rrn long-ampliconsを用いた種および系統レベルの評価により、メタボリックシンドローム被験者の糞便移植による腸内細菌移行にドナーが影響することが示唆された。

2023年4月26日 11:13

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腸内細菌
2022年第14巻-第1号

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rrn long-ampliconsを用いた種および系統レベルの評価により、メタボリックシンドローム被験者の糞便移植による腸内細菌移行にドナーが影響することが示唆された。

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2022.2078621

アルフォンソ・ベニテス＝パエス
,
アニック・V・ハルトストラ
,
Max Nieuwdorp
&
ヨランダ・サンス
論文です： 2078621｜2022年01月03日受領、2022年05月06日受理、オンライン公開：2022年05月23日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2022.2078621
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ABSTRACT
糞便微生物移植（FMT）は、現在、クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療に用いられており、実験的に他の臨床応用が検討されている。しかし、この治療法の有効性は、ドナーの細菌種の移植に依存する部分があり、その評価は、微生物の移植を正確に追跡する費用対効果の高い戦略がないため、困難であることが分かっています。この点から、ヒトの腸内に生息する細菌種を正確に特定することは、ヒトの健康における細菌の役割を明確に定義するために不可欠である。我々は、ナノポア装置を用いて細菌のrrnオペロン（16S-ITS-23S）の配列を決定し、FMT試験のヒト腸内細菌叢における種レベルの存在量変化を明らかにした。FMT前後のドナーおよびレシピエントの微生物叢を評価することで、この分子的アプローチが、微生物の移行と生着を実証する菌株レベルの遺伝子変異を明らかにするかどうかをさらに評価した。FMT後のレシピエントの腸内細菌種数の変化を正確に推定するためには、シーケンスデータの品質と主要な微生物叢の共変数を厳密に管理することが重要でした。我々は、種特異的な方法でrrn領域の一塩基変異（SNV）を介して株レベルの変異を検出した。その結果、rrn領域の一塩基変異（SNV）を介して菌株レベルの変異を検出し、FMT後のレシピエントにおけるドナー菌（Parabacteroides merdaeなど）の生着率を調べることができることを示した。本研究の結果は、ドナーの微生物叢の生着がレシピエントの代謝的健康の改善とある程度相関していること、ヒトにおけるFMTの成功を確実にするためには、ドナーのベースライン腸内細菌叢構成、性別、年齢などのパラメータを考慮する必要があることを示しています。本研究は、オランダのTrial registry - NTR4488 (https://www.trialregister.nl/trial/4488)に前向きに登録されました。
キーワード
ナノポアシーケンス
ミニオン
腸内細菌叢
種移植
一塩基変異
種族レベルの分解能
アールエヌオペロン
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はじめに
マイクロバイオーム研究は急速に進展しており、微生物群集の研究においては、複雑な生態系の微生物種や菌株を同定し、マイクロバイオーム代替戦略を評価する臨床試験において微生物の生着状況を追跡することを可能にする配列決定戦略の導入が求められています。その中でも、糞便微生物叢移植（FMT）は、Clostridioides difficile感染症に対する効率的な治療法として広く認知されており、抗生物質による治療を凌駕しています。引用1 FMTによる感染症伝播のリスクはあるものの、このアプローチは、腸の炎症やインスリン抵抗性などの代謝障害を改善する効果を示しています。引用2-4 FMTの作用機序は、ドナーからレシピエントへの生きた微生物の生着に依存すると考えられているが、いくつかの臨床試験では、別のメカニズムに関する仮説の扉が開かれている。引用5 ドナーの微生物がレシピエントの腸内で増殖する能力が疾患の改善と関連していることを実証することは困難だが、FMT試験において特定の微生物が治療的役割を果たすかどうかを確かめるために必要である。DNAショットガンシーケンスに基づくメタゲノミクスは、現在、このような解像度レベルに到達できる唯一の戦略であるが、まだ非常に高価であり、FMT研究においてこのようなプロトコルを採用した菌株プロファイリングの結果はほとんど提供されていないCitation6-8 FMTマイクロバイオーム調査のほとんどは、主にいくつかの超変動領域（例えば、、引用9,引用10 この手法では、グローバルなマイクロバイオーム構造に影響を与える変化しか捉えることができず、種レベルでの正確な分類学的同定ができないため、限界があることが分かっている。この問題は、FMTにおける種の移植を正確に追跡したり、プロバイオティクスを用いた臨床試験で微生物のコロニー形成を実証したりする上で、特に重要な意味を持つ。我々は以前、ほぼ完全な16S rRNA遺伝子の微生物遺伝的可変性を調べることにより、分類学的同定の解像度を向上させるNanoporeベースのアンプリコンシーケンス法を開発しましたCitation11 このアプローチは、さまざまな微生物相研究で良好に機能することが実証されていますCitation12-15 さらに最近、我々はまた、複雑な微生物群集の種レベルの特性評価を改善するために、非常に可変なマルチローカス領域のシーケンスとサンプル多重化を組み合わせた新しい方法論を開拓してきましたCitation16。 Citation12,Citation17 上記のようなナノポアベースの技術の実装と微生物群集の評価への複数の応用により、さまざまな分析パイプラインの構成に関する知識を得ることができ、最新のプロトコルが提供されれば、そのデータの処理を向上させることができますCitation18-20.
