腸内細菌叢と口腔内細菌叢の個人間伝播ランドスケープ

2023年7月31日 10:07

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発行：2023年1月18日
腸内細菌叢と口腔内細菌叢の個人間伝播ランドスケープ

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05620-1

ミレイア・バジェス＝コロマー
アイトール・ブランコ＝ミゲス
...
ニコラ・セガタ
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Nature 614巻 125-135ページ (2023)この記事を引用する
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指標詳細
要旨
ヒトのマイクロバイオームは、人体に不可欠な構成要素であり、いくつかの健康状態の共同決定因子である1,2。しかしながら、対人関係がマイクロバイオームの個人の遺伝的構成や集団内および集団間での伝播をどの程度形成しているかは、まだほとんどわかっていない3,4。ここでは、9,700を超えるヒトメタゲノムと計算機による菌株レベルのプロファイリングを活用し、個人間での広範な細菌株の共有（1,000万インスタンス以上）を、母親から乳児へ、世帯内、および集団内での明確な伝播パターンとともに検出した。母親から乳児への腸内細菌叢の伝播は、乳幼児期にはかなりの割合で安定しており（共有種のうち約50％が同一菌株（菌株共有率））、年齢が高くなっても検出可能であった。対照的に、口腔マイクロバイオームの伝播は主に水平的に起こり、同居期間によって促進された。同居している個体間ではかなりの菌株共有が認められ、腸内マイクロバイオームと口腔マイクロバイオームの菌株共有率の中央値は12％と32％であった。さらに、細菌株共有は、種レベルのプロフィールよりも宿主集団の構造をよく再現していた。最後に、異なる分類群は、伝播様式を問わず効率的な拡散者として現れ、宿主外生存能力に関連する異なる予測細菌表現型と関連していた。今回明らかになった微生物伝播の程度は、ヒトのマイクロバイオーム研究5、特に非感染性の微生物関連疾患に関する研究において、その関連性を強調するものである。
主な内容
ヒトのゲノムは両親から受け継がれ、生涯にわたって安定したままであり、ヌクレオチドの変異の蓄積は限られている。対照的に、私たちの微生物相補体（ヒトマイクロバイオーム）の遺伝的構成は、出生時に播種され、時間とともに変化し、高い時間的変動性と個別化の両方を示す6,7。食事やライフスタイルなどの要因がヒトマイクロバイオームの構成を変化させることはよく知られている1,2,8が、ヒトの体外で増殖できるマイクロバイオームのメンバーはごくわずかであるため、ほとんどの微生物は他の個体から獲得しなければならない3,4。実際、ヒトの腸内における微生物のコロニー形成は、その大部分が母親からの伝達によって行われている9,10,11,12,13,14。しかし、母親からの伝達だけでは、成人に見られる微生物の多様性を説明することはできない。マイクロバイオームの構成微生物がどのようにして個体によって獲得・伝播され、集団に広がっていくのか、そしてそれが個人のマイクロバイオームの遺伝子構成をどのように形成していくのかは、特にヒトにおいては15,16、ほとんど未解明であり、現在までに予備的な知見が得られているにすぎない11,17。これまでのところ、研究は、正確にデザインされた研究の数と規模が限られていること、そして微生物の同種株、すなわち種内の遺伝的変異体のプロファイリングを一貫して包括的に行うことが困難であることが障害となっている。
菌株はヒトマイクロバイオームの個体特異的な構成要素である18,19。これらの菌株は、1つの種の中でゲノム的にも機能的にも非常に多様である可能性があり、そのプロファイリングは、微生物の伝播と、重複する一連の種に向かうマイクロバイオームの収束とを区別するために必要な前提条件である。マイクロバイオーム伝播の特徴を明らかにすることで、ヒトのマイクロバイオームの複雑さに対する理解が進み、現在非伝染性と考えられている疾患や病態にマイクロバイオーム伝播が加わる「伝染性」の要因に対処することができる5。ここでは、マイクロバイオーム伝播ランドスケープの包括的な説明を提供するために、複数のシナリオにおける個人間マイクロバイオーム株共有のパターンを特徴付け、定量化する。
マイクロバイオーム伝播のプロファイリング
人から人へのマイクロバイオーム伝播の様式を解明するために、私たちは、改良された菌株レベルプロファイリングメタゲノムツールを用いて解析された、家族関係が既知の大規模なメタゲノミックデータセット2,9,10,12,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34（n = 31）について統合解析を行った（Methods）。これらのデータセットのうち8つは、アメリカ（アルゼンチン、コロンビア、米国）、アフリカ（ギニアビサウ）、アジア（中国）、ヨーロッパ（イタリア）の異なる地理的地域と宿主の生活様式から、本研究の文脈で新たに配列決定されたものである。アフリカ（ガーナおよびタンザニア）およびヨーロッパ（イタリア）における他の3つの研究9,34をさらに拡大し、合計978の便および1,929の唾液サンプルを収集した（補足表1および2）。このコレクションは、9,715のマイクロバイオームサンプル（便7,646、唾液2,069）とキュレーションされた宿主情報で構成されており、母子ペア、世帯メンバー、成人双生児ペア、村、集団間での伝播を評価することができる。この31のデータセットは、5大陸20カ国からのヒトメタゲノームであり、多様な宿主のライフスタイルを表しており、サイズは異なるが（図1a,b、拡張データ図1a、補足表2）、統合されたセットにより、世界レベルでの個人間マイクロバイオーム伝播パターンの同定が容易になった。
図1：個人間のマイクロバイオーム株伝播を調査するためのメタゲノム解析の枠組み。
a, SGBフレームワークに基づく調査とデータセットの概要（Methods）。角括弧内の数字は、本研究で配列決定されたユニット数。 b. 腸内サンプルの全体的な種レベルの構造（Aitchison距離による主成分分析、1人当たり無作為サンプル1個、n = 4,840）。c、有病率の低い高感染種であるB. bifidum（SGB17256）（Methods）の系統樹（補足表9）で、菌株の遺伝的多様性と、同一個体のサンプル間および異なる個体間で共有されている菌株を示している。各関係タイプについて、菌株共有の例を1つずつ強調表示している。株共有の事例に関与する木の葉はデータセットごとに色分けされ（拡張データ図1b）、その形は親族関係を反映している。下段は、2つの時点（6カ月未満の間隔、「同一個体」）および無関係な個体（「異なる個体」、拡張データ図3および方法）でサンプリングされた個体における、種のペアワイズ中心nGDの分布。d,e, B. animalis（SGB17278）（d）と、ヒト腸内メタゲノムまたはマウスサンプルおよび発酵食品40から再構成したMAGから再構成したS. thermophilus、S. salivariusおよびS. vestibularis（SGB8002）（e）株との間のペアワイズnGDの分布。ヒトにおけるB. animalisの存在は市販の食事製品の摂取と関連している（Extended Data 図4a）のに対し、S. thermophilus、S. salivarius、S. vestibularis株のサブセットのみが発酵食品の摂取と関連している（Extended Data 図4b）。f. 関係のタイプ間での個人間菌株共有率（共有菌株数／共有SGB数×100%）。すべての比較は統計的に有意である（Kruskal-Wallis検定、n = 26,218、χ2 = 11,420、P < 2.2 × 10-16、post hoc Dunn検定、Padj < 0.05；補足表7）。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位数と上位四分位数を表し、中央の線が中央値を、ひげが四分位範囲（IQR）の1.5倍まで伸びている。上部の数字は、系統共有イベントが検出されなかったペアの割合である。
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メタゲノミクスによる微生物株伝播の推定は、通常、株は少なくとも数ヶ月の期間にわたって個人の腸内に存在するが、直接的または間接的な伝播が起こらない限り、無関係な個体で見つかることはほとんどないという有効な仮定を利用する19,35,36,37,38。ここではまず、菌株レベルのプロファイリング方法39（Methods）を改良し、次に、菌株の同一性に関する種特異的な定義を運用することで、菌株追跡をさらに精緻化した（Extended Data Fig.2）。菌株境界は、4カ国20,22,27,28,31の1,500を超える縦断的サンプルにおいて、同一個体の縦断的な菌株保持と無関係な個体のnGD分布を最もよく分離する正規化系統距離（nGD）閾値を同定することによって設定した（Youdenの指数は5％未満の偽陽性の可能性を許容する-すなわち、無関係な個体によって共有される同一菌株；並べ替え分散分析（PERMANOVA）、n≧50組、R2＝0. 75 to 1%, P < 0.001; Fig. 1c, Extended Data Fig.）このようなnGDベースの閾値は、メタゲノミックサンプル中の検出可能な種のほとんどに典型的な、やや低い平均カバレッジ（平均カバレッジ＝7.2×）と、マーカー遺伝子の連結アラインメントの限られた長さ（平均トリミングアラインメント長＝74,348ヌクレオチド（nt））で構築された系統樹で良好に機能する。さらに、我々のアプローチは、生の一塩基変異（SNV）率や遺伝的類似性を考慮する場合には利用できない、系統樹によって提供される進化モデルに関する情報を利用している。
マイクロバイオームプロファイリングはまた、214,000以上のメタゲノム集合ゲノム（MAG）と約138,000の分離ゲノム39のリポジトリで定義された、培養された代表種（既知の種レベルのゲノムビン（kSGB））を持つ1,730種を補完する、1,022のまだ培養されていない名前のない種（未知の種レベルのゲノムビン（uSGB）と呼ばれる）にも拡大された。uSGBは、検出された全種レベルゲノムビン（SGB）の37%を構成し、特に非西洋化社会の腸内メタゲノム（99%の有病率、全体の相対存在量中央値42%；Methods）において、高頻度（腸内メタゲノムの86%、口腔内メタゲノムの100%、相対存在量中央値17%、相対存在量中央値10%）であることが判明した。各サンプルにおいて、少なくとも1つのコホートの少なくとも20サンプルにおいて、少なくとも10％の有病率で見つかったSGBの優勢株をプロファイリングすることにより、菌株の共有を評価した。その結果、腸内メタゲノム（補足表4）では合計646のSGB、口腔内メタゲノム（補足表5）では合計252のSGBが検出され、両方の環境において24のSGBがプロファイリングされた。開発された計算手法は、あらゆるメタゲノムデータセットからの菌株伝播の推定に利用可能である（Methods and Code availability）。
その一例として、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）（SGB17256）-伝播について評価された646の腸内SGBの1つ-は、1,298の腸内マイクロバイオームサンプル（全便サンプルの17％）でプロファイリングに成功した。その結果、最大6ヵ月間隔で採取された同一個体からのサンプルのペアの87%から同一のB. bifidum株が検出され、株間のnGDは明確な二峰性分布（系統学的距離が0に近い最初のピークは共有株を示す）を示した（図1c）。全体として、13,278例のB. bifidum株が個人間で共有されていることが、大多数の母親とその子供との間で同定された（潜在的伝播よりも検出された株共有事象の割合、すなわちSGB伝播率＝0.93；Methods）だけでなく、世帯員間でも同定された（SGB伝播率＝0.73）。
直接的な伝播と間接的な獲得または共獲得との区別は、縦断的なサンプリングまたは特定の環境（例えば、母親から新生児への伝播）でのみ可能であるにもかかわらず、市販の発酵食品から得られた微生物のMAGまたは分離ゲノムとの類似性が高い（SNV率が0.0015以下）菌株を各SGBで同定して廃棄することにより、共通の食事源からの共獲得に起因する菌株共有が検出される可能性を最小限に抑えた40（Methods）。食品マイクロバイオームの研究はまだ不十分であるため、食品から腸へのコロニー形成はまれであると考えられている40 にもかかわらず、他の菌株や種が食品由来である可能性がある。このフィルタリングの結果、腸内サンプル中のほとんどのビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis、SGB17278）株（278株、全体の94％、図1d、Extended Data 図4a、補足表6、およびMethods）が下流解析から除外され、市販の食品由来と推定されることが裏付けられた20。実際、除外されたサンプルの98％以上が欧米化されたデータセットから得られたものであったのに対し、市販のプロバイオティクスが入手しにくい地域の非欧米化データセットからは6株しか検出されなかった（非欧米化サンプルの0.07％未満）。同じ基準に従って、Streptococcus thermophilus、S. salivarius、S. vestibularis（SGB8002）を含む7つのSGBから、食品由来のMAGに系統学的に近い540株を除外した（除外されたのは19株；図1e、拡張データ図4b、補足表6）。これらの除外を総合すると、腸サンプルでは約635万件、口腔サンプルでは約491万件の異なる個人間での菌株共有が検出された。
