潰瘍性大腸炎に対する腸内細菌叢の腸型：機械学習を用いた主要細菌種の同定と菌種共起ネットワークの解明

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腸内微生物
第16巻 2024年 - 第1号
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研究論文
潰瘍性大腸炎に対する腸内細菌叢の腸型：機械学習を用いた主要細菌種の同定と菌種共起ネットワークの解明

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2023.2292254

Xuangao Wu,Ting Zhang,TianShun Zhang &Sunmin ParkORCIDアイコン
論文 2292254｜2023年05月03日受理、2023年12月04日受理、オンライン公開：2023年12月20日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2292254
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要旨
潰瘍性大腸炎（UC）は、結腸と直腸を侵す慢性の炎症性腸疾患であり、その病因は遺伝的背景、環境因子、腸内微生物に起因すると考えられている。本研究では、UCにおける腸内細菌型の役割を明らかにすることを目的とし、階層的解析、機械学習による差異菌の決定、Species Co-occurrence Network（SCN）解析を行った。UC患者から糞便細菌データを収集し、QIIME2バイオインフォマティクスパイプラインを用いて16S rRNAメタゲノム解析を行った。腸型クラスタリングを家族レベルで行い、各腸型におけるUCと健常対照（HC）についてディープニューラルネットワーク（DNN）分類モデルを学習した。11の16S rRNA腸内細菌叢データセットから得られた結果から、3つの腸型が明らかになった： Bacteroidaceae（ET-B）、Lachnospiraceae（ET-L）、Clostridiaceae（ET-C）であった。ルミノコッカス（R. gnavus）の存在量は、ET-BおよびET-CのUC被験者ではET-Lの被験者よりも有意に高かった。R.gnavusはまた、ET-BおよびET-C被験者において、UC SCN中のClostridiaと正の相関を示し、ET-C被験者ではより高い相関を示した。逆に、Odoribacter (O.) splanchnicusおよびBacteroides (B.) uniformisは、トリプトファン代謝およびAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）シグナル伝達経路と正の相関を示したが、R. gnavusは負の相関を示した。クロストリジウム（C. difficile）を用いたin vitro共培養実験では、ET-B型被験者の糞便微生物叢は、ET-L型被験者よりもC. difficileの存在量が高いことが示された。結論として、ET-B腸型はUCになりやすく、R. gnavusが潜在的な危険因子であり、O. splanchnicusおよびB. uniformisが防御菌である。

keywords: 潰瘍性大腸炎腸内細菌タイプ腸内マイクロバイオームR. gnavusO. splanchnicusB. uniformism機械学習共発生ネットワーク
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はじめに
潰瘍性大腸炎（UC）は腸組織を侵す慢性炎症性疾患であり、寛解と再発を繰り返すのが特徴である。引用1 軽度の無症状の段階から広範な大腸炎症へと進行し、血便、大腸運動機能障害、組織損傷、線維化を引き起こす。 引用1 UCはまた、腸内細菌叢組成の異常、粘液表面のバリア恒常性の破綻、以前は無菌であった粘液層への細菌感染の増加を特徴とする、特異的な腸内細菌異常症に対する過剰に攻撃的な粘膜免疫反応であるとも考えられている。

腸内細菌叢は宿主の代謝プールに影響を与え、短鎖脂肪酸（SCFA）を含む様々な代謝産物を産生する。 引用6 酪酸は腸管上皮細胞の主要なエネルギー源として機能し、制御性T細胞の発達を促進し、杯細胞による粘液分泌を亢進させて腸管粘膜バリアを維持する。

Citation9腸内細菌型は、Bacteroides、Prevotella、およびRuminococcusに大別される。Citation9しかしながら、異なるクラスタリングおよびグループ化戦略を用いた研究では、不均一な結果が得られており、特定の腸内細菌型は、特に直腸がんや糖尿病などの疾患と関連しているCitation10,Citation11。

ハイスループットシーケンスの急速な発展により、疾患に関連する腸内細菌叢データが大幅に増加している。機械学習アプローチは、データマイニングを通じて疾患に関連する腸内細菌叢マーカーを同定するための効果的な手法となっており、がん、糖尿病、認知症研究への応用が期待されている。Citation12 腸内細菌叢は、相互摂食、競合、共生などの相互作用を含む複雑な生態系である。Citation13 にもかかわらず、腸内細菌叢研究のほとんどは分類と機能的反応に焦点を当てており、腸内細菌叢の相互作用が疾患に及ぼす影響や、異なる疾患における腸型間の相互作用についてはほとんど理解されていない。

本研究では、ディープニューラルネットワーク（DNN）分類モデルを革新的に用いて公開データベースからUCデータを解析し、様々な腸型間でUCに影響を及ぼす共生細菌の違いを深く掘り下げた。我々は、異なる腸型のUC被験者および健常対照者（HC）において、腸内細菌叢マーカーおよび他の腸内細菌叢との共生関係を同定した。

研究結果
研究の選択
UC被験者と健常対照者の腸内細菌叢に関する11の研究を対象とし、研究集団は米国人、日本人、中国人のコホートであった（表1）。いずれの研究もサンプルサイズは小さかった。すべてのデータはプールされた16S rRNAメタゲノム解析のためにダウンロードされた。HCの有無にかかわらず、10件のUC研究の糞便中細菌データが、複合研究のために選択された。しかし、2つの研究（PRJNA541040とPRJNA50637）にはHCが含まれておらず、NIH HMPには米国からの多数のUC患者が含まれていた。収集されたデータにおけるUC群とHC群の比率にかなりの格差があるのは、PRJNA50637のデータにはアメリカのUC患者のデータが大量に含まれていたが、HCのデータは含まれていなかったことに起因する。HCは、炎症性腸疾患の研究（PRJNA296920とPRJNA386260）から追加され、両プロジェクトの参加者は、米国で実施されたPRJNA386260に対応し、年齢も一致した。

表1. メタ解析の対象となった研究の情報。

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UCコホートからの873検体、HCからの746検体を含む合計1619検体が解析された。QIIME2のDADA2は、プラグインやプログラムの違いによる様々な配列の品質管理への影響を避けるため、品質管理に統一的に採用された。16S rRNAのQIIMEメタゲノム解析後、1328サンプルが残り、その内訳はUCコホートから621サンプル、HCから707サンプルであった（表1）。本研究には8つの異なるデータセットが含まれることを考慮し、主座標分析（PCoA）をプロットして、結果におけるコホートに起因する偏りや影響を観察し、潜在的なバッチ効果を統計的に同定した（P < 0.001）。PCoAダイアグラムの分布によると、バッチ効果はUC単独のPRJNA50637試験とHC単独のPRJNA296920試験とPRJNA386260試験にほぼ限定され、他の試験のデータは3試験の中間にあることがわかった。手法にもよるが、マイクロバイオームデータのバッチ効果補正ツールは通常、症例対照群を含む各研究のメタデータを必要とする。しかし、公開データでは関連情報が限られていたため、Citation14-16のバッチ補正を行うことはできなかった。腸内コミュニティは頑健な性質を持っており、わずかな摂動は通常、微生物ネットワークの全体構造にはほとんど影響を及ぼさないため、ネットワークを統合し、ネットワーク・サブモジュールの小さな変化を観察することは合理的な戦略であったかもしれない（補足図S1）。

