酪酸は破骨細胞活性をin vitroで抑制し、抗生物質投与マウスと比較して全身性炎症および骨治癒を制御する

2023年2月24日 10:26

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炎症のメディエーター
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筋骨格系疾患における炎症
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研究論文｜オープンアクセス
第2021巻｜記事ID 8817421｜https://doi.org/10.1155/2021/8817421。
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酪酸は破骨細胞活性をin vitroで抑制し、抗生物質投与マウスと比較して全身性炎症および骨治癒を制御する
アレクサンドラ・ワリマン
1,2Walker Magrath
,1Brenna Pugliese
1ニノ・ストッカー
,2Patrick Westermann
2アンヤ・ハイダー,2ドミニク・ゲーヴァイラー
1ステファン・ザイター
1マーカス・J・クラエッソン
,3R. ジェフ・リチャーズ
1セジミ・A・アクディス
2およびクリストファー・J・ヘルナンデス
4,5 et al.
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アカデミック・エディターチャン・チャオファン（Chaofan Zhang
公開日2021年12月10日
要旨
腸内細菌叢が産生する短鎖脂肪酸（SCFAs）は、多くの慢性炎症性疾患に関与し、腸-骨シグナル伝達軸の重要なメディエーターであることがこれまでに明らかにされている。しかし、骨折治癒におけるSCFAの役割や、再生過程における全身性炎症への影響については、まだ広く検討されていない。本研究の目的は、まず、in vitroで骨折治癒に関与する主要細胞、すなわち破骨細胞および間葉系間質細胞（MSCs）に対するSCFAである酪酸の効果を明らかにすること、次に、酪酸補充または抗生物質治療がマウス骨切りモデルにおける骨治癒、全身免疫状態、炎症レベルに対して影響するかを評価することであった。酪酸は、破骨細胞の形成と再吸収活性を用量依存的に有意に低下させ、MSC培養におけるカルシウム沈着量の増加傾向を示した。破骨細胞前駆細胞において、破骨細胞の分化に関連する数多くの遺伝子が、酪酸塩曝露により差次的に発現していた。生体内では、抗生物質を投与したマウスは、盲腸のSCFAレベルが低下し、腸内細菌叢の構成も明瞭になった。さらに、抗生物質投与マウスでは、循環血中の炎症性TNFα、IL-17a、IL-17fレベル、および骨保存性のオステオプロテジェリン（OPG）が、コントロールと比較して増加した。抗生物質投与マウスはまた、欠損部位のミネラル付着の減少や骨回転マーカーPINPの循環レベルの上昇によって明らかにされるように、骨治癒が遅れる傾向を示した。酪酸塩の投与により、骨髄中の単球／マクロファージが減少し、抗生物質投与マウスおよびコントロールマウスと比較して、循環血中炎症性IL-6レベルが減少した。結論として、本研究は、SCFAs、特に酪酸は、骨折治癒に関与する主要な細胞だけでなく、全身の炎症および免疫応答を調節することにより、骨治癒の成功に重要な貢献をしているという我々の仮説を支持するものであった。

はじめに
細菌、古細菌、ウイルス、真菌からなる腸内細菌叢は、宿主の生理と代謝の調節を通じて、人間の健康に重要な役割を持つことが示されている [1]。抗生物質治療、ストレス、または偏った食事によって起こりうる腸内細菌叢の乱れは [2] 、炎症性腸疾患 [3] 、メタボリック症候群 [4] 、喘息 [5] 、心疾患 [6] 、骨粗鬆症 [7, 8] および変形性関節症 [9, 10] など、多くの病気と関連しています。逆に、プレバイオティクス、プロバイオティクス、ポストバイオティクスといった形での積極的な介入は、適切な量が投与されれば、宿主に対する健康上の利益が証明されています[11, 12]。微生物叢の有益な効果の多くは、食物繊維の発酵に伴って腸内細菌が生成するポストバイオティクス短鎖脂肪酸（SCFAs）である酢酸、プロピオン酸、酪酸、バレレートによって媒介されます [13]。これらのポストバイオティクスは、IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8などの炎症性サイトカインの分泌を抑制する一方で、制御性T細胞（Treg）の分化［14］とIL-10やTGFβなどの抗炎症サイトカインの分泌を誘導する能力があることから慢性炎症疾患との関連で広範囲に研究されている［15］。しかし、今日まで、骨治癒との関連で研究されたことはあまりない。

プロバイオティクス細菌自体は、抗炎症性免疫反応の促進、腸内のミネラル吸収の増加、内分泌性骨シグナル因子（例えば、インクレチンやセロトニン）の産生を通じて、骨量減少を防ぐことが示されている[16]。例えば、プロバイオティクスのビフィドバクテリウム・ロンガムATCC 15707を補給したラットは、骨中のカルシウムとマグネシウムの含有量の増加を示し [17] 、ビフィドバクテリウム・ロングム35624®からのエキソ多糖は、TLR2依存性のメカニズムによって破骨細胞形成を阻害することが示されています [18]．もう1つの著名なプロバイオティクス株であるLactobacillus reuteri ATCC PTA 6475は、骨髄におけるCD4+ T細胞の拡大を抑制することによって卵巣摘出による骨量減少を予防し [19] 、微生物のディスバイオシスを低減し腸のバリア機能を回復させることによって抗生物質投与後の骨量減少を予防することが示されました [20]．実際、広域抗生物質投与後、4週間回復させると、リンパ球に依存したディスバイオーシスと海綿骨大腿骨密度の減少が見られた[20, 21]。

骨量減少の予防における腸内細菌叢の役割については既にいくつかの研究がなされているが、骨折治癒における役割に着目した研究は限られている。治癒遅延や非結合を含む骨治癒合併症は、すべての長骨骨折の5-10%で発生し、痛みや機能障害につながる [22, 23]。慢性的で解決しない炎症は、骨癒合が損なわれる原因である[24]。T細胞、B細胞、単球／マクロファージなどの免疫細胞は、骨折の治癒過程において重要な役割を果たし、破骨細胞の形成と活性に影響を与えることがある。末梢血中の炎症性CD8+/CD57+ T細胞の増加は、ヒトにおける骨折治癒の遅れと有意な相関があった[25]。CD4+T細胞は、Th17とTreg細胞を含む異なる亜集団を持つ異質な集団を呈している。Th17細胞からの炎症性IL-17の分泌は破骨細胞形成を刺激することが知られており、一方、Treg細胞数の増加は、マウスにおけるより高い骨量と骨吸収の減少に相関していた[26, 27]。B細胞は、破骨細胞の分化と活性を調節する因子であるOPGを分泌することが示されている[26]。循環しているCD14+単球/マクロファージは破骨細胞前駆細胞として機能し、骨に移動してさらに破骨細胞に分化する[28, 29]。

最近、2つの研究が骨癒合におけるプロバイオティクスの可能性を強調した。Bifidobacterium adolescentis [30] とAkkermansia muciniphila [31] は、全身性の炎症性サイトカインと腸管上皮のバリア機能のレベルを調節することによって、マウスの骨治癒を促進することが示されました。間葉系間質細胞（MSC）、破骨細胞、線維芽細胞といった骨折治癒に関与する様々な細胞種に対するSCFAの幅広い効果 [32] と、免疫を調節する能力から、プロバイオティクスだけでなくポストバイオティクスも骨治癒に影響を与えるかなりの可能性を秘めている。しかし、SCFAが骨癒合に影響を与える役割や、再生過程における全身性炎症への影響については、これまで検討されていない。

本研究の目的は、まず、in vitroで骨折治癒に関与する主要細胞に対するSCFA酪酸の影響を調べ、次に、マウス骨切りモデルにおいて酪酸補給が骨治癒および全身性免疫・炎症レベルに影響を与えるかどうかを評価することであった。SCFA産生の欠損は、ブドウ球菌性骨感染症の骨折患者に投与される一般的な抗生物質レジメンであるrifampicinとlevofloxacinの投与によって誘発されました。