腸内細菌叢の伝播の概要
まず、人間関係全体における一般的な腸内細菌叢の菌株共有パターンを評価し、個人間菌株共有率を、2人の個人間で共有された菌株数を、共通にプロファイリングされたSGBの数（菌株レベルでプロファイリングされた646のSGBのうち；Methods）で正規化したものとして定義した。菌株は、6ヵ月未満の間隔でサンプリングされた被験者20,22,27,28,31において高度に持続的であることが確認され（菌株共有率中央値87％）、検出された菌株に縦断的な重複が見られない個人は0.5％とわずかであった。同居している母親とその0～3歳の子供との間で検出された個人間株共有率が最も高く（株共有率の中央値は34％）、次いで同じ世帯に住む4歳以上の個人（12％）、同居していない成人の双子（8％）、同じ村に住む同居していない成人（8％）であった。成人双生児間の株共有は、母親からの持続的な共有感染による部分もあるかもしれないが、同じ村の個人間での株共有は、おそらく物理的相互作用と共有環境による水平伝播の結果であろう。対照的に、同居していない個体は、同じ村の異なる個体群（以下「集団」）において、株共有率は最小（中央値0％）であった（Kruskal-Wallis検定、n＝26,218、χ2＝11,420、P＜2.2×10-16、post hoc Dunn検定、調整後P値（Padj）＜0.05；図1fおよび補足表7）。この非常に有意なパターンは、検出可能な菌株を1つも共有していない個体の割合によっても確認された：母子間で菌株共有が検出されなかったペアはわずか4％であったのに対して、同じ集団内で人と人との接触が明らかでないペアの82％では菌株が共有されておらず、異なる集団では最大97％の個体で菌株が共有されていた（図1f）。このように、人から人への菌株の共有は、共有する環境や血縁関係における社会的距離に基づく勾配に従っており、種レベルの微生物分岐によって観察される勾配よりも顕著に強い（β多様性指標、Kruskal-Wallis検定とポストホックダン検定、Padj < 0.05；拡張データ図4bと補足表8）。全体として、我々の統合解析は、一個人の腸内細菌叢を形成する上で、人から人への直接的な相互作用と社会的相互作用ネットワークの関連性を浮き彫りにしている。
広範な母子間伝播
母子間のマイクロバイオーム伝播についてはこれまでにも報告されており9,10,11,29,32,41、今回の拡大サンプルセット（711組の母子から得られた3,598サンプル、うち新規便サンプルは636サンプル；図1a）では、これまでに報告されたパターンをさらに一般化することができた。その結果、菌株共有率と子供の年齢との間に顕著な負の相関が認められた（スピアマンの検定、n = 448、ρ = -0.52、P < 2.2 × 10-16; Kruskal-Wallisの検定、χ2 = 156、P < 2.2 × 10-16; Fig. 2a）にもかかわらず、母子の共有種数は年齢とともに増加しており（中央値＝生後1年で17種、3歳までで37種、18歳までで57種）、このことは母子以外から来たと思われる種が母子に蓄積されていることを示唆している。生後1年間で、乳児は母親と、乳児と母親の両方のマイクロバイオームから検出された種の株の半分を共有しており（株共有率）、乳児から検出された株の16％は母親に由来すると推定された（Extended Data Fig. 6aおよび補足表10）、最初の数日後9,12の菌株共有率は有意でないわずかな減少にとどまった（1日後、1週間後、1年後の菌株共有率の中央値はそれぞれ65％、50％、47％、post hoc Dunn検定、Padj ≥ 0.05、補足表10）。離乳後の身体的な親密さの低下と乳児の運動活動の拡大42と一致し、その後、1～3歳では緊張の共有は27％に減少した（図2a）。母子間の負担分担率は3歳以降安定し（18歳までで19％、30歳までで14％；図2a）、世帯員間で観察される負担分担率（12％；図1f）に近づいた。出生時に十分な菌株共有が見られたことから、乳児の腸内に母親のマイクロバイオームが相当程度播種されていることが確認されたが、高齢者（50～85歳）においても菌株共有は有意なままであり、同居していない母親と子どものペアは、血縁関係のない母親よりも有意に多くの菌株を共有していた（16％対8％；Wilcoxon順位和検定、n = 17,177、r = 0.09、P = 4.1 × 10-35；Extended Data図6b）。これは、出生時に長期間持続する母親の微生物刷り込みと、生後に共有される社会環境によって引き起こされる株伝達が複合的に作用した結果であると考えられる。
図2：腸内マイクロバイオームの母子共有。
a,母子間の菌株共有率（左軸；箱ひげ図と灰色以外の点）は減少し、一方、子供における種の豊富さ（右軸；灰色の点）は子供の年齢の関数として増加する（14カ国17データセット）。子孫のStrainPhlAnによってプロファイリングされたSGB数の中央値を豊かさの代用として使用（右軸）。Kruskal-Wallis検定、n = 448、χ2 = 156、P < 2.2 × 10-16、post hoc Dunn検定；NS、有意ではない（Padj ≥ 0.05）；その他の比較はすべて有意（補足表10）。箱ひげ図では、箱の縁は下位四分位数と上位四分位数を表し、中央の線は中央値を表し、ひげはIQRの1.5倍まで伸びている。b, 生後1年間の母子感染性SGBの分布。c, 生後1年間の母子感染性が高い33のSGB（SGBの透過率が0.5以上であり、母子感染性が血縁関係のない母子感染性よりも有意に高い；Methods）。NS、カテゴリーにおける有意でないSGBの伝播性（母子ペア間および非血縁母子ペア間のSGBの伝播数と非伝達数に関するχ2検定、補足表16）。少なくとも3つの伝播の可能性がある比較（少なくとも3つの母子ペアが共有する種）のみを示す；伝播の可能性が3つ未満の比較には点を付ける。有病率は、SGBが検出された母子サンプルの割合として定義されている。本研究の新規データセットにはアスタリスクを付した。グレーのSGB名は、個体間nGDが5％の菌株同一性閾値を使用している（補足表4）。B. cellulosilyticus-timonensis、Bacteroides cellulosilyticusおよびBacteroides timonensis；Bacteroides uniformis-rodentium、Bacteroides uniformisおよびBacteroides rodentium；B. pseudocatenulatum、Bifidobacterium pseudocatenulatum；B. ovatus-xylanisolvens-caecim.、Bacteroides caecimuris。
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母親の腸内マイクロバイオーム伝播に影響を及ぼす可能性のある因子としては、ライフスタイルや分娩様式が挙げられる14,29。新たに配列決定された非西欧化集団は、母親（ウィルコクソン順位和検定、n = 721、r = -0.37、P = 7.4×10-24）とその子孫（Padj < 0. 05, Extended Data Fig. 6c and Supplementary Table 11）、ほとんどの年齢カテゴリーで母子間の菌株共有率に差は見られなかった（ウィルコクソン順位和検定、3～18歳を除くすべての年齢カテゴリーでPadj≧0.05; Supplementary Table 12）。実際、西洋化社会と非西洋化社会では、同程度の数の菌株が母子感染していた（ウィルコクソンの順位和検定、3～18歳を除くすべての年齢区分でPadj≧0.05、補足表13）。したがって、非西欧化集団におけるマイクロバイオームの多様性の高さは、母親からのマイクロバイオーム菌株の伝達によって維持されているのではなく、より多くの個体との密接な相互作用によって獲得されている可能性がある。これとは対照的に、我々は分娩様式と母子間の菌株共有率との間に、生後早期に関連があることを確認した：経膣分娩の乳児（1歳まで）は、母親との菌株共有率が有意に高かった（ウィルコクソン順位和検定、Padj < 0.05；拡張データ図6dおよび補足表14）。しかし、加齢に伴って分娩様式が乳児のマイクロバイオームに与える影響が減少するのと同様に46、3歳以降では差は検出されなかった（n = 56、r = 0.2、Padj = 0.18；補足表14）。したがって、経膣分娩では、生後早期に母親からの伝播によって明らかな腸内マイクロバイオームの刷り込みが行われるのに対し、生活習慣の違い（衛生状態や建築環境の衛生レベルの相違を含む）は、マイクロバイオームの伝播率には実質的に影響しない。
母親から子供への伝播（株共有が減少する前の1歳までの子供で定義；図2a）は、種によって大きく異なるが（図2b）、SGBの伝播性はデータセット間でむしろ一貫しており（ペアワイズ・スピアマンの検定、ρ = 0.59-0.83、Padj < 0.05；補足表15）、微生物の特異的な形質としての種の伝播性が明らかになった。10個のデータセットに含まれる高伝染性SGB（51％のSGB、感染率は0.5以上、母子感染率は無関係な母子感染率より有意に高い；Methods）はすべて特徴的な種（kSGB）に属し（カイ二乗検定、n = 33、Padj < 0.05；図2cおよび補足表16）、そのほとんどがバクテロイデス属とビフィドバクテリウム属のSGB（それぞれn = 16 (48%) とn = 5 (15%) SGB；図2c）であった。その一例として、Bacteroides vulgatus（SGB1814）とBifidobacterium longum（SGB17248）は、欧米化されたすべてのデータセットにおいて、母親と乳児の間で有意に感染していることが検出された（カイ二乗検定、Padj < 0.05；非欧米化データセットでは感染性を評価するほどには流行していない；図2c、補足表16およびMethods）。対照的に、乳児から検出された他のSGB、例えば13人の子どもと102人の母親から検出されたRoseburia intestinalis（SGB4951）は、母体感染することは極めてまれであった（補足表9）。高率に母子感染するSGBは、母親と高齢の子供との間で徐々に共有されなくなることがわかったが（図2cおよび補足表16）、母親と同居していない高齢者（50〜85歳）でも、高率に母子感染するSGBの52％に有意な感染性が検出された（図2cおよび補足表16）。
同居が感染を促進する
同居者間の腸内細菌叢の類似性はよく報告されている45,47,48,49が、菌株レベルの解像度が不足しているため、ほとんどの研究では、より高い分類レベルでの類似性が微生物の伝播を反映しているのか、それともむしろ類似の条件（例えば、遺伝学や食事）による変調を反映しているのかを結論づけることはできなかった。腸内細菌叢の水平伝播を調べるため、4大陸の8集団212世帯（図1a）において、同居する883人（4歳まで）の間で共有されている菌株を評価した。大半の世帯では、同居しているメンバー間での個人間緊張共有率が、同じ集団の同居していない個人との共有率よりも有意に高かった（11%～71%）（64%の世帯、ウィルコクソン順位和検定、Padj < 0.05、異なる世帯間と比較した緊張共有率の中央値は28%～778%増加、図3aおよび補足表17）。種レベルのマイクロバイオームの類似性（β多様性指標；Extended Data図4b）については、同居している個体と同居していない個体との間で、より弱い差異が認められた（3％～9％の増加、Kruskal-Wallis検定とpost hoc Dunn検定、Padj＜0.05；補足表8）。個人間のひずみ共有は世帯間で大きく異なるが（クラスカル・ワリス検定、n＝1,632、χ2＝223、P＝2.8×10-45）、欧米化したライフスタイルとの関連はわずかであり（ウィルコクソン順位和検定、n＝1,632、r＝-0.22、P＝2.2×10-18）、おそらく環境や社会的変数の影響は限定的であることを示している。同居する個体間の菌株共有は年齢とともに減少し（4歳未満と4歳以上のウィルコクソン順位和検定、n＝1,843、r＝-0.12、P＝1.3×10-7）、幼少期のコロニー形成抵抗性が低いことを裏付けている6,32。対照的に、非世帯由来株数（どの世帯員とも共有していない株と定義）は、累積曝露量の増加に伴って予想されるように、年齢とともに増加した（4歳未満対4歳以上のWilcoxon順位和検定、r = 0.20、P = 4.9 × 10-8）。
図3：世帯内および世帯間の腸内細菌叢の伝播。
