Common Variable Immunodeficiency患者における腸内細菌叢の修飾因子としての便中免疫グロブリン濃度

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発行：2023年3月24日
Common Variable Immunodeficiency患者における腸内細菌叢の修飾因子としての便中免疫グロブリン濃度

Fecal Immunoglobulin Levels as a Modifier of the Gut Microbiome in Patients with Common Variable Immunodeficiency - Journal of Clinical Immunology

クリスティーナ・ノルトナー
Alla Bulashevskaさん、
...
ミケーレ・プロイエッティ
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Journal of Clinical Immunology (2023)この記事を引用しています。
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共通可変性免疫不全症（CVID）は、先天性免疫異常症の中でも臨床的に最も多い疾患である。これらの患者では、多様性が低下した腸内細菌叢の構成が変化していることが報告されている。我々は、CVID患者における糞便中の免疫グロブリンレベルと腸内細菌叢への影響について調査することを目的とした。
調査方法
CVID患者28名と健康な家庭内対照者21名を含む健康なドナー（HD）42名の腸内細菌叢を、便サンプルから抽出した細菌16S rRNA遺伝子のV3およびV4領域の配列決定により解析した。CVID患者27名とHD41名の免疫グロブリンA、M、Gの便中濃度をELISA法により上澄み液で測定し、タンパク質濃度で正規化した。
結果
CVID患者の便サンプルにおいて、HDと比較してIgAの減少、IgGの増加を測定した。便中IgAおよびIgMの減少は、微生物の多様性の低下およびディスバイオシスの増加と関連していた。特にIgAレベルの低下した患者において、またIgMレベルの低下した患者においても、対応する患者と比較して、有意に異なる豊富な分類群を多数確認した。
結論
CVID患者は腸内細菌叢の構成が変化しており、これは糞便中のIgAおよびIgMレベルが低下している患者に最も多く見られる。本研究では、CVID患者における腸内細菌叢の潜在的な修飾因子として、糞便中の免疫グロブリンを同定するものである。
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はじめに
共通変数型免疫不全症（CVID）は、臨床的に最も一般的な先天性免疫異常症であり、その有病率は1～25,000人と推定されている[1]。CVIDは、4歳以上で免疫グロブリンG（IgG）およびA（IgA）の低ガンマグロブリン血症、免疫に対する特異的抗体産生の不良または欠如を特徴とします[2]。患者は、特に呼吸器系の感染症を繰り返し発症する。また、約70％の患者は、リンパ球増殖、臓器特異的炎症、自己免疫などの非感染性合併症を発症する [3,4,5] 。その発生は大きく異なりますが、重大な罹患率と死亡率を引き起こします[6]。感染症は免疫グロブリン補充療法や予防的な抗生物質によって予防することができますが、非感染性合併症の治療は依然として課題となっています[7]。
2016年、Jørgensenらは、CVID患者の便サンプルにおける微生物アルファ多様性の低下とディスバイオシスについて初めて説明しました。微生物多様性の低下は、免疫異常のある患者で最も多く見られ、血清IgA値の低下と相関していました[8]。その後の研究で、CVID患者における腸内細菌異常症が確認されている[9,10,11]。Fiedorovaらは、CVID患者と同一家庭の健常対照者の微生物相を比較し、環境因子が微生物の多様性に大きな影響を与えることを示しているようです[11]。Hoらは、CVID患者の血清中に腸内常在菌の16S rDNAレベルの増加を検出し、微生物のトランスロケーションが増加していることを示唆しました[12]。
分泌型免疫グロブリンは、粘膜表面で重要な機能を発揮する。腸管粘膜では、IgAが分泌型抗体の主なアイソタイプであり、IgMとIgGがそれに続く[13]。多量体IgAとIgMは、腸内細菌叢によって刺激された形質細胞によって粘膜の局所的に産生される [14, 15]。