材料と方法
2.1. PBMCの単離と破骨細胞分化誘導試験
健康なヒトドナー()から末梢血単核細胞（PBMC）をHistopaque®-1077試薬（Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を用いた密度勾配遠心分離と800 g, 20分室温遠心分離で分離した。PBMCを回収し、破骨細胞前駆細胞（単球／マクロファージ）の分化を誘導するために、10％（）の牛胎児血清（FBS；Gibco）、100U／mLのペニシリン、100μg／mLのストレプトマイシン、20ng／mLの組み換えヒトマクロファージ-コロニー刺激因子（M-CSF；R＆D Systems，Abingdon，UK) で補充したαMEM中で標準条件（37℃，5％の二酸化炭素）で更に培養をした。2日ごとに新鮮なサイトカインを添加し、付着したM-CSF依存性破骨細胞前駆細胞を5-7日後にトリプシン-EDTA溶液（Gibco）とセルスクレーパーを用いて剥離し、細胞／ウェルで96ウェルプレートにプレーティングした。この培養液にリコンビナントマウス受容体活性化因子NFκBリガンド（RANKL；10ng／mL；R＆Dシステムズ）を添加して、破骨細胞前駆体の多核破骨細胞への融合を誘発させた。さらに、酢酸、プロピオン酸、酪酸、バレレートなどのSCFAを0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM添加し、SCFAの破骨細胞分化への影響を検討した。同様に、破骨細胞形成に対する抗生物質の影響を調べるために、0.5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL rifampicin and/or levofloxacin を添加した。培地、サイトカイン、SCFA、抗生物質は2日ごとに交換し、7-10日後にPBS中4％ホルムアルデヒド溶液を用いて、常温で15分間細胞を固定した。破骨細胞形成の判定には、TRAcP（tartrate resistant acid phosphatase）染色キット（Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland）を用いて細胞を染色した。多核（≧3核）TracP陽性細胞を破骨細胞として分類し、ウェルあたりの破骨細胞の総数をZeiss Axiovert A1光学顕微鏡（Zeiss）を用いて定量化した。

2.2. 骨吸収アッセイ
成熟破骨細胞に対する酪酸の効果を評価するために、まず6ウェルプレートに30万個の破骨細胞前駆細胞／ウェルを播種し、上記のようにM-CSFとRANKLで刺激して破骨細胞を生成させた。細胞融合が観察されると（典型的にはRANKL添加後3〜4日）、成熟破骨細胞をトリプシン化および穏やかな擦過によって剥離し、次に完全培地（20ng／mL M-CSFおよび10ng／mL RANKL含有；2mL／ウェル）中に再懸濁した後に、100μL細胞懸濁液／ウェルのOsteoassay 96ウェルプレート（コーニング）に播種した。Osteoassay基材に細胞を4時間付着させた後、0.1 mM、0.25 mM、0.5 mM、または1 mMの酪酸をそれぞれのウェルに添加した。72時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、4%() ホルムアルデヒド溶液を用いて15分間、常温で固定した。破骨細胞吸収を評価するために、10%()漂白剤を用いて細胞を除去し、von Kossa硝酸銀染色を行った。

2.3. 細胞生存率アッセイ
破骨細胞前駆体およびMSCの細胞生存率に対する酪酸の影響を、CellTiter-Blue試薬（Promega AG, Dübendorf, Switzerland）を用いて、メーカーの説明書にしたがって評価した。

2.4. 機能的破骨細胞形成アッセイ
GPR43およびGPR183が破骨細胞形成に必要であるかどうかを確認するために、ヒト破骨細胞前駆細胞を単離して上記のように培養したが、さらに75nM、750nM、または7500nMのGPR43（FFA2）作動薬（Sigma-Aldrich）または5nM、50nM、または500nMの逆GPR183作動薬（GSK682753A, MedChemExpress）で処理した。化合物はジメチルスルホキシド（DMSO, Sigma）に溶解させた。破骨細胞の定量は、上記のように、TracP染色キットを用いて行った。

2.5. ヒト骨髄由来間葉系ストローマ細胞の単離と培養
ヒト骨髄吸引液は、全ドナーのインフォームドコンセントのもと、フライブルク大学医療センター倫理委員会（EK-フライブルク：135/14）およびグラウビュンデン州倫理委員会（KEK-ZH-NR：2016-00141）の完全承認を得て入手した。ヒト骨髄由来間葉系ストローマ細胞（BM-MSC）は、Histopaque-1077を用いた密度勾配遠心分離により分離し、既報の通り培養した［33、34］。BM-MSCは、加湿雰囲気下、37℃、5％CO2の標準条件下で、10％（）MSC適格FBS（Sera-Plus、PAN-Biotec GmbH、Aidenbach、ドイツ）、100U／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、5ng／mL基礎線維芽細胞増殖因子-2（bFGF-2；Fitzgerald Industries、アメリカ）添加αMEM中で細胞／cm2にて播種された。骨形成および軟骨形成アッセイには、培養膨張したMSCを継代5まで使用した。

2.6. 体外MSC骨形成分化アッセイ
酪酸がMSCの骨形成分化に及ぼす影響を評価するために、ヒトBM-MSC（）を24ウェルプレートのThermanoxカバースリップ上に細胞／ウェルでプレーティングし、コンフルエントになるまで増殖させた。この時点で、細胞単層は、対照培地（1 g/L グルコース DMEM、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン）または骨形成培地：50 μg/mL アスコルビン酸 2- リン酸（AA2P；シグマ）、5 mMβグリセロリン酸（シグマ）および 10 nM デキサメタソン（シグマ）で追加的に補充した対照培地を処理された。培養液は1週間に3回交換し、合計28日間培養した。酪酸（0.5 mM）をウェルに添加し、培地交換のたびに補充した。その後、細胞をPBSで2回洗浄し、4%ホルムアルデヒドで15分（RT）固定し、蒸留水で3回洗浄した。次に、40 mMのアリザリンレッド溶液（pH 4.2）を用いて、ロッキングプラットフォーム上で1時間、細胞単層が染色された。その後、細胞を蒸留水で5回洗浄し、倒立型光学顕微鏡を用いてアリザリンレッド染色を画像化した。

ミネラル化を定量化するために、10%酢酸中で30分間インキュベートすることによってアリザリンレッドを抽出した。掻き取りによって単層を除去した後、試料を85℃で10分間加熱し、氷上で冷やした。13,000 gで10分間遠心分離した後、上清を回収し、10%水酸化アンモニウムでpHを4.3に変化させた。定量は、Multiskan™ GO 3.2 マイクロプレート分光光度計を用いて405 nmで標準/サンプルの吸光度を測定し、SkanIt™ ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) で解析し、既知のAlizarin Red濃度と比較評価した。

2.7. 体外MSC軟骨分化アッセイ
ヒトBM-MSC（）は、上記のように培養展開した。次に、BM-MSCをトリプシン-EDTA（Gibco）を用いて採取し、ダルベッコ変法イーグル血清（DMEM）4.5g/Lグルコース、50μg/mL AA2P、1％（）非必須アミノ酸、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、1％（）ITSサプリメント（コーニング）及び100nMデキサメサソンからなる軟骨透過培地に再懸濁させた。細胞を96ウェルV底プレートに細胞/ウェルの密度で四重に播種した。その後、プレートを遠心分離し（400 g、5分間）、ペレットを24時間形成させた。次に、新鮮な軟骨形成培地または軟骨形成培地（10ng／mLのTGFβ1（Fitzgerald Industries）を補充した軟骨形成培地）を、細胞ペレットに添加した（0日目）。MSCの軟骨形成に対するSCFA補給の影響を評価するために、軟骨寛容条件および軟骨形成条件下で培養したペレットを、0.5mMの酪酸で処理することも行った。増殖培地は2-3日ごとに交換し、その後の硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含量の評価用に調整培地を回収して保存した。細胞ペレットは24日目に採取された。各条件につき2個のペレットを組織学的評価のために処理し、残りの2個のペレットをsGAG含量解析のために処理した。軟骨分化は、プロテオグリカンとコラーゲンを可視化するために、サフラニンO/Fast Greenを用いて評価された。ペレットは、4％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋する前に、昇順エタノール系列で脱水した。6μmに切り出した切片をSafranin O/Fast Greenで染色し、光学顕微鏡で可視化した。ペレット中のsGAGの含有量は、0.5mg/mL Proteinase K（Roche）溶液中で56℃で一晩消化した後、1,9-ジメチル-メチレンブルー（DMB）を用いて評価した。吸光度は、Victor3 Microtitre plate reader (Perkin Elmer®) を用いて、既知濃度のコンドロイチン硫酸の標準曲線を用い、535 nmで即座に測定した。結果は、Hoechst 33258と子牛胸腺DNAを標準として、細胞ペレットのDNA含有量に正規化した後に表した。

