIBS-D被験者で異なっていたが（補足表S3、https://links.lww.com/AJG/C678）、H2SおよびCH4生成に必要な酵素をコードする微生物がIBS被験者の呼気H2SおよびCH4レベルと相関していた。Fusobacteriumと未知のDesulfovibrio種のRAは、H2SのAUCと正の相関があった（それぞれR = 0.33, P = 0.003; R = 0.254, P = 0.025）。メタノブレヴィバクター属のRAは、すべての時点の呼気中CH4レベル（P < 0.0001）およびCH4のAUC（R = 0.658, P < 0.0001）と正の相関を示し、PCR法による便中M. smithiiレベルに関する知見と一致することが示された。さらに、Methanobrevibacter RAは105分（R = -0.401, P < 0.001）および120分（R = -0.387, P < 0.0001）のH2レベルと負の相関が見られた。

微生物代謝パスウェイ分析により、これらの関連性がさらに裏付けられた。バイオメタン生成に関連するシグネチャーは、IBS-C/CH4+被験者の便微生物群に特徴的であり、CO2、メタノール、およびメチルアミンからのメタン生成に関連するKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）モジュールが濃縮されていた（補足図S5、 https://links.lww.com/AJG/C678 を参照のこと）。メタン生成に使用される補酵素であるF420の生合成を予測するKEGGモジュールも、IBS-C/CH4+被験者で濃縮されており（P < 0.0001）、このモジュールはすべての時点の呼気CH4レベル（R = 0.488-0.536, P < 0.0001） およびCH4 AUC（R = 0.537, P < 0.0001) と相関していた。

硫黄代謝に関連する生化学的シグネチャーは、異化性および同化性硫酸還元経路を含むH2S生成に関連するKEGGモジュールの濃縮により、IBS-D被験者の便微生物に特徴的であった（補足図S5、https://links.lww.com/AJG/C678 を参照）。これらの経路と呼気中H2S濃度との間に直接的な関連は見られなかったが、同化型硫酸還元経路はH2濃度と相関があった（R = 0.244, P = 0.027）。

考察
本研究では、異なるIBS表現型に特徴的な呼気ガスプロファイルと関連する腸内マイクロタイプを同定した。特に、CH4呼気試験陽性のIBS-C被験者では、呼気CH4レベルが、メタン生成アーキオンM. smithiiの高い便レベルと関連していることが、qPCRおよび塩基配列決定の両方によって確認された。IBS-C/CH4+対象者は、IBS-D対象者と比較して明確な腸内マイクロタイプを有しており、M. smithiiを含む古細菌科メタノバクテリアのRAが高く、M. smithiiの合成栄養細菌として知られている特定のH2産生細菌科、RuminococcaceaeおよびChristensellaceaeのRAと相関していることが特徴であった。一方、IBS-D群では呼気中のH2およびH2S濃度が上昇することが特徴的であった。呼気中のH2S濃度は、IBS-D被験者のH2S産生菌であるFusobacterium属とDesulfovibrio属の未知種を含む腸内細菌科のRAと相関し、FusobacteriaceaeのRAはH2産生菌のEnterobacteriaceaeのRAと相関していた。また、微生物代謝経路予測解析の結果、IBS-C/CH4+被験者ではメタン生成に関連するKEGGモジュールが、IBS-D被験者ではH2S生成に関連するKEGGモジュールが濃縮していることが示された。これらの結果は、M. smithiiおよびFusobacteriumとDesulfovibrioを含むH2S生成細菌の増加が、それぞれIBS被験者の優勢な便秘と下痢のサブタイプに寄与している可能性を示唆するものであった。

IBSの病態生理はあまり理解されていないが、腸内細菌叢が中心的な役割を担っているようである。H2もCH4もヒトの細胞では生成されないため、呼気検査が重要な役割を担っている(23)。したがって、呼気中のこれらのガスのレベルが上昇すると、発酵菌とメタン生成菌による腸内コロニー形成がそれぞれ増加することを示している。これらのガスは、その後、血流に吸収され、呼気中に排泄される(24)。初期の呼気試験でIBSにおける腸内細菌の重要性が示唆され(25)、3つの重要な試験(26,27)により、IBS-Dに対する抗生物質治療が米国食品医薬品局から承認されるに至った。さらに、IBS-D患者では対照群と比較してH2陽性の割合が高く(4)、ベースラインのH2呼気検査が陽性の患者はリファキシミンに反応する可能性が高い(28)。これらのデータは、H2 SIBOがIBS-Dにおけるマイクロバイオームストーリーの一部であることを示唆している。しかし、H2レベルは下痢と直接的には相関しないため、H2産生菌以外の微生物もIBS-Dに関与している可能性が示唆される。