腸型と生物多様性解析
腸型解析では、最適なクラスター数は3であることがわかった。全コホートの腸型Citation9の属レベルの主成分分析（PCA）プロットは、3つのグループに分けたとき、各腸型がよく分離していることを示した（図1a）。3つの腸型について、科レベルと属レベルの両方で支配的な分類群を比較した。科レベルでは、他の3つの腸型について、それぞれLachnospiraceae、Bacteroidetes、Clostridiaceaeとして有意に優勢な分類群を同定した（図1c、P < 0.05）。属レベルでは、バクテロイデス属とクロストリジウム属が2つの腸型に対して有意に優勢な属として同定された（図1d、P < 0.05）。同定された3つの腸型は、腸型Bacteridaceae（ET-B）、Lachnospiraceae（ET-L）、Clostridiaceae（ET-C）のように、科レベルで主な細菌にちなんで命名された（図1c）。統計解析にカイ二乗検定を適用した結果、UC群とHC群の腸型分布に有意差が認められた。ET-C、ET-B、ET-LにおけるUC群の割合を算出した。ET-C、ET-B、ET-Lの腸型群におけるUCの割合は、それぞれ100％、72.2％、20.5％であった（図1b）。カイ二乗検定に基づくと、UC患者の割合は、ET-B、ET-L、ET-C腸型間で有意に異なっていた（図1b、P < 0.05）。

図1. 腸内細菌叢に基づくUCおよびHC患者における3つの腸内細菌型の特徴と分布。潰瘍性大腸炎（UC）；健常対照（HC）；ET-B：腸内細菌型（Bacteridaceae）；ET-L：腸内細菌型（Lachnospiraceae）；ET-C：腸内細菌型（Clostridiaceae）。(a)3つの腸内細菌型の主成分分析（PCA）図は、科レベルの糞便微生物に基づいて描かれた。(b）各腸型におけるUCとHCの数。カイ二乗検定を用いて、各腸型間の人数の有意差を数えた。(c)各腸型における上位6科の分類群の相対的存在量。Tukeyのpost-hoc検定を採用し、腸型間の有意差を同定した。有意差を示した分類群には、わかりやすくするために英文字で注釈をつけた。(d)各腸型における上位6属の相対的存在量。Tukeyのpost-hoc検定を用いて、腸型間の有意差を同定した。有意差を示した分類群には、わかりやすくするために英文字で注釈をつけた。

図1. 腸内細菌叢に基づくUCおよびHC被験者の3つの腸内型の特徴と分布。潰瘍性大腸炎（UC）；健常対照（HC）；ET-B：腸内細菌型（Bacteridaceae）；ET-L：腸内細菌型（Lachnospiraceae）；ET-C：腸内細菌型（Clostridiaceae）。(a)3つの腸内細菌型の主成分分析（PCA）図は、科レベルの糞便微生物に基づいて描かれた。(b）各腸型におけるUCとHCの数。カイ二乗検定を用いて、各腸型間の人数の有意差を数えた。(c)各腸型における上位6科の分類群の相対的存在量。Tukeyのpost-hoc検定を採用し、腸型間の有意差を同定した。有意差を示した分類群には、わかりやすくするために英文字で注釈をつけた。(d)各腸型における上位6属の相対的存在量。Tukeyのpost-hoc検定を用いて、腸型間の有意差を同定した。有意差を示した分類群には、わかりやすくするために英文字で注釈をつけた。
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参加者全体では、HC被験者グループのシャノン多様性指数がUCグループのそれよりも有意に高かった（図2a、P < 0.05）。また、ET-BとET-Lを持つ腸型サブグループでは、UC群よりもHC群で有意に高いシャノン多様性指数が観察された（図2b,c、P < 0.05）。Bray-Curtis距離に基づくPCoAプロットでは、UC群とHC群はよく分離しており、並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）統計は、総参加者における群間の有意差を示した（図2d、P < 0.05）。ET-Bのβ多様性の結果では、HCとUCの間にある程度の重複が観察され、ET-Lにおける明確な分離とは明らかに異なっていた（図2e、P < 0.05）。しかし、HC検体はUC検体と重なる部分があっても、微生物群集の多様性はUC検体より有意に高かった。UCクラスターと重なるHC参加者はUCになりやすい可能性があり、HCとUCの重なりはET-Bで高く、UC発症リスクが高い可能性がある。ET-L腸型では、Bray-Curtis距離に基づくPCoAプロットでも、UC群とHC群はよく分離していた。PERMANOVA統計では有意差が示された（図2f、P < 0.05）。これらの観察から、病態の変化は異なる腸型間で異なる可能性が示唆された。このような違いは、β多様性だけでは完全には捉えられないかもしれない。その代わりに、さらなるネットワーク分析によって、異なる腸型間のコミュニティ関係を観察する必要があるかもしれない。

図2. シャノン指数によるα-多様性とBray-Curtis法によるβ-多様性。(a)参加者全体におけるα-多様性シャノン指数。(b) ET-Bにおけるα-多様性シャノン指数。(c) ET-Lにおけるα-多様性シャノン指数。(d) 参加者全体のβ多様性。(e) ET-Bにおけるβ-多様性。(f) ET-Lにおけるβ-多様性。シャノン指数はウィルコクソン検定、β多様性は並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて有意性を分析した。数値は有意水準を示した。潰瘍性大腸炎、UC；健常対照、HC；ET-B：腸型バクテロイデス科コホート、ET-L．PCoA： 主座標分析。