2.8. バルク RNA シークエンス
酪酸刺激による破骨細胞前駆細胞の遺伝子発現変化を特徴付けるために、5人の健康なヒトドナーからPBMCを上記のように単離した。CD14 MicroBeads (130-050-201, Miltenyi Biotec), MS+ column 120-000-472, Miltenyi Biotec), OctoMACS™ separator (Miltenyi Biotec) を用いて磁気活性化細胞選別（MACS）を行い、CD14+単球／マクロファージを分離回収した。正選択されたCD14+単球/マクロファージの純度はフローサイトメトリーで評価したところ、95%以上であった。CD14+単球/マクロファージを、10%() FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、20 ng/mL ヒト M-CSF を補充したαMEMでコンフルエンスまでさらに培養した。5-7日後、付着したM-CSF依存性破骨細胞前駆体をトリプシン-EDTA溶液とセルスクレーパーを用いて剥離し、その後6ウェルプレートに播種し（細胞／2mL）20ng／mLヒトM-CSFで刺激した。翌日、破骨細胞前駆細胞に20 ng/mL murine RANKLと0.5 mM butyrateを添加した。0.5 mM 酪酸と RANKL で 6 時間および 24 時間刺激した後、RNeasy® plus micro kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて、製造者の指示に従って全RNAを単離した。単離した RNA の純度と完全性は、それぞれ分光光度計 (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific) と Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) を用いて評価した。RNAライブラリー処理（ポリA選択）およびIllumina Hiseqシングルエンド（150 bp）配列決定は、Functional Genomics Center Zurichで実施された。データはFunctional Genomics Center Zurichが立ち上げたsushi data analysis framework内とMetaCore software (Clarivate™ Analytics)により解析した。False discovery rate (FDR) の閾値は<0.01、fold change ratioは±0.5に設定された。

2.9. In Vivo実験デザイン
In vivo実験は、Tierversuchskommission Graubündenの承認を得た（承認Nr.2019_25）。整形外科的疾患のない健康な雄のC57BL/6Jマウス（、予備を含む）をCharles River（ドイツ）から入手した。マウスは2週間馴化させ、個別に換気されたケージに2〜6匹のグループで12時間暗／12時間明サイクルで収容した。一部のマウスは、ケージ内での攻撃性や上下関係の争いのため、単独飼育が必要と判断された。マウスには自由摂取の餌を与え、常に水にアクセスできるようにした。マウスを以下の実験群のうちの1つにランダムに割り当てた（1群につき）：第1群、対照群は、午前と午後（8時間後）にビヒクル（滅菌水）を経口投与した；第2群は、午前中にビヒクルを、午後に30mM酪酸を経口投与した；第3群は、25mg／kgリファンピシンと20mg／kgレボフロキサシン（）抗生物質混合物を午前と午後にビヒクルとを投与された。さらに第4グループには、午前中に抗生物質混合物、午後に30mM酪酸塩を投与した。しかし、予想以上の脱落率に悩まされた結果、この実験の結果は発表されなかった（Discussion参照）。マウスは、全研究期間（21日間）の間、対応する処理物（投与量200μL）を週5日連続で経口投与し、骨切り手術の朝から投与を開始した。20週齢のマウスを全身麻酔下に置き、無菌条件下で、左後肢に4穴治具とGigliワイヤー（Mouse Fix Drill & Saw guide、RIS.301.107）を用いて0.44mmの大腿骨骨切りを実施した。骨切り部の固定には4穴のポリエーテルエーテルケトン（PEEK）プレート（RISystem MouseFix Plate 4-hole, PEEK RIS.601.001), 0.31 mm drill bit (RIS.592.202), 4本のセルフカット角度安定ネジ (MouseFix Screw, length 2 mm, RIS. 401.100) を使用した．マウスはグループごとに手術され、したがって術者は盲検化されていなかった。骨切り後10日目にカルセイングリーン（5 mg/kg）を、18日目にキシレノールオレンジ（90 mg/kg）をマウスに皮下注射し、カルシウムの付着状態をレトロスペクティブに調査した。

2.10. 麻酔、鎮痛、および安楽死
マウスは、手術中およびCTスキャン中、ならびに頸椎脱臼による安楽死の前に、セボフルラン（O2中1.5～3％、流速0.6～0.8L/min）で麻酔した。術中鎮痛は，麻酔導入直後にブプレノルフィン（1：10希釈0.3 mg/mL溶液，0.1 mL皮下投与）およびカルプロフェン（1：10希釈50 mg/mL溶液，0.1 mL s.c.）で施行した。体温の低下を防ぐため、マウスは術前および術中に温度調節可能なヒーティングマット上に置いた。術後の鎮痛には、トラマドールを飲料水に添加したもの（25 mg/L、水道水100 mL当たり1滴）を7日間投与した。

2.11. マイクロCT画像
手術した大腿骨のマイクロCTスキャンは、VivaCT40（SCANCO Medical AG, Brüttisellen, Switzerland）を用いて実施した。画像は、ボクセル解像度10.5μm、ビームエネルギーおよび強度はそれぞれ70kVpおよび114μAを使用して取得した。スキャンは3つの異なるタイムポイントで実施した：手術直後、手術後10日および21日（安楽死時）。

2.12. 採血および血清の調製
骨切り当日（術前）と術後10日目に側尾静脈から、21日目（安楽死時）に後胸部血管から採血を行った。採取した血液は、常温で30分間凝固させた後、常温6000 gで10分間遠心分離した。血清は回収し、さらなる分析まで-20℃で凍結した。

2.13. 血清中の炎症マーカーと骨代謝回転マーカーの定量化
ラット／マウス PINP EIA キット（ids®、英国）を用いて、製造者のプロトコールに従って、マウス血清中の I 型プロコラーゲン（PINP）濃度を評価した。データはMultiskan™ GO 3.2 マイクロプレート分光光度計で収集し、SkanIt™ ソフトウェアを使用して解析した。V-PLEX Mouse Proinflammatory Panel キット (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD, USA) を使用して、マウスの血清中の IL-6、IL-10、IL-1β、TNFα、および KC/GRO を含む炎症マーカーのパネルを試験した。アッセイは、製造業者のプロトコールに従って行った。

2.14. Olink® ターゲットプロテオミクス
Olink® Target 96 Mouse Exploratory パネル (Olink Proteomics, SE-751 83 Uppsala, Sweden) を使用して、マウス血清サンプル中の 92 のタンパク質バイオマーカーを評価した。データは、Olink® Insights Stat Analysis アプリと GraphPad Prism ソフトウェア (GraphPad Software 8.1.0, Inc., La Jolla, CA, USA) を使用して解析した。