呼気検査におけるCH4は、現在ではSIBOではなくIMOに分類されているが(12)、2001年には早くもIBS-Cとの関連が指摘されている(29)。CH4は、主にM. smithii、Methanosphaera stadtmanae、Methanomassiliicoccus luminyensisなどのメタン生成性古細菌によって生成され(14)、腸壁の平滑筋収縮活動を増大させることにより腸の通過を遅くすると考えられている(15)。より最近の研究では、CH4 は筋肉に直接作用するのではなく、腸管ニューロンへの作用を通じて作用することが示唆され (30)、CH4 もガス伝達物質と考えるべきであると提案されました (30)。

この論文では、IBS-DとIBS-Cの両研究で使用するために、ラクツロースの呼気検査が選択された。グルコースは小腸の早期、十二指腸近位部で吸収されるため(31)、遠位小腸の過成長を見逃す可能性がある(5,32,33)。ラクチュロースは、一部の患者では通過が加速され大腸で発酵するため、偽陽性になることがあるが（5,12）、腸で遅れて吸収されるため、より多くの腸の部分のガスプロファイルを得ることができる。さらに、我々は以前、ラクチュロース水素呼気試験陽性（水素[H2]のベースラインからの上昇≥20 ppm）がSIBOの存在と相関することを検証し（34）、呼気試験でのH2のAUCがギ酸分解およびH2の形成などエネルギー代謝に関連する予測された微生物代謝経路と相関することを示し（34）、ラクチュロース呼気試験のH2レベルが腸内細菌群と相関していることを検証しています。

呼気試験結果と腸内細菌叢の間には明確な関係があり、それぞれがIBSの表現型の予測因子であることがわかった。呼気試験結果のCH4、M. smithiiによる腸内コロニー形成、およびIBS-Cの間に有意な相関が認められた。また、微生物代謝経路解析により、F420（メタン生成に重要な補酵素）の生合成を予測するKEGGモジュールと、IBS-C/CH4+被験者の呼気CH4との間に相関があることが判明した。興味深いことに、CH4とH2レベルの間にも逆相関があり、これは発酵菌と従属栄養メタン生成菌の合成関係と一致する可能性がある(14,35)。発酵菌は炭水化物 (呼気試験中に提供されたラクチュロースまたはグルコース基質を含む) を分解し、H2 と短鎖脂肪酸を産生する。しかし、H2があるレベルを超えて蓄積すると、細菌の増殖が阻害される。M. smithii などの水素栄養メタン菌は、H2 を使用して CH4 を生成するため (14,35) 、H2 レベルが低下し、CH4 レベルが上昇する。H2 の減少により、発酵菌の継続的な増殖が促進され、両方の従属栄養生物に利益がもたらされる。

もうひとつの興味深い発見は、IBS-C/CH4+の被験者は、IBS-Dよりも腸内細菌の多様性が高いということである。おそらく、局所的なH2濃度を下げることで、特定の合成栄養細菌集団が増殖し、その結果、多様性が高まったのだろう。メタン生成菌と最も多く共存する細菌属は、Christensenella、Bacteroides、Ruminococcus、およびDesulfovibrioである(35)。IBS-C/CH4+では、H2産生菌であるChristensenellaceaeとRuminococcaceaeのRAが高く、MethanobacteriaceaeのRAと相関していることがわかった。さらに、Ruaudら（36）は、Christensenella属がMethanobrevibacter属にH2を転移することを示し、これらの種の間に共栄関係があることを確認した。