図2. Shannon指数によるα-多様性とBray-Curtis法によるβ-多様性。(a) 全参加者におけるα-多様性シャノン指数。(b) ET-Bにおけるα-多様性シャノン指数。(c) ET-Lにおけるα-多様性シャノン指数。(d) 参加者全体のβ多様性。(e) ET-Bにおけるβ-多様性。(f) ET-Lにおけるβ-多様性。シャノン指数はウィルコクソン検定、β多様性は並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて有意性を分析した。数値は有意水準を示した。潰瘍性大腸炎、UC；健常対照、HC；ET-B：腸型バクテロイデス科コホート、ET-L．PCoA： 主座標分析。
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DNN分類モデルの構成と性能
様々な設定を試した結果、上記の構成で学習させた分類モデルが最高の性能を達成した。全体、ET-B、ET-Lの参加者に対するDNNモデルの受信者動作特性曲線（AUC）値は、0.93から0.96の範囲であった。精度は0.88～0.93、感度は0.78～0.94、特異度は0.71～0.97、精度は0.86～0.89、F1は0.81～0.91であった（補足図S2および表S1）。

全コホートにおけるSHapley additive exPlanations（SHAP）インタープリターとネットワーク解析
SHAPインタープリターにより、DNN分類器で重要と考えられる微生物の上位20種を取得し、UCまたはHCへの分類の偏りを決定した（補足図S3a）。合計15菌種がHC群に、5菌種がUC群に偏っていた（補足図S3a）。ET-BコホートのSHAPインタープリターでは、重要なUC関連種の上位2種はFusicatenibacter saccharivorans（F. saccharivorans）とRuminococcus gnavus（R. gnavus）であり、HC関連種はOscillibacter valericigenes（O. valericigenes）とBacteroides faecis（B. faecis）であった。20分類群について箱ひげ図を作成し、Wilcoxon順位検定を行った（補足図S3b）。すべての分類群について有意差が認められた（P < 0.05；補足図S3b）。DNNによって選択された細菌をspecies cooccurrence network (SCN)で可視化したところ、HC群では共生細菌が強固に結合した細菌ネットワークが形成されていた。一般的な酪酸産生菌であるFaecalibacterium prausnitzii (F. prausnitzii)は17個の結合を有していた（補足表S2）。また、ネットワークにおける役割を評価するために、各細菌の相関係数の絶対値も加えた。F. prausnitziiの相関係数値の最大和は6.85であり、HC群の共起ネットワークにおける潜在的重要性を示した（補足表S2）。UC群ではErysipelatoclostridium ramosum（E. ramosum）やR. gnavusなどの共生細菌が密な負のつながりを示したが、HC群ではLoriellopsis cavernicola（L. cavernicola）が負のつながりを示した（補足図S3c）。中でもE. ramosumとR. gnavusは最も結合数が多く、互いに密接な正の相関があった（補足図S3c）。

ET-LコホートにおけるSHAPインタープリターとネットワーク解析
また、ET-LコホートだけでDNN分類器を訓練し、上位20の主要細菌種を得た。DNNによって同定されたUC群のET-Lコホートの細菌は、全群の細菌とは全く異なっていた（図3a）。20分類群について箱ひげ図を作成したところ、Lachnoclostridium pacaense (L. pacaense)とClostridium spiroforme (C. spiroforme)を除くすべての分類群で有意差が認められた（ウィルコクソン順位検定によるP < 0.05；図3b）。この結果は、病原性細菌の異なる生態系ネットワークが、異なる腸型におけるその増殖と生存に影響を与えている可能性を示唆している（図3c）。なかでもUC群では、Dorea formicigenerans（D.ホルミシゲネランス）の接続数が最大で、SCNでは最大14接続であった（補足表S3）。HC群では、Odoribacter splanchnicus（O.splanchnicus）とBacteroides uniformis（B.uniformis）の接続数が最も多く、それぞれ13接続であった（補足表S3）。この結果から、O. splanchnicusとB. uniformisはUCに対して保護的である可能性が示唆された。

図3. 図3. SHapley additive exPlanations（SHAP）インタープリターと腸型Lachnospiraceae（ET-L）キューの種共起ネットワーク（SCN）ディープニューラルネットワーク（DNN）。(a)SHAPインタープリターは、DNN分類器における微生物固有の重要度分析を行うために使用された。中央の線は健常対照（HC）分類では左に偏っており、潰瘍性大腸炎（UC）分類ではその逆である。散布点の色は、特徴量の相対的な多さが分類に与える影響を表す。DNNネットワークの学習に使用した変数は、UC群とHC群で有意に異なる微生物種である。(b)SHAP蜂群プロットに含まれる20分類群の箱プロットで、数字は対応するウィルコクソン順位和検定における有意水準を示した。(c) DNN分類器で重要な腸内微生物を用いてSCNを構築した。SHAP重要度を用いて上位20細菌を決定し、ネットワーク図を描いた。SHAPビーコロニーダイアグラムとUCとHCの平均値により、UCに属するかHCに属するかを判定した。SCNにおいて、組成データの疎相関（SparCC）相関係数が0.1未満の接続はすべて削除した。赤いエッジは正の相関、青は負の相関、太さは絶対相関係数の大きさ、黄色のノードはHCグループ、紫はUCグループ、ノードの大きさは相対的な存在量を表す。

図3. SHapley additive exPlanations（SHAP）インタープリターと腸型Lachnospiraceae（ET-L）キューの種共起ネットワーク（SCN）ディープニューラルネットワーク（DNN）。(a)SHAPインタープリターは、DNN分類器における微生物固有の重要度分析を行うために使用された。中央の線は健常対照（HC）分類では左に偏っており、潰瘍性大腸炎（UC）分類ではその逆である。散布点の色は、特徴量の相対的な多さが分類に与える影響を表す。DNNネットワークの学習に使用した変数は、UC群とHC群で有意に異なる微生物種である。(b)SHAP蜂群プロットに含まれる20分類群の箱プロットで、数字は対応するウィルコクソン順位和検定における有意水準を示した。(c) DNN分類器で重要な腸内微生物を用いてSCNを構築した。SHAP重要度を用いて上位20細菌を決定し、ネットワーク図を描いた。SHAPビーコロニーダイアグラムとUCとHCの平均値により、UCに属するかHCに属するかを判定した。SCNにおいて、組成データの疎相関（SparCC）相関係数が0.1未満の接続はすべて削除した。赤いエッジは正の相関、青は負の相関、太さは絶対相関係数の大きさ、黄色のノードはHCグループ、紫はUCグループ、ノードの大きさは相対的存在量を表す。
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ET-BコホートにおけるSHAPインタープリター、ネットワーク解析、および未観測状態の再構成によるコミュニティ（PICRUSt2）機能予測結果
ET-BのSHAP interpreterでは、UCではDesulfovibrio simplex（D.simplex）とR. gnavusが、HCではO. splanchnicusとB. uniformisが存在量の上位2菌種であった。注目すべきことに、R. gnavusは参加者全員のSHAPインタープリターにも登場した（図4a）。20分類群について箱ひげ図を作成したところ、すべての分類群で有意差が認められた（ウィルコクソン検定でP < 0.05；図4b）。3.2節で示された結果に見られるように、ET-BコホートにおけるUCの割合はET-Lコホートよりも高く、ET-CコホートにはHCはいなかった。そこで、ET-Bと一般的な病原性細菌であるクロストリジウム属菌との間のネットワーク解析を行った（図4c）。R. gnavusは、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）、C. paraputrificum、C. perfringensと正の相関があった（図4c）。ET-Lコホートでは、O. splanchnicusとB. uniformisもHCにおける重要な細菌として同定された（図4b）。HC群では、SCNにおいてB. uniformisが最も接続数が多く、相関係数（3.94）が最も高かった（補足表S3）。SCNにおいて、B. uniformisはO. splanchnicusと正の相関を示し、R. gnavus、C. difficile、C. paraputrificum、C. perfringensと負の相関を示した（図4c）。

