常在酵母および食物由来酵母による交差反応性T細胞の選択が、クローン病における細胞傷害性TH1細胞応答を促進する

2023年9月30日 18:44

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公開日：2023年9月25日
常在酵母および食物由来酵母による交差反応性T細胞の選択が、クローン病における細胞傷害性TH1細胞応答を促進する

https://www.nature.com/articles/s41591-023-02556-5

ガブリエラ・リオス・マルティーニ、エカテリーナ・ティホノヴァ、...ペトラ・バッハー著者一覧を見る
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指標詳細

概要
炎症性腸疾患では、腸内微生物に対するCD4+ T細胞の反応性の異常が粘膜炎症を引き起こすと考えられている。疾患に関連する微生物種と、それに対応する微生物特異的な病原性T細胞の表現型は、ほとんど不明のままである。本研究では、クローン病（CD）患者において、変化したCD4+ T細胞反応の直接的な活性化因子として、一般的な腸内常在菌および食品由来の酵母を同定した。CDにおける酵母反応性CD4+ T細胞は、細胞傷害性Tヘルパー細胞（TH1細胞）の表現型を示し、いくつかの常在菌および食物由来の真菌種に高度に交差反応するT細胞クローンの選択的拡大を示した。このことは、慢性腸疾患において、保存された真菌抗原と繰り返し遭遇することにより、交差反応性T細胞が選択されることを示している。我々の結果は、CD患者における異常なCD4+ T細胞反応性のドライバーとしての酵母の役割を強調し、腸内常在真菌と酵母の日常的な食事摂取の両方が、CD患者における炎症性CD4+ T細胞反応の慢性的な活性化に寄与している可能性を示唆している。

主な内容
炎症性腸疾患（IBD）は消化管の慢性炎症性疾患であり、その主な病型はCDと潰瘍性大腸炎（UC）である。これらの慢性疾患では、従来の治療や標的治療による免疫プロセスのコントロールが不十分であり、その結果、生涯にわたる罹患率、生活の質の大幅な低下、高額な医療費が生じる。腸内細菌叢のメンバーに対する異常な免疫反応、特にCD4+ T細胞応答は、IBDの原因あるいは推進因子と考えられている。しかし、マイクロバイオームは多様性に富んでいるため、IBDにおいて疾患を引き起こす微生物T細胞の標的や、それに対応する微生物特異的な病原性T細胞の表現型を同定することはほとんど不可能である。さらに、IBDは複雑であるため、病原性CD4+ T細胞の表現型や疾患関連抗原も患者サブグループによって異なる可能性がある。

TH17細胞は、微生物に対する恒常性免疫応答の中心的な調整役と考えられている。TH17細胞応答の異常は腸の炎症に関与すると考えられており、IBD患者の腸粘膜ではインターロイキン（IL）-17A産生細胞の増加が認められる1,2。しかし、IL-17の中和はCDでは臨床的に無効であり、一部の患者では増悪を引き起こしている3,4。このことから、IL-17AはCDあるいはこれらの患者のサブグループにおいて、病的というよりもむしろ保護的な役割を果たしている可能性が示唆される。この点で、TH17細胞の可塑性と、インターフェロン（IFN）-γや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）などの炎症性サイトカインを共発現する病原性TH17細胞サブセットの発達は、TH17細胞の保護的役割と病原的役割の重要な決定因子かもしれない5。さらに、特徴的なサイトカインであるIFN-γを発現するTH1細胞は、CD患者の腸内では一貫して増加しているが、UC患者では増加していない6。このように、疾患に関連する微生物抗原と、病原性微生物特異的CD4+ T細胞応答の特異的な特徴を解明することは、標的治療の開発につながる可能性がある。

これまでのほとんどの研究は、IBDにおける腸内細菌叢の変化を取り上げており、細菌特異的CD4+ T細胞応答を解析した研究はほとんどない7,8,9,10,11,12,13,14。細菌は消化管内でより豊富な生物であるが、真菌はヒトの腸内細菌叢に不可欠であるが、ほとんど無視されている。最近になってようやく、ヒトの健康や免疫病理における個々の真菌種の重要な役割が注目されるようになってきた15,16,17,18,19,20,21,22。特に、腸内常在菌であるカンジダ・アルビカンスは、恒常性TH17細胞応答15,23や腸管免疫グロブリン（Ig）A17,22、全身性IgG抗体16を誘導することにより、ヒト免疫系の主要な調節因子として同定されている。C.アルビカンスに特異的なTH17細胞が、IBD患者の腸の炎症に関与しているのか、あるいは治癒を促進するために炎症部位にリクルートされているのかは、まだ不明である。最も興味深いのは、CD患者の血清中に抗Saccharomyces cerevisiae抗体（ASCA）が高頻度に認められることが一貫して報告されていることである。これらのアッセイでは通常、S. cerevisiaeのマンナンが結合抗原として用いられていたが、さらなる研究により、ASCAはC. albicansを含む他の真菌のマンナンにも結合することが証明された24。ヒトの腸内には、C. albicansのほかにも、常在菌や食物由来の真菌が多数生息している25,26,27。これらの真菌種がヒトの免疫反応を積極的に調節できるかどうかは、まだ明らかにされていない。

本研究では、常在性および食物由来の酵母に対するCD4+ T細胞応答が、CD患者の血液および炎症組織で強く増加しているが、UC患者では増加していないことを示した。これらの酵母反応性CD4+ T細胞は、細胞傷害性TH1細胞エフェクター機能を示すが、C. albicans特異的TH17細胞応答はほとんど変化しない。細胞傷害性TH1細胞はクローン的に増殖し、いくつかの常在酵母および食物由来の酵母種に対して高い交差反応性を示すことから、異なる酵母に存在する保存抗原との慢性的な遭遇によって選択されることが示唆された。我々のデータは、CD患者におけるCD4+ T細胞反応性異常のドライバーとして、常在性酵母および食物由来酵母を同定し、異なる微生物種に存在する保存抗原との反復的な遭遇が、交差反応性酵母反応性CD4+ T細胞の拡大および慢性的活性化につながる可能性を示唆している。このことは、交差反応性T細胞の選択によって、適応免疫が微生物抗原の膨大な多様性に対処できるようになる一般的なメカニズムを明らかにするものである。

研究結果
CDDでは酵母に対するCD4+ T細胞応答が増加する
IBDにおける病原性T細胞反応を促進する微生物種を同定するために、IBD患者と健常人ドナーのヒト腸内細菌叢の一般的な細菌種および真菌種に対するCD4+ T細胞反応を解析した（人口統計学的データについては、拡張データ表1および2を参照）。末梢血単核球（PBMC）を全細菌および真菌溶解液で7時間生体外で刺激した。異なる刺激を受けた細胞はCD4抗体ベースの蛍光バーコードで標識され、異なる種に対するT細胞反応性の多重分析が可能となった（Extended Data Fig.）微生物反応性CD4+ T細胞は、CD154（CD40L）発現細胞の磁気濃縮（抗原反応性T細胞濃縮（ARTE））15,28に基づいて検出された（Extended Data 図1a,b）。微生物ライセートによるCD154+誘導の特異性は、ヒト白血球抗原（HLA）-DR抗体で抗原提示をブロックし（Extended Data 図2a-c）、特異的または無関係な抗原ライセートで拡大CD154+ T細胞を再刺激することで確認した（Extended Data 図2d）。

異なる微生物種に反応する循環CD45RA-メモリーT細胞（Tmem細胞）は、様々な頻度（範囲0.0001-0.76％）で検出された（図1a,b）。最も豊富な腸内常在菌20,29（図1c）であるC. albicansは、健常人では最も強い反応性を示したが、CD患者では反応性Tmem細胞の増加はわずかであった。これとは対照的に、他のあまり多くないカンジダ属、および食物に付随する酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（図1c）に対する反応性は、CD患者では劇的に上昇したが、UC患者では上昇しなかった（図1a,b）。系統的に離れた酵母Malassezia restrictaや分析した細菌種に対しては、有意差は認められなかった（図1a,b）。このことから、CD患者では腸内真菌叢に対する抗真菌免疫反応が変化していることがわかった。しかし、CD患者間で抗真菌T細胞の頻度に高い不均一性があることにも気づいた（図1a）。ASCAはCD患者の50〜60％の血清中に検出され、重症度のバイオマーカーとして用いられている30。我々のCD患者コホートをASCA免疫グロブリンIgG/IgAの状態によって層別化すると（図1d）、驚くべきことに、酵母反応性T細胞応答の増加がASCA-ではなくASCA+のCD患者で検出された（図1e）。対照的に、C. albicansに対する強いTmem細胞応答は、ASCAの状態とは無関係であった。

図1：CD患者における真菌微生物に対するCD4+ T細胞の反応性の変化。
図1
a,健常人ドナーとIBD患者における全微生物ライセートに対するCD154+CD45RA-CD4+Tmem細胞の反応頻度：健常人ドナー（HD、黒い点）、CD（赤い点）、UC（灰色の点）。nは、各群の下に指定された個々のドナーの数を示す。b,ARTEによる微生物反応性CD4+ T細胞のex vivo検出のドットプロット例。1×107個のPBMCからの磁気CD154+濃縮後の絶対細胞数を示す。c, CD患者（n = 38）の便サンプルのITS-seqと解析。この解析で同定された上位12種の真菌の相対的存在量を示す。d,健常人ドナーおよびIBD患者（HD, n = 46; CD, n = 88; UC, n = 73）における血清抗IgGおよびIgA ASCA濃度。血清の活性が20相対単位（RU）/mlを超えた場合を陽性とした。e,ASCAの状態による、CD患者における真菌反応性CD4+ T細胞の頻度。 f,ASCA+のCD患者（n = 5）の炎症腸組織と非炎症腸組織の生検から分離したCD4+ Tmem細胞の総数。細胞を複数のウェルに 200 個/ウェルで播種し、自己 APC 存在下で真菌溶解液で拡大・再刺激した。患者ごとの全ウェルの反応性CD154+細胞の平均頻度を示す。 g, 炎症生検からの拡大CD4+ Tmem細胞の再刺激のドットプロットの例。CD4+中のCD154+ TNF+細胞のパーセンテージを示す。a、d、e、f の各記号は個々のドナーを表し、a と e の横線は平均値を示す。箱ひげ図が c に示されており、中央の線は中央値、箱の限界は 25%（下限）と 75%（上限）の四分位数、ひげは最小値と最大値を表す。統計的差異は、aではKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定を用いて有意差のみを示し、eでは両側Mann-Whitney U検定を用いた。

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これらの結果は、CD15患者では常在菌であるC. albicansに対するTmem細胞反応が増大することに加えて、ASCA+患者のコホートでは、ヒトにおけるT細胞反応性の主要な誘導因子としてこれまで報告されていない、あまり代表的でない常在菌や食物由来の酵母種に対する予期せぬT細胞反応性が発現することを示している。