また、IBS-D群ではIBS-C/CH4+群に比べて呼気中のH2Sが高く、Fusobacteriaceaeを含む特定のH2S産生菌の存在量が多いことが確認された。さらに、FusobacteriaceaeのRAが高いことは、H2産生菌であるEnterobacteriaceaeやPasteurellaceae、Pseudomonadaceae、Bacteroidaceae、Vibrionaceaeなどグラム陰性菌を含む他のファミリーのRAと相関し、ChristensenellaceaeやRuminococcaceaeなどMethanobacteriaceaeと関連する細菌ファミリーのRAは低いことが示された。これらの知見は、IBS-DとIBS-C/CH4+の被験者における微生物プロファイルが非常に異なることを示すものである。H2S産生菌は、消化管内のH2をめぐってメタン生成菌と競合し（37）、このことと矛盾しないように、Fusobacterium sppとM. smithiiのRAおよびFusobacterium sppとCH4に対するAUCの間に負の相関を見いだした。

また、微生物代謝経路解析の結果、IBS-D患者では、硫酸還元経路を含むH2S生成に関連するKEGGモジュールが濃縮されていることが確認された。これらの知見は、下痢と呼気中H2S濃度を関連づける我々の以前の知見(10)や、H2Sと潰瘍性大腸炎を含む下痢性疾患とを関連づける独立した研究(38)と一致している。これを裏付けるように、H2SはL型カルシウムチャネルの直接阻害を介して、おそらく平滑筋弛緩剤として作用することがラット研究で示されている(39)。また、IBS-Dでは、H2S産生菌を含むFusobacterium属と未知のDesulfovibrio属のRAが高く、FusobacteriumとH2SのAUCに相関があることが判明した。これらのデータは、FusobacteriumとDesulfovibrio属がIBS-DにおけるH2S産生を促進し、下痢の主症状に寄与している可能性を示唆している。

本研究にはいくつかの限界がある。IBS-C/CH4-被験者から便が得られなかったため、このグループの微生物組成を測定することはできなかったし、健常対照者もいなかった。IBS-C/CH4-被験者のCH4レベルはIBS-Dグループよりさらに低く、H2レベルは同程度であったことは興味深い。すべてのIBS-C被験者が呼気検査を受ける前に広範な対象・除外基準を満たす必要があったため、併存する疾患や薬剤の違いがIBS-C/CH4-対IBS-C/CH4+被験者の違いに寄与する可能性は低くなるが、食事や喫煙など他の潜在的交絡因子の情報は得られなかった。IBS-C/CH4-被験者のマイクロバイオーム構成を明らかにすること、そして彼らが実際に、異なる原因微生物を持つ異なるIBS-Cマイクロタイプを構成しているかどうかを明らかにすることは、今後の研究において重要であろう。さらに、今回の研究では、IBSの優勢な症状を引き起こすCH4、H2、H2Sおよび対応する微生物生産者の重要性に焦点を当てたが、その他の要因についてもさらなる調査が必要であろう。例えば、我々はIBS-D vs IBS-C/CH4+でSpirochaetaceaeのRAが増加していることを発見した。また、ある研究ではIBSの被験者でBrachyspiraの存在量が増加し、大腸好酸球数と関連していることを発見した(40)。この知見がどのようにガスダイナミクスに影響を与えるかは未解明である。

結論として、我々のデータは、IBS-CおよびIBS-Dの被験者の呼気ガスパターンに関連する異なる腸のマイクロタイプを同定した。IBS-Cの被験者は、呼気CH4が検出され、メタン生成アーキア（主にM. smithii）の高いコロニー形成と便秘の表現型に関連していることが特徴的であった。一方、IBS-D患者は、呼気H2が高く、呼気H2Sが高いことが特徴で、H2S産生菌（主にFusobacteriumとDesulfovibrio属）の有病率が高く、下痢表現型であることが関連する。さらに、IBS-C/CH4+ではRuminococcaceaeとChristensenellaceaeのRAが高く、IBS-DではEnterobacteriaceaeのRAが高く、これらの異なるマイクロタイプでは優勢なH2生成者が異なることがわかった。これらの異なるマイクロタイプの同定は、腸内細菌とIBSの異質な表現型との関係の理解を促進し、マイクロバイオーム標的治療の開発においてより高い精度を可能にすると思われる。

利益相反
論文の保証人 マーク・ピメンテル（Mark Pimentel）医学博士。

特定の著者の貢献 コンセプト立案。M.P., R.M. 形式的な分析。G.L.、M.J.V.M.、J.W.、A.R.、M.P. Methodology: 調査：M.J.V.M., G.L., W.M., S.W., M.P: M.J.V.M., G.L., G.P., M.L.P., G.M.B., M.S., S.A., D.C., S.W., C.C., M.R., A.H., A.F., B.C., N.P., A.R., M.P. Visualization（視覚化）: M.J.V.M.、G.L. 資金獲得。資金獲得：G.B.、R.M.、M.P. プロジェクト運営：R.M.、M.P: 監修：R.M.、M.P: W.M., S.W., C.C., M.R., R.M., M.P. Writing-original draft: 執筆-原案：M.J.V.M., G.L., G.B., W.M., J.W., M.P., 執筆-査読および編集：M.J.V.M., G.L., J.W., M.P: M.J.V.M.、G.L.、G.B.、W.M.、J.W.、A.R.、R.M.、M.P.