図4. SHapley additive exPlanations（SHAP）インタープリターと腸内細菌型バクテロイデス（ET-B）キューの種共起ネットワーク（SCN）ディープニューラルネットワーク（DNN）。(a)SHAPインタープリターは、DNN分類器における微生物固有の重要度分析を行うために使用された。中央の線は健常対照分類（HC）では左に偏っており、潰瘍性大腸炎（UC）分類ではその逆である。散布点の色は、特徴量の相対的な多さが分類に与える影響を表す。DNNネットワークの学習に使用した変数は、UC群とHC群で有意に異なる微生物種である。(b)SHAP群プロットに含まれる20分類群のボックスプロットで、数字は対応するウィルコクソン順位和検定における有意水準を示した。(c) DNN分類器で重要な腸内微生物を用いてSCNを構築した。SHAP重要度を用いて上位20細菌を決定し、ネットワーク図を描いた。SHAPビーコロニーダイアグラムとUCとHCの平均値により、UCに属するかHCに属するかを判定した。SCNでは、組成データの疎相関（SparCC）相関係数が0.1未満の接続はすべて削除した。赤のエッジは正の相関、青は負の相関、太さは絶対相関係数の大きさ、黄色のノードはHCグループ、紫はUCグループ、ノードの大きさは相対存在量を表す。(d)LDA効果量（LEfSe）におけるHC群とUC群の線形判別分析（LDA）スコア。 (e)ET-BコホートにおけるPICRUSt2が予測した腸内細菌叢機能のUC群とHC群の差分分析をLEfSeを用いて行った。LEfSeが有意差を示した機能と、SHAP解析におけるHCとUCの共通の炎症促進機能および重要菌との相関解析をヒートマップに描いた。

図4. SHapley additive exPlanations（SHAP）インタープリターと腸内細菌型バクテロイデス（ET-B）キューの種共起ネットワーク（SCN）ディープニューラルネットワーク（DNN）。(a)SHAPインタープリターは、DNN分類器における微生物固有の重要度分析を行うために使用された。中央の線は健常対照分類（HC）では左に偏っており、潰瘍性大腸炎（UC）分類ではその逆である。散布点の色は、特徴量の相対的な多さが分類に与える影響を表す。DNNネットワークの学習に使用した変数は、UC群とHC群で有意に異なる微生物種である。(b)SHAP群プロットに含まれる20分類群のボックスプロットで、数字は対応するウィルコクソン順位和検定における有意水準を示した。(c) DNN分類器で重要な腸内微生物を用いてSCNを構築した。SHAP重要度を用いて上位20細菌を決定し、ネットワーク図を描いた。SHAPビーコロニーダイアグラムとUCとHCの平均値により、UCに属するかHCに属するかを判定した。SCNでは、組成データの疎相関（SparCC）相関係数が0.1未満の接続はすべて削除した。赤のエッジは正の相関、青は負の相関、太さは絶対相関係数の大きさ、黄色のノードはHCグループ、紫はUCグループ、ノードの大きさは相対存在量を表す。(d)LDA効果量（LEfSe）におけるHC群とUC群の線形判別分析（LDA）スコア。 (e)ET-BコホートにおけるPICRUSt2が予測した腸内細菌叢機能のUC群とHC群の差分分析をLEfSeを用いて行った。LEfSeが有意差を示した機能と、SHAP解析におけるHCとUCの共通の炎症促進機能および重要細菌との相関解析をヒートマップに描いた。
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図4.

図4.
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線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析により、HC群とUC群に対応する腸内細菌を選択した（図4d）。PICRUSt2によって評価された各群に選択された腸内微生物の代謝機能は、UC群とHC群の間で微生物の生合成、代謝、およびシグナル伝達に有意な差があることを明らかにした（図4e）。相関ヒートマップを描くと、B. uniformisとO. splanchnicusは、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンの生合成、AMPKシグナル伝達経路、フルクトースとマンノースの代謝、チアミン代謝と高い正の相関を示した。しかし、UCのR. gnavus、C. perfringens、C. paraputrificum、C. difficileは、神経変性経路-上皮細胞への細菌の侵入、腫瘍壊死因子（TNF）シグナル伝達経路と正の相関を示した（図4e）。

ET-C腸型ネットワーク解析
ET-L、ET-B、ET-Cのうち、ET-CはUC患者のみを含んでおり、腸内微生物におけるクロストリジウム科細菌の相対存在量の増加がUCの主要な危険因子である可能性を示唆している。ET-Cは健康な人の典型的な腸内細菌型ではなく、特定の疾患状態で発生する可能性がある。ET-BはET-LよりもUC患者の割合が高く、以前の研究結果17と同様であった（図1b）。そこで、SCNを用いてET-Bの細菌と比較するため、ET-C群の細菌に注目した。まず、各腸型におけるET-Bの重要なUCおよびHC微生物の相対的存在量を比較した（表2）。B. fragilis、Phocaeicola doreiおよびD. simplexは、UC群の他の2つの腸型よりもET-B群で有意に多かった（表2、P < 0.05）。R. gnavusはET-BとET-CでET-Lよりも有意に高く、ET-Cの相対存在量はET-Bよりも0.52高かった（表2、P < 0.05）。HCのAnaerostipes hadrus（A. hadrus）、Bifidobacterium longum（B. longum）、Bacillus luti（B. luti）、F. saccharivoransおよびO. splanchnicusは、ET-Lで他の2つの腸型よりも有意に高く、ET-BのO. splanchnicusはET-Cよりも有意に高かった（表2、P < 0.05）。ET-BとET-LのB. uniformisはET-Cより有意に高かった（表2、P < 0.05）。