酵母反応性CD4+ T細胞は炎症粘膜に濃縮される
次に、酵母反応性T細胞が腸の炎症部位にも存在するかどうかを解析した。腸管生検から得られた細胞数はARTEで直接分析するには少なすぎるので、炎症および非炎症の腸管生検から全CD4+ T細胞をポリクローナルに拡大し、様々な真菌溶解物で再刺激した。酵母反応性T細胞は、ASCA+患者の炎症腸組織には選択的に存在したが、同じ人の非炎症組織には存在せず（図1f,g）、またASCA-CD患者の組織にも存在しなかった（Extended Data 図2e）。注目すべきことに、このことは、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）やプロバイオティック酵母であるサッカロマイセス・ブーラルディ（Saccharomyces boulardii）のような他のサッカロマイセス属にも当てはまり、C. アルビカンス（C. albicans）に対する反応性は低かった（図1f）。さらに、酵母に対するT細胞反応性の亢進が、疾患の状態や罹病期間に影響される可能性があるかどうかを検討した。イースト菌に反応するT細胞の頻度は、Harvey-Bradshaw indexおよびCD活性指数によって決定される罹病期間、薬物療法、活動性と有意な相関は認められなかった（Extended Data Fig.3）。

要約すると、これらのデータは、ASCA+のCD患者において、血液中および炎症組織中の腸内常在菌および食物由来の酵母に対するCD4+ T細胞の反応性が予想外に増加していることを明らかにした。健常人ではC. albicansが抗真菌T細胞反応を支配し、CD患者ではC. albicans反応性T細胞が依然として高率に存在するが、ASCA+であるCD患者におけるT細胞反応性の増加は、主に非アルビカンス性カンジダ属、および食物関連サッカロミセス属に向けられた。

酵母に反応したCD4+ T細胞はIFN-γ産生の増加を示した。
IBDにおける腸の炎症は、異常なTH17細胞応答や、IFN-γ1,2などの炎症性サイトカインを産生する病原性TH17細胞の発生と関連している。我々は最近、ヒトのマイコバイオームに見られる多くの菌種の中で、C. albicansがヒトにおける真菌反応性TH17細胞の主要なドライバーであることを示した15。しかし、IBD患者における真菌反応性IL-17A産生には、健常人ドナーと比較して有意差は認められなかった（図2a,b）。対照的に、C. albicansを含む異なる酵母種に反応するCD4+ T細胞は、CD患者においてIFN-γ産生の大量増加を示し（図2a,b）、この産生は、ASCA-患者と比較してASCA+患者で再び強く増強された（図2c）。頻度（図1）と同様に、IFN-γ産生の増加は、非アルビカンス型カンジダ属、特にS. cerevisiaeでより顕著であった。IFN-γとIL-17Aの共発現は低値にとどまり（図2a）、既存のTH17細胞をTH1細胞的に調節するというよりは、選択的なTH1細胞の拡大を示している。しかし、IL-17A+IFN-γ+共産生細胞の小集団（≤5%）は、カンジダ属やセレビシエ（S. cerevisiae）に対しても増加した（Extended Data 図4a,b）。酵母反応性T細胞のさらなる特徴づけにより、S. cerevisiaeやCandida tropicalisに反応して、IL-2やGM-CSFを含むいくつかの炎症性サイトカインの産生が亢進していることが明らかになったが、ASCA+のCD患者ではIL-10の産生が有意に減少していた（図2dおよびExtended Data図4c,d）。ここでも、M. restricta反応性T細胞に差は見られなかった（Extended Data Fig.4d）。

図2：CD患者では、酵母に対するTH1細胞応答は亢進しているが、TH17細胞応答は亢進していない。
図2
a,b、ARTE後の真菌反応性Tmem細胞の生体外サイトカイン産生。a、酵母反応性CD154+ T細胞のIL-17AおよびIFN-γ染色。c、CD患者における酵母反応性CD4+ T細胞のIL-17AおよびIFN-γ産生。d、健常人ドナーおよびIBD患者におけるS. cerevisiae反応性T細胞のサイトカイン産生。b、c、dの各記号は個々のドナーを表し、横線は平均値を示す。cでは両側Mann-Whitney U検定、dではKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定を用い、有意差のみを示した。

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これらのデータを総合すると、ASCA+のCD患者では、カンジダとサッカロマイセス酵母に対する炎症性TH1細胞応答が強く亢進し、IL-17A+IFN-γ+細胞の発達はわずかであることが示された。対照的に、C. albicans特異的T細胞内のIL-17A産生細胞の割合は保存され、疾患の影響をほとんど受けなかった。

酵母に反応するTH1細胞には細胞傷害性の特徴がある
酵母反応性T細胞の細胞構成とその機能的能力をより深く理解するために、ASCA+のCD患者3人と健常人ドナー3人から採取した、生体外でFACS精製したC. albicans、C. tropicalis、S. cerevisiae反応性CD154+Tmem細胞の単一細胞RNA配列決定（scRNA-seq）を行った（図3a）。合計で、15,012個のC. albicans-、21,623個のC. tropicalis-、および23,495個のS. cerevisiae-反応性CD4+ T細胞の塩基配列を決定した。これらの細胞の中で、Leiden教師なしクラスタリングに基づき、転写プロファイルが異なる8つのクラスターを同定した（図3b,c）。これらのクラスターの中で、細胞傷害性マーカー遺伝子（例えば、PRF1、GZMB、SLAMF7）を高レベルで発現することによって特徴づけられるTH1細胞集団（マーカー遺伝子IFNGとTBX21）を再び検出した（図3c）。実際、このクラスター内の細胞は、ウイルス感染や癌で生じる細胞傷害性CD4+ T細胞について以前に報告された遺伝子を多数発現していた32（Extended Data Fig.）さらにこれらの細胞は、慢性的なT細胞の活性化に関連する転写因子をコードするHOPXを高レベルで発現していた33,34。TH1細胞-細胞傷害性クラスターは、健常ドナーと比較してCD患者で強く増加していた（図3b,d）。また、C. tropicalisおよびS. cerevisiaeに反応したCD患者の細胞では、TH17細胞シグネチャー遺伝子（IL17AおよびIL22）が低レベルで発現しているが、TH1細胞マーカー遺伝子IFNGおよびTBX21、ならびにCSF2およびIL2も発現しており、エフェクタークラスターが増加していることに気づいた（図3c,d）。このクラスターにおける健常細胞と患者由来細胞の識別から、CD由来細胞はTH17細胞遺伝子をアップレギュレートせず、むしろこのクラスターを定義する他のいくつかの炎症性遺伝子（すなわち、IFNG、TBX21、CSF2、IL2）をアップレギュレートすることが明らかになった（Extended Data Fig.）これはIL-17Aタンパク質を発現する細胞の割合が低いことと一致しており（図2b）、さらにIL-17Aタンパク質を分泌するT細胞を直接ハッシュタグ抗体で標識することによっても確認された。その他の同定された遺伝子クラスターは、CD患者では対照群と比べて変化がないか、減少しているか、あるいは一般的に細胞のわずかな割合（≤5%）しか構成していなかった（図3d）。

図3: CD患者の酵母反応性CD4+細胞は細胞傷害性表現型を持つ。
図3
a, 実験デザインの概要。ASCA+であった3人の健康なドナーとCD患者のそれぞれのPBMCを、C. albicans、C. tropicalis、S. cerevisiaeの溶解物で刺激した。反応性CD154+ Tmem細胞をFACSで精製し（ソーティングについてはMethodsを参照）、scRNA-seqおよびTCR-seqで解析した。 c, 各T細胞クラスターにおける選択したマーカー遺伝子の発現をドットプロットで可視化。色は正規化した平均発現レベルを表し、大きさはそれぞれの遺伝子を発現する細胞の割合を示す（Tcm細胞、セントラルメモリー細胞；TTM細胞、トランジショナルメモリー細胞；TEM細胞、エフェクターメモリー細胞；TFH細胞、濾胞ヘルパー細胞；TFR細胞、濾胞レギュラトリー細胞）。 d, 個々のドナーの各T細胞クラスター内の細胞の割合（健常人、n=3；CD、n=3）。f,eで同定された軌跡の枝に沿ったクラスター定義遺伝子の遺伝子発現を描いたヒートマップ。

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TH17細胞から病原性IL-17A+IFN-γ+共産生細胞への発達、あるいはTH17細胞からTH1細胞への完全な転換が、慢性炎症において起こることが示唆されている5,34。細胞内サイトカイン染色に基づくと、IFN-γとIL-17Aサイトカインを共発現している細胞はわずかな割合しか観察されなかった（図2a）。酵母反応性細胞傷害性TH1細胞（TH1-CTL）の発生起源をさらに解析するため、次に遺伝子発現の類似性に応じて細胞の擬似的な時間的順序付けを明らかにする擬似時間解析を行った。Monocleアルゴリズム35 を用いると、中心記憶細胞（TCM細胞）からエフェクター／TH17細胞クラスター、あるいはTH1-CTL 系統の2つの主要な軌跡が同定された（図3e）。このことは、TH1-CTLが主にTH17細胞前駆体から転換するのではないという結論を支持している。IFNGとTBX21の発現が、TH1-CTL分枝に沿った細胞傷害性マーカー遺伝子の発現に先行していたことは興味深く、TH1細胞における細胞傷害性エフェクター機能の漸進的な獲得が、時間の経過とともに進行していることを示唆している（図3f）。

これらのデータを総合すると、定常状態ではなく、CDにおいて酵母抗原に暴露されると、細胞傷害性シグネチャーを持つ酵母反応性TH1細胞が強く増殖することが明らかになった。

TH1-CTLはIECに対する殺傷能力を持つ
我々は、CD患者の酵母反応性CD4+ TH1細胞による細胞傷害性マーカーのタンパク質発現をフローサイトメトリーで確認した（図4a,b）。ここでも、TH1-CTLはASCA+のCD患者には存在したが、ASCA-の患者には存在しなかった（図4cおよびExtended Data図5f,g）。酵母反応性TH1-CTLの殺傷能力をさらに調べるため、in vitro細胞傷害性アッセイを行った（図4d）。対照抗原として用いたS. cerevisiaeまたはM. restrictaに反応するCD154+ Tmem細胞を、健常人とASCA+のCD患者から生体外で分離し、同種の初代腸管上皮細胞（IEC）と異なる比率で共培養した。T細胞とIECはStaphylococcus enterotoxin B (SEB)の添加によって架橋され、IECの殺傷力はリアルタイム細胞分析によって測定された。細胞傷害性シグネチャーと一致して、ASCA+であるCD患者由来のS. cerevisiae反応性CD4+ T細胞は、健常人ドナー由来ではなく、用量依存的にIECを溶解した。M. restricta反応性CD4+ T細胞を用いた場合には、細胞毒性は観察されなかった（図4e,f）。

図4：CD患者由来の酵母応答性TH1-CTLは、IECに対して強力な殺傷能力を有する。
図4
a, S. cerevisiae反応性CD154+ Tmem細胞の細胞傷害性マーカー（GZMB、PRF1、CD319、CCL4）とIFN-γの生体外染色。c,CD患者のASCA状態（ASCA-, n = 8; ASCA+, n = 14）によるS.cerevisiae反応性T細胞における細胞傷害性マーカーの発現 d,電気インピーダンス測定による細胞傷害性のリアルタイムモニタリング。真菌反応性CD154+ Tmem細胞を、T細胞対標的細胞比（T:IECs）でプライマリーIECとインキュベートし、細胞インデックスの変化によりIECの殺傷をモニターした。灰色の線： T細胞を添加していないIEC；青線：青線：洗剤Triton X-100添加後のIEC（最大溶解の陽性対照）；黒線： HD患者のT細胞；赤線： e, T細胞とIECの比率を変えたM. restricta反応性Tmem細胞とS. cerevisiae反応性Tmem細胞の共培養35時間後のT細胞介在性殺傷のまとめ（健常人、n = 3; ASCA+ CD、n = 3）。f, T細胞対IEC比1:4におけるT細胞介在性殺傷の統計的要約（HD S. cerevisiae, n = 5; M. restricta, n = 6; CD S. cerevisiae, n = 6, M. restricta n = 5）。b、c、e、fの各記号は1人のドナーを表す。統計的差異は、cでは両側Mann-Whitney U検定、fではKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定で求めた。CD患者由来のS. cerevisiae反応性細胞との統計的差異を示す。