a, 少なくとも4人の同居者がいる72世帯（n = 883）における一対の個人間菌株共有率（共有菌株数／共通SGB数×100％）。破線は、同じ村の異なる世帯の個人間での共有率の中央値を示す。灰色で塗りつぶした箱は、世帯内ひずみ共有率が同じ集団の世帯間共有率よりも有意に高くない世帯を表す（ウィルコクソン順位和両側検定、Padj≥0.05；補足表17）。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位数と上位四分位数を表し、中央の線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びている。本研究で得られた新規のデータセットにはアスタリスクが付いている。ポストホックダン両側検定、n = 282、***Padj < 10-4（補足表18）。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位数と上位四分位数を、中央の線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びている。 c, 同居していない成人双生児（n = 1,734）における歪み共有率は、離れて暮らしている時間の関数として減少する（loess曲線）。d, 世帯内SGBの伝播率のヒストグラム。 e, 世帯内伝播率が高い（SGBの伝播率が0.5を超え、世帯内伝播率が世帯間伝播率よりも有意に高い）21のSGBのパネルで、特定のデータセットおよび非同居成人双生児における伝播率を示す。NS、カテゴリーにおける有意でないSGBの伝播性（世帯ペア間および異なる世帯のペア間のSGBの伝播数および非伝達数に関するカイ2乗検定；補足表20）。感染の可能性が3つ以上ある比較（少なくとも3組の同居ペアが共有する種）のみを示し、感染の可能性が3つ未満の比較には点を付した。有病率は、SGBが検出されたサンプルの割合として定義されている。本研究の新規データセットにはアスタリスクを付した。灰色のSGB名は、個体間nGDが5％の菌株同一性閾値を使用している（補足表4）。S. thermophilus-salivarius-vest.、S. thermophilus、S. salivarius、S. vestibulari。
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次に、親族関係が判明している4つの集団について、親子間、兄弟間、パートナー間の菌株共有を評価した。すべての家族関係において、異世帯間の比較よりも有意に高い株共有率を示したが（post hoc Dunn検定、n = 282、Padj < 0.05；図3bおよび補足表18）、それらの間に有意差は検出されなかった。4歳以上の子どもでは、父親と母親の株共有率はほぼ同じであり、遺伝的に血縁関係のある幼い（つまり、コロニー形成が進んでいない）兄弟姉妹間では、パートナー間よりも株共有率がわずかに（しかし有意ではない）高かった。同居が後世の菌株共有にどの程度影響するかを評価するため、過去に同居経験のある非同居の成人双生児（英国で公表された3つの横断データセット2,25,33から1,734サンプルを抽出）のメタゲノムを分析した（一卵性双生児と二卵性双生児の両方を含む）。双生児ペア間の系統共有は、離れて暮らした年数が長いほど（スピアマンの検定、n=708、ρ=-0.30、P=9.2×10-15）、また年齢を考慮すると（一般化線形モデル（GLM）、n=648、β=-0.58、P=7.1×10-18；図3c）有意に減少した。一卵性双生児の方が二卵性双生児よりも、同居から数十年後に高い株共有率を示すなど、過去の同居の影響以外にも中程度の遺伝的効果が見られた（ウィルコクソン順位和検定、Padj < 0.05；拡張データ図7および補足表19）。最後に、双子が離れて暮らした年数を除算すると、加齢に伴う菌株共有率がより緩やかに低下することから（GLM、n = 648、β = -3.9 × 10-3、P = 0.02）、成人におけるマイクロバイオーム伝播に対する同居の影響と、遺伝や年齢よりも大きな量的効果を示すさらなる証拠が得られた。したがって、成人双生児間の菌株共有は、両親からの共有伝播の長期にわたる影響というよりも、過去の同居の結果である可能性がある。
10種類の細菌属から21種類のSGB（評価したSGBの4％）が世帯員間で高度に伝播していた（SGBの伝播率は0.5以上、世帯内伝播率は世帯間伝播率より有意に高い；図3d,e、補足表20および方法）。母子感染とは対照的に、家庭内SGB感染率はデータセット間で一貫しておらず（ペアワイズSpearman検定、Padj≥0.05、補足表21）、欧米化したライフスタイルと非欧米化したライフスタイルの間ではSGB感染率に大きな違いが見られ（図3e）、マイクロバイオーム組成の相違と一致していた30,45,50,51。高感染性SGBの大部分（38％）は、属する種（n = 1）または属（n = 7）について特性化された分離株またはゲノム（uSGB）を持たない種であった。ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）およびバクテロイデス属（Bacteroides）は、家庭内で高い伝播率を示した種のほとんどが、母親から子供へ高い伝播率を示した種と一致しており（図2cおよび3e）、これらは伝播様式に関係なく効率的に伝播することが示唆された。特筆すべきことに、家庭内で高い伝播性を示したSGBは、双子のペアが離れても共有される傾向があり（21種の高い伝播性を示したSGBの94％；図3eおよび補足表20）、伝播した菌株の部分的な持続性を裏付けていた。
集団に沿った微生物伝播
村の中で同居していない個体は、同じ世帯のメンバーよりも顕著に低い割合ではあるが、環境を共有していないと推定される個体とは対照的に、腸内細菌叢の無視できない菌株共有を示した（クラスカル・ワリス検定、7つのデータセットにわたるn = 1,132サンプル、χ2 = 1,721、P < 2.2 × 10-16; ポストホックDunn検定、Padj < 0.05; 拡張データ図8aおよび補足表22）。村落内の菌株共有率は集団内で大きく変動したが（図4a）、評価した7集団のうち5集団では、67％の村落で、同じ村落の異なる世帯の個人の菌株共有率が、異なる村落の個人の菌株共有率よりも有意に高かった（ウィルコクソン順位和検定、Padj < 0.05；補足表23）。このように、人から人へのマイクロバイオームの伝播は、より遠く離れた接触者間の相互作用によっても起こり、集団構造の影響を受ける可能性がある4,17。実際、集団内および集団間のマイクロバイオーム株伝播は、種の共有（種の共有ネットワーク上のユークリッド距離に関するPERMANOVA、n = 951、R2 = 46%、P = 10-2；図4bおよび方法）よりも著しく強い程度で、宿主の集団構造を再現することがわかった（種の共有ネットワーク上のユークリッド距離に関するPERMANOVA、n = 951、R2 = 11%、P = 10-2；拡張データ図8b）。
図4：村と集団に沿った腸内マイクロバイオームの伝播。
a, 村の異なる世帯（n = 1,132）における個人間菌株共有率。破線は、同じデータセットの異なる村における個人間の菌株共有率の中央値を示す。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位数と上位四分位数を示し、中央の線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びている。灰色で塗りつぶしたボックスは、村内および村間の個人間菌株共有率の有意差がないことを示している（Wilcoxon順位和両側検定、Padj≥0.05；補足表23）。b, 集団構造を表示した世帯データセットにおける個人の腸内細菌叢菌株共有教師なしネットワーク。線幅は共有菌株数に比例する。 c, 異なる世帯の個人間で高率に伝播するSGB（SGBの伝播率が0.5を超え、集団間の伝播率よりも集団内の伝播率が有意に高い）、および特定のデータセットにおけるこれらのSGBの伝播率（欧米化の状況で分類）。NS、カテゴリーにおける有意でないSGBの伝播性（世帯間ペア間および異なるデータセットにおけるペア間のSGBの伝播数および非伝達数に関するカイ二乗両側検定；補足表24）。少なくとも3つの伝播の可能性がある比較（少なくとも3つのペアが共有する種）のみを示す。有病率は、SGBが検出されたサンプルの割合として定義されている。本研究で得られた新規のデータセットにはアスタリスクを付した。
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全体として高い個体群内伝播率を示したのはわずか4種のSGB（0.8％）だけであったが（SGBの伝播率＞0.5、個体群間伝播率よりも個体群内伝播率の方が有意に高い；図4c、補足表24および方法）、個体群内種の伝播率はデータセット間で非常に一貫していた（データセットごとのSGBの個体群内伝播率に関するペアワイズSpearman検定、ρ＞0、Padj＜0.05；補足表25）。SGBのうち3種はヒトマイクロバイオームのメンバーとして知られている： B. angulatum（SGB17231、有病率4％）、Streptococcus parasanguinis（SGB8076、日和見病原体を代表する種52、16％）、S. thermophilus、S. salivarius、S. vestibularis（SGB8002、プロバイオティクスとして一般的に使用されている菌株53を含む、37％）であることから、健康関連種と潜在的病原性種の両方が効率的に伝播する可能性があることが示唆される。ルミノコッカス科の未同定種もまた、感染率の高いSGBのひとつであった（SGB15073、有病率1％）。S.thermophilus、S.salivarius、S.vestibularisおよびB.angulatumも家庭内で高率に伝播したが、S.parasanguinisおよびSGB15073の非同居者間での特異的な高い伝播性（図2cおよび3e）は、異なる伝播メカニズムを示唆している。
ほとんどが口腔内での水平伝播
口腔内細菌叢株は、唾液を直接媒介とすることができるため、おそらく腸内細菌叢株よりも個人間で伝播しやすいと考えられる54が、個人間の口腔内細菌叢伝播についてはまだ十分に調査されていない17,54,55。われわれは、米国の家庭から新たに配列決定された1,929のメタゲノム（USAデータセット）と、フィジー諸島の集団から公開されている140の唾液メタゲノム17を用い、252のSGBの菌株レベルプロファイリングによって口腔内菌株共有のパターンを評価した（Methods）。その結果、腸内細菌叢の菌株共有率で観察されたのと同様に、共有環境や血縁関係による菌株共有率の勾配が検出された：同居している個体の口腔内菌株共有率の中央値は32％であったのに対し、同居していない個体の口腔内菌株共有率は、同じ集団では3％、異なる集団では0％であった（Kruskal-Wallis検定、N＝2,069、χ2＝41,317、P＜2.2×10-16；図5a）。このように、同居している個体は、同居していない個体よりも口腔内の菌株共有率が10倍高いという特徴があるが、これとは対照的に、種レベルのマイクロバイオームの類似性は0.5倍未満であった（Extended Data図5bおよび補足表26）。このことから、世帯メンバー間の菌株伝播は、類似した条件やライフスタイルを通じた種レベルのマイクロバイオーム収束よりも、遺伝的マイクロバイオーム組成の強力なドライバーであることが示唆される。さらに、同じ世帯のメンバーで菌株を1つも共有しなかったのは0.5％未満であり、集団内ペアの18％、集団間ペアの65％とは対照的であった。このことは、細菌性口腔菌株の個人間伝播が、腸内マイクロバイオーム伝播よりも頻繁に起こっていることを示している（図1f）。
図5：口腔マイクロバイオームの伝播。
a, 人と人との関係（n = 2,069）における個人間菌株共有率（共有菌株数/共通SGB数×100%）。特に断りのない限り、すべての比較は統計的に有意である（Kruskal-Wallis検定、n = 26,218、χ2 = 11,420、P < 2.2 × 10-16、post hoc Dunn両側検定、Padj < 0.05；補足表28）。b,母子および父子の共有率（共有株数／共通SGB数×100％）（n = 2,069）（左軸；箱ひげ図および灰色以外の点）および子孫で検出されたSGB数の中央値（右軸；灰色の点）。ポストホックDunn両側検定、補足表29。特に断りのない限り、すべての比較は多重検定の補正後に統計的に有意である。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位数と上位四分位数を表し、中央の線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びている。c,同居している個体間の菌株共有率は正の相関がある（スピアマンの両側検定、母子および父子： n = 637, ρ = 0.52, P < 2.2 × 10-16; 母子およびパートナー： n = 611, ρ = 0.21, P = 1.2 × 10-7; 父子およびパートナー： n = 611, ρ = 0.38, P < 2.2 × 10-16）。破線は対角線であり、母子間系統連鎖率は父子間系統連鎖率と等しい。d,年齢区分を超えて、また4歳以上の世帯員の間で、母親と子供の間で高率に感染するSGBの持続性（SGBの伝播率が0.5を超え、世帯内伝播率が世帯間伝播率よりも有意に高い）。Ca.、Candidatus。