2.15. 組織学的処理および形態学的解析
4穴PEEKプレートを装着した手術済み大腿骨（各群）をメタノールで固定し、その後メタクリル酸メチル（MMA）に包埋した。50-70μmのスライスを切り出し、Olympus BX63F光学顕微鏡で画像化した。蛍光イメージングの際、スライスを15％（）ギムザ溶液と1％（）エオシン溶液で染色し、Olympus BX63F光学顕微鏡でイメージングした。蛍光マウス大腿骨の画像は、ImageJ（NIH, Bethesda, USA）を用いて解析し、500μmのスケールバーを用いてスケーリングを行った。関心領域（ROI）は、2本の中ネジと骨切り部との間の組織を囲む長方形の領域とした。赤色および緑色チャンネルは、各画像におけるキシレノールオレンジおよびカルセイングリーンの平均蛍光強度（平均画素値）をそれぞれ定量化するために使用された。

2.16. 大腿骨のバイオメカニカルテスト
新たに形成されたカルスの剛性および未手術の大腿骨の機械的特性を測定するために、4点曲げ（破壊試験）を実施した。手術した大腿骨からPEEKインプラントを慎重に取り出し（各グループ）、大腿骨をリンゲル液で湿らせ、ガーゼで包んで、試験を行うまで-20℃で冷凍保存した。未手術の対側大腿骨も同様に採取し、保存した。凍結保存の期間は、すべてのサンプルについて一定に保った。測定当日、マウスの大腿骨はリンゲル液から取り出し、各サンプルから骨以外の組織を慎重に取り除いた。機械的試験には，100 N のロードセルを備えた Instron® 5866 機（Norwood MA, US）を使用した．すべてのサンプルは、2つの曲げポイントに同じ向きで置かれた。サンプルには0～0.05Nの予荷重をかけ、0.5mm/minの速度で試験を行った。大腿骨サンプルが破断した時点で計測を中止した。力対変位のプロットは、4点曲げ試験から得られたものである。破断荷重は各曲線から外挿した。

2.17. 16S rRNA 配列決定とデータ解析
マウスの黄嚢液を安楽死当日に採取し、-20℃で凍結保存した後、さらに処理した。QIAmp® PowerFecal Pro DNA kit (Qiagen)を用いて、マウスの糞便のDNAを分離した。サンプルは、SeqBiome Ltd. (アイルランド、County Cork) により配列決定および解析された。(County Cork, Ireland)で解析した。DADA2 R パッケージは、SILVA 138 を分類学的割り当てのための参照データベースとして使用して、データ解析に使用されました。

2.18. マウスセカル水中のSCFA測定
DNA分離に使用しなかった残余の糞便内容物から、SCFAを測定するための糞便水を調製した。硫酸（0.15 mM）を0.3 gあたり1 mL添加し、ボルテックスした後、14,000 g、4℃で30分間遠心分離した。上清を回収し、再び同じ速度で遠心分離した。試料を0.45μmと0.2μmのフィルターで順次ろ過した。ろ過した上清をACQUITY UPLC H-Class Bio System (Waters Corp, Milford, MA, USA)で分析した。分離はAminex HPX-87Hイオン交換カラム(, 9 μm particle, Bio-Rad Laboratories Inc.) とMicro-Guard Cation H+ refill cartridge (Bio-Rad Laboratories Inc.) を用いて、溶離液として10 mmol/L H2SO4を用いて40℃で流速 0.35 mL/minで実施された。注入量は20 μL、検出波長は210 nmとした。試料は、並行して測定した標準品との関係で定量した。

2.19. フローサイトメトリー解析
脾臓、手術部位の鼠径リンパ節（iLN）、および脛骨骨髄を安楽死当日に採取した。すべての組織から40μmのセルストレーナーを用いて単細胞懸濁液を調製し、その後、以下の表面マーカーを染色した。PE抗マウスCD3抗体（クローン：17A2、アイソタイプ：ラットIgG2b）、Alexa Fluor® 700抗マウスCD4抗体（クローン：GK1.5、アイソタイプ：ラットIgG2b、κ）、PE/Dazzle™ 594抗マウスCD8a抗体（クローン：53-6. 7, isotype: Rat IgG2a, κ）、Brilliant Violet 510™ 抗マウスCD45（clone: 30-F11, isotype: Rat IgG2b, κ）、PE-Cy5 抗マウス CD19（clone: 6D5, isotype: Rat IgGa, κ）、FITC 抗マウス CD14（clone: Sa14-2, isotype: rat IgG2a, κ）です。細胞生存率は、固定化生存率色素eFluor™ 780を用いて評価した。抗体はすべてBioLegendから、viability dyeはeBioscienceから購入した。サンプルはBD FACSAria™ III Cell Sorter (BD Biosciences, New Jersey, US) を用いて取得し、Kaluza Software (Beckman Coulter GmbH, Germany) を用いて解析した。

2.20. 統計解析
データは、特に断りのない限り、以下のように報告する。実験群間の統計的有意差の判定には一元配置分散分析を用い、Tukeyのポストホック解析を使用した。統計的有意性の閾値は. 特に断らない限り、すべての解析はGraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software 8.1.0, Inc., La Jolla, CA, USA)を用いて実施した。

結果
3.1. 酪酸は、ヒト破骨細胞の形成および吸収活性を抑制し、ヒトMSCの骨形成分化に影響を与える。
破骨細胞形成に対する酪酸の影響を調べるために、ヒトPBMCから破骨細胞前駆細胞を作製した。これらの破骨細胞前駆細胞は、RANKL単独または0.1 mMから1 mMの濃度の酪酸で処理した。TRAcP染色により破骨細胞の定量を行ったところ、0.1 mM（54％減少）、0.25 mM（59％減少）、0.5 mM（76％減少）、1 mMの酪酸塩存在下で破骨細胞形成が有意（）に減少した（図1（a））。また、酢酸、プロピオン酸、バレレートなどの他のSCFAでも同様の抑制効果が検出された（補足図1A）。しかし、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mLのリファンピシンまたはレボフロキサシンの存在下では、破骨細胞形成に大きな影響を与えなかった（補足図1B）。成熟破骨細胞の再吸収活性も0.5 mM（40%減少）および1 mM酪酸（66%減少）存在下で有意に（）減少した（図1（b））。0.25 mM以下の濃度では細胞生存率に影響を与えず、72時間処理後の高濃度では30%以下の減少が観察され（補足図1C）、図1（a）に見られるような明らかな毒性の兆候は見られなかった。破骨細胞形成および吸収活性に対する酪酸の抑制効果とは対照的に、0.5 mMの酪酸は、骨形成培地で培養したMSCにおいてカルシウム沈着の増加傾向を示し（図1（c）、）、Alizarin Red染色で明らかにした。しかし、0.5 mM 酪酸存在下、軟骨形成培地で培養したMSCのペレット培養物のsGAG量には有意な変化は認められなかった（補足図1B）。0.5mM酪酸塩で処理したMSCの細胞生存率は、有意な影響を受けなかった（補足図1D）。全体として、これらのin vitroの実験は、酪酸が骨再形成と治癒に有益であると予想される方法で、骨吸収破骨細胞の分化と活性、およびMSCの骨形成分化の両方に影響を与えることを示している。