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これらのデータから、ASCA+であるCD患者の酵母応答性TH1細胞は、in vitroでIECを強力に殺傷する細胞傷害性エフェクター機能を有することが確認された。IECは非従来型の抗原提示細胞（APC）として機能し、腸内微生物の抗原を提示することが報告されている36。したがって、酵母反応性TH1-CTLがin vivoでIECの殺傷を促進し、CD患者における腸管バリアの悪化に関与している可能性を推測することは魅力的であり、さらなる調査が必要である。

IBD-FDRにおける酵母反応性CD4+ T細胞の変化
これまでのところ、酵母反応性TH1-CTLの発達が疾患の結果なのか、あるいは最終的に疾患の発症や増悪に関与するのかは不明である。疾患前状態ですでに酵母応答性T細胞が変化している可能性を検討するため、IBD患者の第一度近親者（IBD-FDR）のコホートを解析した37,38。その結果、IBD-FDRでは、FDRでない対照群と比較して、C. tropicalisおよびS. cerevisiae反応性T細胞の頻度増加もIL-17A産生増加も検出されなかった（Extended Data Fig.）しかし、IBD-FDRのC. tropicalis-およびS. cerevisiae-反応性T細胞は、CD患者（図2）よりも顕著ではなかったものの、IFN-γ産生が有意に増加した（Extended Data図6c,d）のに対し、対照として用いた大腸菌反応性細胞は変化しなかった（Extended Data図6c）。IFN-γとは対照的に、細胞傷害性マーカーは非FDR対照と比較して有意に増加しなかった（Extended Data図6e）。しかし、個々のIBD-FDRでは、C. tropicalisおよび/またはS. cerevisiae反応性T細胞上のCD319とPRF1のレベルは明らかに上昇したが、GZMBとCCL4は変化しなかった(Extended Data Fig. 6f)。ASCA抗体は、CD39,40の臨床診断の数年前に検出される予測バイオマーカーとして報告されている。限られた数のIBD-FDRの中で、我々はASCA IgGおよびIgAの血清中濃度が上昇している個体を同定した（拡張データ図6g）。CD患者と同様に、細胞傷害性マーカーの発現増加は、IBD-FDRにおけるASCA抗体価の上昇と関連していた（Extended Data Fig.）

まとめると、これらのデータは、酵母応答性T細胞のTH1細胞表現型への偏向がIBD-FDRにおいて、つまりIBDの臨床的発症前にすでに検出可能であることを示している。さらに、細胞傷害性エフェクター機能のさらなる獲得は、IBD-FDRで報告されている腸管透過性の亢進41により、酵母抗原との相互作用がより強く、あるいは持続的に起こる結果、徐々に進展する可能性が示唆される。

クローン拡大したTH1-CTLは複数の酵母種に交差反応する
これまでのデータから、ASCA+であるCD患者では、慢性的な抗原刺激がTH1-CTLの発達を促進する可能性が示唆される。多種多様な常在菌や食餌性真菌への慢性的な曝露が、酵母反応性T細胞のクローン構成にどのような影響を及ぼすかをより良く理解するために、我々はscRNA-seqデータセットからT細胞受容体（TCR）シーケンスデータを統合した。実際、CD患者由来のTH1-CTLは、個々のクローン型の大幅な拡大を示し（図5a）、さらに集団の均等性を示すジニ係数が高いことが証明された（図5b）。驚くべきことに、CD患者のS. cerevisiae刺激TCRの多くは、C. tropicalis刺激細胞やC. albicans刺激細胞と共有されていたが、異なる真菌に対する共有TCRは健常人ドナーではそれほど多くなかった（図5c,d）。実際、強く拡大したクローン型のほとんどは、2つまたは3つすべての真菌に反応するTCRレパートリー間で共有されていた（図5d）。TCRの交差反応性は、TH1-CTLクラスター内で最も顕著であり、CD患者のS. cerevisiaeに反応するTCR-β配列の70％以上が、C. tropicalisおよびC. albicans刺激細胞にも認められた（図5e）。このことは、異なる酵母種に存在する保存抗原に持続的あるいは交互に暴露されることで、交差反応性クローン型の選択的拡大が促進される可能性を示唆している。特に、これらの交差反応性クローン型は、単一種特異性を持つクローン型ではなく、細胞傷害性マーカー遺伝子、およびそれぞれ最近の活性化と慢性マーカーをコードするHLA-DRとHOPXの高発現を示した（図5f）。

図5：クローン拡大したTH1-CTLは、複数の酵母種に対して交差反応性を示す。
図5
a、TCR-βクローン型の大きさをscRNA-seqデータセットのUMAP可視化と重ね合わせた。 b、TCR-β配列の分布を描いた、異なるT細胞クラスターに応じたジニ係数（0は完全な平等、すなわちすべてのクローンが同じ割合を持つ、1は完全な不平等、すなわち集団が単一のクローンに支配されている）。サンプルによって選別された全細胞の分布が不均一であることを考慮し、真菌抗原ごとに各個人から無作為に500細胞を採取したダウンサンプリングデータセットを使用した（HD、n = 3; CD、n = 3）。 c, 健常人ドナーとCD患者において、2つまたは3つ全ての酵母に反応するT細胞の数。d,抗真菌TCRレパートリーのクローンネットワーク。各ドットはTCR-β配列によって定義されるクローン型を示す。連結線は抗真菌レパートリー間で共有されているTCR-β配列を示す。e,異なる酵母種で刺激したサンプルで見つかった同一のTCR-β配列の割合。 f,TCR特異性に応じて選択したマーカー遺伝子の発現。色は正規化した平均発現レベルを表し、大きさはそれぞれの遺伝子を発現している細胞の割合を示す。 g. 同所性TCR置換を用いて初代T細胞に挿入された単一細胞データセットからの交差反応性TCR。h,TCR遺伝子導入T細胞（n = 7）を異なる真菌種で再刺激した結果。 i,個々のTCR遺伝子導入T細胞（n = 7）の交差反応性をS. j, S. cerevisiae反応性、細胞傷害性、CD154+CD319+の単細胞クローン（n = 10）をex vivoで選別し、異なる真菌種で拡大・再刺激したもの。交差反応性のパーセンテージは、S. cerevisiaeでの刺激との関係で示した。bの各記号は1人のドナー、hは1つのTCR遺伝子導入T細胞株、jは1つのT細胞クローンを表す。bとjには、四分位数と範囲を示した切り詰めたバイオリンプロットを示した。

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個々のTCRのT細胞交差反応性をさらに確認するために、単一細胞データセットから最も拡大した交差反応性TH1-CTL TCRを、clustered regularly interspaced palindromic repeats（CRISPR）-Cas942,43を用いて初代T細胞で再発現させた（Extended Data図7a,b）。拡大したTCRトランスジェニックT細胞を、自己抗原提示細胞（APC）の存在下で、異なる酵母のパネルで再チャレンジした。図5g-iに示すように、いくつかの酵母種に対するトランスジェニックT細胞の高い交差反応性が観察され、個々のTCRの反応性は、TCR-seqで最初に観察された交差反応性パターンをさらに反映していた（図5i）。いくつかの酵母種に対する高い交差反応性は、ex vivoで選別・拡大された、S. cerevisiae反応性、細胞傷害性、CD154+CD319+単細胞クローンでも確認された（図5j）。最後に、ASCA+患者における交差反応性細胞の選択的濃縮を検証するために、CD患者から得たバルクのC. albicans-、C. tropicalis-、S. cerevisiae-反応性CD154+ Tmem細胞を拡大した。ASCA+ではなくASCA-であるCD患者由来の酵母反応性T細胞は、様々な酵母種に高度に交差反応し（Extended Data Fig. 細胞傷害性CD4+ T細胞は、これまでのところ、主に持続性ウイルス感染の文脈で報告されている32。しかしながら、TCRトランスジェニックT細胞はいずれも一般的なウイルス抗原に反応せず、また酵母反応性T細胞の頻度において、サイトメガロウイルス（CMV）陽性のCD患者とCMV陰性の患者との間に差は認められなかった（Extended Data Fig.）

これらのデータを総合すると、様々な酵母種を交差認識するCD4+ TH1-CTLが、ASCA+のCD患者で強く増殖していることがわかる。このように、異なる酵母種に存在する保存抗原との反復的な遭遇は、交差反応性クローンの選択的な拡大をもたらし、CD患者における慢性的な刺激により細胞傷害性細胞へと進行する可能性がある。

CD4＋TH1-CTLは食品由来の酵母抗原に反応する
CD4+TH1-CTLによる様々な酵母種の実質的な交差認識という所見から、我々はこれらの細胞の更なる抗原性トリガーとなり得る可能性を調査することにした。いくつかの酵母種は広く存在する生物であり、食事とともに頻繁に摂取されることから、我々は、食品由来の酵母種もCD患者由来のCD4+ TH1-CTLの活性化を促進する可能性があると仮定した。チーズには、様々なカンジダ、サッカロミセス、ペニシリウム、その他いくつかの真菌類を含む生きた微生物が含まれている44,45。食品由来の真菌種がCD患者においてCD4+ TH1-CTLを活性化しうるかどうかを分析するため、一般的なチーズの熱不活性化溶解液でPBMCを刺激し、ARTEによって反応性T細胞を分析した。健康なドナーではなく、ASCA+であるCD患者では、特にカビで熟成させたチーズのカマンベールとゴルゴンゾーラに対する反応性が明らかに増加した（図6a,b）。これまでの結果と同様に、CD患者のこれらのチーズで活性化されたT細胞は、IFN-γの産生量が増加し（図6b）、細胞傷害性マーカーの発現レベルが上昇した（図6c）。チーズ溶解液で観察されたT細胞の反応性が、酵母に対するT細胞の交差反応性の結果であることを確認するため、ゴルゴンゾーラで活性化したCD154+ Tmem細胞を拡大し、異なる微生物種で再刺激した。実際、ASCA+のCD患者から得たT細胞株は、いくつかの酵母種に対して最大100％の交差反応性を示したが、細菌や乳タンパク質に対しては示さなかった（図6d,e）。このことは、ゴルゴンゾーラの溶解液に対するTCRトランスジェニック細胞の反応性（図6f,g）、および酵母Kluyveromyces lactis（旧Saccharomyces lactis）に対する反応性によってさらに確認された。一方、チーズにも頻繁に含まれる系統的に遠いPenicillium属やGeotrichum属のカビに対する反応性は低かった44,45。