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腸内細菌叢のパターンとは対照的に、口腔内菌株共有率は子供の年齢とともに増加した（スピアマンの検定、n = 658、ρ = 0.15、P = 1. 9 × 10-4（母子、n = 643、ρ = 0.24、P = 7.1 × 10-10（父子））、特に3歳以降（Kruskal-Wallis検定、χ2 = 31、P = 1.7 × 10-7（母子）、χ2 = 58、P = 2. 4 × 10-13 for father-offspring, post hoc Dunn test, Supplementary Table 27）、子供の口腔マイクロバイオームにおける微生物種の蓄積の増加と一致している（1歳までの母親と子供の共有種中央値49種、父親と子供の共有種中央値55種から、18歳までの母親と子供の共有種中央値85種、父親と子供の共有種中央値86種へ；スピアマンの検定、n = 658, ρ = 0. 21, P = 6.2 × 10-8; 図5b)。異なるタイプの関係間で有意差は認められなかったが（post hoc Dunn 検定、Padj ≥ 0.05；補足表28）、系統共有率はパートナー間（中央値38%）の方が、母親（30%）や父親（24%）との関係（図5a）よりも若干高かった。母子間における種の共有率は、母乳育児を通じたより緊密な接触と刷り込みの結果である可能性があるが、年齢を問わず、父子間における種の共有率よりも高い傾向があった（post hoc Dunn 検定、Padj < 0.05；補足表29）。しかし、両方のパートナーと共有する菌株の割合は子どもの年齢が上がるにつれてわずかに増加したものの（1歳未満で6％、18歳未満で8％；図5b）、さらに多くの菌株がそれぞれの親と別々に共有されていた（母親で17～21％、父親で13～17％）。全体として、親からの菌株の伝播は、幼少期の口腔マイクロバイオームの形成に特に影響を与えているようには見えず、むしろ接触期間にも依存する水平伝播様式を利用しているようであった。
家族内における口腔内菌株の伝播は、世帯によって大きく異なり（0～75％）、サンプルサイズが異なる2つのデータセットに基づいて生活習慣との関連について結論を出すことはできないが、評価したすべてのタイプの親族関係において、世帯での菌株共有の間に有意な相関が認められた（図5c）。母子間系統共有率は父子間系統共有率（スピアマンの検定、n = 637、ρ = 0.52、P < 2.2 × 10-16）、パートナー間系統共有率（スピアマンの検定、n = 611、ρ = 0.21、P = 1.2×10-7）と相関していた。また、父親と子どもの負担分担率は、パートナー間の負担分担率と相関していた（スピアマンの検定、n = 611、ρ = 0.38、P < 2.2 × 10-16）。このように、密接に相互作用している家庭は、親族関係に関係なく、同居しているすべての個体間で経口株伝播が促進されるようである。
次に、親から子へ、および家庭内での経口菌種伝播性を評価した（補足表30）。16の異なる属から18のSGB（その半数はuSGB）が、1歳までの母親とその乳児の間で有意に高度に共有されていた（評価したSGB全体の19％、SGBの伝播性＞0. 5、母子間よりも母子間で有意に高い；図5d）。その中には、2種のPrevotella属（Prevotella histicola（SGB1543）とPrevotella pallens（SGB1564））と、ほとんど未同定の2種のActinomyces属（SGB17132とSGB17167；補足表31）が含まれていた。1歳までのSGB感染率は1～3歳の感染率と強い相関を示したが（スピアマンの検定、n＝95、ρ＝0.73、P＜2.2×10-16）、3～18歳の感染率（n＝95、ρ＝0.78、P＜2. 2 × 10-16）、5種のみが第1（1歳まで）と第2（1～3歳）の間で、3種が第3（3～18歳）の間で、それぞれ高い伝播率を維持し、さらに最大68種が出現した（図5dおよび補足表31）。これら68種の後期出現種は、有意に高い家庭内伝播性（評価されたSGB全体の28％；補足表32）を示す70種（28種のuSGBを含む）と高度に一致した。対照的に、同居していない個体間で高い伝播性を示した種はなかった（補足表30）。このように、全体として、3つの特徴的でないSGBは、一貫して強い経口感染の可能性を示した： Actinomyces sp. ICM47（SGB17167）、Candidatus Saccharibacteria bacterium TM7（SGB19822）、FlavobacteriaceaeのuSGB（SGB2532）であった（図5dおよび拡張データ図9）。
感染様式に関連する表現型
腸内細菌種の伝播性は、多様な生活様式を持つ地理的に離れたデータセット間で非常に一貫していた（スピアマンの検定、Padj < 0.05；母親から乳児へ：71％、集団内： 75％の有意な関連；補足表15、21、25、伝播性の推定値は0～100％）。同時に、腸内細菌種は特定の感染経路で優先的に感染することが多かった56（23％のSGBは1つ以上の感染経路で高感染した；図2c、3e、4c）。これとは対照的に、経口感染するSGBは、その感染様式がほぼ重複していた（図5d）。種の伝播性は、集団における相対的存在量の中央値も有病率も、その種の伝播性と正の相関が見られなかった（スピアマンの片側検定、Padj≥0.05；補足表33）。
有病率と伝播性の間に直接的な関連がないことは、異なる様式による種の伝播性が特異的な形質であることと一致するため、次に、環境中での持続性に関連する表現型特性3,4が、検出されたパターンをより適切に説明できるかどうかを調べた。株レベルでプロファイリングした腸内SGBの58％と口腔内SGBの24％はまだ培養されていないため、ゲノム配列に基づいて細菌の表現型を推定した（Methods）。予測された表現型は、実験的に決定された形質が利用可能な場合には90％以上の一致を示した（補足表34およびMethods）。腸内および口腔内マイクロバイオームの伝播様式は、特定の表現型特性と関連していた（図6）。グラム陰性菌は一般的に除菌剤や消毒剤57に対してより耐性があり、腸内母体および家庭内伝播性の向上（SGB伝播性の第1四分位群対第4四分位群に関するウィルコクソン順位和検定、n=35、r=-0.59、Padj=2.0×10-3およびn=213、r=-0.40、Padj=2.2×10-8、それぞれ）と、口腔内家庭内伝播性の向上（n=126、r=-0.22、Padj=0.04）を示した。より長距離の腸内集団内伝播性には、より強力な環境生存メカニズム、すなわち耐気力と胞子形成が必要であった（それぞれn＝268、r＝0.16、Padj＝0.03およびn＝280、r＝0.10、Padj＝0.04）。プロファイリングされた腸内SGBの10％未満が酸素耐性と予測されたのに対し、経口SGBの66％以上が酸素耐性であったことから、耐好性は経口SGBの感染性とは関連しなかった（図6）。最後に、乳児の腸内に頻繁に生息するが不安定である運動性の種58は、非運動性のSGBよりも母親から子供への感染頻度が低かった（n = 35, r = -0.43, Padj = 0.03）。全体として、今回の結果は、環境中での生存を促進する微生物の表現型特性が、個人間の腸内マイクロバイオーム伝播ダイナミクスを少なくとも部分的に調節していることを示唆している。
図6：腸内細菌種および口腔内細菌種の伝播性と表現型特性との関連。
SGBの表現型はTraitar60を用いて推定した（Methods）。SGBの伝播性と予測される表現型との間の関連は、各伝達様式および環境について、最も高い伝播性を示すSGBの25％について、Wilcoxon順位和両側検定を用いて評価し、最も低い伝播性を示すSGBの25％と比較した。色はウィルコクソンのr統計量を表し、有意なPadj値は黒（Padj < 0.05）で、それ以外は灰色で示す。
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結論
多様な集団におけるマイクロバイオーム伝播に関する我々の統合的マルチコホート研究は、これまで見過ごされていた広範な個人間伝播を示している。このことは、すでに示唆されている仮説3,4,5,16を裏付けるものであり、長期間にわたって密接に接触している個人間での微生物株の伝播が、マイクロバイオームの個人的な遺伝的構成、ひいてはそれに対応する代謝や宿主と微生物の相互作用の可能性を形成する主要な原動力となっていることを明らかにするものである。予想通り、生後1年間は母親と乳児の腸内細菌叢の間で菌株の共有が最大であったが9,10,12,29,32（中央値50％）、同居している個人間で共通する腸内細菌叢と口腔内細菌叢の種のうち、共有菌株はそれぞれ12％と32％を占めていた（図1fと5a）。このような相互作用は、成人期になってから始まった場合でも、密接な物理的相互作用によって誘発される可能性があり（パートナー間での腸内および口腔内の菌株共有率はそれぞれ13％と38％；図3bと5a）、長期間にわたって部分的に可逆的である。異なる集団、あるいは同じ集団の異なる村であっても、血縁関係のない個体はほとんど菌株を共有していないことから（菌株共有率の中央値は0％）、今回の結果は、マイクロバイオームの形成における社会的相互作用の影響が無視できないものであることを浮き彫りにしており、これはマイクロバイオーム関連疾患に関与している可能性があり、ヒトマイクロバイオーム研究における人から人への菌株伝播を考慮する必要がある。
対照的に、私たちは、ライフスタイルの相違がマイクロバイオーム伝播動態に及ぼす影響はほとんどないことを発見した。食事、医療施設や医薬品へのアクセス、衛生状態などの特徴に基づいて、西洋化または非西洋化34,43,51と緩やかに定義された集団では、マイクロバイオーム組成に大きな違いがあるにもかかわらず（Methods）、私たちは、垂直的および水平的な菌株共有率が驚くほど類似していることを発見した。この知見の確実性を確認するためには、より大規模で多様なコホートと、参加者のライフスタイルや文化的習慣に関するより詳細なメタデータが必要であるが、今回の結果は、異なる集団における微生物のコロニー形成抵抗性が類似していることを示唆しているのかもしれない。また、非西洋化社会34,43で観察される微生物の豊富さは、他の世帯員からの感染促進によるものではなく、むしろ微生物の多様性を支える食生活や生活習慣だけでなく、環境との相互作用の結果であることが示唆された。
特に高い伝播性を示す種（図2c、3e、4c、5d）は、ゲノムおよび表現型の特徴をより深く理解するための出発点となるべきであり、それによって伝播メカニズムを知ることができる。本研究では、人から人へのマイクロバイオーム伝播が直接的なものであるかどうか、あるいはその方向性を解明することはできなかったが、ヒトにおけるマイクロバイオーム伝播の体系的な概観を提供することができた。ヒトにおける日常的な社会的相互作用ネットワークの変化（例えば、家庭の変化に伴う変化など）や、他の社会的動物をモデル化した特定の研究デザインを用いれば、人から人へのマイクロバイオーム伝播やその方向性についてのさらなる洞察を得ることができるだろう。私たちが用いた改良された菌株追跡法には、これまで培養されていなかった種の菌株レベルのプロファイリング39や、系統学的距離に基づく菌株の種特異的定義が含まれていたため、80万株以上に相当する大量のサンプルにスケールアップすることができた。とはいえ、今後、より詳細なシーケンシングやロングリード技術、あるいはシングルセルアプローチによって全ゲノムの解像度を高めた研究が進めば、これらの知見をさらに明確にし、洗練させることができるかもしれない。全体として、今回の結果は、現在非感染性と考えられているいくつかの疾患や病態は再評価されるべきであり5、また、感染性と社会的ネットワーク構造を考慮することで、将来のマイクロバイオーム調査や調節アプローチの設計が改善されるという仮説を補強するものである。
方法
メタゲノミクスデータセット
31のヒトメタゲノムデータセット（合計：5.17×1011リード、平均：5.32×107リード/サンプル）から、健常な母親と子供、世帯、双子ペア、村、集団（つまり同居情報）間のマイクロバイオーム伝播を評価できるメタデータが利用可能な合計9,715サンプルを選択して本研究に組み入れた（補足表1および2）。また、被験者内の菌株保持率を評価し、菌株同定に関する種特異的な操作上の定義を設定するために、少なくとも2つのサンプルの採取間隔が6カ月未満で、介入（抗生物質や薬物治療、特定の食事など）が行われていない少なくとも15人の健常人から採取したサンプルを含む、公開されている便ショットガンメタゲノムデータセットも対象とした。 25のデータセットが公開されており、そのうちの3つは、14サンプル（FerrettiP_20189）、32サンプル（ガーナデータセット34）、61サンプル（タンザニアデータセット34）で、本研究で拡張された。新たに追加されたサンプルは、原著論文に記載されたプロトコールに従って収集・処理された。さらに、8つのデータセット（合計：2,800サンプル）は、以下に記述するように、本研究の文脈で新たに収集され、同様の方法で配列決定された（ただし、サンプル処理、DNA抽出、配列決定ライブラリー調製の違いは、系統の共有を推測するために使用する系統学的距離に直接影響しない）。
一貫したメタデータの収集と整理