私たちは、何千もの細菌種から得られたrrn配列に関する多くの遺伝情報をまとめるために多大な努力を払ってきました（rrn_db、https://github.com/alfbenpa/rrn_db で自由に利用可能）。Citation16 とはいえ、複数の生態系の細菌について公開リポジトリで入手できる適切な注釈付きDNA配列の数は限られており、あまり探索されていない生息地でこのアプローチを利用することはできません。引用12,引用21 それにもかかわらず、生物学的多様性を調査するためのrrnベースの解析の有用性は、メタバーコードアプローチによるメタゾアンの同定で有望な結果を示し、王国の間で探求されている。引用22
特定の細菌群や環境サンプルでは、個々の領域の研究によって対処できる16S rRNAと23S rRNAマーカーCitation23がリンクしていない問題にもかかわらず、細菌のrrn領域のロングリードアンプリコンシーケンスは、費用対効果の高い方法で、FMT戦略における微生物の移行と安定したコロニー形成を実証するための既存のギャップを埋めることができると考えています。
本研究では、FMTによるメタボリックシンドローム緩和効果を評価する試験において、ドナーからレシピエントへの特異的な腸内微生物の移行に対するドナーの影響を評価することを目的として、ユニークドナー・トゥ・マルチプルレシピエントのアプローチとナノポアベースシーケンスによるほぼ完全なrrn領域のアンプリコンシーケンスを用いて、FMTレシピエントに移行を試みた。ヒトの腸内に生息する優勢な細菌種からrrn領域に関するde novo情報を取得し、rrn既存データベースを数十の微生物種や菌株のアノテーションで充実させました。FMTによってレシピエントの腸内細菌叢組成がどの程度変化するかを種レベルで評価し、さらに重要な点として、菌株レベルの変化を追跡して微生物叢の生着率を調査しました。全体として、我々の結果は、メタボリックシンドローム患者の健康効果を媒介すると考えられる、ドナーとレシピエント間の特異的な微生物移行を示し、この移行は、ドナーとレシピエントのペア、ベースラインの腸内細菌叢構成、および特定のドナーに関連する人口統計変数に一部依存していることを示した。
研究結果
ヒト腸内細菌由来のrrn配列のアセンブリ
FMTを受けたメタボリックシンドローム患者の腸内細菌叢を評価することで、微生物叢の生着を明らかにすることを目的とし、以前のrrnリポジトリで編集したものに加え、種および株レベルの変異を裏付ける信頼できる遺伝情報を作成するために、Nanoporeシーケンスデータを包括的に解析する必要がありました（引用16）rrnアセンブリの最初のステップ（図1）では、非冗長NCBI 16Sデータベースとフォワードリードをマッピングして高品質のアラインメントの選択に基づいて381種類の種の存在を検出しました。しかし、予備的なrrnアセンブリは、少なくとも10倍のカバレッジを持つ種（合計250種）に対してのみ開始され、下流の分析において高品質のコンセンサスrrn配列をサポートしました。予備的なrrnアセンブリに対するリバースリードのマッピングにより、229の微生物種の検出を確認することができた。信頼性の高い分類学的アノテーションを持つ完全なrrn配列は、個々のカバレッジレベル（例：低、中、高図S1）に関係なく検索されました。
図1. 研究の図式的説明。サンプル選択、アンプリコンシークエンス、ヒト腸内細菌叢からのrrn領域のde novoアセンブリのための一般的なパイプラインを含むデータ取得および処理ステップを描いている。
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FMTに伴う種数のシフト
サンプル由来のフォワードリードとリバースリードをマッピングし、多様性と分類学的特徴のシフトを評価した。全リードのうち、43%のみが最高品質のアラインメント（同一性と長さによる）をサポートし、下流の解析に使用された。分類学的な割り当ての後、分析したアルファ多様性記述子のいずれにも大きな変化は見られなかった。しかし、FMTは10人中6人のレシピエントで微生物叢の豊かさ（チャオ指数）を増加させ（図S2）、平均で31種の増加を示しました。残りの4名では、FMTの結果、平均16種が失われ、豊かさの減少が見られた。Bray-Curtis非類似度指数に基づくβ多様性評価では、FMTの結果、レシピエントの微生物構造に大きな変化は見られなかった（PERMANOVA = 1.02, p = .403）。しかし、レシピエントの腸内細菌叢の構成は、シーケンスラン（PERMANOVA = 3.69, p = .001）、性別（PERMANOVA = 1.70, p = .032）、ドナー（PERMANOVA = 1.69, p = .004）によって大なり小なり強い影響を受けた。この多変量解析の結果を図2aに示す。世界的に、POST-FMTサンプルはドナーからのサンプルに近い位置にマッピングされる傾向があることが確認された。この仮説をさらに評価するために、それぞれのドナーとPRE-FMT微生物叢またはPOST-FMT微生物叢との距離（Bray-Curtis重み付け指標）を比較しました。その結果、ドナーの微生物叢とPRE-FMTのペアは、ドナーの微生物叢とPOST-FMTのペアよりも異種である傾向があり、Bray-Curtis距離が減少していることが示された（PRE-FMT vs ドナー中央値 = 0.79, POST-FMT vs ドナー中央値 = 0.71, 平均delta = 0.09, p = 075）（図2B）。
図2. rrn配列決定によって評価された微生物コミュニティのベータ多様性。 a - FMTに参加したレシピエントとドナーの微生物叢の多変量解析（主座標分析 - PCoA）から得られたデータをまとめた散布図です。ドナーおよびレシピエントのサンプルとサンプリング時点は、上部の凡例に従って定義されている。PCo；主座標（最も情報量の多い2つの座標が示されている）。色の凡例は、PRE-FMTとPOST-FMTの異なるサンプルの、評価した4つのドナーサンプルに関連するグループへの分布に対応している（プロットの凡例を参照）。 b - ドナーとレシピエントのペア間の微生物相の移動を評価するための遺伝距離ベースのアプローチ。PRE-FMTおよびPOST-FMTサンプルの微生物群集構造は、Bray-Curtis非類似度指数の計算によってドナーのものと比較され、ボックスプロットとして表される。遺伝的距離の差の比較には、ペアサンプルのWilcoxon signed-rank testを使用した。 c - FMT後の微生物叢の存在量シフト。表1に記載した種から選択した、FMT後の増加が有意義な3種の存在量データ分布をボックスプロット方式で示した。