図6：食品由来の酵母は、CD患者において交差反応性TH1-CTLを活性化する可能性がある。
図6
a-c、健康なドナーとCD患者のPBMCを異なる種類のチーズの溶解液で刺激し、反応性CD4+ T細胞をARTEで分析した。1×107個のPBMCからの磁気CD154+濃縮後の絶対細胞数を示す。 b, 異なるチーズタイプ（HD, n = 5; ASCA+ CD, n = 5）に反応したCD154+ Tmem細胞頻度とIFN-γ産生。c, 異なるチーズタイプ（HD, n = 5; ASCA+ CD, n = 5）に反応した反応性CD154+ Tmem細胞のex vivo細胞傷害性マーカー発現。 d, ASCA+であるCD患者からの反応性CD154+ Tmem細胞を、ゴルゴンゾーラ溶解液で刺激した後に分離し、拡大した。e,異なる微生物抗原およびコントロール抗原（Kluyveromyces lactis, Penicllium camemberti, P. roqueforti, Geotrichum candidum, n = 2; 他の全ての抗原, n = 6）に対するASCA+であるCD患者からの拡大ゴルゴンゾーラ活性化細胞の交差反応性。f,g,ゴルゴンゾーラまたはチーズによく含まれる異なる真菌種の溶解液で再刺激したTCRトランスジェニックT細胞。 f,1つのTCR-α/βコンストラクトについて、反応性CD154+TNF+細胞のパーセンテージを示したドットプロットの例。b,c,eの各記号は1人のドナーを表し、gでは1つのTCRトランスジェニックT細胞株を表す。b,c,eには四分位数と範囲を示した切り捨てバイオリンプロットを、gには平均値とs.e.m.を示した。

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要約すると、我々のデータは、腸内常在菌に加えて、食物由来の酵母もCD患者の細胞傷害性TH1-CTLを活性化する可能性があることを明らかにした。本研究で同定されたような、真菌叢の異なるメンバーによる交差反応性CD4+ T細胞の選択的拡大は、常在菌や食物由来の異なる真菌によって持続的に活性化された場合、CDの慢性化や治療抵抗性の一因となる可能性がある。

考察
腸内微生物に対する不適切な免疫応答が、CDの病態生理に大きく関与していることが示唆されている。IBDの病態形成にT細胞が関与していることを支持する多くのデータがあるにもかかわらず、関連する腸管抗原とそれに対応する抗原特異的T細胞のエフェクター機能は、依然として不明な点が多い。本研究では、一般的な腸内常在菌および食品由来の酵母が、CDD患者における炎症性CD4+ T細胞応答の異常の一因であるという直接的証拠を提示する。

我々は、CD患者において、異なる酵母種に対するCD4＋T細胞応答が大量に増加していることを観察した。ヒトの適応免疫の強力なモジュレーターとして同定されているC. albicansに加えて15,16,17,22,46、非アルビカンスのカンジダや食物に関連するサッカロマイセス属に対するT細胞応答の変化は、CDにおける炎症性免疫反応にさらなる層を加えている。病原性TH17細胞の発達はIBD病態の一因であると議論されており、最近、ヒトにおいてC. albicansが真菌誘導性恒常性TH17細胞応答の主要なドライバーであることが示された15。本研究では、C. albicansに対するTH17細胞の割合は、CD患者では驚くほど影響を受けていないが、非アルビカンスのカンジダ属や異なるサッカロマイセス酵母にも強く反応する細胞傷害性TH1細胞が発達していることを観察した。どの真菌種がTH1反応の最初の引き金になるのか、またどの真菌が単に交差反応性TCRの選択を促すだけなのかは、まだ解明されていない。最近、乳製品によく含まれる酵母であるDebaryomyces hanseniiが、CD18患者の炎症創傷に特異的に濃縮されていることが報告され、食品由来の真菌もIBD腸内環境の変化に適応している可能性が示唆された。このように、腸内常在菌と食物由来の真菌の両方が、今回観察されたTH1細胞応答の初期プライミングに関与している可能性がある。いったん確立されたTH1細胞は、複数の真菌種によって増殖され、高度に選択された交差反応性TCRレパートリーの進化につながる可能性がある。

C.アルビカンスに対するTH17細胞反応に対するIBDの影響は限定的であることから、ほとんどの人に存在する恒常性の高いTH17細胞反応は、摂動に対して比較的不活性であることが示唆される15。C.アルビカンスに対するTH17細胞反応がIBDの影響を受けにくい理由はまだ不明である。真菌に反応するTH1細胞とTH17細胞が、CDと健常人では異なる抗原を認識している可能性がある。実際、酵母に反応するTH1-CTLでは、TH17細胞と比較して高いTCR交差反応性が検出された。このことは、TH17細胞ではなくTH1-CTLが、多くの酵母種に共通に存在する保存エピトープを指向し、それによって抗原量も増加していることを示している。あるいは、慢性炎症における継続的な抗原刺激により、TH17細胞からTH1細胞への転換が起こる可能性もある5,34。しかし、酵母反応性TH17およびTH1細胞サイトカインは、主に異なる細胞集団によって産生され、IL-17A+FN-γ+細胞の小さな集団のみが、非アルビカンス型カンジダ属およびサッカロミセス属に対して発現した。このことから、TH17細胞とTH-CTLは、おそらく別々の抗原群によって駆動される2つの独立した集団であることが示唆される。今後の研究では、TH17細胞や交差反応性TH-CTLに認識される特定の真菌タンパク質やペプチドを定義することが重要であり、これにより抗原特異的な標的治療法の開発が可能になるかもしれない。交差認識される抗原は、異なる酵母種に存在する全く同じか類似のエピトープ、あるいは構造的に類似したエピトープを形成する関連性のない配列から構成される可能性があり、さらにそれはTCRによって異なる可能性もある。

全体として、我々のデータは、最初のTH1細胞のプライミングの後、複数の真菌種に存在する保存抗原に繰り返し暴露されることで、高度に交差反応性のTCRレパートリーが選択され、おそらく慢性的なT細胞の活性化の結果として、細胞傷害性エフェクター機能の獲得を伴うというモデルを示唆している。このことは、個々のIBD-FDRの酵母応答性T細胞において、IFN-γ産生の増加と特定の細胞傷害性マーカーが上昇しているが、細胞傷害性表現型全体が上昇しているわけではないという観察結果からも支持される。さらに、CD患者から得られた最も拡大した交差反応性クローン型は、慢性活性化マーカー遺伝子HOPX33,34と同様に、細胞傷害性マーカーの遺伝子発現が最も高いことを示した。健常人も腸内常在酵母を保有しており、食事からS. cerevisiaeを頻繁に摂取していることから、CD患者において観察されたT細胞反応性の変化や、個々のIBD-FDRにおける初期の変化は、上皮バリア機能障害に起因する、酵母抗原とのより強い、あるいは持続的な相互作用を反映している可能性がある。T細胞介在性細胞傷害はIECの死に寄与すると報告されており47,48、マウスではTH1免疫の増悪が上皮バリアの欠損と粘膜真菌感染を促進した49。したがって、酵母応答性TH-CTLは、腸管バリアの破壊を通じて、疾患の発症および/または増悪に直接関与している可能性があると推測したくなる。この点から、交差反応性酵母応答性TCRは、抗原特異的制御性T細胞（Treg細胞）療法やT細胞枯渇戦略による特異的治療介入を開発するための格好の標的となりうる。

酵母反応性T細胞は、ASCA+のCD患者では選択的に変化したが、ASCA-やUC患者では変化しなかった。したがって、酵母反応性TH-CTLまたはそのTH1前駆細胞が、ASCA形成にB細胞の助けを借りている可能性がある。CDにおけるASCAの存在は30年以上前に報告されており50,51、ASCAは疾患の重症度を示すバイオマーカー30として、またIBDを発症するリスクのある人の予後マーカーとして用いられている40。このような強い関連性があるにもかかわらず、直接的な病原性との関連性については疑問視されており、CD患者における酵母応答性T細胞の詳細な解析は今のところ行われていない。パン酵母としても知られるS. cerevisiaeは、栄養摂取によって毎日摂取されるため、一般にヒトにおける病原性は低いと考えられている。その代わりに、C. albicansは免疫原性が高いため、ASCAがC. albicansのマンナンに結合する結果、誘導種になると推測されている24。本研究で示されたデータを踏まえると、ASCA形成に関与する真菌種とそのメカニズム、特にTH1-CTLの寄与をさらに明らかにすることが重要であろう。

我々のデータは、CD患者を特定の治療法に選択するための概念にもつながるかもしれない。例えば、ヤヌスキナーゼの治療的阻害は、サイトカインの中でも特にIFN-γの放出を標的としており、ASCA+のCD患者においてより高い効果を示す可能性がある。さらなる研究では、酵母抗原を選択的に除去する栄養介入の役割を検討する予定であり、もし有効であれば、他の抗炎症療法や寛解維持療法の有効性をサポートする魅力的な治療戦略となるであろう。抗真菌療法やイースト菌除去食は、ASCA+のCD患者を対象とした将来の臨床試験で分析されるであろう。

我々の研究にはいくつかの限界もある。我々はCDにおける酵母反応性CD4+T細胞の関与を示す強力な相関的証拠を提供したが、疾患の病態生理への直接的な寄与を明らかにするためにはさらなる研究が必要である。この方向での我々の最初の試みは、試験管内でこれらの細胞が腸管上皮を直接死滅させる能力について、いくつかの勇気づけられる結果と証拠を提供した。しかし、腸内酵母や酵母応答性TH1-CTLを治療標的とすることが臨床的に有効かどうかについては、さらなる研究が必要である。CD患者におけるこれらの高度交差反応性T細胞は複数の酵母種に反応するが、酵母反応性T細胞反応の変化の最初のトリガーが単一種なのか複数種なのかを明らかにするためには、今後の研究が必要である。本研究では、限られた数の細菌種と真菌種のみを分析したため、菌株の変異によって誘発される潜在的な差異については言及しなかった。さらに、交差反応性酵母反応性集団の原動力となるタンパク質やペプチドについては、まだ明らかにされていない。CD患者の特定のサブグループが酵母に対するCD4+ T細胞応答とASCAを変化させるのに対し、他のIBD患者は変化しないという発見は、このサブグループ内に宿主と微生物の基本的に異なる相互作用が存在することを強調している。このことは、根底にあるメカニズムに光を当て、CD患者のこのサブグループに特有の特徴を明らかにするための詳細な研究の必要性を強調している。

方法
献血者
健常ドナーの末梢EDTA血液サンプルは、ドイツ、UKSHキールの輸血医学研究所の血液バンクドナー、または社内ボランティアから得た（倫理委員会CAU Kiel D578/18, D427/19）。IBD患者からの末梢EDTA血液サンプルは、UKSH KielのDepartment of Internal Medicine I、Comprehensive Center for Inflammation Medicine、Gastroenterology-Hepatology Center Kielから入手した（倫理委員会CAU Kiel D427/19）。IBD-FDRは、キール大学/キール大学病院SHのpopgen Biobankによって構築された、IBD患者とその家族からなるドイツ全体のコホートであるKiel IBD Family Cohort Study（ethics committee CAU Kiel A117/13）から募集した。研究参加者に関する人口統計学的データは、Extended Data Table 1および2に記載されている。CMV血清ステータスは、抗CMV IgG ELISAを用いて製造元の説明書に従って決定した（Serion Diagnostics）。すべての献血者は、参加前に書面によるインフォームド・コンセントを行った。