サンプルおよび被験者の識別子、時点、参加者の年齢、性別、分娩様式（経膣分娩または帝王切開）、家族の識別子、家族関係、双生児の接合性および双生児が離れた年齢、村、国に関するメタデータを、リソースに含まれている場合はcuratedMetagenomicData 3.0.0（文献61）から、そうでない場合は出版物の補足資料または指定のリポジトリから取得した。新たに配列決定されたサンプルを含むすべてのメタゲノムのメタデータは、curatedMetagenomicDataフォーマットでキュレーションおよび整理され、補足表2に掲載されている。パートナーは世帯を共有する夫婦と定義した。母集団は、地理的な観点ではなく、西洋化されたライフスタイルの採用とみなし、一般的に高度に加工された食品（脂肪分が多く、複合炭水化物が少なく、精製された糖分や塩分が豊富）を多く含む食事の摂取、医療や医薬品へのアクセス、衛生・衛生状態、家畜への暴露の減少、人口密度の増加などと定義される、西洋化の状況（西洋化または非西洋化）に基づいて分類された。この分類は、研究に含まれる集団が上記の基準でどのように異なるか、また原著論文でどのようにサンプルが報告されているかという、入手可能な情報に基づいている。この2分類には明らかな限界があることは認めるが62、宿主のライフスタイルと個人間のマイクロバイオーム伝播の関連性を洞察することができる。
新たに配列決定されたメタゲノム解析データセット
アルゼンチンデータセット
アルゼンチンの農村部（Villa Minetti村、Esteban Rams村、Pozo Borrado村、Las Arenas村、Cuatro Bocas村、Logroño村、Montefiore村、Belgrano村、サンタフェ州、補足表2）に住む合計14人の母親（16～37歳）とその1歳未満の乳児13人（ここでは非西欧化集団とみなす）を研究に参加させた。DNAは、QIAamp DNA stool kit（Qiagen社製）を用いて、メーカーの指示に従って糞便サンプルから抽出した。シーケンスライブラリーは、Nextera DNA Flex Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、メーカーのガイドラインに従って調製した。シーケンシングはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームでメーカーのプロトコールに従って行った。
コロンビアデータセット
コロンビアのカリブ海地域のWayúu民族のコミュニティ（Etkishimana、Koustshachon、Paraiso、Invasión、Tocomana、Warruptamana、Wayawikatの各コミュニティ；補足表2）から、合計12人の母親（15～40歳）とその生後6ヵ月未満の乳児12人（ここでは非西欧化集団とみなす）が研究に参加した。便サンプルからのDNA抽出は、Master-Pure DNA抽出キット（Epicentre社製）を用い、製造者の指示に従い、以下の変更を加えて行った：サンプルをリゾチーム（20 mg ml-1）およびムタノリシン（5 U ml-1）で37℃で60分間処理し、ビーズビーターFastPrep 24-5G Homogenizer（MP Biomedicals社製）を用いて、直径3μmのガラスビーズで6 m s-1で1分間細胞を破砕する予備工程を行った。DNAの精製は、DNA精製キット（Macherey-Nagel）を用い、製造元の指示に従って行った。DNA 濃度は Qubit 2.0 Fluorometer（Life Technologies）を用いて測定し、さらに解析を行った。シーケンスライブラリーは、Nextera DNA Flex Library Preparation Kit（イルミナ社）を用いて、メーカーのガイドラインに従って調製した。シーケンシングは、メーカーのプロトコールに従ってIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで行った。
中国_1データセット
契東市（中国江蘇省）に住む116人の非老年者と百寿者（女性97人、男性19人、94～105歳）とその子孫231人（女性79人、男性152人、50～85歳）を登録した（ここでは西洋化集団とみなす）63。参加者は全員、組み入れ時に大きな病気にかかっていなかった。新鮮な便サンプルが上海第10病院で採取され、採取後-20℃で保存された。DNAは、EZNA Stool DNA Kit（Omega Bio-tek社製）を用い、製造元の指示に従って抽出した。DNAの完全性とサイズは1％アガロースゲル電気泳動で評価し、DNA濃度はNanoDrop（Thermo Fisher Scientific）で測定した。DNAライブラリーはTruSeq DNA Sample Prep v2 Guide（イルミナ社）に従い、ゲノムDNA2μg、平均インサートサイズ500bpで構築した。ライブラリーの品質はDNA LabChip 1000 Kit（Agilent Technologies）で評価した。シーケンシングはIllumina HiSeq 4000プラットフォームで、150 bpペアエンドリード長で行った。
China_2データセット
中国の農村部（中国北西部、陝西省、ビン県）の母親8人と1歳未満の乳児19人が、大規模研究（ClinicalTrials.gov NCT02537392）の一部として登録された。DNAはQIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen）を用いて抽出し、エタノールで沈殿させた。シーケンスライブラリーは、Nextera DNA Flex Library Preparation Kit（Illumina）を用い、メーカーのガイドラインに従って調製した。シーケンシングはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームでメーカーのプロトコールに従って行った。
ギニアビサウデータセット
ブバケ島（ギニアビサウ、ビジャゴス群島）の74世帯342人のボランティア（0～85歳）-ここでは非西欧化集団とみなす-からサンプルを収集し、以前の研究の一部としてDNAを抽出した64。簡単に説明すると、サンプルは基準研究所で-20℃で凍結された。ホモジナイズと洗浄の後、DNeasy PowerSoil PROキット（Qiagen）を用いてDNAを抽出した64。シーケンスライブラリーは、Nextera DNA Flex Library Preparation Kit（イルミナ社）を用いて、製造元のガイドラインに従って調製した。シーケンシングはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームでメーカーのプロトコールに従って行った。
イタリア_1データセット
合計4人の母親（37～46歳）とその子供8人（0～2歳）が、イタリア、トレントのサンタキアラ病院に登録された。母親の便サンプルは、病院スタッフが分娩中または分娩直後に糞便採取管（Sarstedt）を用いて採取した。乳児の便サンプルは母親が採取し、採取時に-20℃で凍結し、1週間以内に-80℃の施設に移した。合計48検体を採取した（補足表2）。HMPプロトコル（Human Microbiome Project Consortium）65に記載されているように、PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories）を用いてDNAを抽出し、予備加熱工程（65℃、10分、95℃、10分）を加えた。DNAは10 mM Tris pH7.4で回収し、Qubit 2.0（Thermo Fisher Scientific）蛍光光度計を用い、製造元の指示に従って定量した。NexteraXT DNA Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、メーカーのガイドラインに従ってシーケンスライブラリーを調製した。シーケンシングはIllumina HiSeq 2500プラットフォームで行った。
イタリア_2データセット
イタリア、ジェノバのIRCCS Istituto Giannina Gasliniで、大規模研究の一環として、合計19人の母親（30～47歳）と37人の健康な子ども（0～11歳）が登録され、ここでは西洋化集団とみなされた。便サンプルはDNA/RNAシールド糞便採取チューブ（Zymoresearch）に採取し、DNA抽出まで-80℃で保存した。DNA抽出はDNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen）を用い、製造元の手順に従って行った。DNA濃度はNanoDrop spectrophotometer（Thermo Fisher scientific）を用いて測定し、-20℃で保存した。NexteraXT DNA Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、メーカーのガイドラインに従ってシーケンスライブラリーを調製した。シーケンシングは、メーカーのプロトコールに従ってIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで行った。
米国データセット
SPARKコレクションのNYゲノムセンターコーホートの646家族から合計1,929唾液サンプル（Western IRB (https://www.wcgirb.com/)、プロトコル追跡番号： WIRB20151664、ここでは欧米化集団とみなす）の640の母親サンプル（22～55歳）、631の父親サンプル（23～67歳）、および正常に発育している子供（0～18歳）の658サンプルで構成される。唾液はOGD-500キット（DNA Genotek）を用いて採取し、DNAはChemomagic MSM1/360 DNA抽出装置を用いて抽出し、PreventionGenetics社（Marshfield）で110ulのTE緩衝液に溶出した。シーケンスライブラリーは、Illumina DNA PCR-Free Library Prep kit（Illumina）を用いて、メーカーのガイドラインに従って調製した。S2/S4フローセルを用い、メーカーのプロトコールに従い、Illumina NovaSeq 6000プラットフォームでシーケンスした。
メタゲノム前処理および品質管理
新たにシーケンスした便サンプルを、https://github.com/SegataLab/preprocessing に記載されているパイプラインを用いて前処理した。短時間でメタゲノムリードの品質管理を行い、低品質のリード（品質スコア<Q20）、断片化した短いリード（<75 bp）、および2塩基以上のあいまいなリードをTrim Galore（v0.6.6）を用いて除去した。汚染DNAと宿主DNAは、Bowtie2（v2.3.4.3）66で-sensitive-localパラメータを使用して同定し、phiX 174イルミナスパイクインとヒト関連リード（hg19ヒトゲノムリリース）の確実な除去を可能にした。残りの高品質リードをソートして分割し、各メタゲノムについて標準的なフォワードリード、リバースリード、アンペアリード出力ファイルを作成した。
新たに配列決定した唾液サンプルは、https://github.com/SegataLab/preprocessing に記載されているパイプラインのカスタムバージョンを使用して前処理した。短時間でメタゲノムリードの品質管理を行い、品質の低いリード（品質スコア<Q20）、断片化した短いリード（<75 bp）、2塩基以上のあいまいなリードを除去した。Bowtie2(v2.3.5.1)66を「end-to-end」グローバルモードで用いて汚染DNAと宿主DNAを同定し、ヒト関連リード(hg19)を確実に除去した。残りの高品質リードをソートして分割し、各メタゲノムについて標準的なフォワードリード、リバースリード、アンペアリードの出力ファイルを作成した。
便および唾液サンプルのリード統計（リード数、塩基数、サンプルあたりのリード長の最小値と中央値）の詳細は、補足表2に示す。300万リード以上のメタゲノム（n = 7,646便、n = 2,069口腔）を解析に含め、シーケンス深度が不十分なメタゲノムは除外した（n = 97便、n = 0口腔）。
拡張SGBデータベース
160,267のMAGと75,446の分離ゲノムを含むカスタムデータベースをref. 30から取得し、本研究で拡張したイタリアの母子データセット9から184のMAG、イタリアの百寿者67から1,439のMAG、非西洋化集団34の個人の便サンプルから得られた3,584のMAG、2、ヒト以外の霊長類の便検体から得たMAG 985個68、牛のルーメンから得たMAG 20,404個69、マウス検体から得たMAG 14,097個70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83、シロアリから得たMAG 1,235個（PRJNA365052, PRJNA365053, PRJNA365054, PRJNA365049, PRJNA365050、 PRJNA365051, PRJNA405700, PRJNA405701, PRJNA405702, PRJNA405782, PRJNA405783, PRJNA366373, PRJNA366374, PRJNA366375、 PRJNA366251, PRJNA405703, PRJNA366252, PRJNA366766, PRJNA366357, PRJNA366358, PRJNA366361, PRJNA366362, PRJNA366363、 PRJNA366255、PRJNA366256、PRJNA366257、PRJNA366253、PRJNA405704、PRJNA366254、PRJNA405781）、以前のカタログ84から入手可能なMAGは7,760、NCBI GenBankから入手可能なMAGは2,137、NCBI GenBankから入手可能なリファレンスゲノムは63,142（https： //を参照）。 com/SegataLab/MetaRefSGBを参照）。イタリアの母子データセットおよび非ヒト宿主のMAGはMEGAHIT85を用いてアセンブルし、イタリアの百寿者データセットおよび非西洋化集団のMAGはmetaSPAdes86を用いてアセンブルした。