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LMM解析を行ったところ、β多様性評価と同様の結果が得られた。その結果、シーケンサーバッチ、性別、ドナーが微生物叢データに影響を与える主な共変量であることがわかりました。さらに、年齢とベースラインのBMIも、本研究の対象者の腸内細菌叢の変動をある程度説明することがわかりました。上記の変数をランダム効果としてモデルに含めた後、FMTの結果として変化を示す微生物種のリストを取得し（表1）、FMTの結果として存在量の増加を示すそれらのいくつかを図2cにプロットした。FMTの前後で得られたペアサンプルを比較したところ、10種類の微生物種が異なって増加していることがわかり、そのうち3種類（Bifidobacterium adolescentisなど）だけが移植のために減少しているように見えました（表1）。
表1. FMT後の腸内細菌種の存在量と有病率の変化
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移植された腸内細菌種と生着した腸内細菌種
次に、菌株レベルの変異を識別し、微生物の生着状況をより正確に追跡するための概念実証解析を設計した。この目的のために、我々は、FMTの結果として最大の増加を示した評価サンプルの優勢種であるParabacteroides merdae（図3a）と、ドナー-レシピエントペア間の明らかな移植が観察されなかった分析サンプルの高濃度種であるFaecalibacterium prausnitzii（図3b）を選択して、株の同一性や移行を示す一塩基変異（SNVs）を検出しました。すべての被験者から得られた種特異的なrrnリードを統合した全データセットを大量に解析した結果（方法を参照）、P. merdae rrnには3つの情報提供可能なSNVサイトが、F. prausnitziiのカウンターパートには6つが見つかりました（図3c-d）。このような解析から推定された遺伝的変異の自然な存在を予測的に探るため、P. merdaeのすべてのSNVについて、100 ntの周辺領域をクエリーとして用いて、NCBI nonredundant nucleotide databaseに同様の変異が存在するかどうかを調べた。推測される遺伝的変動は、少なくともSNV-3527については再現され、複数のマッチがこの位置のAおよびGヌクレオチドを提示した（図S3）。サンプル間でこれらの特定のSNVのヌクレオチド頻度を調べたところ、ドナーからレシピエントへのP. merdae遺伝子型の明確な移転パターンが検出され、ドナーサンプルとPOST-FMT間の遺伝的距離（すべてのSNVにおける4ヌクレオチドの存在度を一度に評価するBray-Curtis指数、片側ウィルコクソン符号付き順位検定＝11、p＝.051）が、POST-FMT対PRE-FMTのものと比べて減少していることからわかる（図3e）。一方、POST-FMTまたはPRE-FMTサンプルとそのドナーとの間でF. prausnitziiの遺伝子型を比較した後に検索した遺伝的距離は、この種に属する菌株がドナーからレシピエントに移動したことを示さなかった（図3f）。また、両種間のdelta Bray-Curtis距離（POST vs DONORからPRE vs DONORサンプルを引いた値）の比較解析でも、POST-FMTサンプルとドナーサンプル間の距離が減少する傾向にあることから、P. merdaeのみがドナーからレシピエントに移されたと考えられる（図3g、p = .056）。2人のレシピエントとその共通のドナーにおけるP. merdae SNV-1254、SNV-2293、SNV-3527の直接サンガー配列決定が、ロングリードに基づくFMTの評価結果を支持した（図3h）。また、エレクトロフェログラムで可視化されたベースカリングプロファイル（Donor1および06-PreサンプルのSNV-3527など）から、いくつかのサンプルでは、全体的に菌株が混在していることが確認された。このような菌株の共存パターンは、両方の解析対象者のPOST-FMTサンプルにおいてより顕著であった（図3hのSNV-2293とSNV-3527を参照）。Donor1で観察された優勢なハプロタイプ（A1254-C2293-A3527）は、探索した2人のレシピエントに移行し、FMT後に優勢になった。他のドナー-レシピエントペアでも同様の移行パターンが観察された。この結果から、FMT後にP. merdaeの存在量が増加したのは、ドナー株の伝達の直接的な結果であることが明らかになった。これは、FMTの結果として増加した他の細菌種についても同様であると思われる。
図3. 一塩基変異（SNV）解析による種の移行と生着の検出。Parabacteroides merdaeとFaecalibacterium prausnitziiのrrnsという種を用いて、それぞれの種内のSNVとFMTの結果としてのその存在量を明らかにした（それぞれa、bパネル）。c、d - P. merdaeとF. prausnitzii rrnsの数千のリードのマッピング、インデックス付け、パイルアップにより、少なくとも2塩基で均一の頻度を示す多型部位を特定することができました。これらのSNVの可能性は、開いた円内にハイライトされ、rrnの配列中の位置番号も示されている。rrnの構造配置をX軸に示す。黒線は優性対立遺伝子の相対頻度を示し、灰色線はrrn全体の平均に関連する部位ごとの相対カバー率を示す。 eおよびf - P. merdaeおよびF. prausnitziiでそれぞれ検出されたSNVの塩基頻度の組み合わせを用いて、POST-FMTおよびPRE-FMTサンプルと対応ドナー間の微生物相のブレイ・カーティス類似度指数の分布である。g - Faecalibacterium prasunitziiおよびParabacteroides merdae種について、POST-FMT対DONORサンプル対PRE-FMT対DONORサンプルで計算したデルタブレイカーティス距離の評価。 h - P. merdae SNV-3527、SNV-2293およびSNV-1254の菌株のSangerシーケンスから得たエレクトロフェログラム。すべてのサンプルで推定された優勢な対立遺伝子（ベースコーリングのQスコアに基づく）は、Nanoporeベースの評価で予想されたように、菌株がドナーとレシピエントのペア間で移されたという仮説を支持するものであった。