酪酸はヒト破骨細胞の形成と吸収を抑制する。骨癒合に関与する細胞に対する酪酸の影響。(a) 破骨細胞前駆細胞を、20 ng/mL M-CSF と 10 ng/mL RANKL と共に、それぞれ 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, または 1 mM の酪酸と一緒に培養した。破骨細胞形成はTracP染色により定量化した。データは以下の通り。0.5 mM酪酸非存在下（左画像）および存在下（右画像）でのTracP染色破骨細胞を示す代表的な画像。(b) 成熟破骨細胞は、上記に示した濃度の酪酸の存在下および非存在下で、ハイドロキシアパタイトコートプレート上で培養された。吸収領域はvon Kossa染色によって定量化した。示されたデータは、（ドナー、3連で行い、1ウェルあたり2枚の写真を撮り、定量化した）。0.5 mM酪酸の非存在下（左画像）および存在下（右画像）におけるハイドロキシアパタイトでコーティングしたウェルの吸収領域を示す代表的な画像。(c) MSCを骨形成培地で培養し、0.5mM酪酸の非存在下および存在下で、アリザリンレッド染色によりカルシウム沈着を定量化した。示されたデータは. 0.5 mM 酪酸の非存在下（左図）および存在下（右図）におけるアリザリンレッド染色の代表的な画像。すべてスケールバー ; UT = 未処理 ; RKL = RANKL; ; .
3.2. 酪酸は骨癒合と破骨細胞分化に関連する経路と遺伝子の発現に影響を与える。
バルクRNA配列解析により、酪酸による破骨細胞形成の阻害に関与する経路と遺伝子の可能性をさらに追求した。5人の健康なヒトドナーの破骨細胞前駆細胞（CD14+単球/マクロファージ）のトランスクリプトームを、6時間と24時間の0.5 mM酪酸非共存下および存在下で解析した。6時間の酪酸刺激で2718遺伝子が発現上昇し、2342遺伝子が発現低下した（図2（a））。24時間の酪酸処理後、4つの遺伝子のみがFDR閾値を通過した（LAD1、CCR7、HTR2B、ANKRD1、データは示していない）。MetaCore™ソフトウェアによるパスウェイエンリッチメント解析の結果、骨癒合に関連するいくつかのパスウェイが有意に変化していることがわかった。酪酸刺激により破骨細胞前駆細胞で統計的に有意に減少したパスウェイのトップ3は、IFN-α/βシグナル伝達に関する免疫応答パスウェイ、活性酸素による酸化ストレス細胞シグナル伝達、小胞体関連タンパク質分解だった（図2（b））。アップレギュレートされた経路は、p38、ERK、PI3Kを介したアンジオテンシンIIのシグナル伝達、GPCRを介した化学走性シグナルの経路、骨関連WNT5Aシグナルのシグナル伝達であった（図2（c））。GPCRシグナルの一部として、GPR43をアゴニストで刺激すると、破骨細胞形成の有意な（）減少につながった（補足図2A）。GPR43アゴニストの溶媒となったDMSOは、破骨細胞形成に影響を与えなかった（データ示さず）。

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図2

酪酸は骨癒合と破骨細胞分化に関連する経路と遺伝子の発現を制御する。6時間の酪酸処理後のヒト破骨細胞前駆細胞のRNA配列決定。(a) 破骨細胞前駆細胞を0.5 mMの酪酸で6時間刺激し、発現が増加した遺伝子と減少した遺伝子の数を示すVolcanoプロット。機能的濃縮解析により、0.5 mM酪酸塩6時間処理により最も有意にダウンレギュレートされた（b）およびアップレギュレートされた（c）パスウェイを3つ示した。(d) 破骨細胞分化に関与する遺伝子の、6時間の0.5 mM酪酸処理によるダウンレギュレーションとアップレギュレーション。全チャートのFold ChangeとFDR。
破骨細胞の分化・融合に関わる個々の遺伝子を調べたところ、酪酸処理した破骨細胞前駆細胞では、GPR183、ELF1、FCER1G、SBNO2、CHUK、SNX10、TRAF6、TCIRG1が著しくダウンレギュレートされていた（図2（d））。選択的インバースアゴニスト（GSK682753A）を用いたGPR183の阻害は破骨細胞形成にわずかな影響を与えるだけであった（補足図2B）。一方、EPHA2、CA2、TNFRSF11A（RANK受容体としても知られている）、FARP2、CTNNB1、TYROBP、CD300LF、TNF、NFATC1、MAPK14、TGFB1、GLO1が酪酸処理破骨細胞前駆細胞において著しく発現している（図2（e））。要約すると、酪酸は破骨細胞前駆細胞のトランスクリプトームにおいて、骨治癒に関連する経路や破骨細胞の分化と融合に重要な遺伝子を含む著しい変化を誘導することが明らかとなった。

3.3. リファンピシンおよびレボフロキサシン投与マウスは、酪酸塩およびコントロール投与マウスと比較して、Cecal SCFAレベルの低下と腸内細菌組成の変化を示した。
骨のリモデリングと治癒に関与する主要な細胞、すなわち破骨細胞とMSCに対する酪酸の潜在的な有益性を示す我々のin vitroデータに基づいて、我々はさらにマウスの骨切りモデルでこれを調べた（図3（a）に概要を示す）。対照マウスは、酪酸の経口補給を受けたマウスと比較し、酪酸の経口補給を受けたマウスは、. -を投与したマウスは、酪酸塩投与マウスやコントロールマウスと比較して、糞便中の酢酸、プロピオン酸、酪酸が最大で3倍減少した（図3（b）, )。酪酸塩の補給は、コントロールと比較してマウスの腸内細菌叢組成に影響を与えなかったが、ブレイ・カーティス距離を用いた主座標分析（PCoA）により明らかになったように、投与は著しい影響を与えた（補足図2A）。細菌の種類をみると、-投与マウスはFirmicutesが多く、酪酸塩投与マウスとコントロールはBacteroidataが多い（図3（c））。さらに、酪酸投与マウスでは、Prevotellaceae, Rikenellaceae, Deferribacteraceaeの相対量が多く（補足図2B）、Clostridiodes属の相対比率がコントロールおよび酪酸投与マウスに比べて高い（補足図2C）。まとめると、酪酸塩の補給は腸内細菌叢やSCFA産生に影響を与えなかったが、関与する抗生物質レジメンを投与すると、糞便水中のSCFAレベルが強く低下し、腸内細菌叢組成に著しい変化が誘発されることが明らかとなった。

Rifampicin-およびlevofloxacin-投与マウスは、酪酸塩-およびコントロール-投与マウスと比較して、腸内SCFAレベルの低下と腸内細菌叢組成の変化が見られる。酪酸塩が腸内細菌叢、全身性免疫、骨癒合に及ぼす影響をマウス骨切りモデルで評価した。(a) 介入と時間枠を示すin vivo研究の実験概要。図は、http://BioRender.com/ を用いて作成した。(b）酢酸、プロピオン酸、酪酸の頭蓋内濃度をUPLCにより測定した。データは平均値（）および±SEMを示す。c）マウス糞便内容物のDNAを分離し、16s rRNAの塩基配列を決定してマイクロバイオーム構成を決定した。マウス盲腸内の細菌フィラの存在比（-処理動物、酪酸処理動物、コントロール処理動物）。
3.4. 酪酸は炎症性メディエーターを減少させるが、RifampicinとLevofloxacinは血清中の炎症性マーカーと骨保存性マーカーを増加させる。
酪酸塩と抗生物質の全身的な効果を調べるために、マウスの血清中の様々な（炎症性）サイトカインと広範なタンパク質バイオマーカーをさらに評価した（図4）。炎症性IL-6は、骨切り後10日目の酪酸塩処理マウスでは-処理マウスに比べて有意に減少したが（）、この効果は21日目には、この時点の抗生物質処理マウスのレベルの減少が主因で減少した（図4（a））。炎症性TNFαのレベルは、両時点でコントロール-と酪酸塩-処理マウスで同程度であったが、-処理マウスで有意に増加した（図4(b)）。炎症性IL-1βレベルおよびマウスIL-8ホモログであるKC/GROは、いずれの時点でも酪酸または抗生物質治療による有意な影響はなかったが（図4（c）および4（d））、KC/GROは10日（）において-治療マウスでレベルが増加する傾向が見られた（図4（d））。10日後および21日後の抗炎症性IL-10レベルに関して、群間の明確な差は検出されなかった（補足図3A）。