細菌を結合し補体系を活性化することで、粘膜免疫グロブリンは微生物の豊かさを保ち、細菌感染に対する宿主の免疫反応を刺激する [16,17,18,19,20]. 比較的低いレベルで存在するが、分泌型IgGは腸内細菌叢やコート細菌によっても誘導され、大腸菌やサルモネラ菌の感染を防ぐことができる[21]。
CVIDでは血清免疫グロブリンレベルがよく研究されているが、糞便免疫グロブリンレベルについてはほとんど知られていない。2018年、Shulzenkoらは、HDと比較して、CVID患者の十二指腸生検でIgAとIgGを示す遺伝子の転写物を少なく検出しました[22]。
本研究の目的は、便サンプルの分析により、CVIDにおける便中免疫グロブリンと腸内細菌叢組成の間の可能な関連性を調査することであった。
方法
サンプル採取
便サンプルは、CVID患者および健康な家庭内ドナー（HD）がいる場合は、そこから採取した。採取期間は、フライブルク大学の現地倫理委員会（プロトコル番号526/14）による倫理承認後、フライブルク大学医療センターにて2015年9月から2017年6月の間であった。研究参加者は、安定化液（Stratec）8mlを含む便管を受け取り、サンプリング後24時間以内に送付することが義務づけられた。サンプルとともに、すべての研究参加者は、食事、環境、薬物摂取、臨床症状に関する86の質問を含む質問票（Kieler Fragebogen für Erwachsene, Studie zur Rolle des Mikrobioms, Version 1.2 of 01.08.2014 に基づく）を提出しました。
除外基準について
除外基準として、サンプリング前最近4週間以内の抗生物質、プロバイオティクス、免疫抑制剤（プレドニゾロン1日5mg以下を除く）の摂取が選ばれた。また、これらの基準に関してアンケートで結論が出なかったサンプルも除外した。除外基準に基づいて除外されたCVID患者のHHDからのサンプルは、健康なドナー（HD）の総プールに含まれた。さらに、CVID患者28名とHD42名の便サンプル（対応するHHDからのサンプル21名を含む）をまとめて分析しました。
糞便微生物DNAの単離
到着後、便サンプルをホモジナイズし、アリコートに分け、-80℃で保存した。微生物DNAは、QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen）を用いて、製造元の説明書に修正を加えながら、2mlのアリコートから抽出した。便の溶解温度は、グラム陽性菌など溶解しにくい菌の溶解のために、70℃（推奨温度）から95℃に上昇させた。後の工程で、400μlの上清（提案された体積200μlの代わりに）をピペットで15μlのプロテイナーゼKに加え、そこに400μlのAL緩衝液（提案された体積200μlの代わりに）を加えた。スピンカラムにライセート400μlを2回ロードした。この変更により、より高い全DNA収量を得ることができました。
16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列決定
16S rRNA遺伝子の可変（V）領域3および4アンプリコンは、イルミナの16Sメタゲノムシーケンスライブラリープロトコルに従って配列決定した。16S Amplicon PCR Forward Primer 5′ TCGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAGCCTACGGGNGCWGCAGおよび16S Amplicon PCR Reverse Primer 5′ GTCTCGTGGCTCGAGATGTGTATAAGACAGGACTACHVGGTATCTAATCCは16S rRNA遺伝子の関心領域（V3およびV4）に関する特定のプライマーとして選択した。96サンプルの最終ライブラリーをMiSeqにロードし、ハイスループットシーケンスを行った（2×300サイクルV3キット）。
塩基配列の解析
品質評価された配列は、fastqファイルから抽出されました。配列解析は、USEARCHバイオインフォマティクスプラットフォーム[23,24,25]の検索およびクラスタリングツール、および異なるRパッケージを使用して実施した。
アルファ多様性の計算
微生物α多様性指標Fisher、Shannon、Chao1の算出は、USEARCH.