腸管生検
炎症および非炎症腸組織からの生検は、大腸内視鏡検査を受けたCD患者から採取した（倫理委員会CAU Kiel、ファイル：B 231/89-1/13）。すべての患者は、参加前に書面によるインフォームド・コンセントを行った。

小腸IEC
初代小型IECはPELOBiotech社から購入した。細胞はゼラチンベースのコーティング液（Cell Biologics）で前処理したT25フラスコ中、上皮細胞培地（Cell Biologics）で培養した。膨張中、培地は補充され、細胞は必要に応じて分割された。

ASCAの定量
血清ASCAは、製造元の説明書（Euroimmun）に従ってELISAで測定した。つまり、ASCA IgA/IgG ELISAキットには3種類のキャリブレーション血清、陽性対照、陰性対照が含まれている。血清はプローブバッファーで1:101に希釈され、プレコートマイクロタイタープレート上で室温で30分間インキュベートされた。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgAまたはIgGを30分間添加し、プレートを再度洗浄した。基質溶液を加え、15分後に発色反応を停止した。620nmを基準波長とし、450nmで光学濃度を測定した。ASCAの状態は、3つの検量線血清を用いて標準曲線を作成した後に算出した。ASCAの定量は二重に行い、平均値を用いた。活性が20相対単位ml-1以上の血清を陽性とした。IgAまたはIgGの単独陽性検体と二重陽性検体の両方をASCA+ドナーと分類した。

ITS配列決定
ITS（内部転写スペーサー）アンプリコンはInvitrogen AccuPrime PCR試薬を用いて35サイクルで作成した。これらのアンプリコンを2回目のPCR反応に用い、Illumina Nextera XT v.2（Illumina）のバーコード付きプライマーを適用して、既述のように各サンプルを一意にインデックス化した20。すべてのライブラリーは、ペアエンドフローセルを調製する前に、DNA 1000 Bioanalyzer（Agilent）とQubit（Life Technologies）を用いて品質管理を行い、ライブラリー構築の検証と定量を行った。シーケンスバイアスを最小化するため、サンプルはフローセル間でランダムに分割された。クローンブリッジ増幅（Illumina）はcBot（Illumina）を用いて行い、2×250塩基対（bp）シーケンスバイシンセシスはIllumina MiSeqプラットフォームを用いて行った。

微生物抗原ライセートの作製
細菌および真菌のライセートは、以前に記載された方法15,52に従って作製した。簡単に言えば、細菌E. coli（DSM 8698）、Faecalibacterium prausnitzii（DSM 17677）、Bacteroides fragilis（American Type Culture Collection（ATCC） 25285）、Clostridium leptum（DSM 753）、Prevotella copri（DSM 18205）、Akkermansia muciniphila（DSM 22959）およびKlebsiella pneumoniae（臨床分離株）を固体培地（Columbia Blood Agar、Biomérieux）上で培養し、17. 4mlの蒸留水を加え、0.4mlのNaOH（1M）、0.2mlのHCl（2M）、2mlの10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.5を加えて溶解した。細胞の溶解は、顕微鏡分析と溶解液の陰性培養によって確認した。加熱死菌Lactobacillus rhamnosusはInvivogen社から購入した。

C. albicansの凍結乾燥エキス（SN-1 6946）はGreer Laboratoriesから購入した。S. cerevisiae (ATCC 9763)、S. boulardii (Perenterol)、S. pastorianus (DSM 6580)、Cyberlindnera jadinii (CBS 1600)、C. dubliniensis (CD36)、C. tropicalis (DSM 11953)。tropicalis (DSM 11953)、Candida glabrata (ATCC 2001)、C. parapsilosis (GA1)、C. orthopsilosis (ATCC 96141)、Debaryomyces hansenii (JMRC STI25082)、K. lactis（旧S. lactis; STH00086）およびG. candidum（SF012383）を、まず酵母-ペプトン-デキストロース（YPD）寒天プレート（ペプトン10 g l-1、酵母エキス5 g l-1、デキストロース20 g l-1および寒天15 g l-1）上で培養した。タンパク質抽出のために、S. pastorianusとC. jadiniiの液体培養を、合成定義（SD）培地（2％グルコース、6. 7 g l-1、ヒスチジン 20 mg l-1、ロイシン 120 mg l-1、リジン 60 mg l-1、アルギニン 20 mg l-1、トリプトファン 20 mg l-1、チロシン 20 mg l-1、スレオニン 40 mg l-1、メチオニン 20 mg l-1、フェニルアラニン 50 mg l-1、ウラシル 20 mg l-1、アデニン 20 mg l-1）、K. lactis、G. candidumで培養した。lactisおよびG. candidumをSD+CSM（2％グルコース、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース6.7 g l-1、1×完全サプリメント混合物（CSM、Formedium））、D. hanseniiを液体Sabouraud 2％（w/v）グルコース-ブイヨン（Carl Roth）、C. dubliniensis、C. tropicalis、C. glabrata、C. parapsilosisおよびC. orthopsilosisを液体YPD培地で30℃で一晩培養した。M. restricta（CBS-7877）およびM. furfur（DSM 6170）を、250 mlのMLNA培地（細菌学的ペプトン10 g l-1、グルコース10 g l-1、酵母エキス2 g l-1、脱脂牛胆汁8 g l-1、グリセロール10 ml l-1、グリセロールモノステアレート0.5 g l-1、Tween-80 5 ml l-1、オリーブ油20 ml l-1）中で、32℃で4日間培養した。

酵母細胞を1,500g以上で5分間遠心分離して回収し、3回洗浄して培地を除去した。細胞ペレットは、ガラスビーズ付き組織ホモジナイザーで少なくとも3回、高強度で破砕し、その間に氷上で5分間インキュベートした。すべての微生物抽出物を15,000～20,000gで1～15分間遠心分離して残渣を除去し、上清を0.2μmの滅菌フィルター（Sartorius社製、Minisart）に通し、使用するまでアリコートで-70℃に保存した。

Penicillium roqueforti (SF006507)とP. camemberti (STN02007)を20℃で7-10日間、麦芽寒天プレート上で培養し、グルコースを唯一の炭素源とするアスペルギルス最小培地中で、24℃で十分な菌糸ペレットが存在するまで発芽させた。菌糸体をMiracloth（Merck Millipore）で培地から分離し、水で洗浄した後、液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて菌糸体を粉砕し、タンパク質抽出物を生成した。

チーズから懸濁液を調製するため、チーズを小片に切り、3mlの1×PBS緩衝液を入れたgentleMACS M-tubes（Miltenyi Biotec社製）に入れた。チーズをgentleMACS装置（Miltenyi Biotec）のプログラムRNA.01 3×を用いて破砕した。チューブを1,000gで10分間遠心し、上清を65℃で10分間熱不活化した。

すべての微生物溶解液は40 µg ml-1のタンパク質濃度で刺激に使用し、チーズ懸濁液は200 µg ml-1のタンパク質濃度で使用した。

その他の抗原
以下のコントロール抗原を刺激に使用した：CMV（Siemens Healthcare Diagnostics）、アデノウイルス（AdV；Microbix）、水痘帯状疱疹ウイルス（Microbix）およびエプスタイン・バーウイルス（Hölzel Biotech）の溶解物。すべてのウイルス溶解液は、10μg ml-1の濃度で刺激に用いた。単純ヘルペスウイルス1（エンベロープ糖タンパク質D；Miltenyi Biotec）、インフルエンザA H1N1（HA、MP1、MP2、NP、NAのプール；Miltenyi Biotec）、ヒトヘルペスウイルス6（U54、U90のプール；peptides&elephants）およびSARS-CoV-2（スパイクタンパク質；JPT）のペプチドプール。ペプチドプールはメーカーの指示に従って再懸濁し、細胞はペプチド1mlあたり0.5μgの濃度で刺激した。牛の乳タンパク質抽出物はGreer Laboratoriesから購入し、100 µg ml-1の濃度で使用した。

抗原反応性T細胞の濃縮
PBMCは、密度勾配遠心法（Biocoll、Biochrom）により、献血当日のEDTA血液から新鮮な状態で分離した。ARTEは、若干の修正を加えて、以前に記載された15,28,52,53,54に従って行った。簡単に述べると、1-2×107個のPBMCを、5％（v/v）のヒトAB血清（Sigma-Aldrich）を添加したRPMI-1640培地（Gibco）中、12ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、1μg ml-1のCD40および1μg ml-1のCD28純粋抗体（いずれもMiltenyi Biotec）の存在下、微生物溶解物で7時間刺激した。いくつかの実験では、刺激中に100μg ml-1の抗HLA-DR純粋抗体（Miltenyi Biotec；クローンAC122またはBioXcell；クローンLT43）を加えた。複数の特異性を多重化するために、異なる濃度の2つのCD4抗体クローン（CD4-BV421、BioLegend、クローンOKT4、力価1:20と1:200；CD4-APC-Vio770、Miltenyi Biotec、クローンMT-466、力価1:50と1:500）で異なる刺激細胞を標識した。低濃度では、バーコードラベルの混合をブロックするため、それぞれの非標識CD4純粋抗体を1 µg ml-1の濃度で添加した。バーコード標識された集団をプールし、CD154-ビオチンで標識した後、抗ビオチンMicroBeads（CD154 MicroBead Kit、Miltenyi Biotec）を用い、2回連続のMS Columns（Miltenyi Biotec）で磁気濃縮した。1本目のカラムで表面染色を行い、続いて2本目のカラムで固定と細胞内染色を行った。抗原特異的 T 細胞の頻度は、濃縮後の CD154+ T 細胞の細胞数に基づいて決定し、カラムに適用した CD4+ T 細胞の総数で正規化した。各刺激について、非刺激コントロールから濃縮した CD154+ バックグラウンド細胞を差し引いた。

フローサイトメトリー
細胞は、フルオロクロム標識抗体（括弧内はクローン名と力価）の異なる組み合わせで染色した： CD3-PE（REA613）、CD4-APC-Vio770（M-T466）、CD4-VioBlue（REA623）、CD4-FITC（REA623）、CD8-VioGreen（REA734）、CD8-PerCP（BW135/80）、CD14-VioGreen（REA599）、 CD14-PerCP（TÜK4）、CD20-VioGreen（LT20）、CD20-PerCP（LT20）、CD45RA-VioGreen（REA562）、CD45RO-APC（REA611）、CD69-PE（REA824）、CD154-FITC（REA238）、 CD154-APC（REA238）、TNF（腫瘍壊死因子）-PE（フィコエリトリン）-Vio770（cA2）、CD197（CCR7）-PE-Bio770（REA108）、IL-17A-PE-Vio770（REA1063）、 IL-21-VioR667（REA1039）、IL-21-PE（REA1039）、パーフォリン-PE（REA1061）、GM-CSF-APC（REA1215）、GM-CSF-PE-Vio770（REA1215）（すべてMiltenyi Biotec、すべて力価1： 50）、CD4-PV421（OKT4、1：20）、CD45RA-PE-Cy5（HI100、1：60）、IFN-γ-PV785（4 S． B3、1：20）、IL-2-PV605（MQ1-17H12、1：20）、IL-2-PV711（MQ1-17H12、1：50）、IL-10-PE-Dazzle-594（JES3-9D7、1：50）、IL-17A-PV605（BL168、1：20）、グランザイム-B-PerCP-Cy5（QA16A02、1：20）、CD319-PE-Dazzle-594（162. 1、1:20）、TNF-BV650（MAb11、1:20）、抗マウス-TCR-β-APC（H57-597、1:20）、抗ヒト-TCR-αβ-FITC（IP26、1:20）（すべてBioLegend）、およびIL-17A-BV650（N49-653、1： 20）、インテグリンb7-BV650（FIB504、1：20）、CCL4（MIP-1b）-AF770-（D21-1351、1：20）、Ki-67-AF700（B56、1：20）、Ki-67-BV480（B56、1：20）およびIL-22-PerCP-eFluor710（IL22JOP、1：100）（すべてBD Biosciences）。死細胞の除外にはViability 405/520 Fixable Dye 1:100（Miltenyi Biotec）を用いた。細胞内染色には、細胞を固定し、inside stain kit（Miltenyi Biotec）で透過処理した。データはLSR Fortessa（BD Bioscience）またはNorthern Lights 3000（Cytek Biosciences）で取得した。MACSQuantXアナライザー（Miltenyi Biotec社製）を用いて、384ウェルプレート上の拡大T細胞株のスクリーニングを行った。解析にはFlowJo v.10.9.0（Tree Star社製）を用いた。