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図4

酪酸は炎症性メディエーターの減少を誘導するが、rifampicinとlevofloxacinは血清中の炎症性マーカーと骨保存性マーカーを増加させる。骨切り後10日および21日に、マウスの血清中の様々な（プロ）炎症性サイトカインを、マルチプレックスサイトカインアレイとOlink標的プロテオミクスを用いて評価し、マウスの血清中の全身性バイオマーカーを調べた。骨切り後10日および21日の、酪酸および , の非存在下での (a) IL-6, (b) TNFα, (c) IL-1β, および (d) KC/GRO (murine IL-8 homologue) の血清濃度をそれぞれ示す。示したデータは、. (e) 酪酸投与マウスでは対照マウスと比較して、(f) -投与マウスでは対照マウスと比較して、92のバイオマーカーの発現に差異がある。有意差の閾値. 有意に変化したバイオマーカーは赤色で表示されている。Flrt2 = ロイシンリッチリピート膜貫通タンパク質；Tpp1 = トリペプチジルペプチダーゼ1；Ccl3 = C-Cモチーフケモカイン3；Lgmn = legumain；Wfikkn2 = WAP, Kazal, immunoglobulin, Kunitz, and NTR domain-containing protein 2; Tnfrsf11b = tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B (osteoprotegerin); Ccl2 = C-C motif chemokine 2; DII1 = delta-like protein 1; Fst = follistatin; Gcg = glucagon. ; .
Olink® テクノロジーで検査した92のバイオマーカーの発現差解析の結果、抗生物質投与は血清バイオマーカーに大きな影響を与え、11のタンパク質が有意に影響を受けた()。酪酸は2つの有意な変化を誘発した。細胞間の接着と移動のマーカーであるFlrt2とリソソームのセリンプロテアーゼであるTpp1は、コントロールマウスと比較して酪酸投与マウスで有意にダウンレギュレートされた（図4（e））。また、酪酸投与マウスでは、炎症性、破骨細胞性のIL-1β（；）、IL-6（；）、IL-17a（；）、Tnfrsf11b（＝OPG、；）のダウンレギュレーション傾向が観察された。一方、抗生物質投与マウスでは、IL-17a、IL-17f、Tnfrs11bがコントロールマウスと比較して有意に発現上昇した（図4（f））。その他、有意に発現が増加したタンパク質は以下の通りであった。成体幹細胞制御因子DII1、卵胞刺激ホルモン（FSH）阻害因子Fst（フォリスタチン）、血糖制御因子Gcg（グルカゴン）、タンパク質阻害因子Wfikkn2、ケモカインCcl2である。抗生物質投与マウスでは、Flrt2とケモカインCcl3がコントロールマウスに比べ有意に低下していた。血清分析をまとめると、抗生物質投与、SCFA欠乏マウスは、コントロールマウスと比較して、炎症性、破骨細胞形成性のTNFα、IL-17a、IL-17fのレベルが高く、またOPGレベルも高いことが示された。一方、酪酸塩処理マウスは逆の傾向、すなわち、コントロールマウスと比較して、炎症性および破骨細胞形成性のIL-6、IL-1β、IL-17aのレベルが低く、OPGのレベルが低いことが示された。

3.5. 酪酸塩処理により、骨切りマウスの骨髄において、CD14+単球/マクロファージ集団は減少し、CD19+B細胞集団は増加した
マウスの脾臓、手術した骨部位を排出する左鼠径リンパ節（iLN）、左脛骨骨髄（BM）において、フローサイトメトリーによりイムノフェノタイピングを行った。脾臓は全身的な免疫反応を反映するように選ばれ、BMとiLNは局所的な免疫反応を反映するように選ばれた。興味のある細胞集団は、補足図3Bに示すようにゲーティングされた。CD45+ CD14+ 単球/マクロファージの生存率は、対照マウスおよび抗生物質投与マウスと比較して、酪酸投与マウスのBMでは〜50%減少していた（図5（a））。CD14+の減少は、酪酸処理マウスのiLN（）と脾臓（）でも-処理マウスと比較して同様の傾向が観察された。一方、酪酸投与マウスのBMにおける生存可能なCD45+ CD19+ B細胞集団の割合は、コントロールおよび-投与マウスと比較して2倍高かったが、iLNおよび脾臓ではほとんど変化しなかった（図5（b））。生存可能なCD45+ CD3+ CD4+ T細胞に関して、酪酸塩処理マウスは-処理マウスと比較してiLNで有意に高い割合を示したが、BM脾臓での割合はグループ間でほとんど変わらなかった（図5（c））。CD45+CD8+T細胞の生存率は、酪酸投与マウスでは-投与マウスと比較して高い傾向にあったが（）、対照群と比較して有意差はなく、iLNと脾臓では群間の大きな差は検出されなかった（図5(d))。以上より、酪酸は主にマウスBMのCD14+単球/マクロファージおよびCD19+B細胞集団に影響を与え、したがってin vitroで示された破骨細胞前駆細胞に対する強力な作用と一致している。

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図5

酪酸処理により骨髄中のCD14+単球/マクロファージ集団は減少するが、CD19+B細胞集団は骨切り術後に増加する。手術したマウスの骨髄（BM）、鼠径リンパ節（iLN）、脾臓の単細胞懸濁液のイムノフェノタイピングを実施した。(a) 脾臓、iLN、BMにおけるCD45+ CD14+ 単球/マクロファージ、(b) CD45+ CD19+ B細胞、(c) CD45+ CD3+ CD4+ T細胞、および (d) CD45+ CD3+ CD8+ T細胞の生存率、それぞれ酪酸および , 存在下で測定した。示されたデータは、.
3.6. 酪酸は骨癒合に有意な影響を及ぼさないが、RifampicinとLevofloxacinは骨癒合を遅延させる可能性がある。
酪酸は破骨細胞の形成と活性を抑制し、MSCの骨形成分化を促進する傾向があるというin vitroの知見に基づき、酪酸がマウス骨切りモデルにおいて骨治癒に影響を与えるかどうかを評価した。マウスの未手術の対側大腿骨の骨力学的特性を試験し、破壊荷重を決定した。酪酸投与マウスの破壊荷重はコントロールマウスと有意差はなかったが、-投与マウスは骨切り後21日目に破壊荷重の有意な（）減少を示した（図6（a））。骨代謝マーカーである全身性PINPは、21日目に-treatedマウスは酪酸投与マウスに比べ有意に（）高かったが、骨切り後10日目には群間の有意差は検出されなかった（図6（b））。骨切り部位に新たに形成されたカルスの骨量を、骨切り後21日目にμCTにより定量化した。骨切り後21日目の新たに形成された骨に関して、群間の有意差は検出されなかった（図6（c））。骨のリモデリングと治癒の指標として、ミネラル付着の状態を調べるために、蛍光標識したカルシウム結合剤を骨切り後10日（カルセイングリーン）および18日（キシレノールオレンジ）経過したマウスに投与した。-処理したマウスは、10日後と18日後に平均蛍光強度がわずかに減少していることがわかる（Figure 6(d) and 6(e)）。さらに、術後21日目の骨切り部における軟骨および骨性カルス形成をさらに視覚化するために、ギムザ・エオジン染色を行った。-を投与したマウスは、コントロールおよび酪酸投与マウスと比較して、骨性ではなく軟骨性のミネラル化カルスがより多く存在することが示された（補足図5）。このことは、酪酸処理マウスで平均蛍光強度が低下し、ミネラルが付着していることを示す結果と一致する。結論として、酪酸はマウス骨切りモデルにおける骨特性および治癒成績に有意な影響を及ぼさない。しかし、-処理マウスは、血清中のPINP濃度の上昇、ミネラル付着の減少、骨切り後21日目の不全負荷によって明らかになったように、骨リモデリングの遅延傾向および骨特性の変化を示す。