(https://www.drive5.com/usearch/manual/alpha_metrics.html)。
相対的存在量とCVIDに特異的なディスバイオシス指標の算出
分類群の相対的な存在量は、ある分類群の配列数をそれぞれのサンプルの総配列数で割ることによって算出した。最初のステップでは、CVIDとHDのコホート間で有意差があるかどうか（Mann-Whitney Uテスト、p値<0.05）、分類群をスクリーニングした。
有意差のある種のヒートマップでは、患者コホートの平均値を健常者コホートの平均値で割ることにより、有意差のある分類群の相対存在量の平均値の変化量を算出しました。次に、Jørgensenら[8]と同様の方法で、CVID特有のディスバイオシス指標を算出した。HDと比較してCVIDで増加した分類群の相対存在量の合計を、HDと比較してCVIDで減少した分類群の相対存在量の合計で割ることにより、各サンプルのすべての分類群ランクについてCVID特異的なdysbiosis指数を求めた。
糞便中の免疫グロブリン濃度の測定
便サンプル2mlのアリコートを遠心分離して、便上清を採取した。次に、アルカリホスファターゼ系を用いた酵素結合免疫吸着法（ELISA）を実施した。Corning社製96ウェルハーフアリアプレートを、最終濃度5μg／ml（総容量30μl）のヤギ抗ヒトIgG-UNLB、IgA-UNLBまたはIgM-UNLB（Southern Biotech）のいずれかでコートした。プレートは4℃で一晩インキュベートした。その後の洗浄工程はすべて、Microplate Washerを使用してPBS 0.025% Tween 20で実施した。プレートを4回洗浄した後、75μlのPBS 10%FCS溶液（ブロッキングバッファー）で3時間ブロッキングし、上清の1～5倍希釈液を調製した。2μg/mlから始まる標準希釈列を、ヒトの参照血清を使って調製した。プレートは、25μlの希釈した上清と標準液で、室温で4時間インキュベートされました。さらに洗浄後、ブロッキングバッファーで1：500に希釈した二次抗体（Goat anti-human IgG-AP, IgA-AP and IgM-AP, Southern Biotech）25μlを加え、インキュベーション時間を室温で2時間とした。さらに4回洗浄した後、1mg/mlの濃度の50μlのホスファターゼ基質を添加した。37℃で30分間インキュベートした後、プレートを405nmの波長で読み取った。標準曲線は、SkanITソフトウェアで算出した。
糞便タンパク質量の測定
便タンパク濃度は、Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific™）を用い、マニュアルに記載されているマイクロプレートの手順に従い測定した。便上清の1～8倍希釈液を調製した。標準曲線のために、アルブミン標準物質を2000μg/mlから12.5μg/mlに希釈した。プレートはELISAリーダーで波長562nmで読み取った。解析はSkanITソフトウェアで行った。
免疫グロブリンレベルの正規化
各サンプルの糞便免疫グロブリン濃度は、除算によりタンパク質濃度に正規化した。便の重量に対する正規化は、便の組成が変動するため選択しなかった；便の重量とタンパク質濃度の間に関連する相関はなかった（補足図S1）。2つの別々の実験（Exp_01とExp_02）のデータをプールするために、免疫グロブリン濃度は、それぞれの実験のHDの免疫グロブリン濃度の中央値で正規化した（補足図S2).
免疫グロブリン濃度による患者のサブグループへの分割
HDの免疫グロブリンレベルの分布に基づき、患者はさらなるサブグループに分けられた。IgAレベル（タンパク質で正規化）がHDsのレベルの第1四分位以下の患者は、IgA_lowグループに属した。第1四分位以上のレベルの患者は、IgA_normグループに属した。IgMについては、同じように進めた（IgM_lowとIgM_norm）。IgGについては、患者がHDよりもIgGレベルが有意に高かったため、第3四分位をカットオフレベルとして選択した。HDsのレベルの第3四分位値以上の患者はIgG_highグループに属し、第3四分位値以下の患者はIgG_normグループに属しました。
統計解析
特に断りのない場合、有意性はMann-Whitney U testを用いて計算した。0.05未満のp値は、統計的に有意であるとみなした。Q値（調整済みp値）は、Storey手順［26］を用いた偽発見率（FDR）解析により算出した。図の作成には、GraphPadPrism 5を使用した。図7とS3にはVennyプログラムを使用した[27]。
結果
研究対象者の説明
研究グループの疫学的特徴