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FMT後の臨床変数と生物種の存在感の相関性
メタボリックシンドロームを有するこれらの被験者で評価された複数の臨床変数のうち、FMTはレシピエントの糖代謝および血圧のマーカーにポジティブな変化を引き起こす傾向があった（表2）。空腹時インスリン（p = 030）、空腹時グルコース（p = 074）、そして結果としてHOMA-IR（p = 0.005）は、FMT後のレシピエントにおいて改善する傾向があった。これらの所見と同様に、FMT後にグリコシル化ヘモグロビン濃度の明らかな減少が見られた（p = 0.060）。一方、収縮期および拡張期血圧は、ドナーFMT治療の結果として低下し、それぞれ10％（p = .028）および19％（p = .0008）減少した（表2）。糞便中の酪酸（p = .018）および酢酸（p = .033）などのSCFA濃度は、FMT後に低下したが、プロピオン酸の濃度は低下しなかった（p = .280）。脂質代謝のマーカーについては、血漿中のHDLコレステロールレベルが低下した（p = 0.032）。順位ベースのKendallのτ（tau）パラメータを計算することにより、これらの臨床変数とFMTの結果としての微生物種の存在量の変化との間に関連性を確立した（表1参照）。FMT後に増加したP. merdaeなどの種は拡張期血圧と負の相関を示し（τ = -0.44, FDR = 0.062）、A. shahiiは糞便中の酢酸および酪酸の存在量と負の相関を示した（τ = -0.50, -0.42, FDR = 0.017, 0.042, それぞれ）。上記の相関は、他の近縁で豊富な種（Parabacteroides johnsonii, Parabacteroides distasonis, Parabacteroides goldsteinii, Alistipes finegoldii, Alistipes onderdonkii, Alistipes putredinis または Alistipes indistinctusなど）については検出されなかった。
表2. FMT後に変化した臨床変数
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種の生着と代謝機能障害の改善に対するドナーの影響力
ドナーとレシピエントの間で微生物叢の移植が行われ、特定の代謝変化がドナーからレシピエントに移植された特定の微生物種によって導かれた可能性があることを示した後、我々は、ドナーとその微生物叢の構成がFMTの成功をどの程度説明できるかを探ろうと考えた。このような目的のために、FMTの被験者10人の血圧、空腹時グルコースとインスリン値、グリコシル化ヘモグロビン、HOMA-IR、体重減少、BMIの減少を含む代謝改善度を個別に（1から10、低い方から高い方まで）ランク付けしました。そして、すべての被験者のすべてのスコアの合計からなる健康スコアを推定した。このスコアは、ドナー・レシピエントペアのベースラインの微生物叢構成と、ドナーペアを考慮したすべてのレシピエントのFMTによるコミュニティ構造の変化との間の非類似度指数（Bray-Curtis）に関連したものである（図4）。世界的に見ると、メタボリックヘルススコアは、ドナーとレシピエントの微生物叢のベースラインの非類似性とFMT後のコミュニティ構造の変化とある程度相関していることが観察されました。その結果、ドナーとレシピエントの腸内細菌叢のベースラインの非類似度が高いほど、レシピエントの代謝機能不全を回復させるメリットが低く、FMT後の腸内細菌叢構造への影響も小さくなります。上記の観察は、Donor2を含むペアを除く、ほぼ全てのDonor-Recipientペアに当てはまります。ドナー-レシピエントペア間の平均的な非類似度とFMT後のコミュニティ構造のそれぞれのシフトとの間に線形関係が観察されたが（調整R二乗：0.956、p = .013）、ランクベースのアプローチ（Kendallのタウ）では、これらのパラメータは代謝健康スコアとあまり相関しない（τ ≥ -0.24, p ≥ .381）ことがわかった。したがって、ドナー・レシピエントペアにおいてまだ調査されていない新たな特徴が、FMTを成功させるための被験者選定に役立つはずである。この仮説に基づき、メタボリックヘルススコアとレシピエントの性別の関係を評価したところ、女性は男性よりもメタボリックパラメータの改善が大きかった（女性 [N = 5] = 49.6 ± 13.8 health score, 男性 [N = 5] = 33.6 ± 11.3 health score, t-test = 6.62, p = 0.003）．さらに、ドナーとレシピエントのペアの年齢差（ドナー年齢-レシピエント年齢）とメタボリックヘルススコアの間に強い順位相関が見られ（Kendallのτ = -0.51, p = 046）、（レシピエントに対して）ドナーが若いほど、代謝機能障害の回復が大きいことが示唆されました。
図4. FMTの成功に対するドナーの影響。ベースライン時のドナー-レシピエントペア間の腸内細菌叢の比較（x軸、Bray-Curtis非類似度指数計算）と、FMT前後の各レシピエントの微生物叢構造の変化（y軸）を示す散布図である。塗りつぶしたドットの大きさは、評価したすべての代謝パラメータ（血圧、空腹時グルコースとインスリン、グリコシル化ヘモグロビン、HOMA-IR、体重減少、BMI減少）の改善にリンクしたランクの合計（代謝健康スコア）によって決定されます。色の凡例は、ドナー情報と関連しています。アスタリスクとサイズは、すべてのドナーにリンクされたすべてのレシピエントの平均値を示す。灰色の破線は、平均値（アスタリスク）に基づく線形相関を示す。