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図6

酪酸は骨癒合成績に有意な影響を及ぼさないが、リファンピシンおよびレボフロキサシンはマウス骨切りモデルにおいて骨癒合を遅らせる可能性がある。骨切り後10日、18日、21日（安楽死）に手術したマウスの骨癒合成績を評価した。(a) 対側の未手術大腿骨の破壊荷重は、4点曲げ試験により決定した。(b) 血清中のプロコラーゲンI型C末端プロペプチド（PINP）を骨切り術後10日および21日後に測定した。c）骨切り後21日目にμCTにより骨量を測定した。d）骨切り後 10 日目（カルセイングリーン注入）および骨切り後 18 日目（キシレノールオレンジ注入）の骨切り部位のカルシウム沈着量を定量化した。e）骨切り部位の露出したカルシウムのカルセイングリーンおよびキシレノールオレンジラベリングを示す代表的な蛍光画像。, .
4. 考察
大腸炎や関節炎などの様々な炎症性疾患に対するプロバイオティクスおよびポストバイオティクスの有益な効果は、骨折治癒にも重要な役割を果たす可能性を提起している。ポストバイオティクスのSCFAは、過炎症反応を解消する能力が証明されており [35] 、炎症治癒段階の延長に起因する骨折結合の遅延を防ぐ可能性がある。逆に、例えば抗生物質治療によるSCFA産生の妨害は、骨折治癒にマイナスの影響を与えるかもしれないが、これも現在ではまだほとんど研究されていない。

我々の最初のin vitro研究は、SCFAが破骨細胞の形成とその吸収活性を低下させることにより、強力な破骨細胞阻害剤となることを示した。この効果のメカニズムについては、RNA配列解析によって明らかにされた。その結果、酪酸塩に暴露された破骨細胞前駆細胞では、骨癒合に重要ないくつかの経路が大きく影響を受けることがわかった。例えば、GPRを介した走化性経路は、酪酸存在下でアップレギュレートされていた。GPR41、43、109a、嗅覚受容体78はSCFAsの受容体としてよく知られており、特に関連性の高いGPR43（FFAR2としても知られる）はSCFAsの破骨細胞に対する抑制効果に必要であることが以前示されている[36]。我々は、GPR43を選択的アゴニストで刺激すると破骨細胞形成が有意に減少することを見出し、破骨細胞形成の予防におけるGPR43の重要性を示した。Lucasらは、破骨細胞に対するSCFAの抑制効果はGPR43とはほとんど無関係であり、むしろ破骨細胞前駆細胞の代謝的再プログラミングの結果として生じ、破骨細胞必須遺伝子であるTRAF6およびNFATc1のダウンレギュレーションにつながることを見いだした[37]。この相違は、これらの研究で使用されたSCFA濃度およびマウスの性別の相違に起因している可能性がある。GPRシグナルとの関連では、GPR183（EBI2としても知られる）がマウスの破骨細胞前駆体の移動および破骨細胞の分化に必要であることが示された[38]。GPR183 の遺伝子発現は酪酸処理により著しく低下したが、ヒト破骨細胞前駆細胞における GPR183 シグナルを阻害しても破骨細胞形成には影響を及ぼさないことがわかった。Wnt5aは骨折の修復で発現が増加することが示されていることから、我々の遺伝子濃縮解析におけるWnt5aシグナルの発現増加は、酪酸と骨治癒の別の関連を示唆するものである[39]。ダウンレギュレーションされたパスウェイに関しては、酸化ストレスに関連するROSシグナルが最も影響を受けたパスウェイの一つであった。高い酸化ストレスは、破骨細胞形成を促進することにより、骨リモデリングに負の影響を与えることが示された[40]。Tangらはさらに、酪酸が活性酸素レベルを下げ、ミトコンドリアの抗酸化酵素の活性を促進することによって、ラットの骨量減少から保護することを示した[41]。本研究では特に検討しなかったが、いくつかのin vitro研究では、酪酸の破骨細胞形成抑制効果は、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）活性の抑制効果に起因すると強調されていることは言及に値する [42, 43]。我々のトランスクリプトームデータと他の研究に基づいて、SCFAによる破骨細胞形成の阻害は、GPRシグナル伝達、HDAC阻害、免疫関連シグナル伝達、代謝変化など複数の経路への影響の結果と考えられることが明らかとなった。

破骨細胞前駆細胞に対する酪酸の作用は、我々のin vivo骨切りモデルでも明らかである。破骨細胞の前駆細胞であるCD14+単球/マクロファージは、コントロールおよび抗生物質投与マウスと比較して、酪酸投与後にBMにおいて有意に減少した。酪酸は転写後機序によりCD14受容体の発現を低下させ、CD45+ CD14+細胞に直接影響を与えることが以前に示されている[44]。さらに、SCFAプロピオン酸は、マウスのマクロファージと樹状細胞前駆体に主に影響を与えることによって、骨髄造血を変化させた[45]。酪酸によるマウス骨髄の単球／マクロファージの減少は、破骨細胞形成に対する酪酸の強力な影響のさらなる証明となる。SCFAs、特に酪酸塩のマクロファージに対する効果は以前に証明されており、それによってSCFAsはそれらの細胞の貪食能と抗菌活性を増加させた[46, 47]。単球／マクロファージ集団の減少とは対照的に、酪酸はコントロールおよび抗生物質投与マウスと比較して、BMにおけるCD19+ B細胞数を増加させた。最近、酪酸塩の補給が制御性B細胞（Breg）依存的にマウスの関節炎を抑制することが報告された[48]。Breg細胞はまた、炎症性サイトカインを抑制することにより、骨接合プロセスにおいて重要であり[49]、Breg細胞機能の喪失は、以前に脛骨骨折患者の治癒遅延と関連していた[50]。我々のモデルで観察された酪酸の効果に対するBregおよびTreg細胞の特異的な寄与は評価しなかったが、これはさらなる調査に値する潜在的なメディエーターである可能性が高い。

酪酸は、様々な免疫細胞集団に影響を与えるだけでなく、血清炎症メーカーにも影響を与え、特に、炎症性IL-6レベルを低下させた。IL-6はマクロファージなどの免疫細胞だけでなく、骨芽細胞からも分泌され、破骨細胞の形成を促進する[51]。興味深いことに、可溶性IL-6の薬理学的阻害は、マウスにおける重度の外傷後の骨折治癒の障害を改善した[52]。破骨細胞形成能を有する他のサイトカインとしては、TNFα、IL-1β、IL-17などが知られている[53]。ここで、-処理マウスは、コントロールおよび酪酸処理マウスと比較して、血清中のTNFα、IL-17aおよびIL-17fレベルが強く上昇している。実際、-投与したマウスは、糞便中の酢酸、プロピオン酸、酪酸のSCFAsレベルが著しく低下し、それに伴って腸内細菌叢の組成も著しく変化した[54]。SCFAsの減少が，抗生物質投与マウスの血清中の炎症性TNFα，IL-17a，IL-17fの高レベルの循環を説明するかもしれない．一方、OPG（Tnfrsf11b）は骨量を維持する抗骨芽細胞性因子であり、抗生物質投与マウスでは対照マウスに比べ増加するが、酪酸投与マウスでは減少することが示された。我々の研究におけるTNFαとOPGの相関は、TNFαがOPG発現のプロモーターであると記述している他の研究と一致する[54]。実際、TNFαは樹状細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞におけるOPGの発現をアップレギュレートすることが示され［55］、またヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）からのOPGの分泌を刺激することが示された［56］。さらに、TNFαとOPGの両方の血清レベルは、健常者と比較して変形性関節症患者で高かった[57]。したがって、OPGの発現の増加は、過剰な骨破壊から保護するために、TNFαレベルの増加による破骨細胞形成促進効果を打ち消す可能性がある。興味深いことに、ラットにおけるOPG投与は、初期のカルスの膨張には影響を与えなかったが、破骨細胞数を減少させることにより、カルスのリモデリングを阻害した[58]。また、RANKL標的抗体であるデノスマブによるRANKシグナルの遮断、またはビスフォスフォネートであるアレンドロネートによる治療は、骨折カルスのリモデリングを遅らせるが、機械的強度と骨密度を改善することが、マウスで示された［59, 60］．このことから、骨折治癒における破骨細胞の標的化された一時的な活性が、カルスのリモデリングを成功させるために必要であることが強調される。酪酸は、リモデリング段階での破骨細胞の過剰活性を防ぐことによって、骨折治癒を最適に支援し、骨折治癒の初期炎症段階の効果的な解消を支援する候補化合物である可能性がある。