表2. 各腸型におけるET-B群UC菌およびHC菌の相対的存在量。

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UCの細菌ネットワークを比較したところ、ET-C UCネットワークでは、ET-B UCネットワークと比較して、HC細菌であるAkkermansia muciniphila（A. muciniphila）、B. faecis（B. faecis）、B. uniformis（B. uniformis）、Parabacteroides merdae（P. merdae）、Gemmiger formicilis（G. formicilis）、Lachnospira eligens（L. eligens）が減少していた（表2および補足図S4）。HC群の残りの微生物の存在量もET-Cで有意に減少した（表2および補足図S4）。R.gnavusは前回のET-B解析でUCの有害微生物として同定されたが、ET-C解析でも同様の傾向が観察された。ET-B解析では、R. gnavusはすべてのClostridium種と正の相関があり、ET-C解析ではこの正の相関がより強まった。R.gnavusは、UC優勢菌の中で唯一ET-Cで存在量が減少しなかった微生物であり、クロストリジウムとの共生関係を示した（表2および補足図S4）。したがって、R. gnavusは、ET-Bを有するUC患者におけるクロストリジウム菌の増加に寄与し、腸内細菌叢異常症を悪化させる可能性がある。

C. difficileと異なる腸内細菌型とのin vitro共培養実験
最後に、25.2±0.66歳の男性6名と女性4名、合計10名の健康なボランティアを募集し、彼らは抗生物質とプロバイオティクスを2週間以上服用していなかった。10名の糞便サンプルの16S rRNAアンプリコンシークエンシングを用いて腸内細菌叢を解析した結果、ET-BとET-Lを有する6名の被験者を同定した。3人はET-B、残りの3人はET-Lに分類された（図5a）。qPCRを用いたC. difficile含有量を回帰曲線を用いてプロットし、糞便細菌と勾配希釈したC. difficileを共培養した後のC. difficile数を定量化した。qPCRを用いると、1.48×10Citation2から1.48×10Citation8の範囲からC. difficileを検出することができ、R2値は0.993であった。in vitro共培養実験の結果、12時間と24時間で、ET-B由来の糞便細菌はET-L由来のものよりC. difficileの存在量が有意に高かった（図5b、P < 0.05）。

図5. ボランティア被験者の腸内細菌叢組成とin vitro実験の結果。(a）5人の被験者の家族レベルでの上位5つの腸内細菌叢の相対的存在量。バクテロイデス科（Bacteroidaceae）の存在量が多く、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）とルミノコッカス科（ruminococcaceae）の存在量が少ない被験者は腸内細菌科（ET-B）に分類された。Lachnospiraceaeとruminococcaceaeの数が多い被験者は、腸型Lachnospiraceae（ET-L）に分類された。(b）試験管内で培養したET-BおよびET-L糞便中のC. difficileの菌数。ETL-CD：C.difficileと共培養したET-L腸型糞便、ETL-Con： ETL-CD：C.ディフィシルと共培養したET-L腸型糞便、ETB-CD：C.ディフィシルと共培養したET-B腸型糞便、ETB-Con： ETB-Con：単独培養したETB腸球菌糞便。Tukeyの検定における統計的差は文字で示した。異なる文字は群間で有意差があることを示し、同じ文字は有意差がないことを示す。

図5. ボランティア被験者の腸内細菌叢組成とin vitro実験の結果。(a)5人の被験者の家族レベルでの上位5つの腸内細菌叢の相対的存在量。バクテロイデス科（Bacteroidaceae）の存在量が多く、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）とルミノコッカス科（ruminococcaceae）の存在量が少ない被験者は、腸内細菌科（ET-B）に分類された。Lachnospiraceaeとruminococcaceaeの数が多い被験者は、腸型Lachnospiraceae（ET-L）に分類された。(b）試験管内で培養したET-BおよびET-L糞便中のC. difficileの菌数。ETL-CD：C.difficileと共培養したET-L腸型糞便、ETL-Con： ETL-CD：C.ディフィシルと共培養したET-L腸型糞便、ETB-CD：C.ディフィシルと共培養したET-B腸型糞便、ETB-Con： ETB-Con：単独培養したETB腸球菌糞便。Tukeyの検定における統計的差は文字で示した。異なる文字は群間で有意差があることを示し、同じ文字は有意差がないことを示す。
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考察
腸内細菌型は、腸内細菌叢組成に基づく臨床試験デザインにおいて、ヒト集団を層別化するために使用できる可能性があり、各腸内細菌型は異なる細菌組成を有する。引用18 IBDに関する研究では、ディリクレ多項混合（DMM）法によってクラスター化された4つの腸型のうち、バクテロイデス腸型におけるIBDの有病率は80％と高いことが判明した。引用17 本研究では、ET-BにおけるUCの高い有病率が示された。R.gnavusは、ヒトの90％以上の消化管に存在する一般的な常在菌である。しかし、IBDではR. gnavusの相対量が短時間で急速に増加し、最大相対量が69％のピークに達することが研究で示されている。引用20 IBDにおける腸内細菌叢異常症の特徴として、腸内微生物が酸化ストレスの増加に対応できる生物へとシフトしていることが挙げられる。 Citation21 微生物が産生する酪酸は、腸上皮細胞株を刺激して酸素をより多く消費させ、低酸素誘導因子（HIF）の発現を安定化させる。Citation22 HIFは、腸バリアを保護し、β-酸化代謝経路を通じて結腸細胞による酸素消費を促進する必須転写因子である。 引用22 R.gnavusは偏性嫌気性菌に分類されるが、一定の酸素耐性を有している。引用19 R.gnavusは1時間および3時間の酸素曝露後、それぞれ10Citation6および10Citation4の菌数を保持している。引用19 このことも、UCにおけるR.gnavusの割合の増加を説明しているのかもしれない。

R. gnavusは腸内常在菌として、ムチンを分解する能力を示した。R. gnavus ATCC 29,149は、2,7-アンヒドロ-Neu5Ac誘導体を産生するユニークなシアル酸代謝経路を示す。引用24 シアル酸（N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac））は、大腸ムチン糖鎖の末端位置に一般的に見出されるため、R. gnavusの栄養素として機能する。腸内細菌叢は、接着剤、鞭毛、繊毛などの粘液バリアに付着し、ムチンを分解することで相互栄養を行うように進化してきた。ムチンの化学的分解によって生じる単糖類は、C. difficileのような有害な微生物のコロニー形成を誘引する。引用25 本研究のSCN解析において、R. gnavusはC. difficileと正の相関を示したことから、ムチンを分解してC. difficileのコロニー形成を促進することで、C. difficileと交差摂食関係を形成している可能性が示唆された。