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ディスカッション
ここでは、ナノポアシーケンスによるヒト腸内細菌叢のrrnアンプリコンシーケンスと、この多座超可変領域の配列のde novoアセンブリを検討し、対応する遺伝子マーカーについての洞察を得ることで、種および株レベルで複雑なコミュニティを深く特徴付けるための潜在能力を実証し、FMT臨床試験におけるドナーおよびレシピエントの間の微生物移植を評価できるようにしました。MinIONTMプラットフォームによるrrnオペロンシーケンスの有用性は、すでに種レベルでの微生物コミュニティの解明に顕著な性能を示しており、特定の種の株変動を定義する可能性を持っています引用24、引用25
我々は、ヒトの腸内微生物の200以上のrrn領域配列について、de novoの信頼できるアセンブリを提供しました。この数は、主にシーケンスカバレッジによって制限されるが、DNAの完全性を維持し、5 kbpアンプリコンの増幅を成功させるために物理的破壊ステップを省略したDNA抽出方法によって減少する可能性もある。しかし、すべてのサンプルを均質に処理した結果、FMT前後の微生物プロファイルは同等となり、本研究で実施した種特異的な評価には影響しませんでした。
24検体から得られた約400Kナノポアリードからなるデータセットを用い、最新のrrnデータベースを採用し、微生物相に影響を与える共変数をコントロールすることにより、FMT介入の結果としてヒト腸内細菌相の種および株レベルでの変化を明らかにしました。このロングアンプリコンベースのアプローチにより、FMTの結果としてParabacteroides merdae、Butyricimonas virosa、Prevotella copri、Sutterella massiliensisといった種の増加を検出することができました。年齢、性別、シーケンスの実行回数（微生物叢データの解釈を混乱させる確率的な実行回数間の変動が認められる）、引用26、引用27、ベースラインのBMIに加えて、複数のレシピエントに一人のドナーを使用する場合、ドナーがレシピエントの微生物叢にFMTが与える影響に寄与する重要な共変量であることがわかった。これらの結果は、より大規模なコホートで探索された16S rRNA細菌遺伝子のV4超可変領域からのショートリードに基づいて以前に発表された結果、例えば、FMT後にP. copriが著しく増加したことと一致しています（引用3）。興味深いことに、潰瘍性大腸炎（UC）の治療に関する最近のFMT研究では、ショートリードの配列解析によって微生物叢が解析され、介入の結果としてSutterella種の増加も示されたCitation28 同様に、抗生物質耐性菌の根絶を目的としたFMT介入の結果としてButyricimonas種の存在量が増加したCitation29 これらの結果は、レシピエントの状態にかかわらず、ヒトにおけるFMTによって頻繁に変化が見られる種もあることを示唆しています。しかし、短鎖アンプリコン技術に基づくこれらの研究では、十分な解像度がないため、ドナーとレシピエントの間で推定される種の移動とその生着は確認できなかった。さらに、レシピエントにおける近縁種への置換の可能性は、ショートリードに基づく従来の微生物叢調査ではモニターしきれない可能性がある。株の多様性に関連すると思われるSNVを評価し、ドナーの微生物がレシピエントに移植されたことを示すrrnシーケンスアプローチの能力を明らかにするために、我々は、FMT後にレシピエントの腸内で著しい増加を示したP. merdaeと、FMT介入に影響を受けないように見えたF. prausnitziiを選択して概念実証分析を計画しました。P. merdaeのrrn配列から得られた様々な情報量のSNVに関する情報を総合すると、FMT後にレシピエントで観察されたこの種の増加は、ドナーからの株移動が原因である可能性が高いことが明らかになった。この推測は、本研究で評価したサンプル、または公開リポジトリに存在するゲノムデータで、異なるシーケンス手法に由来するNanoporeデータ処理から推測されるヌクレオチドバリアントの存在によってさらに支持されます。
今回のシーケンサーによる分類学的解像度は、ドナーからレシピエントへの特定の細菌株の移行を証明し、種レベルでの部分的な群集構造を描き、FMTの結果としての組成上の距離とそのシフトを決定するのに役立ちました。この戦略により、腸内細菌叢の変化とレシピエントの臨床変数の改善との間の因果関係をより強固に裏付けることができた。この観点から、我々は、代謝健康度の全体的な改善（グローバルスコア）が、ドナーおよびレシピエントの微生物群集のベースラインの非類似性およびFMT後の微生物叢構成のシフトと関連していることを示そうとした。ドナー・レシピエントペアの腸内細菌叢がベースラインで類似しているほど、微生物叢の移行と代謝パラメータの改善が良好であることが確認された。しかし、この関係はすべてのペアで証明されたわけではない。おそらく、FMTの臨床的成功を確実にするための最適なドナーの選択には、まだ決定されていないドナーとレシピエントの追加的な特徴を考慮する必要があるのだろう。そのような未知の追加要因の1つが、レシピエントとドナーの性別である可能性がある。実際、女性のレシピエントは男性よりもFMT後のメタボリックヘルススコアが高いことが確認された。ドナーとレシピエントの性別が一致していることから、i）レシピエントの性別に関係なく女性の糞便がより良く移植されるかどうか、ii）FMT材料の性別に関係なく女性がFMTに良く反応するかどうかを調べるには、男女混合分布でのさらなる研究が必要である。我々は以前、特定の食事介入に対する女性と男性の腸内細菌叢の反応の違いを明らかにしたことがあり、このような性差に関連する微生物の構成と関連する形質がFMTの成功をもっともらしく説明できることを示唆しているCitation30 それにもかかわらず、IBSの文脈における過去のFMT介入では女性と男性の間で反応の違いがないCitation31 最後に、FMTに対する個人特有の反応は無視できない。我々の試験では、ドナー1からの材料は3人の異なる受信者の代謝健康に最もポジティブな影響を及ぼした。したがって、ドナーの個人的特徴、特に腸内細菌叢の組成と代謝の可能性に影響を与えるもの（例：食事、ライフスタイル）、および他の宿主の共変量（例：年齢）がFMTの成功に及ぼす役割については、ドナーの選択をより適切に導き、代謝の健康を改善する微生物シグネチャーを特定するためにさらに調査する必要があります。