抗生物質を投与したSCFA欠乏マウスにおけるTNFα、IL-6、IL-17a、IL-17fの高い循環レベルは、それらのマウスにおける全身性炎症段階の長期化と未解消を示す。このことは、骨切り21日後のPINPレベルの上昇と欠損部でのミネラル付着の減少傾向によって明らかになった、抗生物質投与マウスの骨治癒の遅延傾向を説明することができる。PINPはマトリックス形成時にプロコラーゲンが切断される際に産生され、ミネラル化するため、抗生物質投与マウスでは骨のリモデリングとミネラル化が初期段階にあるのに対し、コントロールと酪酸投与マウスではさらに進行していることが示唆される。さらに、TNFα、IL-6、IL-17a、IL-17fの慢性的な上昇は、破骨細胞活性を過剰かつ長期化させ、その結果、骨の純減と骨の安定性の低下をもたらすと考えられる[61]。実際、抗生物質を投与したマウスは、この研究において、対側の未手術の大腿骨において破壊荷重値の減少を示し、骨回転に対する全身的な負の効果を示した。本研究におけるIL-17a、IL-17fなどのサイトカインの測定は、破骨細胞が重要な役割を果たす骨折修復の中期と後期（手術後10日、21日）に行われた[24]。骨折修復の初期（7日未満）には、IL-17a、IL-17fともに骨芽細胞の成熟を促進し、骨形成を促進することが示されている[62, 63]。したがって、骨折治癒の段階によって、IL-17aとIL-17fは破骨細胞と骨芽細胞の両方に対して異なる機能と影響を与えるかもしれない。このような骨折治癒におけるサイトカインの二元的な役割は、IL-6についても記述されている[64]。

我々の知見に基づくと、今後の研究として興味深いのは、酪酸の補給が抗生物質治療による骨癒合への悪影響を逆転させることができるかどうかを調べることであろう。実際、我々は、別の研究グループにおいて、酪酸塩と抗生物質の両方を投与することにより、複合的な治療法をテストした。しかし、予想以上の脱落率に悩まされ、この実験グループからの限られた知見は発表されなかった。全群に見られた脱落の主な理由は、スクリューの緩みであった。これは、部分的には柔軟固定法に起因すると考えられ、一般的に雌マウスよりも重く、より顕著なバーバーリング行動を示す雄マウスを使用したことが原因であると思われる。柔軟な固定方法は、より高い炎症性カルス形成を誘発することが知られているため、SCFAが治癒を良い方向に調節する可能性を明らかにするために、この研究に選ばれたのである。この酪酸塩と抗生物質の組み合わせを試験するためには、例えば、より硬い固定方法を用いるなどして、モデルの改良が必要かもしれない。酪酸塩と抗生物質の組み合わせの影響は、著しい炎症性骨溶解が予想される骨感染モデルで試験することも可能であろう。

結論
結論として、酪酸塩は用量依存的に破骨細胞の形成と吸収活性を有意に低下させ、MSC培養におけるカルシウム沈着量を増加させる傾向を示した。In vivoでは、酪酸はマウス骨切りモデルにおいて、コントロールおよび抗生物質投与マウスと比較して、骨髄中の単球/マクロファージおよび全身性IL-6濃度を減少させた。一方、抗生物質投与マウスでは、盲腸のSCFA濃度が低下し、循環血中の炎症性TNFα、IL-17a、IL-17f濃度が上昇した。また、抗生物質投与マウスは、コントロールマウスや酪酸投与マウスと比較して、骨治癒が遅れる傾向が見られた。

本研究は、腸内細菌叢とその関連物質であるSCFAが骨治癒の成功に寄与する可能性を明らかにした。

データの入手方法
RNAシーケンスおよび16s rRNAシーケンスのFastqデータファイルは、論文発表と同時にhttp://ncbi.nlm.nih.gov/ に寄託される。その他のデータについては、著者にお問い合わせください。

利益相反
すべての著者は、利益相反がないことを宣言している。

謝辞
動物実験に協力してくれたARI Davosの前臨床施設のすべてのメンバー、特に動物の世話をしてくれたCaroline Constant、μCT解析のサポートをしてくれたKaren Mys、組織学的サンプル処理をしてくれたMauro BluvolとNora Goudsouzianに感謝したい。Pamela Furlong, Ge Tan, Susanne Bärtl, Ciara Ferris, and Samson Arveladzeにも、この研究の実施における支援に謝意を表する。本研究は、Clinical Priority Program Bone Infection（AR2017_06）の一環として、AO Traumaから資金提供を受けた。

補足資料
補足図1：（A，B）酢酸、プロピオン酸、酪酸、バレレート（A）、抗生物質（B）が破骨細胞形成に与える影響。破骨細胞前駆細胞は、20 ng/mL M-CSFと10 ng/mL RANKLと、異なるSCFAクラスの0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM、あるいは0.5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL rifampicin and/or levofloxacin, とそれぞれ培養させた。破骨細胞形成は、TracP染色により定量化した。C）MSCを軟骨形成培地で培養し、細胞ペレット中の硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含有量を評価し、DNA含有量に正規化したものを示す。データは平均値（独立ドナー）、±SEMを示す。0.5mM酪酸塩非存在下（左図）および存在下（右図）におけるサフラニンOおよびファストグリーン染色の代表的な画像。(D, E）破骨細胞前駆体（D）およびMSC（E）の細胞生存率に対する酪酸の効果は、CellTiter-Blue試薬を用いて評価した。示すデータは、. 細胞生存率のパーセントは、それぞれ未処理の破骨細胞前駆細胞およびMSCsに対して正規化した。, , , および . 補足図2：（A, B）破骨細胞形成に対するGPR43アゴニストおよびGPR183インバースアゴニスト（阻害剤）の影響を示す。ヒト破骨細胞前駆細胞を 20 ng/mL M-CSF および 10 ng/mL RANKL と共に、75 nM, 750 nM または 7500 nM GPR43 アゴニスト (A) または 5 nM, 50 nM または 500 nM インバース GPR183 アゴニスト (B) で培養し、破骨細胞形成を定量した。破骨細胞形成はTracP染色により定量化した。UT = 未処理；RKL = RANKL。(C) 未処理細胞（UT）、RANKL刺激細胞（RKL）、および500 nM GPR183阻害剤または7500 nM GPR43アゴニストで処理した場合のTracP染色の代表的な画像。いずれもスケールバー補足図3：(A) プリンシプルコーディネート分析（PCoA）は、ブレイ・カーティス距離を使用して、フィルタリングされたリボソーム配列変異体（RSVs）に対して実行されました。(B) 最も多い50のRSVの存在率を分類群別に分類した。(C) DADA2解析パイプラインによって割り当てられた最も豊富な50の属のヒートマップ。補足図4：(A) 骨切り後10日および21日の酪酸および , の非存在下でのIL-10の血清濃度をそれぞれ示す。(B) フローサイトメトリーによるイムノフェノタイピングのゲーティング戦略。生存可能な細胞（eFluor 780陰性細胞）が選択され、この集団からさらにCD45+細胞がゲーティングされた。CD19+、CD14+、CD3+ CD4+、およびCD3+ CD8+細胞は、提示されたように選択された。補足図5：ギムザ・エオジンで染色した手術21日後の骨切り部位の代表的な画像である。画像は、手術後21日目にμCTで測定された各治療群の骨量中央値に基づいて選択された。(補足資料)

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Copyright © 2021 Alexandra Wallimann et al. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの下で配布されるオープンアクセス論文であり、原著を適切に引用することを条件に、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、複製を許可するものである。
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