財政的支援。本研究は、The Monica Lester Charitable Trust（R.M. ）、The Elias, Genevieve, and Georgianna Atol Charitable Trust（R.M. ）、Synthetic Biologics, Inc（A.R. ）、 Bausch Health（M.P. ）およびThe National Philanthropic Trust（M.P. ）からの資金により一部支援されています。

競合する可能性のある利益。M.P.は、Bausch Health、Ferring Pharmaceuticals Inc.、Vivante Health Inc.のコンサルタントであり、M.P.は、Bausch Health、Ferring Pharmaceuticals Inc. M.P.はBausch Health社およびSynthetic Biologics社から助成金を受けている。R.M.は、Valeant Pharmaceuticalsから助成金支援を受けています。A.R.は、ボシュ・ヘルス社のコンサルタント/講演者であり、ボシュ・ヘルス社から助成金支援を受けています。さらに、シーダーズ・サイナイ・メディカル・センターは、ボシュ・ヘルス社およびジェメリ・バイオテック社とライセンス契約を締結しています。A.R.、M.P.、R.M.はGemelli Biotechに、M.P.はSynthetic Biologicsに資本参加している。他の著者は利益相反を報告しない。

データの入手 本研究で得られたデータセットは、National Center for Biotechnology Information (NCBI) BioProject Repository https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject BioProject PRJNA804225で利用可能である。

研究ハイライト

知っていること
過敏性腸症候群（IBS）には、下痢優位型（IBS-D）と便秘優位型（IBS-C）のサブタイプがある。
腸内細菌はIBSと関連しているが、特定の腸内細菌集団の役割は十分に理解されていない。
✓ ガスである水素（H2）、硫化水素（H2S）、メタン（CH4）は、腸内細菌によって産生される。
呼気試験における CH4 の増加は IBS-C と関連し、Methanobrevibacter smithii を含むメタン生成細菌の優勢と相関している。
H2 レベルは下痢と直接相関しないが、H2S は最近、下痢の表現型と相関している。
ここでの新情報
IBS-CおよびIBS-D被験者において、異なる腸のマイクロタイプが呼気ガスパターンに関連している。
CH4+のIBS-C被験者では、呼気CH4の増加が腸内細菌の多様性の増加と相関していた。
IBS-Dでは、呼気H2の増加は微生物多様性の低下と相関し、呼気H2Sの増加はFusobacteriumおよびDesulfovibrio種を含むH2S生産者の優位性の増加と相関していた。
IBS-Cでは、メタン生成菌の合成栄養細菌として知られるRuminococcaceaeとChristensenellaceaeがH2生成菌として優勢であった。
予測される微生物代謝経路分析により、IBS-C/CH4+被験者ではメタン生成に関連する経路が、IBS-D被験者ではH2S生成に関連する経路がそれぞれ豊富であることが示された。
謝辞
John and Geraldine Cusenza Family Foundation、Tull Family Foundation、Monica Lester Charitable Trust、 Elias, Genevieve, and Georgianna Atol Charitable Trust、National Philanthropic Trust、Synthetic Biologics, IncおよびBausch Healthの皆様にMAST研究プログラムへのご支援に感謝いたします。また、継続的な研究支援をしていただいているFrank LeeとJoel Levineに感謝したい。Chandrima Chatterjeeのグラフィックアートの協力にも感謝したい。

参考文献

1. Black CJ, Ford AC. 過敏性腸症候群の世界的な負担。傾向、予測、リスクファクター。Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2020;17:473-86.
   引用元：こちら｜Google Scholar

2. Ford AC, Sperber AD, Corsetti M, et al.過敏性腸症候群. Lancet 2020;396:1675-88.
   引用元：こちら｜Google Scholar

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