IBDのマルチオミクス研究が進むにつれて、腸内微生物の代謝産物が宿主の腸にどのような影響を及ぼすのか、また、これらの代謝産物がIBDの疾患進行や病因にどのような影響を及ぼすのかについての理解が明らかになりつつある。引用文献5,引用文献26,引用文献27 IBDのメタボロミクス研究では、SCFAの産生が減少する傾向が一般的に認められている。Citation27本研究では、A. hadrusやO. splanchnicusなどの酪酸産生菌がET-B UC群で有意に減少していた。Citation28,Citation29 IBD患者における腸炎は、酸化ストレスに対する腸内環境の適応であり、その結果生じる酸化ストレスや胆汁酸代謝の変化は、F. prausnitziiなどの酪酸産生菌の相対的存在量に影響を与える。prausnitzii.引用5,引用26 本研究では、ET-B型UCの腸内微生物においてAMPKシグナル伝達経路が抑制されていること、またAMPKシグナル伝達は一般的にUCに濃縮された細菌と負の相関を示し、B. uniformisおよびO. splanchnicusと正の相関を示すことを見出した。AMPKの活性化は、さまざまな病変における酸化ストレスを抑制することができる。引用30 これは、炎症によってUC患者が経験する酸化ストレスに対する腸の適応を表しているのかもしれず、その結果、代謝的に有益な細菌が減少することになる。

In vitro共培養実験でET-LとET-Bの有害菌に対する抵抗性を評価した結果、ET-L群はET-B群よりもC. difficileに対する抵抗性が高かったが、これはおそらく有益な共生微生物生態系がより強固なためであろう。Lachnospiraceaeグループは腸内細菌叢全体の約10％を占める。代謝産物や免疫制御の観点から見ると、ラクノスピラ科の細菌はSCFAを産生し、腸管上皮細胞の炭素源の制御や制御性T細胞の誘導に重要な役割を果たしている。病原性細菌の抑制に関しては、ラクノスピラ科の分離株がC. difficile感染を効果的に抑制できることが、無菌マウスを用いた先行研究で示されている。

標準化されたバイオインフォマティクス手順が採用されているにもかかわらず、データはDNA抽出方法、配列決定数、多様な16s rRNA配列決定領域など、実験条件が異なる可能性のある様々な研究から得られた。このばらつきが、研究間のバッチ効果の出現につながった。しかし、このバッチ効果は、PCoAプロットで明らかなように、各プロジェクト内よりもむしろUC群とHC群の間で顕著であったことは注目に値する。これは、プロジェクトに起因する不一致という点では、プロジェクト内である程度均質であることを示唆している。潰瘍性大腸炎に影響を及ぼす可能性のある特定の交絡変数は、分析では考慮されず調整されなかったが、研究結果は食事パターンの影響を受けた腸型に基づいて分類された。この分類により、いくつかの交絡因子を調整することができた。しかしながら、症例対照デザインに基づく研究の性質上、同定された結果間の因果関係を確立することはできない。したがって、所見とその意味を解釈する際には、この限界を考慮した。

結論として、本研究は、腸型分析、機械学習ベースの重要微生物スクリーニング、およびSCN分析を用いて、UCおよびHC被験者の腸内微生物サンプルを革新的に比較した。その結果、腸型の違いによるUCとHCの比率の有意差が明らかになり、ET-BはUC感受性腸型であり、ET-LはUC保護腸型として機能した。さらに、本研究では、UCにおける潜在的な病原体R. gnavusと、潜在的な有益共生生物O. splanchnicusおよびB. uniformisを同定した。これらの重要な生物種の実際の相互作用とメカニズムをさらに解明するためには、in vitro共培養実験、細胞ベースのアッセイ、in vivo研究を用いた今後の研究が極めて重要である。

方法
データの取得と前処理
腸内細菌叢メタゲノミックデータは3つのアプローチで取得した： 1) The data repository for Gut Microbiota (GMrepo, [https://gmrepo.humangut.info/home]);Citation34 2) The European molecular biology laboratory (EMBL)'s European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home);Citation35 and 3) Google Scholar。GMrepo のウェブサイトで使用した検索条件は、「表現型」（大腸炎と潰瘍性）と「実験タイプ」（アンプリコン）である。EMBL-EBIとGoogle Scholarの検索キーワードは、"UC"、"16S"、"gut"、"ulcerative colitis "であった。Google Scholarでは、検索キーワードとして "bioproject "を追加した。

組み入れ基準
16S rRNA遺伝子アンプリコンの生データを提供する、UCでない対照を含む、UCと確定された患者の腸内細菌叢組成に関するすべての研究を対象とした。動物や乳幼児を実験対象としており、粘膜にサンプリング部位があり、詳細なグループ分け情報を提供していない研究は除外した。最後に、以下のNational Center for Biotechnology Information（NCBI）のBioproject IDを持つ11の研究のデータセットを組み入れた： PRJEB33711、PRJNA50637、PRJDB6133、PRJNA368966、PRJNA431126、PRJNA596546、PRJNA681685、PRJNA753210、PRJNA541040、PRJNA398089。各試験は、各施設のIRB（Institutional Review Board）の承認を得て実施された。データ収集の際、PRJNA50637にはHCのいない米国のUCデータ（n＝601）が大量に含まれていたため、米国で実施されたPRJNA296920とPRJNA386260のHCを追加した。引用文献19 PRJNA296920は炎症性腸疾患の研究を行っていたため、本研究のHCとして用いるには適切であった。HCはUCを含む炎症性腸疾患を有していなかった。PRJNA386260は米国における横断的なデータセットであり、特に他のマイクロバイオーム研究と併用するために健常人から収集されたものであったため、HCにはIBDやUCは含まれていなかった。 引用18 HCデータを補足する際には年齢も考慮した。引用1 PRJNA386260の健常対照者の年齢は55.3±1.39歳で、UCの発症率が2番目に高い時期と一致した。PRJNA50637のデータは米国の患者から得られたものであり、PRJNA296920とPRJNA386260をHCデータの補足に使用することも、両プロジェクトが米国の患者データに由来することを考慮している。

メタゲノムデータ解析と下流解析
選択されたデータは糞便fastqファイルを提供し、いくつかのプロジェクトでは参加者の年齢と性別を提供していた。しかし、生活習慣など、UCリスクに関する他の潜在的交絡因子を含むプロジェクトはなかった。解析したfastaファイルは、16S rRNA腸内マイクロバイオーム解析用ソフトウェアパッケージQIIME2（Quantitative insights into microbial ecology、2021年2月アクセス）を用いて解析した。その後、DADA2パイプラインを使用して配列の品質管理とフィーチャーテーブルを構築し、ユニークな配列ファイルを作成した。Citation37 DADA2のノイズ除去フィルター処理では、順方向および逆方向の品質スコアの中央値が30未満で、配列長が126より短い配列はフィルターで除去された。NCBIの基本ローカルアライメント検索ツール（BLAST）+の16SリボソームRNA配列データベース（https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/）を配列アライメントに使用し、特徴データ（ユニーク配列）に分類を割り当てた。ノイズ除去後、代表的な配列に分類を割り当てた（図6）。RDP、SILVA、Greengenesは一般的な16S rRNAデータベースであるが、しばしば種レベルの解像度を欠いている。NCBIには最も多くの配列が含まれており、SILVAの分類単位と最もよく整列していることから、分類作業にはNCBIを選択した。