結論
今回発表された分子的手法とデータ解析により、最も豊富なヒト腸内細菌種を考慮した、種レベルでの信頼性の高い微生物調査と菌株変異の推論が可能になりました。我々の知る限り、これはFMT臨床試験に参加したドナーとレシピエントから得られた糞便サンプルの微生物相評価で、アンプリコンシーケンスを用いて菌株レベルでの遺伝的多様性を探ることにより、特定の細菌種の移行と生着を実証した最初の例である。今回用いた高度なシークエンス手法から得られた遺伝子および分類学的情報により、腸内細菌叢の移行およびFMTの臨床的成功に対するドナーの影響を評価することができました。成功の決定要因としては、ドナーとレシピエントのベースライン微生物叢構成の高い関連性、ドナーの性別と年齢が挙げられ、これらは腸内微生物の移植とメタボリックシンドロームマーカーの改善に影響すると考えられる。より大規模な介入試験で我々の知見を確認し、その予測値を実証するために、さらなる研究が必要である。
材料と方法
被験者、サンプル、臨床データ
サンプルは、2014年9月から2017年3月にかけてMyNewGutプロジェクト（http://www.mynewgut.eu/）の枠組みで実施された過去のFMT臨床試験の参加者からインフォームドコンセントを得た上で入手しました。研究デザインの詳細は、別の場所で公開されています引用3簡潔に言えば、本研究では合計24個の糞便サンプルを分析しました。20のサンプルは、同種FMTを受けた10人のレシピエントから得られ、介入前に1つのサンプル（PRE-FMT糞便サンプル）および介入4週間後に1つのサンプル（POST-FMT糞便サンプル）を提供しました。4人のドナーのサンプルも分析され、この変数がレシピエントに与える影響もデータ分析で考慮された。このサンプルのサブセットは、主に、共通のドナーを持つ複数のFMTレシピエントにおける種間移植の差異を探るために評価されました。本研究で評価したサンプルサイズは、この介入群について以前に説明したパラメータ（両側有意水準0.05、検出力80％、最小サンプルサイズ＝10）によれば、依然として代表的なものである。引用3 正規性検定は、調査した臨床変数の変化を評価するためのパラメトリックまたはノンパラメトリック検定を行う前に完了した。
DNA抽出、マルチローカスアンプリフィケーション、シークエンス
微生物DNAは、QIAamp® Fast DNA Stol Miniキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用い、製造者の指示に従い、長さ5kbpのアンプリコンを増幅するのに必要な高分子量のDNAを保存するために機械的方法（ビーズビート）による細胞破壊を省略し、100mg糞便試料から回収した。ほぼ全長の細菌RNAリボソームオペロン（16S、ITS、23S）を構成するrrn領域は、既報の通り増幅した。引用16 二重バーコード精製PCR産物は、配列決定ライブラリー調製の前に等モルの割合で混合された。SQK-LSK108 シークエンシングキット（Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK）を用いて、1Dリードを生成するために、製造者の指示に従って、混合アンプリコンDNA（7、8または10のバーコード付きサンプルを含む）〜1μgから合計3種類のライブラリーを作成した。各ライブラリーをFLO-MIN107 (R9.5) フローセル (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK) に個別にロードし、MINKNOW v1.10.23 software (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK) を用いて、ポータブル MinION™ MkIb sequencer (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK) でシーケンシングを実施しました。フローセルはメーカーの指示に従いプライミングされ、その後、各ライブラリーとフローセルについて、18時間程度の1Dシーケンス（このマルチプレックスとアンプリコンセットアップでは2Dアプローチより優れており、バーコード+プライマータグの使用によりデマルチプレックスを改善）が実行されました。
データ前処理
Fast5ファイルはAlbacore v2.1.3 basecallerとデフォルト設定（最小q-score filter = 7）で処理し、下流の解析用にFastaファイルを取得した。バーコードとプライマー（フォワードまたはリバース）の配列情報は、以前の手順に従って、フォワードプライマーとリバースプライマーから生成されたDNAリードへのデマルチプレックスに使用された。次に、フォワードおよびリバースリードの5'末端の50ヌクレオチドをトリミングすることにより、バーコードおよびプライマー配列を除去した。シーケンスケミストリーとNanoporeデータ処理アルゴリズムは、データが生成された2018年1月までに入手可能な最新のものでした。この解析の終了後にリリースされた高性能のbasecallerをfast5データでテストしたところ、配列品質に有意な差は得られなかった（図S4）。
rrn領域のアセンブリ
研究デザインとrrn配列の組み立てを図1に図解した。このパイプラインは、以下のステップを経て、rrn領域再構成のためのストランドワイズおよびリファレンスアシスト法と呼ばれるものを実行します：