研究対象は、CVID 28検体と、患者の対応するHHDからの21検体を含む合計42検体のHDから構成されています。彼らの疫学的特徴は表1に示されている。男性参加者の割合は、患者コホートで39％、HDコホートで46％であった。サンプリング時の平均年齢は、HDの方が有意に高くはなかった。HDのうち3人はこの研究の時点で喫煙者であったが、患者コホートでは非喫煙者のみであった。患者はHDよりも体格指数（BMI）が低かったが、これは統計的に有意ではなかった。雑食の人の割合は、研究グループで同等であった。
表1 研究グループの疫学的特徴
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CVID患者集団の臨床表現型
全患者が再発性感染症に罹患していた。CVID患者のほぼ80%は、さらにCVIDに関連した非感染性合併症を呈し（表2）、その中でも脾腫が最も多く（50%）見られた。その他、リンパ節腫脹（28.6%）、自己免疫（39.3%）、腸疾患（21.4%）、肉芽腫性疾患（32.1%）などの合併症が頻発しました。これらの合併症を呈する患者を、感染症のみの患者群（n=6）に対して、免疫異常の患者群（n=22）と定義している。
表2 CVID患者群（n = 28）の臨床表現型
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免疫異常のある患者群では、特定の合併症の発生と別の合併症の発生は相関していなかった（補足図S3）。患者の主な検査データとCVIDクラス（Freiburg、EUROclass）を補足表S2.1-2.2に要約した。
28名中26名がIgG補充療法を受けており、そのほとんどが皮下投与であった（n = 20）。免疫グロブリン補充以外の免疫調節薬については、3名の患者さんが低用量グルココルチコイドを服用していました。除外基準の一部として、サンプリング前の過去4週間以内に抗生物質の摂取があった患者は、研究対象から除外された。1人の患者は、過去6週間以内に抗生物質を摂取していた。HD2名とCVID患者12名は、過去6ヶ月以内に抗生物質を摂取していた。
CVIDにおける腸内細菌叢のα多様性
微生物のアルファ多様性は、1つのサンプル内の種の多様性を表すもので、さまざまな尺度（多様性指標）で定量化することができます[28]。アルファ多様性は、豊かさ（種の総数）と均等性（種の相対的存在量の類似性）に依存します[29]。我々は、CVID患者の便サンプルにおいて、HDと比較して、種の豊かさと均等性を推定するFisher指数（平均16.75 vs. 17.88）とShannon指数（平均3.20 vs. 3.32）の低下を測定しました（図1A）。このうち、統計的有意差に達したのはFisher指数のみであった。種の豊かさの推定値であるChao1指数[30]は、差がなかった。患者コホート内では、Fisher指数で測定された免疫異常の兆候を持つ患者において、微生物の多様性が低いという有意ではない傾向が見られたが、Shannon指数とChao1指数は同等であった（図1B）。便採取前の過去6ヶ月以内の抗生物質摂取は、微生物α多様性の低下と関連しなかった（補足図S4）。
図1
CVIDにおける腸内細菌叢のα多様性。(A)HD（n=42）とCVID患者（n=28）のサンプル、(B)感染症のみ（n=6）と免疫異常（n=22）のCVID患者の微生物多様性指標Fisher、Shannon、Chao1を表示した箱型プロットです。箱ひげ図の箱は、25パーセンタイルから75パーセンタイルの範囲である。ひげは最小値と最大値を示し、中央値は箱の中の黒線で示されている。マン・ホイットニーのU検定で計算された有意差は、アスタリスクで強調されている（*** p < 0.0005, ** p < 0.005, および * p < 0.05）。
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CVIDにおける腸内細菌叢の組成の変化について
その結果、CVID患者サンプルでは、HDと比較して、多くの発現量の異なる分類群が確認された（補足表S3.1-3.6）。門のレベルでは、CVID患者のサンプルでは、HDと比較して、プロテオバクテリアの相対的な存在量が有意に高く、分類されていない細菌の割合が低いことが検出された（図2A）。プロテオバクテリアの増加は、ガンマプロテオバクテリアとイプシロンプロテオバクテリアのクラスが増加したことに起因する（図2B）。
図2
CVIDにおける腸内細菌叢の変化。(A) HDサンプル（n = 42）とCVID患者（n = 28）の表示されたフィラの平均相対存在量を示す積み上げ棒グラフ図。(B）HDサンプル（n = 42）およびCVID患者（n = 28）のProteobacteria門内の表示クラスの平均相対存在量および標準偏差を示す棒グラフ。Mann-Whitney U 検定で算出された有意差は、アスタリスクで強調されている（*** p < 0.0005, ** p < 0.005, * p < 0.05)