図6. ワークフロー。ArumugamらCitation9が採用した腸型分類を用いた。ET-B：腸内細菌科、ET-L：腸内細菌科Lachnospiraceae、ET-C：腸内細菌科Clostridiaceae。ディープニューラルネットワーク（DNN）。SHapley additive exPlanations (shap)。

図6. ワークフロー。Arumugam et al.Citation9が採用した腸型分類を用いた。ET-B：腸内細菌科、ET-L：腸内細菌科Lachnospiraceae、ET-C：腸内細菌科Clostridiaceae。ディープニューラルネットワーク（DNN）。SHapley additive exPlanations (shap)。
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操作的分類単位（OTU）表とDADA2およびNCBI BLAST+で得られた分類ファイルは、各分類について単一の分類に統合された。さらなる解析では、各OTUのカウントをそのまま、または相対存在量で使用し、指定された解析に従ってカウントを正規化した。各分類レベルの相対存在量表が計算された。QIIME2のq2-picrust2プラグインを用いて、腸内細菌叢の機能的オルソログから予測されるKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Ortholog (KO)存在量表を作成した。次に、KO存在量表を相対存在量表に変換し、https://www.genome.jp/kegg/ のオンライン比較を通じて対応するKO代謝パスウェイマップを得た。関連する機能のKOを組み合わせて合計し、各被験者の様々な腸内細菌叢機能の相対的活性を決定した（図6）。

ヒト腸内細菌叢の腸型に関するArumugamらの発表論文で提供された腸型クラスタリング法を採用し、腸内細菌叢のクラスタリングを属によって層別化した。引用文献9 腸型解析のノイズを減らすため、エクセルのVAR関数を用いて属相対存在量表の各OTUの分散を計算し、分散が1未満のOTUを除外した。次に、https://enterotype.embl.de/enterotypes.html で提供されているRコードを用いて腸型クラスタリングを行った。最適なクラスター数はCalinski-Harabasz（CH）法を用いて決定した。このステップは、特にclusterSimパッケージのindex.G1関数を使用して、Arumugamらによって提供された腸型クラスタリングコードにも含まれている。各腸型数の差の有意性を分析するためにカイ二乗検定を用いた。Rパッケージのveganとade4を用いて、種レベルの相対存在量表分類とβ-多様性（Bray-Curtis）指標を用いてα-多様性（Shannon）を算出した。α-多様性（Shannon）はWilcoxon検定を用いて統計解析した。Bray-Curtis距離に基づく有意性の判定にはveganパッケージのAdonis関数を使用した。同じ手順を全参加者、ET-BとET-Lの参加者にも適用した（図6）。

DNNとSHAP
参加者全体とET-BとET-Lの参加者で、種レベルでの相対存在量データを分けた。DNN分類モデルはPythonのKerasパッケージ（2.8.0）を用いて構築した。低存在種によるノイズを低減するため、OTUテーブルの分散が0.1未満の低存在OTUを計算し除外した。これは希少種や調査への影響が少ない種を表している可能性がある。scikit-learnパッケージのStandardScaler関数を利用して、データのzスコア正規化を行った。その後、scikit-learn の train_test_split 関数を使用して、データをランダムにトレーニングセット（80%）とテストセット（20%）に分割した。次に、Pythonのscipyパッケージのttest_ind関数を用いて、トレーニングセットの各OTUの統計的検定を行った。UCとHCの間で有意差のあるOTUのみがDNNモデルトレーニングのために保持された。その後、SHAPを用いて各特徴の重要度を計算し、有意な上位20分類群を保持した。Rのggpubrパッケージを使って20分類群についてWilcoxon順位検定を行い、箱ひげ図を作成した。次に、この改良されたデータセットでモデルを再トレーニングしました。モデルの学習後、AUC下面積、精度、感度、特異度、精度、F1スコアなどの指標を用いて、テストセットでの性能を評価した。テストデータは、繰り返しデータ分割を用いてランダムに1,000回分割し、テスト性能パラメータの平均と標準偏差を計算した。同時に、PythonのMatplotlibパッケージを使用して、テストセットにおけるモデルの受信者動作特性曲線（ROC）をプロットした。

引用40 SHAP（0.39.0）を用いて、DNNの各特徴のSHAP値を計算し、その値に基づいて、特徴の重要性と分類への影響を決定した。また、有意性解析のためにt検定を行った。ET-CコホートにはUC患者しか含まれていなかったため、DNN分類器の構築は不可能であった。そこで、全コホート、ET-Bコホート、ET-Lコホートについて解析を行った（図6）。SHAPの説明から、積み重ね棒グラフのカテゴリーが不明確な分類群に気づいた。これはモデル構築時の不確実性やノイズによるものである可能性がある。そこで、これらの分類群の平均存在量をUCとHCで比較し、分類を決定した。

ネットワーク解析と腸内細菌叢機能の予測
まず、相対存在量に変換されていない種のOTUテーブルを使用し、手作業でmothur (1.48.0)のcount_table形式に変換した。その後、make.shared 関数を適用して、mothur.Citation41 でのダウンストリーム解析用にデータを適合させた。次に、sub.sample 関数を使用し、size を 1000、persample を True に設定した。このステップにより、データを正規化し、同時に総カウント数が1000未満のサンプルを除外することができた。次に、すべてのパラメータをデフォルトに設定してsparcc関数を使用し、Sparse Correlations for Compositional Data（SparCC）分析を実行した。続いて、DNNとSHAP分析から同定された上位20分類群の相関行列を手作業で抽出した。得られたスパース相関ネットワーク（SCN）は、Cytoscape 3.4.0アプリケーションを用いて可視化した。有意な相関のないエッジや相関係数が0.1未満のエッジはSCNに表示されなかった。

さらに、PICRUSt2からの相対的な機能プロファイルを使用して、PICRUSt2が予測した代謝機能について、UCとHCの間のLDA値を計算するために、GitHubで利用可能なネイティブLEfSeツール（https://github.com/SegataLab/lefse）を採用した。Citation42 さらに、PICRUSt2からの腸内細菌と代謝機能の相対存在量テーブルを利用して、それらのピアソン相関係数を計算した。相関ヒートマップはpheatmap Rパッケージ（バージョン1.0.12）を用いて作成した。