抗原反応性 T 細胞の拡大および再刺激
抗原特異的T細胞の増殖のために、PBMCをCD40純抗体1μg ml-1およびCD28純抗体1μg ml-1の存在下で6時間刺激し、CD154+細胞を磁気活性化細胞選別（MACS）により単離し、CD154+CD69+CD45RA-発現に基づいてFACS Aria Fusion（BD Bioscience）を用いてFACSによりさらに精製し、96ウェル丸底プレートに入れた。酵母応答性TH1-CTL単細胞クローンの作製には、S. cerevisiae刺激CD154+CD69+CD45RA-CD319+細胞を単細胞としてFACSで96ウェル丸底プレートに選別した。

バルクまたは単細胞で選別したT細胞を、TexMACS培地（Miltenyi Biotec）中、1×105個の自己抗原負荷照射フィーダー細胞（CD154+ MACSからの陰性画分）の存在下で、5％（v/v）ヒトAB血清（GemCell）、200U ml-1のIL-2（Proleukin；Novartis）、100IU ml-1のペニシリン、100μg ml-1のストレプトマイシン、0. 25 μg ml-1のアムホテリシンB（抗生物質抗真菌液、Sigma-Aldrich）、20μMの2-メルカプトエタノール（Gibco、Life Technologies）、2mMのグルタミン、30ng ml-1の抗CD3（OKT-3、Miltenyi Biotec）。7日後、培地100mlを補充し、照射したフィーダー細胞1×105個を加えた。2-4週間の拡大期間中、培地は補充され、細胞は必要に応じて分割された。

再刺激のために、CD14+ MACS分離単球（CD14 MicroBeads；Miltenyi Biotec）から、1,000 IU ml-1のGM-CSFと400 IU ml-1のIL-4（いずれもMiltenyi Biotec）を添加したX-Vivo15培地（BioWhittaker/Lonza）で培養してfastDCを作製した。再刺激の前に、拡大T細胞を、IL-2を含まない5％ヒトAB血清を補充したRPMI-1640で2日間休ませた。次に、0.5-1×105個の拡大T細胞を、384ウェルの平底プレートに1：1の割合でfastDCとプレーティングし、6時間再刺激した。

腸管生検からのCD4+ T細胞の増幅
患者あたり最大4個の生検をプールし、0.5%（v/v）ヒトAB血清、100 IU ml-1ペニシリン、100 µg ml-1ストレプトマイシン、0. 25 µg ml-1のアムホテリシンB、10 IU ml-1のDNase I（CellSystems）、および1 mg ml-1のCLS IV型コラゲナーゼ（Biochrom）を添加し、37℃で30分間振盪した。細胞を40μmのセルストレーナーで濾過して凝集塊を除去し、CD4-VioBlue、CD3-PE、CD8-PerCP、CD14-PerCP、CD20-PerCP、CD45RO-APC、CCR7-PE-Vio770（すべてMiltenyi Biotec）に対するフルオロクロム標識抗体で染色した。各200個のCD3+CD4+CD45RO+細胞を、5%(v/v)のヒトAB-血清、200U ml-1のIL-2、100IU ml-1のペニシリン、100μg ml-1のストレプトマイシン、0.25μg ml-1のアムホテリシンBを添加したTexMACS培地中で、照射した同種フィーダー細胞を含む96ウェルプレートの複数のウェルで、2×105細胞cm-2の密度で選別した。細胞は30 ng ml-1の抗CD3（OKT-3；Miltenyi Biotec）存在下で4週間ポリクローナルに増殖させた。異なる真菌溶解物による再刺激は、上述のように行った。反応性T細胞の頻度を算出するために、各抗原について平均値を算出し、入力ウェル数で割った。

細胞毒性アッセイ
付着性小型 IEC（PELOBiotech）に対する酵母反応性 CD4+T細胞の細胞傷害性を、Real Time Cell Analyzer（RTCA, X-Celligence, ACEA）55を用いて二重測定した。RTCAを用いると、細胞のインピーダンスは96ウェルマイクロEプレートの底にある電子センサーでモニターされる。細胞のインピーダンスは、細胞増殖、形態学的変化（例えば、拡散、接着）、細胞死などの細胞パラメーターの変化を反映し、セル・インデックス（CI）と呼ばれる任意の単位で表される。

96ウェルマイクロE-プレートに、1ウェルあたり合計7,500個の接着IECs細胞を加え、60時間、3分ごとに細胞のインピーダンスをモニターした。ウェルによって初期接着が若干異なることがあるため、CIは直線成長期に達した後に1に正規化した。24時間後、精製したばかりのS. cerevisiaeおよびM. restricta反応性CD154+CD69+ Tmem細胞を、エフェクター対ターゲットの比率を変えて添加した（1:1、1:2、1:4）。T細胞とIECは1μg ml-1のSEB添加により架橋された。T細胞によるIECの溶解は、インピーダンスの消失、すなわち正規化CIの減少によって示される。陽性対照として、IECを1% Triton X-100（最終濃度）で処理した。RTCAソフトウェア（v.2.0.0.1301、ACEA）による解析では、Triton X-100サンプルの平均値を算出し、エフェクター細胞添加後の100%溶解と定義した。各サンプルの溶解のパーセンテージは、エフェクター細胞を添加していないコントロールサンプルとの関係で計算した。

初代ヒト CD4+T細胞における同所性TCR置換
DNAテンプレート（補足表1）は、以前に発表された方法42に基づきインシリコで設計され、Twist Biosciences社によりpTwist Ampベクターで合成された。手短に言えば、この構築物は左右のホモロジーアームで挟まれた挿入型TCRのα鎖とβ鎖の全長からなり、分離のための自己切断ペプチド(P2AとT2A)とポリ(A)テール(bGHpA)を含んでいる。β鎖はヒト可変領域と追跡マーカーとして使用されるマウス定数領域からなる。

TCRの置換は、以前に記述された通りに行った42。簡単に言えば、CD4+ T細胞をネガティブ磁気選択（CD4+ T Cell Isolation Kit; Miltenyi Biotec）により単離した。続いて、CD4+ T 細胞を、T Cell Activation/Expansion Kit（Miltenyi Biotec）を用いて2日間活性化した。活性化CD4+ T細胞を回収し、MACSiMAG Separator（Miltenyi Biotec）を用いて活性化ビーズを除去した。各ヌクレオフェクションには1×106個の細胞を用い、20μMリボ核タンパク質（RNP）混合物（Integrated DNA Technologies（IDT））および相同性指向性修復テンプレート（1μg）（Twist Biosciences）と混合した。RNP（全成分はIDT社製）は2つの連続したステップで作製した：まず、ガイドRNA（gRNA）を、等量のトランス活性化CRISPR（tracr）RNA（80μMストック）とhTRAC CRISPR（cr）RNA（80μMストック）とを混合することにより調製した（gRNAのcrRNA配列は、TRBC32については5′-GGAGAATGACGAGTGGACCC-3′であった）、 TRBC1およびTRBC2の両方を標的とし、TRACについては5′-AGAGTCTCTCAGCTGGTACA-3′であった）、95℃で5分間加熱し、次いで室温まで冷却した（RT）。第2ステップでは、等容量のCas9ヌクレアーゼ（6μM）とgRNA（40μM）を混合し、RTで15分間インキュベートすることにより、gRNAをCas9ヌクレアーゼと組み立てた。エレクトロポレーションエンハンサー（400μMストック）をRNP混合物に添加した。P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S（Lonza）およびEH100プログラム付き4D-Nucleofector Xユニット（Lonza）を使用した。エレクトロポレーションされた細胞は、拡張培地中の96ウェル細胞培養プレートに直ちに移され、37℃、5％CO2で5日間培養された。5 日後、TCR トランスジェニック CD4＋ T 細胞を、マウス TCR-β 発現に基づいて FACS Aria Fusion（BD Bioscience）上で FACS により選別し、その後の機能アッセイを行うまで、2 × 105 照射同種フィーダー細胞存在下でさらに 2～3 週間増殖させた。FACSのために、細胞はCD4-Vioblue、CD8-PerCP、CD14-PerCP、CD20-PerCP（全てMiltenyi Biotec）、マウスTCR-β鎖-APC、ヒトTCR-α/β鎖-FITC（共にBioLegend）に対する蛍光色素標識抗体で染色した。ソーティング後、ノックイン細胞を2週間増殖させた。

ScRNA-seqアッセイ（10×Genomics社製）
scRNA-seqおよびTCR-seqのために、酵母反応性IL-17A産生細胞、IFN-γ産生細胞、およびダブルネガティブCD154+ Tmem細胞をFACSで選別し、バーコード抗体で標識した（CITE-seq）。簡単に説明すると、PBMCをCD40純抗体1μg ml-1とCD28純抗体1μg ml-1の存在下、C. albicans、C. tropicalis、S. cerevisiaeで6時間刺激した。細胞をIFN-γおよびIL-17Aキャッチ試薬（サイトカイン分泌アッセイ、いずれもMiltenyi Biotec社製）で標識し、2％（v/v）ヒトAB血清を添加したRMPI-1640培地で連続回転下にさらに45分間インキュベートした。細胞はさらにCD154-PE、IL-17A-APC、IFN-γ-FITCで標識され、抗PE MicroBeadsに続いてMS Columns（すべてMiltenyi Biotec社製）で磁気濃縮された。

細胞は、0.5%(v/v)のヒトAB血清を添加した滅菌濾過1×PBSを含む、プレコートされた低結合回収チューブにソーティングされた。ソーティング後、細胞をMSカラムに再添加し、洗浄ステップ中の細胞の損失を避け、1μlのハッシュタグ抗体（TotalSeq-C0251抗ヒトハッシュタグ1（LNH-94、1： TotalSeq-C0251抗ヒトhashtag 1（LNH-94、1:50）、TotalSeq-C0252抗ヒトhashtag 2（LNH-94、1:50）およびTotalSeq-C0253抗ヒトhashtag 3（LNH-94、1:50）を、Human TruStain FcX（力価1:20）（すべてBioLegend）の存在下、50μlの染色液に溶解した。カラムを2回洗浄し、0.5%(v/v)のヒトAB血清を添加した滅菌濾過1×PBS500μlで細胞を溶出した。ローディングの直前に、各抗原の IL-17A+、IFN-γ、CD154+ 集団を組み合わせ、遠心分離し、Chromium Next GEM Chip K（10×Genomics）に、Chromium Next GEM Single Cell 5′ Kit v.2 で処理するための製造元の指示に従ってローディングした。各反応で5,000～12,000個の細胞をロードしました。続いて、同じ細胞からChromium Single Cell V(D)J Enrichment Kit, Human T Cell (10× Genomics)を用いてTCRシングルセルライブラリーを調製した。ライブラリーはIllumina NovaSeq 6000装置で、遺伝子発現ライブラリーは2×100 bp、TCRライブラリーは1細胞あたり50,000リード、1細胞あたり5,000リードを目標にシークエンシングした。