新たに追加したMAGについては、メタゲノム解析に以下のプロトコルを採用した。1,500塩基より長いアセンブルされたコンティグは、MetaBAT287を用いてMAGにビニングされた。全ゲノムの品質管理はCheckM version 1.1.3 (ref.88)を用いて行い、中・高品質のゲノム（完全度≥50%、コンタミネーション≤5%）のみをデータベースに登録した。Prokkaバージョン1.12および1.13（文献89）を用いて、ゲノムのオープンリーディングフレームのアノテーションを行った。コード配列は、UniRef90データベース（バージョン201906）に対してDiamond検索（バージョン0.9.24）91を行い、セントロイド配列との平均配列同一性が90%以上で、セントロイド配列の80%以上をカバーする場合にUniRef90 IDを割り当てることにより、UniRef90クラスター90に割り当てた。どのUniRef90クラスターにも割り当てられなかったタンパク質配列は、MMseqs292を使用して、Uniclust90基準93に従ってSGB内でde novoクラスター化した。
ゲノムは、文献に記載されているように、遺伝的多様性5％以下の種レベルのゲノムビン（SGBs）、および属レベルのゲノムビン（GGBs、距離15％）およびファミリーレベルのゲノムビン（FGBs、距離30％）にクラスタ化された30。30. MAGはPhyloPhlAn 3（文献94）のサブルーチンである'phylophlan_metagenomic'を適用してSGBに割り当てた。このサブルーチンはMash95を使用してゲノム間の全ゲノム平均塩基同一性を計算する。ゲノムとの遺伝的距離が5%を下回るSGBがない場合、平均連鎖の割り当てと階層的クラスタリングに基づいて、新しいSGBを定義した（デンドログラムではゲノム間の遺伝的距離が5%になるようにした）。新規GGBおよびFGBがまだ定義されていない場合は、同じ手順でSGBを割り当てた。
SGBの分類学的割り当てとkSGBおよびuSGBの定義
少なくとも1つの参照ゲノムを含むSGB（kSGB）には、多数決に従って、参照ゲノムの分類を種レベルまで割り当てた。参照ゲノムが存在しないSGB（uSGB）には、対応するGGB（属レベルまで）に参照ゲノムが含まれる場合はその分類法を、対応するFGB（科レベルまで）に参照ゲノムが含まれる場合はその分類法を割り当てた。FGBに参照ゲノムが存在しない場合は、「phylophlan_metagenomic」によって提供されたSGBのMAGに最も近い参照ゲノム最大100個に適用された多数決に基づいて、門を割り当てた。本研究で株レベルでプロファイリングされたSGBの分類学的割り当ては、補足表3および4に記載されている。
メタゲノムサンプルの種レベルでのプロファイリング
種レベルのプロファイリングは、デフォルトのパラメータとカスタムSGBデータベースを用いて、MetaPhlAn 4（文献38,39）を用いて全9,715サンプルに対して実施した。MAGが5未満のuSGBは、潜在的なアセンブリーアーテファクトまたはキメラ配列として破棄され、プロファイリングにおける有病率の閾値に達しそうになかった。SGBのコア遺伝子は、既存のUniRef90のオープンリーディングフレーム、またはSGBのゲノムの少なくとも半分（つまり「コアネス」50%）に存在するde novoクラスター化遺伝子ファミリーのオープンリーディングフレーム（Uniclust90クラスター化手順93に従う）と定義した。コア遺伝子はさらに、少なくとも800のコア遺伝子を検索できる最も高いコアネス閾値を選択することにより最適化された。次に、各SGBのコア遺伝子をスクリーニングし、他のSGBにおけるその存在を確認することにより、マーカー遺伝子を同定した。これは、まずコア遺伝子を150 ntの断片に分割し、Bowtie2（バージョン2.3.5.1; -sensitiveオプション）を用いてすべてのSGBのゲノムに対して断片を整列させる手順で行われた66。マーカー遺伝子は、他のSGBのゲノムの少なくとも99%に断片が見つからないコア遺伝子と定義した。マーカー遺伝子が10個未満のSGBについては、あるSGBの200個以上のコア遺伝子が他のSGBのゲノムの1％以上に出現することをコンフリクトと定義し、そのSGBのすべてのコンフリクトを検索してコンフリクトグラフを作成した。各コンフリクトグラフは繰り返し処理され、可能なすべてのマージシナリオを検索し、マージされるSGBの数を最小化し、検索されるマーカーの数を最大化するコンフリクトの最適なマージが得られるようにした。最後に、各SGBについて、まずそのユニークさ、次にその大きさ（大きい方が先）に基づいて最大200個のマーカー遺伝子が選択され、それでもなお10個未満のマーカーを持つSGBは破棄された。マージされた腸と口腔のSGB（SGB_group）は、それぞれ補足表3と4にある。得られた3.3Mマーカー遺伝子（SGBあたり189±34マーカー遺伝子（平均±s.d.））を、MetaPhlAnおよびStrainPhlAnプロファイリングのための新しい参照データベースとして使用した。
メタゲノムサンプルの菌株レベルプロファイリング
StrainPhlAn438,39で、カスタムSGBマーカーデータベースを用い、パラメータ "marker_in_n_samples 1 -sample_with_n_markers 10 -phylophlan_mode accurate -mutation_rates "で菌株プロファイリングを行った。ノイズを減らすため、20サンプル以上で検出されたSGBと、10以上のマーカーを持つデータセット（StrainPhlAnの-print_clades_only引数）中の少なくとも10％のサンプルのみが、株レベルのプロファイリングのために選択された（便および経口サンプルでそれぞれn = 646およびn = 252のSGB）。大半のSGB（n = 481/646の腸SGBおよびn = 148/252の経口SGB）について、合計200のマーカー遺伝子が利用可能であった。SGB間の平均カバレッジは1.3倍であった。発酵食品に由来する可能性のあるSGBについては、ref. 40の配列がパラメータ"-r "を用いて追加された。アセンブリーベースのアプローチ（90％以上の完全性および5％未満のコンタミネーションとして定義された高品質のMAG；アセンブリー方法は、上記の「拡張SGBデータベース」のセクションで報告されている）と比較して、StrainPhlAnを用いた株レベルのプロファイリングは、より多くのサンプルにおける種間の株共有評価を可能にした（SGBあたり355の株レベルプロファイルの中央値および四分位範囲（IQR）＝［185、806］に対して、SGBあたり69の高品質のMAGの中央値およびIQR＝［7、60］）。
ひずみ共有イベントの検出
菌株共有事象を検出するために、まず、3大陸の4つの異なる国（ドイツ、カザフスタン、スペイン、米国）の5つの公表された便メタゲノミックデータセットにおいて、同一個体の縦断的な菌株保持（同一菌株）と非関連個体（異なる菌株）のnGD分布を最適に分離するSGB固有の正規化系統距離（nGD）閾値を設定した20,22,27,28,31。nGDは、StrainPhlAnによって作成された系統樹の総枝長で正規化された葉から葉への枝の長さとして計算された。この系統樹は、少なくとも1%の変動がある位置のマーカー遺伝子アラインメントに基づいて構築されている。6ヵ月以内の間隔で得られた少なくとも50組の同一個体の便サンプルから検出されたSGB（n = 145 SGB；ある個体について、菌株レベルで種をプロファイリングでき、かつ時間的に最も近い2つのサンプルが選択された）について、ユーデン指数を最大化することに基づいてnGD閾値を定義し、偽発見率の境界として、同一菌株を共有する無関係な個体の割合を5%に制限した（Extended Data Fig.）少なくとも6ヵ月間、個体内に頻繁に株が存在するという仮定は、縦断的セットにおける系統間距離の分布によって裏付けられている：すべての種について、nGDが0に近づくところにピークがあり（拡張データ図3）、個体間サンプル比較で観察されたものよりも顕著に高い。種特異的なnGDを確実に推定できない、50個体未満の同一個体近接ペア（n = 501）および口腔内サンプル（n = 252）で検出されたSGBについては、無関係な個体のnGD分布の第3パーセンタイルに対応するnGDを使用した。この値は、少なくとも50個の同一個体間比較でSGBのユーデン指数を最大にするnGDに対応する個体間nGD分布の中央値パーセンタイルである。このように、3組の閾値は同じ原理、すなわち腸内細菌叢における菌株の個体特異性と持続性を技術的に定義したものであり、nGD値に有意差は生じなかった（Kruskal-Wallis検定、χ2 = 2. 34、P = 0.31; Extended Data Fig. 10a）。nGDの閾値も門によって有意差はなく（Extended Data Fig. 10b）、便サンプルと経口サンプルで設定された閾値は同程度であった（nGDの差の中央値 = 0.006）。偽発見率の上限として、同一菌株を共有する無関係な個体の割合を5%に制限しない場合、結果として得られるパーセンタイルは、これら38のSGBで中央値8.2%（範囲= [5.2-22.3%]）にしかならない（補足表4）。株の同一性閾値を設定するために、我々が含めた5つのデータセットではなく、単一のメタゲノミックデータセットを使用した場合、多くの場合、十分な縦断的サンプルが得られず（＜50の同一個体ペア）、いくつかのばらつきが観察された（拡張データ図10c）。
全体として、nGD閾値が対応するSNV率の中央値は0.005であり、イルミナHiSeqおよびNovaSeqプラットフォーム96による推定0.1%以上のシーケンスエラー率を下回った（補足表4）。nGDの閾値は、いくつかのSGB（n = 646のうち16-つまり2.5%）のSNV率が0に相当し、そのほとんどは非常に低い遺伝的変異を包含するものである（例えば、B. animalis SGB17278）。発酵食品から得られた微生物のMAGを含むSGBツリーにおいて、食品MAGと高い類似性（PhyloPhlAn 3（https://github.com/biobakery/phylophlan/wiki#mutation-rates-table）により決定された≤0.0015 SNV率-すなわち、ヌクレオチドの相違がある位置の数をアライメントの長さで割った値）を持つ菌株を同定し、廃棄した（補足表6）。B. animalis（SGB17278）については、その系統的多様性をよりよく評価するために、7つの公開マウスメタゲノムデータセット73,75,97,98,99,100,101でプロファイリングされた62株を追加した。StrainPhlAnによって生成された樹とSGB固有のnGD閾値は、StrainPhlAn4のstrain_transmission.pyスクリプト（-threshold引数）で使用された（https://github.com/biobakery/MetaPhlAn/blob/master/metaphlan/utils/strain_transmission.py）。一対のnGDが株同一性閾値を下回る株のペアを株共有イベントと定義した。中心nGDは、nGDを系統樹の中央値nGDで割ったものと定義した。SNV率とは対照的に、系統学的距離に基づく株同一性閾値を選択したのは、(1)シーケンシング深度の閾値を超えた後でも、メタゲノムサンプル中の種について得られるカバレッジがかなり低い（平均カバレッジ＝7.2×、中央値＝0.69、IQR＝[0.14, 3.09]）。 09]）がSNV率の推定に特にノイズを加えること、（2）いくつかのSGBのマーカー遺伝子のアラインメントの長さが限られていること（平均トリミングアラインメント長＝74,348 nt、中央値＝70,879、IQR＝[42,513, 104,347]）がSNV率をむしろ信頼できないものにすること、（3）系統樹によって提供される進化モデルに関する貴重な情報（例えば、同義塩基の変化と非同義塩基の変化の区別）。
我々は、新しい種特異的株同一性閾値と、以前のいくつかの出版物やバージョン4以前のStrainPhlAnバージョン（参考文献9,32,102）で使用されていたnGD = 0.1閾値（つまり、最低10%の系統間距離を同一株間とみなす）とを比較した。以前の閾値では、母親と乳児の株共有率は中央値で44％であったのに対し、今回得られた株共有率は50％であった： 3.5％対4％であった。このことは、種特異的株同一性閾値が、一致した母親と乳児の間ではより多くの株共有事象を検出し、血縁関係のない母親と乳児のペアの間ではより少ない株共有事象しか検出しないことから、より優れた性能を持つことを裏付けている。