バーコードとプライマーの配列情報を用いてNanoporeデータを再多重化し、rrnアンプリコンの5´末端から始まるDNAリード（16S rRNA遺伝子開始部位のフォワードプライマーマッピングから開始されたリード＝フォワードリード）とrrnアンプリコンの3`末端で始まるDNAリード（23S rRNA遺伝子終了部位のリバースプライマーマッピングから開始されたリード＝リバースリード）を含むサンプルごとの二つのデータセットが得られた。
全24サンプルのリードは、フォワードリードとリバースリードのサブセットにマージされました。
非冗長16S NCBIデータベース（2018年1月リリース）に対する競合アライメントを介して、正確な微生物種にフォワードリードをビニングした。この目的のために、-s 2 -q 1 -b 1 -Q 0 -a 1 -r 1の構成を持つLAST alignerCitation32が使用された。アライメントスコアは、トップヒットを選択するための主な基準であった。同じトップスコアを持つ複数のヒットの場合、アライメントは下流処理のために破棄された。配列同一性（33パーセンタイル以上の配列同一性≧85％）と長さ情報（アラインメント≧1500nt）に従って、高品質のアラインメントを保持した。
高品質のアラインメントを生成する1種あたり最大500本のフォワードリード（ランダムにシャッフル）を選択し、MAFFT v7.310に実装された反復精密化法を用いてデフォルトパラメータでアラインし、HMMER3に実装されたhmmbuildおよびhmmemitアルゴリズムを用いて合意配列を得たCitation33。ナノポアデータをサポートするアセンブラー（解析時点で一時的に利用可能）を用いてde novoコンセンサス配列を作成するテストを行ったが、データ間のカバレッジバイアスのため、期待される種レベルの多様性を裏付ける出力を得ることはできなかった。
コンセンサス配列は、NCBI分類法に従って注釈を付け、フォワードリードに使用したのと同様の方法でリバースリードをビン詰めするための基準として使用された。リバースリードに基づく高品質なアラインメントの選択とrrn領域の予備的なアセンブリのための閾値は、85％の配列同一性（上位45パーセンタイル）と≧3500 ntの長さだった。
リバースリードは、フォワードリードのアセンブリから得られたコンセンサス配列と比較し、NCBI分類学的アノテーションに従ってそれぞれの種にビニングした。高品質なアラインメントを生成する1種につき最大500本のリバースリード（ランダムにシャッフル）を選択し、同じ種に相互に割り当てられた最大500本のフォワードリード（ランダムにシャッフル）とマージし、MAFFTに実装された反復精密化手法でアラインメントした後、HMMER3に実装されたhmmbuildとhmmemitアルゴリズムを使って新しいコンセンサス配列を得た。
最終的なコンセンサス配列は、フォワードリードとリバースリードから得られた、一致するNCBI分類法に従ってアノテーションされ、腸内細菌叢メンバーの存在量と有病率を種レベルで研究するための参考資料として使用されました。
再構築および同定されたオペロンの公共データベースにおける表現を評価するために、非冗長核酸および参照16S NCBIデータベースに対するrrnアセンブリのBLASTベースの検索が行われた。トップヒットの選択は、TS = Log10[アライメントスコア配列同一性アライメント長]のタクソノミースコアに基づいて行われ、SINAアライナーを使ってSILVAデータベース（引用35）と比較した。
ロングリードのマッピングとバリアントコール
rrn databaseCitation16は、本研究で組み立てた200以上の新しいrrnオペロン配列（operontと表示）で更新し、NCBI分類学データベースに従って異なる分類学レベルに再アノテーションした。サンプルリードのマッピングは、上記のようにLASTアライナーを用いた競合アライメントにより、rrn_DBv2 (https://github.com/alfbenpa/rrn_DBv2)に対して実施した。分類学的な割り当ては、TS（上記参照）の計算によって得られた最良のヒットに基づいて行い、信頼できる分類学的割り当ては、1500 ntより長い、少なくとも85％の配列同一性を持つアラインメントに基づくものにフィルタリングされた。種のリードカウントは、compositions::clr R v3.6関数を用いて正規化し、共変量制御線形混合モデルベースの方法を用いて、以下の段落に記載されているように条件間の分類学的特徴の存在量の差異を探索した。種の移植は、Parabacteroides merdaeとFaecalibacterium prausnitziiの種にマッピングされたすべてのサンプルリードの選択によって評価された。菌株の変異に関連すると思われる一塩基変異に基づく有益な部位を検出するために、まず、LAST alignerと本研究で設定したパラメータ（rrn assembly参照）を使用して、これらの種に一致するすべてのサンプルリードをそれぞれの参照rrn配列にマッピングすることを進めた。それぞれのSAMファイルを生成するために、maf-convertアルゴリズム（LAST aligner toolkit）が使用された。SAMtools v1.3.1に含まれるアルゴリズムを使用して、リードのインデックス付け、順序付け、パイルアップ、および部位ごとの塩基頻度とカバレッジに関する情報を取得した（vcfファイル）。サイトの選択は、ヌクレオチドの優位性がなく（単一ヌクレオチドの頻度が70%未満）、カバレッジが低下していない（相対カバレッジの75%以上）rrn位置に基づき、すべてのサンプルで株の変異を表す可能性が高い少なくとも二つの優勢な対立遺伝子をバランスよく表現するサイトを得るために行われました。次に、参照種にマッピングされたサンプルのリードを個別に評価し、レシピエントPRE-FMTとPOST-FMTサンプル間の腸内細菌遺伝子型における意味のある変化を検出した。選択したすべてのSNV部位（P. merdaeについては3箇所、F. prausnitziiについては6箇所）における塩基頻度の変化は、POST-FMTとPRE-FMTサンプル、またはPOST-FMTと対応するドナーサンプルのペアについて、ウィルコクソン署名順位検定を用いた統計的評価後に、Bray-Curtis類似度指数を計算することにより評価した。