実験被験者のリクルートと糞便サンプルの処理
UC患者はClostridium difficile感染症（CDI）のリスクが高いため、CDIはUC疾患進行の主な原因であり、UCの有病率は増加し続けている。C43 本研究のテーマに沿って、C. difficileに対する異なる腸型の耐性を観察するために、我々は共培養実験を計画し、実施した。男女を問わず20〜30歳の健康なボランティアを以下の条件で募集した： 急性・慢性疾患なし、抗生物質治療なし、採便前3ヵ月以内にプロバイオティクスの補給なし。また、採便前日にはアルコール摂取を控えるように指示した。韓国法政大学のIRBは、承認番号1041231-190816-BR-094-02で、本試験プロトコールを審査・承認した。研究開始前に、すべての参加者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。

第1ラウンドで研究室に到着すると、各参加者に10mLの滅菌水が入った遠心チューブと滅菌綿棒が渡された。参加者は、研究施設内にある専用のトイレのような、人目につかない無菌環境で糞便サンプルを自己採取するよう指示された。採取後、参加者はサンプルを直ちに提供された遠心分離チューブに入れ、研究室に返送した。受領したサンプルからのDNA抽出は、サンプルの完全性を確保し、汚染の可能性を防ぐために速やかに行われた。QIAamp PowerFecal DNA Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて糞便微生物群から全DNAを抽出し、ジエチルピロカーボネート（DEPC, AM9906 Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）水を用いてDNAサンプルの濃度を5ng/μLに調整した。その後、KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit (KK2602; KAPA Biosystems, Wilmington, MA, USA)とプライマーB341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') およびB805R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') を用いてV3-V4遺伝子断片を増幅した。その後、16S DNAアンプリコンをAMPureビーズ（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いて精製した。最後に、精製した16S RNAサンプルをMacrogen Ltd（韓国、ソウル）に送り、ハイスループットシークエンシングを行った。

我々は、参加者のファミリーレベルでの相対存在量表を用いて、腸型を手動で分類した。バクテロイデス科の相対存在量が35％を超える被験者をET-B群に分類した。LachnospiraceaeとRuminococcaceaeの相対的存在量の合計が25％を超えるものは、ET-L群に分類された。上記の基準によると、ET-B群とET-L群に割り当てられた被験者は、他の群の条件を満たしてはならない。第2ラウンドの糞便サンプル採取では、参加者は第1ラウンドと同じ手順を踏んだが、いくつかの重要な違いがあった。各参加者には、この段階で糞便サンプル採取用の空の50ml遠心チューブが提供された。採取後、サンプルは直ちに研究室に提出された。糞便サンプル5gを正確に量り、あらかじめ調製しておいた25mlの改良型脳心筋梗塞（mBHI）培地に投入した。混合液を撹拌し、4℃で1分間静置した。その後、225×g、3分間、4℃で遠心分離し、上清（10mL）を回収した。上清は細菌抽出液として使用し、層流フード内で保存した。2回目の糞便サンプルの採取時間は、培地添加後15分以内になるようにコントロールした。

細菌株の培養と共培養
C. difficileの市販株KCTC 5009をKorean Collection for Type Cultures（KCTC、5009）から購入した。この菌株をmBHI培地で37℃、18時間嫌気培養した。基礎BHI培地（KisanBio, MB-B1007）に0.5％酵母エキス（Sigma-Aldrich, Y1625）と5％L-システイン（Sigma-Aldrich, St.） 培養はハンゲート嫌気培養管で行った。窒素ガスを導入して液体中の酸素を置換した後、チューブを嫌気チャンバーに移した。各チューブに培地を加え、キャップをし、オートクレーブで121℃、15分間滅菌した。C. difficileと糞便細菌群との共培養もmBHI培地を用いて行った。これまでの研究で、in vitroで糞便細菌群集を共培養するためのmBHI培地は、他の培地と比較してより多様な微生物を保存できることが示されているCitation45。

一晩培養後、細菌計数プレート（Marienfeld Superior、Lauda-Königshofen、ドイツ）を用いてC. difficile株を計数した。各個体の糞便細菌培養をコントロール（ETL-Con、ETB-Con）とし、C. difficile 1×10Citation3と共培養したものを共培養群（ETL-CD、ETB-CD）とした。各サンプルのプロセスは3回繰り返した。培養は37℃で行い、菌数の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）のために、12時間と24時間に同じチューブからサンプルを採取した。

プライマー設計とqPCR定量
C. difficile KCTC 5009の全ゲノム配列をウェブサイトhttps://kctc.kribb.re.kr からダウンロードした。プライマーは、Species Primer自動ハイスループットスクリーニング設計特異的プライマーパイプラインを用いて設計した。Citation46 V型ナトリウムATPアーゼサブユニットGに発現するntpG-1遺伝子を最終的にC. difficileのqPCRターゲットとして選択した。最終的に設計されたプライマーは、フォワードATCTTCCCAGCCTATGATAGTGAC、リバースTCGCATTCATCTTCATCAACCAACTであった。プライマー設計を確認した後、糞便DNA抽出と同じプロトコールに従って、一晩培養したC. difficileからDNAを抽出した。抽出したDNAはqPCR検出のためにDEPC水で10倍に希釈した。DNA、SYBR green、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、各サンプルについて2つの複製を用いた。引用47 qPCR定量はPCR装置（Step One Plus; Applied Biosystem, Waltham, MA, USA）を用いて行い、未知サンプル中の遺伝子発現レベルは比較CT（ΔΔCT）法を用いて定量した。異なる濃度で得られたCT値を用いて、C. difficileコロニー形成単位を定量するための標準曲線を作成した。培養過程で採取したサンプルからは、qPCR定量に用いたのと同じ方法でDNAを抽出した。

統計解析
2群間のt検定にはPythonのscipyパッケージのttest_ind関数を用いた。複数群間の統計解析は、SPSS（20.0）を用いてANOVA（Tukey's post hoc）分析を行った。データは平均値±標準偏差（SD）で示し、統計的有意性はP＜0.05とした。

データと資料の入手
本研究で生成されたデータセットとスクリプトは、Githubリポジトリhttps://github.com/WXG920713/Gut-microbes。

著者貢献
Wu X： 概念化、形式的分析、初稿執筆。Zhang T: 糞便fastaqデータの探索。Tian S: In vitro微生物培養実験。Park S: 初稿の校閲と修正。

補足資料
補足表および図.docx
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情報開示
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。

補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2292254。

追加情報
資金提供
本研究は、韓国のNational Research Foundation [RS-2023-00208567]の支援を受けた。
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