単一細胞トランスクリプトームデータ解析
10×シーケンシングデータは、10× Genomics Cell Ranger v.6.0.0ソフトウェアパイプラインを用いて、前述のように処理した56。Cellranger mkfastqを用いて細胞バーコードを多重化解除し、fastqファイルを作成し、cellranger countを用いてSTAR aligner57を用いてリードをヒトゲノム（GRch38）にマッピングし、細胞ごとの転写産物数のマトリックスを得た。

データ解析は、Python v.3.7（参考文献58）を用いて、scanpy Pythonパッケージv.1.9.0で行った。品質管理の一環として、細胞は以下の基準に従った： (1)発現遺伝子が500個以上、(2)ユニーク分子識別子の総数が1,000個以上、(3)ハッシュタグ抗体に基づくダブレットがない、(4)ミトコンドリアRNAが5%未満。最初の63,732細胞のうち、60,130細胞がこれらの基準を満たし、その後の解析に使用された。

データの正規化ステップには、細胞あたり10,000カウントへのライブラリーサイズの正規化と、発現データのlog2(変換)が含まれた。変動性の高い遺伝子を同定し、主成分分析アルゴリズムを用いてデータの次元を30主成分（PC）にまで減少させた。PC値は、scanpy.external.pp.harmony_integrate関数に実装されているharmonyアルゴリズム59を用いて調整し、サンプル調製の違いによって生じるバッチ効果を補正した。細胞の教師なしクラスタリングはLeidenクラスタリングアルゴリズム（scanpy.tl.leiden）を用いて行い、発現量の異なるマーカー遺伝子に基づいて細胞のサブタイプをクラスタに割り当てた。

ScTCRレパートリーデータ解析
scTCR-seqデータからのV(D)J遺伝子コールのためにCellranger vdjパイプラインを使用した。Scirpy Pythonパッケージv.0.12.0を使用して60、TCRデータとトランスクリプトームデータを統合し、各細胞のTCR特性を推論してクローン型を定義した。同じTCR-βアミノ酸配列を持つ細胞は、同じクローン型に属するとみなされた。TCRレパートリーのクローナリティの定量的尺度として、ジニ係数61 を計算した。ジニ係数の範囲は0から1までで、0は全クローノタイプが等しく存在することを表し、1に近い値は完全な不平等（すなわち、1つの配列が高い頻度で存在する）を表す。ジニ係数解析のために、サンプルサイズ（サンプルあたりの細胞数）の違いによる影響を除去するため、真菌抗原ごとに各個体から500個の細胞を無作為に選択してサンプルを正規化した。TCR共有ネットワークは、Cytoscapeソフトウェアv.3.9.1（文献62）を用いて作成し、可視化した。1つの細胞のみで見つかったクローン型はネットワーク解析から除外した。

軌跡の推論
擬似時間軌跡解析はMonocle v.2アルゴリズム35を用いて行った。サンプルサイズ（サンプルあたりの細胞数）の違いによる影響を除去するため、サンプルは真菌抗原ごとに各個体から500個の細胞を無作為に選択して正規化し、解析は36マーカーの遺伝子セットに限定した（Extended Data Table 3）。

統計解析
n の正確な値、中心の定義、分散と精度の測定、および統計的有意性を含む統計パラメータは、図と図の凡例に報告されている。統計検定はGraphPad Prismソフトウェアv.9.4.1を用いて行った。統計検定は、データ分布と分散特性に関する適切な仮定に基づいて選択した；P < 0.05を統計的に有意とみなした。

ソフトウェア
フローサイトメトリーデータは、FlowJo v.10.9.0（Tree Star）およびMiltenyi MACSquantify v.2.13（Miltenyi Biotec）ソフトウェアを用いて解析した。グラフと統計はGraphPad Prism software v.9.4.1で作成した。TCR共有ネットワークは、Cytoscapeソフトウェアv.3.9.1（文献62）を用いて作成し、可視化した。

報告の要約
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの入手可能性
遺伝子発現ライブラリーおよびTCRライブラリーの両方から得られた生のペアエンドscRNA-seq fastqファイル、ならびにそれぞれfeature-barcode matrixファイルおよびclonotype tableとして処理された遺伝子発現データおよびTCRデータは、Gene Expression Omnibus (accession no GSE227638)およびGitHubにhttps://github.com/agbacher/fungi。その他のデータはすべて、対応する著者に依頼すれば4週間以内に仮名付きで入手可能である。

コードの利用可能性
すべてのコードはGitHubのhttps://github.com/agbacher/fungi。

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謝辞
N. Bekel、S. Meise、B. Messnerには技術的援助を、M. GoldmannとA. Bittroff-Lebenには微生物ライセートの作製を、Popgen biobankのA. Gollmerには研究参加者のリクルートを、K. SchoberとE. Schuster、フローサイトメトリー施設（Flow Cytometry Facility Kiel）とゲノム解析能力センター（Competence Centre for Genomic Analysis Kiel）には、細胞選別とシングルセルシーケンスのサポートをいただいた。本研究は、ドイツ研究財団（Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)）によるドイツの卓越戦略（Excellence Strategy）の支援を受けた： EXC2167-プロジェクトID 390884018「Precision Medicine in Chronic Inflammation」（W.L.、J.R.、K.A.、A.F.、A.S.、S. Schreiber、P.B.へ）、EXC2051-プロジェクトID 467 390713860「Balance of the Microverse」（A.A.B.、B.H.へ）、RU5042-miTarget（J.R.、K.A、 A.F.およびP.B.へ）、DFG助成金第433038070号（A.F.、A.S.およびP.B.へ）、DFG助成金第387835892号（A.S.へ）、TRR241プロジェクトID 375876048（B.S.、A.S.およびP.B.へ）、米国国立衛生研究所（助成金番号R01DK121977およびR01AI163007）、Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust助成金（I.D.I.へ）。このプロジェクトは欧州連合（European Research Council、ERC）より助成を受けた。しかしながら、表明された見解および意見は筆者個人のものであり、必ずしも欧州連合またはERC執行機関の見解を反映するものではない。欧州連合および助成機関はそれらに責任を負うことはできない。

資金提供
Christian-Albrechts-Universität zu Kielよりオープンアクセスファンドの提供を受けた。

著者情報
著者および所属
免疫学研究所、キール・クリスチャン・アルブレヒト大学およびシュレスヴィヒ・ホルシュタイン大学医療センター、キール、ドイツ

ガブリエラ・リオス・マルティーニ、エカテリーナ・ティホノヴァ、エリサ・ロザーティ、フィリップ・ホフマン、カリーナ・サガウ、ステファン・シュナイダーズ、アン・クリスティン・カンプス、ハンス・ハインリッヒ・オベルグ、ダニエラ・ヴェッシュ、アレクサンダー・シェフォルド、ペトラ・バッハー

臨床分子生物学研究所、キール・クリスチャン・アルブレヒト大学およびシュレスヴィヒ・ホルシュタイン大学医療センター、キール、ドイツ

ガブリエラ・リオス・マルティーニ、エカテリーナ・ティホノヴァ、エリサ・ロザーティ、ラウラ・カタリーナ・シーバーズ、フローリアン・トラン、ソフィア・ヒンツ、フィリップ・ホフマン、ステファン・シュナイダーズ、アン＝クリスティン・カンプス、コンラート・アデン、アンドレ・フランケ、ステファン・シュライバー、ペトラ・バッハー

ジル・ロバーツ炎症性腸疾患研究所、ワイル・コーネル・メディスン、コーネル大学、ニューヨーク州、米国

メーガン・ビアルト・デセリー & イリヤン・D・イリエフ

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コーネル大学ワイル・コーネル医学部、ジョーン＆サンフォード・I・ワイル医学科

メーガン・ビアルト・デセリー＆イリヤン・D・イリエフ

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コーネル大学ワイル・コーネル医学部微生物学・免疫学教室

メーガン・ビアルト・デセリエ＆イリヤン・D・イリエフ

シュレスヴィヒ・ホルシュタイン大学医療センター内科I科（ドイツ・キール

Laura Katharina Sievers, Florian Tran, Matthias Lessing, Arne Bergfeld, Sophia Hinz, Susanna Nikolaus, Julia Kümpers, Anna Matysiak, Konrad Aden & Stefan Schreiber

キール大学疫学研究所、シュレースヴィヒ・ホルシュタイン大学医療センター、キール、ドイツ

グンナー・ヤコブス＆ウォルフガング・リープ

ドイツ、ベルリン、バイエルン広場消化器内科

ヨッヘン・マウル

ベルリン・シャリテ大学消化器・リウマチ・感染症科、ベルリン・フンボルト大学、ベルリン健康研究所、ドイツ・ベルリン

ヨッヘン・マウル＆ブリッタ・ジークムント

キール消化器病センター／ドイツ・キール

バーバラ・ゼーガーズ＆ホルガー・ヒンリクセン

ベルリン・シャリテ大学微生物学・感染症・免疫学研究所、ベルリン・フンボルト大学、ベルリン衛生研究所（ドイツ・ベルリン

シュテファン・ベレスウィル＆マルクス・M・ハイメサート

リューベック大学感染症・微生物学科（ドイツ・リューベック

ヤン・ルップ

ドイツ・イエナ、ライプニッツ天然物研究所・感染生物学ハンス・クノエル研究所、分子・応用微生物学部門

オラフ・クニーマイヤー＆アクセル・A・ブラッケージ

フリードリヒ・シラー大学／ドイツ・イエナ

アクセル・A・ブラッケージ＆ベルンハルト・ヒューベ

ライプニッツ天然物研究所・感染生物学ハンス・クノエル研究所・微生物病原性メカニズム研究部門・微生物学研究所／ドイツ・イエナ

サッシャ・ブルンケ＆ベルンハルト・ヒューベ

貢献
G.R.M.とP.B.がプロジェクトを発案。G.R.M.、C.S.、P.H.、S. Schneiders、A.K.K.およびM.B.D.が調査を行った。G.R.M.、E.T.、E.R.、M.B.D.が正式な分析を行った。L.K.S.、F.T.、M.L.、A.B.、S.H.、S.N.、J.K.、A.M.、G.J.、W.L.、B.Seegers、H.H.、K.A.、S.Schreiberが患者を集め、臨床データを提供した。J.M.、B.Siegmund、H.O.、D.W.、S.Bereswill、M.M.H.、J.R.、O.K.、A.A.B.、S.Brunke、B.H.、A.F.はリソースを提供した。原稿はP.B.が執筆。P.B.、A.S.、I.D.I.、S.Schreiberが校閲・編集。P.B.はプロジェクトを監督した。すべての著者が討論を行い、原稿の改訂に参加し、最終版に同意した。