種特異的株同一性閾値の再現性をさらに無関係なデータで評価するために、糞便マイクロバイオーム移植（FMT）を受けた患者の独立したデータセットを用いた。種特異的閾値の設定には、介入を行わず、縦断的サンプリングを行ったメタゲノム解析コホート20,22,27,28,31を公開されているものを使用したため、株の伝播が予想される別個の設定として、完全に独立したFMTデータセットを検証に使用した。FMTでは、健康なドナーの菌株の一部が患者に移される一方で、ドナーの元の検体の菌株の一部が介入後も残る。われわれは、FMTを受けた患者の25の異なるコホートから得られた1,371検体103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123をメタアナリシスの一部として分析した124。この評価では、縦断的サンプルのセットで行ったのと同様に、以下の2つの状況における同じSGBからの菌株のnGD距離の分布の分離を評価した：(1)菌株が同一人物のサンプル、またはFMTドナーとFMT後のそのレシピエントのものである場合、(2)菌株が異なるFMTトライアド（ドナーからのサンプル、FMT前の患者のサンプル、FMT後の患者のサンプルで定義される）に属するサンプルのものである場合。Ianiroらの研究でもプロファイリングされた95のSGBのそれぞれについて、この解析を行った。独立した縦断的データセットで定義された）種特異的株同一性閾値未満の（1）のサンプル間の一対の系統距離（nGD）値を真陽性、閾値未満の（2）のものを偽陽性、閾値以上の（2）のものを真陰性、閾値以上の（1）のものを偽陰性とみなした。StrainPhlAn4は、ここで定義した種特異的菌株同一性閾値を用いると、同一個体またはFMTトライアドに含まれる菌株と、異なるFMTトライアドに含まれる異なる菌株を非常によく識別できることがわかった：想起度中央値＝0.97、IQR＝[0.95,0.99]、精度＝0.72[0.67,0.82]、Fスコア＝0.97[0.96,0.98]（補足表35）。
個人間株共有率とSGBの伝播性の評価
個人間菌株共有率は，2人の個人間で共有された菌株数をStrainPhlAnでプロファイリングされた共有SGB数で割った値（共有菌株数／共有SGB数）として算出した．1人の個人について複数の検体が得られた場合、任意の時点で菌株またはSGBの共有が検出された場合、菌株またはSGBが共有されたとみなした。確実な計算のため、個人間の菌株共有率は、2人の個人間で少なくとも10個のSGBが共有されている場合にのみ評価した。縦断的データセットにおける2時点間の同一個体間系統保持率の評価にも、同じ計算を用いた。子個体による菌株獲得率（Extended Data Fig. 6a）は、子個体でプロファイリングされた菌株のうち、母親と共有され、母親に由来すると推定される菌株の割合として定義した。ロバストな計算のため、子孫による菌株獲得率は、少なくとも10個のSGBが母親と子孫の間で共有されている場合にのみ評価した。StrainPhlAn36,38,39は各生物種の優占株をプロファイリングしているため、2つのサンプル間で共有された株の総数は、0とプロファイリングされた共有SGBの総数の間の範囲であり、株の共有率と子孫による株の獲得率は0と1の間の境界となる。
SGBの伝播率は、StrainPhlAn4による株レベルプロファイルの存在に基づき、SGBについて検出された株共有イベントの数を、潜在的な株共有イベントの総数で割ったものと定義した。1人の個体について複数のサンプルが入手可能な場合は、どの時点でも菌株共有が検出されたとして、菌株共有があったとみなした。ロバストな計算を行うため、SGBの伝播性は、複数のデータセットで少なくとも10件の菌株共有の可能性があるSGBについてのみ評価し、単一データセットの計算では少なくとも3件の菌株共有の可能性があるSGBについてのみ評価した。データセット間のSGB透過性の一致を評価するため、透過性が評価されたSGBが10個以上あるデータセット間でスピアマンの相関（Rのcor.test関数（https://www.R-project.org/））を実行した。透過性の高いSGBは、SGBの透過性が0.5を超え、かつグループ間の透過性よりもグループ内の透過性が有意に高いものと定義した（カイ二乗検定、Padj < 0.05）。SGBの伝播性とトリミングされたアラインメントの長さとの間には有意な関連は認められなかった（スピアマンの検定、ρ = 0.06, P = 0.13）。
母子間（1歳までの母親とその子供の間で定義）、世帯間（同居している個体間で定義）、個体群内（親族関係の証拠がない個体群内の同居していない個体間で定義）の3つの主な伝播様式で株の共有を評価した。
種レベルのベータ多様性と順序付け
マイクロバイオーム組成データの適切な解析のために、MetaPhlAnで得られた種レベルの存在量行列を、CoDaSeq Rパッケージ（v0.99.6）のcodaSeq.clr関数を用いて中心対数比変換し125 、各分類群について検出された最小比例存在量を用いてゼロのインピュテーションを行った。Aitchison距離の主成分分析プロットは、phyloseq（v1.28.0）126のordinateおよびplot_ordination関数を用いて、個体ごとに無作為に選択した1サンプル（n = 4,840腸サンプル、n = 2,069口腔サンプル）を用いて作成した。種レベルの類似度と菌株共有率を比較するため、vegan Rパッケージ（v2.5-7）で計算したベータ多様性指標（Aitchison距離、Bray-Curtis非類似度、Jaccard二値距離）を類似度指標（1 - （距離または非類似度））に変換した。
系統共有ネットワーク
共有株および共有種に基づく教師なしネットワークは、Rパッケージのggraph（v2.0.5）、 igraph（v1.2.6）127、およびtidygraph（v1.2.0）を用いてストレスレイアウトで可視化し、個体（ノード）間で5以上の共有株（エッジ）または50以上の共有種（エッジ）のつながりを示した。
種の表現型形質のアノテーション
実験的に決定された細菌の表現型は、Microbe Directory v2.0（文献128）から取得し、NCBIの分類学的識別子によってkSGBにマッチさせた。以前に種の伝播性3との関連が仮説された表現型形質は、50％コア遺伝子（拡張SGBデータベースで利用可能なゲノムの50％に存在する遺伝子）上でTraitar（バージョン1.1.12）60を使用してすべてのSGBについて予測した。phypatとphypat + PGL分類法（2番目の分類法には表現型の獲得と喪失に関する進化的情報が追加されている）のアノテーションが一致したアノテーションのみが保持された。SGBの伝達性と微生物の表現型との関連は、25％の最も伝達性の高いSGBと25％の最も伝達性の低いSGBについて、ウィルコクソン順位和検定で評価した。
統計解析
統計解析とグラフ表示は、vegan（バージョン2.5-7）、phyloseq（v1.28.0）126、QuantPsyc（v1.5）、ggplot2（v3.3.3）、ggpubr（v0.4.0）、corrplot（v0.84）の各パッケージを用いてRで行った。多重検定の補正（Benjamini-Hochberg手続き、Padj）は適切な場合に適用され、有意性はPadj < 0.05で定義された。すべての検定は両側検定とした。メタデータ変数と距離行列の間の関連は、veganのadonis関数を用いたPERMANOVAで評価した。2群間の差はWilcoxon順位和検定で評価した。2群以上の場合は、Kruskal-Wallis検定とpost hoc Dunn検定を用いた。相関はスピアマンの検定で評価した。潜在的な交絡因子を除外しながら変数間の相関を評価するために、glm R関数（Gaussian, link = identity）を用いてGLMをフィッティングした。標準化GLM回帰係数は、lm.beta R関数（QuantPsyc Rパッケージ）を用いて計算した。有意性は、ネストしたGLMに対して対数尤度（カイ2乗）検定を行うことで評価した。
倫理遵守
すべての研究手順は、関連するすべての倫理規定に準拠している。手順はヘルシンキ宣言を遵守して行われた。アルゼンチンのコホートの倫理的承認は、アルゼンチン、CCTサンタフェの倫理・安全委員会（CEySTE）により与えられた（29112019）。コロンビアのコホートは、コロンビアのUniversidad MetropolitanaのResearch Bioethics committeeによって承認された（NIT 890105361-5）。China_1データセットの研究プロトコルは、同済大学医学部上海第10病院倫理委員会（SHSY-IEC-pap-18-1）により承認され、China_2は中国西安交通大学健康科学センター倫理委員会（2016-114）により承認された。ギニアビサウの研究は、ギニアビサウ公衆衛生省保健倫理国家委員会（Comitê Nacional da Ética na Saude）（076/CNES/INASA/2017）およびLondon School of Hygiene and Tropical Medicine倫理委員会（参照番号22898）により承認された。Italy_1データセットの研究プロトコルは、イタリアのトレントにあるサンタ・キアラ病院の倫理委員会（51082283、2014年7月30日）およびイタリアのトレント大学の倫理委員会、Italy_2はイタリアのリグーリア地域倫理委員会（006/2019）により承認された。米国データセットの倫理的承認は、Western IRB（https://www.wcgirb.com/）により得られた。プロトコル追跡番号はWIRB20151664。成人参加者全員および成人以外の参加者の両親から、書面によるインフォームドコンセントを得た。
報告概要
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
アルゼンチン、コロンビア、中国_2、ギニアビサウ、イタリア_1、米国のショットガンメタゲノミクスのシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveのアクセッション番号PRJEB45799で入手可能である。China_1データセットのシーケンスデータは、NCBI Sequence Read Archiveデータベースでアクセッション番号PRJNA613947で入手可能。Italy_2データセットのシーケンシングデータはNCBI Sequence Read Archiveデータベース（アクセッション番号PRJNA716780）に掲載されている。メタデータはSupplementary Table 2およびcuratedMetagenomicData61の最新リリースに掲載されている。
コードの利用可能性
本研究で開発・使用したすべてのソフトウェアと閾値は、MetaPhlAn4パッケージ39（StrainPhlAn4と、種特異的株同一性閾値を用いた株伝播推論用スクリプトを含む）で利用可能であり、http://segatalab.cibio.unitn.it/tools/metaphlan、オープンソースコードはhttps://github.com/biobakery/MetaPhlAn。また、Bioconda（https://anaconda.org/bioconda/metaphlan）やPIP（https://pypi.org/project/MetaPhlAn）からも入手できる。菌株の共有を評価するために行った手順を説明したチュートリアルは、https://github.com/biobakery/MetaPhlAn/wiki/Strain-Sharing-Inference。
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謝辞
すべての研究参加者のコミットメントに感謝する。SPARK収集データを親切にサポートしてくれたSimons財団のN. Volfovsky、P. Feliciano、A. Packer、メタゲノミックライブラリーのシーケンスに協力してくれたトレント大学のLaBSSAH-CIBIO次世代シーケンス施設（V. de Sanctis、R. Bertorelli、P. Cavallerio、C. Valentini）に感謝する。本研究は、欧州研究評議会（ERC-STG project MetaPG-716575およびERC-CoG microTOUCH-101045015）よりN.S.に、EMBO ALTF 593-2020よりM.V.-C.に助成を受けた。また、本研究の一部はMIUR 'Futuro in Ricerca'（助成金番号RBFR13EWWI_001）によりN.S.に、欧州H2020プログラム（ONCOBIOME-825410プロジェクト、MASTER-818368プロジェクト、IHMCSA-964590）によりN.S.に助成された、 N.S.には米国国立衛生研究所がん研究所（1U01CA230551）から、N.S.にはPremio Internazionale Lombardia e Ricerca 2019から、E.D.とN.S.にはサイモンズ財団（賞ID 648614）から、M.C.C.には欧州研究会議（ERC-STG project Mami-639226）から授与された。
著者情報
著者および所属
トレント大学CIBIO学部、トレント、イタリア
Mireia Valles-Colomer、Aitor Blanco-Míguez、Paolo Manghi、Francesco Asnicar、Leonard Dubois、Davide Golzato、Federica Armanini、Fabio Cumbo、Kun D. Huang、Serena Manara、Giulia Masetti、Federica Pinto、Michal Punčochář、Liviana Ricci、Moreno Zolfo、Marta Selma-Royo、Michele Filosi、Adrian Tett、Enrico Domenici & Nicola Segata