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Gammaproteobacteriaクラスでは、Enterobacterales目、Enterobacteriaceae科、Escheria属がCVID患者でより多く見られた。ε-proteobacteriaクラスでは、Campylobacterales目、Campylobacteraceae科、Campylobacter属、およびCampylobacter concisus種が豊富であった。
CVIDで有意に多かった種は、B. fragilis、Veillonella atypica、Neisseria perflava、Haemophilus parainfluenzae、分類不能のEscheriaであった。中でも、Slackia isoflavoniconvertens、Alistipes indistinctus、Acetanaerobacterium elongatum、Intestinimonas butyriciproducensは、HDよりもCVID患者の便サンプルに少ない量であった（図3）。
図3
種レベルで異なる腸内細菌叢の構成。このデュアルグラディエントヒートマップには、HDと比較したCVID患者の表示種の相対存在量の倍率変化が示されている。計算可能なフォールドチェンジで有意に異なる種（p値<0.05、Mann-Whitney Uテスト）を示す。赤色はCVIDでより多く存在した種を示し、青色はより少ない存在であることを示す。ヒートマップの右手にあるクラスターツリーは、分類学的階層を示す。可視化のため、フォールドチェンジは最大値2までとした。
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CVIDにおける糞便中IgAの減少について
糞便中のIgA、IgM、IgGの濃度を測定したところ、CVID患者ではHDに比べてIgAが有意に低く、IgGが高いが、IgMの濃度は差がなかった（図4A）。さらに、糞便中の免疫グロブリンの組成も変化していた（図4B）。HDではIgAが最も大きな割合を占めていたが、CVID患者では平均してIgM、IgG、IgAの割合が同程度であった。
図4
IgA、IgM、IgGの糞便中レベル。(A) HD（n=41）とCVID患者（n=27）のELISA法で測定した糞便中のIgA、IgM、IgGレベルを箱ひげ図に示した。HDsの中央値で正規化した免疫グロブリン濃度の変化倍率を示す。(B）糞便中の免疫グロブリンの組成。HD（n=41）およびCVID患者（n=27）について、糞便中の免疫グロブリン濃度全体に占めるIgA、IgM、IgGの割合の平均値を表示した。(C）正常（n＝9）および低糞便IgAレベル（n＝18）のCVID患者のサンプルについて、ELISAで測定した糞便IgMおよびIgGレベルを表示したボックスプロットである。箱型プロットのボックスは、25パーセンタイルから75パーセンタイルの範囲である。ひげは最小値と最大値を示し、中央値はボックス内の黒線で示されている。(D) CVID患者（n = 27、赤で描かれている）とHD（n = 41、灰色で描かれている）におけるIgMのIgAに対する倍数変化の散布図である。HDとCVIDのIgMの共通ベストフィット線と95%信頼区間が描かれている（傾き1.899 ± 0.2991, R.2 = 0.3793, p < 0.0001）. Mann-Whitney U testで算出した有意差はアスタリスクで強調した（*** p < 0.0005, ** p < 0.005, and * p < 0.05)
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さらなる解析のために、患者はHDの免疫グロブリンレベルの分布に基づいてサブグループに分けられた（方法参照）。
便中免疫グロブリンレベルはCVID関連合併症の発生と相関しなかったが（補足図S5）、これはおそらく研究参加者の数が限られているためである。
選択的IgA欠損症患者では、糞便中のIgAの不足がIgMの増加によって相殺される可能性があるという証拠がある[32]。選択的IgA欠損症の患者とは異なり、糞便中IgA濃度が低いCVID患者は、糞便中IgA濃度が正常な患者よりも糞便中IgM濃度も有意に低かった（図4C）。重要なことに、HDの便中IgAレベルとIgMレベルの間にわずかな正の相関も測定された（図4D）。これは、IgMレベルがHDsとCVID患者の間で差がなかったこととは対照的である（補足図S6）。