サンガーシーケンスとparabacteroides merdae SNVsのバリデーション
P. merdaeの参照rrn配列をPrimer-BLAST web server (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)に提出し、このrrn配列とSNV-1254、SNV-2293、SNV-3527をSanger sequencing用に選択的に増幅する種特異的プライマー対を取得した。プライマー予測のチェックパラメータとして、NCBIデータベースとの比較、参照生物としてParabacteroides merdae [taxid:46503] を固定しました。P.merdaeのrrn領域は、以下の段階を含む28回のPCRサイクルを経て増幅された： Phusion High-Fidelity Taq Polymerase（Thermo Scientific）、pm623（TGCCGTTGAAACTGGTTACTTGA）およびpm3785（TTTCGCACAGCCATGTGTTGTT）プライマー対を増幅反応に使用した。PCR産物をIllustra GFX PCR DNA and gel band purification kit (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)で洗浄し、ABI 3730XL sequencer (STAB-VIDA. Caparica, Portugal)でpm1855 (ACCCCTTACGAGTTTATCGTGGA) および pm2686 (TTCGCGTCTACTCACTCCGACTAT) に加えて上述のプライマ（ pm623および pm3785）を用いてサンガー技術を利用して配列決定した。ab1ファイルのシーケンスエレクトロフェログラムは、FinchTV v1.4.0 (Geospiza Inc.)で可視化した。
種レベルでの多様性と分類学的解析
データベースに含まれる合計 2,519 種の有病率と存在度を評価し、平均 0.01% 以上の相対存在度を持つ種（合計約 250 種）を考慮し、多様性分析を行った。QIIME v1.9.1 を用いて、Chao の指数、Shannon のエントロピー、Simpson の逆数指数、優性などのアルファ多様性記述子を求めた。Citation37 同様に QIIME を用いて、サンプル間の Bray-Curtis 異同指数の算出、多変探索分析（主座標分析 - PCoA）と統計分析（PERMANOVA）を実施した。また、介入前後の微生物叢の差分特徴を検出するために、clr変換したデータに対して線形混合モデル（LMM - nlme::lme R v3.6 function）分析を実施した。個々の特徴による固有の変動は、分析した各変数のランダム効果として設定した（固定効果）。臨床および糞便微生物叢の共変量のうち、試験群間で差異が認められた（p値≦0.05）可能性のあるものを選択した。年齢、性別、ベースラインBMI、シーケンスバッチなどの微生物叢の認識された共変量は、本研究で有意であると確認され、LMMにランダム効果として含まれた。FMTの結果として変化した臨床変数と潜在的に関連する微生物種を特定するために、変数ペア間でKendallのτ（tau）パラメータを推定し、偽発見率（FDR）アプローチを使用して多重検定で補正した。関連は、FDR p値≦0.1に従って選択された。グラフはR v3.6でggplot2パッケージを使用して作成した。
補足資料
補足資料
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謝辞
著者らは、バレンシア共同体の欧州地域開発基金（ERDF/FEDER）2014-2020の共同資金によるクラスターへのアクセスを提供してくれたプリンシペ・フェリペ研究センター（CIPF）のバイオインフォマティクスと生物統計ユニットに感謝します。
情報開示について
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。
データおよび資料の利用可能性
特定のランで得られたAlbacore-basecalled fast5ファイルは、European Nucleotide Archiveのアクセッション番号PRJEB33947で一般に公開されています。更新されたrrnデータベース（rrn_DBv2）は、GitHubリポジトリ https://github.com/alfbenpa/rrn_DBv2 で一般に公開されています。
著者の貢献
ABPは、本研究を構想し、設計した。ABPは実験的な配列研究とデータ解析を行い、AVHとMNは臨床研究を行った。ABPとYSが研究を指揮した。ABPとYSは原稿を執筆した。すべての著者が最終版の原稿を確認し、承認した。
倫理的承認と参加への同意
本研究は、オランダの治験登録機関（https://www.trialregister.nl/trial/4488）に前向きに登録され、ヘルシンキ宣言に定められたガイドラインおよびアムステルダムUMC（所在地AMC）の人体実験に関する担当地方委員会の倫理基準に従って実施された3。本研究は、2014年8月1日に登録された。最初の参加者は2014年9月1日に登録された。
補足資料
本論文の補足データは、オンライン（https://doi.org/10.1080/19490976.2022.2078621）で閲覧できます。
追加情報
ファンディング
本研究は、欧州委員会第7次枠組み計画のEUプロジェクトMyNewGut [No.613979] および科学イノベーション省（スペイン）の助成金 [PID2020-119536RB-I00] によって支援されました。また、本研究は、カルロス3世健康研究所（ISCIII）のABPに対するMiguel Servetプログラムの[CP19/00132]助成金と欧州社会基金（ESF/FSE）からの共同出資により完成しました。
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