実験腫瘍学部門、IEOヨーロッパ腫瘍学研究所IRCCS、ミラノ、イタリア
エリサ・ピペルニ＆ニコラ・セガタ
ロンドン大学衛生熱帯医学部臨床研究部（英国・ロンドン
オリビア・ファラント、アドリアナ・ゴンカルヴェス、アンナ・ラスト
スペイン、バレンシア、パテルナ、農業化学・食品技術研究所（IATA-CSIC)
マルタ・セルマ・ロヨ & マリア・カルメン・コラド
アルゼンチン、サンタフェ、リトラル国立大学工学部、産業乳製品研究所（CONICET-UNL）
アナ・G・ビネッティ
コロンビア、バランキージャ、メトロポリターナ大学、人間行動・栄養研究グループ
ジミー・E・ベセラ
中国・西安交通大学健康科学センター公衆衛生学院
ベイ・ハン
タンザニア・タンガ医学研究センター国立医学研究所
ジョン・ルシング
クワメ・ンクルマ科学技術大学熱帯医学共同研究センター（ガーナ・クマシ
ジョン・アムアシ
イタリア、ジェノバ、IRCCS Istituto Giannina Gaslini腫瘍学ユニット
ロレダーナ・アモローゾ
英国、ロンドン、キングス・カレッジ・ロンドン、双生児研究・遺伝疫学部門
アレッシア・ヴィスコンティ、クレア・M・スティーブス、マリオ・ファルキ、ティム・D・スペクター
ウィーン大学微生物学・環境システム科学センター（オーストリア・ウィーン
エイドリアン・テット
中国・上海同済大学医学部・上海第十人民病院
Qian Xu、Nan Qin、Huanlong Qin
中国・上海リアルバイオゲノミクス研究所
Qian Xu & Nan Qin
ベルンハルト・ノヒト熱帯医学研究所／ドイツ・ハンブルク
ユルゲン・メイ & ダニエル・アイバッハ
イタリア、ジェノバ、IRCCS Istituto Giannina Gaslini、腫瘍学実験治療研究所
マリア・ヴァレリア・コリアス＆ミルコ・ポンツォーニ
イタリア・ポルティチ、ナポリ・フェデリコ2世大学農業科学部
エドアルド・パソッリ
計算システム生物学センター（COSBI）、マイクロソフト研究財団、ロヴェレート、イタリア
エンリコ・ドメニチ
貢献
M.V.-C.およびN.S.は、本研究の構想および設計を行った。A.B.-M.、F. Asnicar、F.C.はStrainPhlAn、PhyloPhlAn、拡張SGBデータベースのソフトウェア開発に貢献した。P.M.、D.G.、F. Armanini、F.C.、K.D.H.、S.M.、G.M.、F.P.、E. Piperni、M. Punčochář、L.R.、M.Z.、O.F.、A.G.、M.S.-R.、A.G.B.、J.E.B.、B.H.、J.L.、J.A.、L.A.、A.V.、C.M.S.、M. Falchi、M. Filosi、A.T、 A.L.、Q.X.、N.Q.、H.Q.、J.M.、D.E.、M.V.-C.、M.Ponzoni、E.Pasolli、T.D.S.、E.D.、M.C.C.はコホートのリクルートに参加し、および/またはメタデータとメタゲノム・データの取得に貢献した。L.D.とM.V.-C.は株共有推論のチュートリアルを開発した。F. Armaniniは新規データセットのDNA抽出とショットガンシーケンスライブラリー調製を行った。F. Asnicar、P.M.、M.Z.はメタゲノムデータセットの前処理と品質管理を行った。M.V.-C.とN.S.は解析を行い、データを解釈し、原稿を執筆した。著者全員が原稿の重要な修正を行い、最終版の提出を承認した。
対応する著者
Mireia Valles-ColomerまたはNicola Segataまでご連絡ください。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
本論文の査読にご協力いただいた匿名の査読者に感謝する。
追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図における管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
図表
図1 データの概要。
A) 種レベルの順序付け（Aitchison距離のPCoA、N = 2,069サンプル）。サンプルは国別に色分けされ、形状は年齢を表す。B)図1cの系統樹におけるサンプルの色分けは、それらが属するデータセットを表す。
Extended Data 図2 株共有のワークフロー。
今回の原稿で菌株共有の評価に使用したワークフロー。
Extended Data 図3 種特異的な系統の操作上の定義。
腸内メタゲノム縦断データセットで最も一般的な25のSGBについて、同一個体（緑）と非関連個体（紫）の遺伝的距離の比較。株同一性の閾値は、ユーデン指数（黒破線）、または最初の閾値が5％を超える場合は、非関連個体比較の5パーセンタイル（赤破線）として設定した（例：Parabacteroides merdae [SGB1949]）。中央nGD：正規化された系統距離を系統樹の中央nGDで割ったもの。各ヒストグラムのNは、各SGBが株レベルでプロファイリングされた同一個体比較の数に対応する。
Extended Data 図4 食品から検出された菌株を含む種の系統樹。
A) StrainPhlAn（Methods）を用いて作成したBifidobacterium animalis（SGB17278）の系統樹（ヒト腸内メタゲノムから再構成した株、マウスサンプルから再構成した株（灰色の点）、発酵食品から再構成したMAG（黄色の点）を含む）。マウスで発見された菌株とは異なり、ヒト由来の菌株の94%は、発酵食品から得られたMAGと0.0015以下の一塩基変異（SNV）率であり（Methods）、ヒトにおけるこの種の存在は、市販の食餌製品の摂取と関連していることを示唆しており、その結果、さらなる解析から除外された（横の灰色の棒グラフ）。B) StrainPhlAn（Methods）を用いて作成したStreptococcus thermophilus-salivarius-vestibularis（SGB8002）の系統樹（ヒト腸内メタゲノムから再構成した株と発酵食品から再構成したMAGを含む）。拡大したサブツリー（「発酵食品サブツリー」）の葉のみが、発酵食品から得られたMAGと≦0.0015一塩基変異（SNV）率であり（Methods）、その結果、さらなる解析から除外された。
Extended Data 図5 関係を超えた菌株および種レベルの類似性。
A) 腸内マイクロバイオームの菌株共有率および種レベルの類似性指標（Aitchison類似度、Bray-Curtis類似度、およびJaccard二項類似度）。系統共有率との比較のため、種レベルの比較は類似度指数（1-距離または非類似度）として描かれている。すべての比較は有意である（Padj<0.05、Kruskal-Wallis検定とPost-hoc Dunn検定、表S8）。系統共有率に続く社会的距離に基づく勾配は、種レベルの類似性指標で観察されるものより顕著に強い（表S8）。ボックス：下位四分位数および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ：1.5×IQR： 1.5×IQR。B) 口腔内マイクロバイオームの菌株共有率および種レベルの類似性指標（Aitchison、Bray-Curtis、Jaccardの2値類似性）：同一世帯（「世帯内」）の個人と、同一集団の異なる村落（「集団内」）および異なる集団（「集団間」）の非同居の無関係な個人との比較。系統共有率との比較のため、種レベルの比較は類似度指数（1-距離または非類似度）として描かれている。すべての比較は有意である（Padj<0.05、Kruskal-Wallis検定とPost-hoc Dunn検定、表S28）。ボックス：下位四分位数および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。
Extended Data 図6 母から子への腸内マイクロバイオームの伝播。
A) 子供による菌株獲得率は、子供の年齢の関数として減少する傾向がある。子孫による菌株獲得率は、子孫にプロファイリングされた菌株のうち、母親と共有された菌株の割合として定義され、あらかじめ定義された年齢カテゴリーにまたがる14カ国の17のデータセットで計算された。Kruskal-Wallis検定、Chi2=65、P=3.57e-12、Post-hoc Dunn検定、NSはPadj≧0.05に対応、その他の比較はすべて有意（表S10）。箱：下位四分位数および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。新規のデータセットにはアスタリスクを付けた。B) 高齢個体と非同居の母親との間の系統共有率と、血縁関係のない母親と子供のペア間の系統共有率との比較。ウィルコクソン順位和検定、N = 17,177、r = 0.09、P = 4.1e-35。ボックス：下位四分位数および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。C)非西欧化個体群と比較した、欧米化個体群の子供の年齢カテゴリーで観察された豊かさ（MetaPhlAnで検出されたSGBの数）。ウィルコクソン順位和検定、N = 721、*Padj <0.001およびPadj<0.01、表S11。ボックス：下位四分位数および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。D) 経膣分娩児と比較した帝王切開による分娩児の年齢カテゴリーにおける母子株共有率。ウィルコクソン順位和検定、**Padj<0.01、NS Padj≥0.05, Table S14。箱：下位および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。
Extended Data 図7 成人双生児における腸内細菌叢の共有。
同居から数十年後の二卵性双生児と一卵性双生児の腸内マイクロバイオーム株共有率。ウィルコクソン順位和検定、N=708、**Padj<0.01、*Padj<0.05、NS Padj≥0.05, Table S19。箱：下位四分位数および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。
Extended Data 図8 個人間の腸内細菌叢の種および株の共有。
A）世帯員間（世帯内）、同じ村の異なる世帯の個人間（村内）、同じ集団の異なる村の個人間（集団内）、異なる集団間（集団間）の腸内マイクロバイオーム株共有率の密度分布。B) 家庭データセットの教師なしネットワークを共有する腸内細菌叢種。線幅は共有種数に比例する。50以上の共有種を持つ接続のみを示す。
Extended Data 図9 口腔サンプル中の高感染性SGB。
口腔メタゲノムで一貫して有意に高発現している3つのSGBの同系（緑）対異系（紫）遺伝的距離比較。株同一性の閾値は、無関係な個々の比較の3パーセンタイル（破線）とした。
Extended Data 図10 菌株同一性閾値の評価。
A) 便サンプルでプロファイリングされた646のSGBについて、菌株の定義別に、菌株同一性の閾値（個体間分布のパーセンタイルに対応）として使用された中心nGD（正規化された系統距離を系統樹の中央値nGDで割ったもの）。パーセンタイルが異なっても、nGD値に有意差はない（Kruskal-Wallis検定、Chi2=2.34、P=0.31）。ボックス：下位および上位四分位値、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。B) 中心化nGD閾値（正規化系統間距離を系統樹のnGD中央値で割ったもの）の門別分布。統計的に有意な関連は見られなかった（クラスカル・ワリス検定、Chi2=6.6、P=0.25）。ボックス：下位四分位数および上位四分位数、中央線：中央値、ひげ： 1.5×IQR。C) 縦断的データセット（N = 145 SGBs profiled in at least 50 same-individual pairs）において流行しているSGBsそれぞれについて計算された株同一性閾値（個体間nGD分布のパーセンタイル）。
補足情報
補足情報
このファイルには、補足表1～35（表は別途提供）への案内と、系統の共有を評価するために行った手順を説明するチュートリアルへのリンクが含まれています。
報告概要
補足表
補足表1～35：完全な説明は補足情報文書を参照のこと。
権利と許可
オープンアクセス本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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Valles-Colomer, M., Blanco-Míguez, A., Manghi, P. et al. 腸内細菌叢と口腔内細菌叢の個人間伝播ランドスケープ。Nature 614, 125-135 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05620-1
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2021年7月14日受領
受理2022年12月02日
2023年1月18日発行
発行日2023年02月02日
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41586-022-05620-1
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