筆者
ペトラ・バッハー宛。

倫理申告
競合利益
2023年1月より、E.R.はグラクソ・スミスクライン社の社員である。残りの著者は、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Medicine誌は、本論文の査読に貢献した本田健也氏、ダニエル・ムチダ氏、その他の匿名の査読者に感謝する。主担当編集者 Ulrike Harjes、Saheli Sadanand、協力：Nature Medicineチーム。

その他の情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

拡張データ
図1 抗原反応性T細胞濃縮法（ARTE）。
(a)異なる刺激サンプルの多重化と組み合わせたARTEの実験セットアップ。PBMCを異なる微生物溶解液で7時間刺激した。細胞は異なる抗CD4クローンを用いてCD4抗体ベースの蛍光バーコードで標識され、混合された。反応性CD154+ T細胞をARTEで濃縮した。ドットプロットの例は、2x10e7 PBMCからの濃縮前および磁気CD154+濃縮後のC. albicans溶解液刺激細胞を示す。CD4＋ T細胞内のCD154＋細胞のパーセンテージと絶対細胞数を示す。(b) ARTEによるCD154+細胞の濃縮後のゲーティング戦略。

Extended Data 図2 微生物溶解液によるCD154発現の特異性。
(a, b) (a)健常人ドナー(n = 10)および(b)CD患者(n = 6)の抗HLA-DR抗体存在下または非存在下で刺激された微生物溶解液刺激CD154+ T細胞の頻度。(c) 抗HLA-DR抗体存在下または非存在下でのCD154誘導を示す代表的フロープロット。濃縮されたCD154+細胞の数を示す。(d)微生物ライセートでの刺激後、CD154+細胞をFACS精製し、数週間増殖させ、自己抗原提示細胞の存在下、特異的または無関係な微生物ライセートで再刺激した。陽性対照としてPMA-イオノマイシン刺激を用いた。CD4+中のCD154+ TNFα+細胞の割合を示す（E. coli, F. prausnitzii, C. albicans, C. glabrata n = 5; K. pneumoniae n = 7; P. copri, B. fragilis, C. tropicalis n = 4; S. cerevisiae n = 8; M. restricta n = 2）。(e) CD4+メモリーT細胞は、ASCA-CD患者（n = 5）の炎症腸管組織と非炎症腸管組織の生検から単離した。細胞を複数のウェルに200細胞/ウェルで播種し、自己APCの存在下、真菌溶解液で拡大・再刺激した。患者ごとの全ウェルの反応性CD154+細胞の平均頻度を示す。a,b,d,e）の各記号は個々のドナーを表す。(e)には四分位数と範囲を切り捨てたバイオリンプロットを示す。統計的差異：(a, b)では両側対応のt検定。

Extended Data 図3 T細胞データと臨床パラメータとの相関。
C.アルビカンス、C.トロピカリス、S.セレビシエに対する反応性CD4+ T細胞頻度は、全CD患者（a-d）またはASCA+ CD患者（e-h）における異なる臨床パラメータと相関していた。(a, e) 真菌反応性T細胞頻度に対する、診断時年齢、疾患局在、またはモントリオール分類に基づく行動の影響。(b, f) 酵母反応性CD4+ T細胞頻度と、Harvey-Bradshaw Index（HBI）またはクローン病活動性指標（CDAI）によって決定される疾患期間または活動性とのスピアマン相関。(b、C. albicans n = 88、C. tropicalis n = 59、S. cerevisiae n = 44；f、C. albicans n = 50、C. tropicalis n = 38、S. cerevisiae n = 28）。(c、g）異なる治療法による酵母反応性T細胞頻度。IFXはインフリキシマブ、VDZはヴェドリズマブ、USTはウステキヌマブ、ADAはアダリムマブ、5-ASAは5-アミノサリチル酸。nは各群の下に示した個々のドナーの数を示す。(d, h)性別による酵母反応性T細胞頻度。nは各群以下に示した個々のドナーの数を示す。a-hの各記号は1人のドナーを示す。横線は(a, c, d, e, g, h)の幾何平均値を示す。

Extended Data 図4 酵母反応性CD4+ T細胞のサイトカイン産生。
(a)異なる真菌抗原に対して反応するIL-17A+IFN-γ+細胞の割合。nは各群の下に指定された個々のドナーの数を示す。(b)CD患者におけるIL-17A+IFN-γ+細胞の割合（ASCAステータスによる）。(c）ARTE後のS. cerevisiae反応性Tmemのex vivoサイトカイン産生のプロット例。CD154+Tmem中のサイトカイン陽性細胞の割合を示す。(d)健常ドナーとIBD患者におけるC. tropicalis、C. albicans、M. restricta反応性T細胞のサイトカイン産生。(a,b,d)の各記号は1人のドナーを表し、(b,d)には四分位数と範囲を切り捨てたバイオリンプロットを示した。統計的差異：(b)では両側Mann-Whitney検定、(d)ではKruskal-Wallis検定とDunnのpost hoc検定、有意差のみを示す。

Extended Data Fig. 5 酵母応答性Th1細胞は、いくつかの細胞毒性関連マーカーを発現している。
(a）各T細胞クラスターにおける細胞傷害性関連32遺伝子の発現をドットプロットで可視化。色は正規化した平均発現量を表し、大きさはそれぞれの遺伝子を発現している細胞の割合を示す。(b）各T細胞クラスターにおける選択した遺伝子の発現を示すヒートマップ。色はZスコアで正規化した発現量を表す。(c)エフェクター/Th17クラスター内の選択されたマーカー遺伝子の発現を、抗原特異性に応じて健常人ドナーとCD患者について示したドットプロット可視化図。色は正規化した平均発現量を表し、大きさはそれぞれの遺伝子を発現する細胞の割合を示す。(d）IL-17A産生細胞は、scRNA配列決定の前にハッシュタグ抗体で標識し（Methods参照）、エフェクター／Th17クラスターと重ねてプロットした。これらのデータは、このクラスター内の細胞のサブセットのみがTh17シグネチャーを持つことを示している。(e）個々のドナーと特異性（健常者n=3、CD n=3）について、ハッシュタグ抗体で標識したIFN-γ+細胞またはIL-17A+細胞の割合。(f,g)CD患者の(f)C. tropicalisおよび(g)C. albicans反応性T細胞における細胞傷害性マーカーの発現。(ASCA- n = 8; ASCA+ n = 14）。(f,g)の各記号は個々のドナーを表す。(f,g)の各記号は1人のドナーを表す。四分位数と範囲を示した切り捨てバイオリンプロットを(f,g)に示す。統計的差異： (f,g)の両側Mann-Whitney検定。

Extended Data 図6 酵母反応性CD4+ T細胞の変化は、IBD患者（IBD-FDR）の第1度近親者に存在する。
(a)IBD-FDR（n=25）および非FDR対照（n=22）における酵母反応性T細胞の頻度と(b)IL-17A産生。(c) IBD-FDR（n=25）と非FDR健常対照（n=38）における酵母反応性T細胞のIFN-γ染色。(d) S. cerevisiae反応性T細胞のIFN-γ染色のドットプロット例。(e) C. tropicalisおよびS. cerevisiae反応性CD154+ Tmemの細胞傷害性マーカー発現（非FDR n = 16、IBD-FDR n = 14）。(f)フローサイトメトリーで測定したCD154+Tmem内の酵母反応性T細胞のex vivo細胞傷害性マーカー産生を描いたヒートマップ。(g) 非FDR (n = 46)およびIBD-FDR (n = 25)における血清中の抗IgG抗体およびIgA ASCA抗体濃度。(h) 個々のIBD-FDRのASCA濃度上昇（ASCA < 10RU/ml n = 8, ASCA > 10 RU/ml n = 5）に関連したIBD-FDRの細胞傷害性マーカー発現。個々のドナーを点で示す。(a,b,c,e,g,h)の各記号は1人のドナーを示す。横線は(a)の平均値を示す。(b,c,e)には、四分位数と範囲を示した切り捨てバイオリンプロットが示されている。箱ヒゲプロットは(h)に示し、中央の線は中央値、箱の限界は25%(下限)と75%(上限)の四分位数、ヒゲは最小/最大値を示す。統計的差異：(a, b, c, e, h)では両側Mann-Whitney検定。

Extended Data 図7 酵母応答性T細胞の交差反応性。
(a) 単一細胞データセットから同定された最も拡大した交差反応性TCRのα/β-TCR構築物を、CRISPR/Casを用いた同所的T細胞受容体置換によって初代ヒトCD4+ T細胞に挿入した。パルスのみ、内在性TCRのノックアウト、内在性TCRの複合ノックアウト、および追跡マーカーとして用いたマウスβ鎖定数領域を含む遺伝子導入TCRのノックインを有するCD4+ T細胞を示すドットプロットの例。形質転換細胞はさらにFACSで精製し、高純度まで増殖させた。(b）トランスジェニックT細胞作製のためにscRNAseqデータセットから選択したTCR-α/β配列。(c)ASCA+CD患者由来のS. cerevisiae反応性Tmemを拡大し、様々な酵母種で再刺激した。反応性CD154+ TNFα+細胞の割合を示す。(d) ASCA- CD患者（C. albicans n = 4、S. cerevisiae、C. tropicalis n = 3）およびASCA+ CD患者（C. albicans、S. cerevisiae n = 4、C. tropicalis n = 3）における拡張酵母反応性T細胞の交差反応性。交差反応性は、最初に使用した酵母種で刺激した後の全反応性に対するパーセンテージとしてプロットした。(e) ASCA- CD患者（n = 39）とASCA+ CD患者（n = 49）のCMV血清抗体状態をELISAで測定し、CMV陰性とCMV陽性の割合を示した。(f)ASCA+患者のCMV状態による酵母反応性T細胞頻度（C. albicans CMVneg n = 32, CMVpos n = 17; C. tropicalis CMVneg n = 24, CMVpos n = 14; S. cerevisiae CMVneg n = 17, CMVpos n = 11）。(g)TCRトランスジェニックT細胞(n = 7)を共通のウイルス抗原で再刺激した。S.セレビシエによる刺激との交差反応性を示す。(d,f)の各記号は個々のドナーを表し、(g)では1つのTCRトランスジェニックT細胞株を表す。(d)には、四分位数と範囲を示した切り詰めたバイオリンプロットを示した。横線は(f)の幾何平均値を示す。統計的差異：(f)では両側Mann-Whitney検定。

拡張データ表1 コホートの特徴
フルサイズの表
拡張データ表2 UCおよびCD患者の特徴
フルサイズの表
Extended Data 表3 疑似時間軌跡解析に使用した遺伝子セット
フルサイズの表
補足情報
報告概要
補足表1
TCR置換に使用したTCRコンストラクトのDNAテンプレート。

権利と許可
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この記事の引用
Martini,G.R.,Tikhonova,E.,Rosati,E.ほか. 常在酵母および食品由来酵母による交差反応性T細胞の選択は、クローン病における細胞傷害性TH1細胞応答を促進する。Nat Med (2023). https://doi.org/10.1038/s41591-023-02556-5

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受領
2023年03月08日

受理
2023年8月22日

掲載
2023年9月25日

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https://doi.org/10.1038/s41591-023-02556-5

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対象
クローン病
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Nature Medicine (Nat Med) ISSN 1546-170X (online) ISSN 1078-8956 (print)

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