便中IgAおよびIgMレベルは、CVIDにおける微生物の多様性およびディスバイオシスと相関する
便中IgA濃度が低い、あるいは低いCVID患者のサンプルでは、便中IgA濃度が正常な患者と比較して、α多様性が有意に減少していることが確認された。微生物多様性の低下は、さらにIgMの糞便レベルの低さと関連していた（図5）。なお、微生物の多様性と糞便中のIgGレベルとの関連は見られなかった。
図5
微生物αの多様性と糞便中の免疫グロブリンレベルの相関性。正常なCVID患者（n = 9）と糞便中IgA量が少ないCVID患者（n = 18）、および正常なCVID患者（n = 19）と糞便中IgM量が少ないCVID患者（n = 8）のサンプルについて、微生物のα多様性指標Fisher、Shannon、Chao1を表示したボックスプロットです。箱型プロットのボックスは、25パーセンタイルから75パーセンタイルの範囲である。ひげは最小値と最大値を示し、中央値はボックス内の黒線で示される。Mann-Whitney U検定で算出された有意差は、アスタリスクで強調されている（*** p < 0.0005, ** p < 0.005, and * p < 0.05)
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Jørgensenらと同様に、HDと比較してCVID患者で有意に増加した分類群と減少した分類群を考慮し、各サンプルについてCVID特有のdysbiosis indexを算出しました。6種類のdysbiosis indicesを算出した（分類学的ランクごとに）。糞便中IgA濃度の低さは、分類学的ランクのクラス、ファミリー、オーダー、ジェネラスにおいて、より高いディスバイオシス指数と関連しており、ディスバイオシスがCVIDの糞便中IgA濃度の低さとも関連していることが示された（図6）。同様に、CVIDに特異的なdysbiosisは、分類学的ランクのorderとfamilyで糞便IgMレベルが低い患者でより多く見られたが、糞便IgGレベルはdysbiosis指数と相関がなかった。
図6
ディスバイオシスは、IgAおよびIgMの糞便レベルの低さと関連している。箱ひげ図は、CVID患者グループの門、目、クラス、科、属、種（左から右へ）のCVID特有のディスバイオシス指標を表示した（A）IgA、（B）IgM、（C）IgG）。門派のdysbiosis indexの数値は、それぞれの指数を算出できなかったケースが少ないため、変動しています。箱型プロットの箱は、25～75パーセンタイルの範囲である。ひげは最小値と最大値を示し、中央値は箱の中の黒線で示されている。Mann-Whitney U検定で算出した有意差はアスタリスクで強調表示（*** p < 0.0005, ** p < 0.005, * p < 0.05)
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これまでの研究と同様に、CVID特異的なdysbiosisは、分類学的ランクの属と種において、CVID関連合併症を持つ患者群に最も多くみられた（補足図S7）。
CVIDにおけるIgA-およびIgM-特異的な分類学的差異
さらに、糞便中の免疫グロブリン量が正常な患者と低下している患者のサンプル間で、相対的な存在量を比較することにより、有意に異なる分類群を同定することを目的とした解析を行いました。この解析により、CVID患者における腸内細菌叢のシグネチャーは、ほとんどがIgA-であったが、IgM特異的なものもあることがわかった（補足表S4.1-5.2）。
糞便中のIgA量が少ないCVID患者のサンプルは、正常なIgA量の患者と比較して、Gammaproteobacteriaクラス（図7A）、その目Enterobacterales、その科Enterobacteriaceae、その属Escheria、および種未分類のEscheriaに有意に富んでいました。増加した分類群の数が限られているのとは対照的に、IgA値が低い患者からのサンプルでは減少した分類群の数が多かった（例えば、種のランクで44に対して3）。
図7
特定の分類群の存在量は、糞便中のIgAおよびIgMレベルに依存している。(A) CVID患者（n = 27）における、HDの中央値で正規化した糞便中IgAの倍率変化とガンマプロテオバクテリアの相対存在量（％）を表示したグラフです。(B）ベン図は、糞便IgA（赤、n = 47）またはIgM（黄、n = 13）レベルが正常な患者と低下した患者の間で有意に異なる種の数およびこれらの間で共有される種（オレンジ、n = 4）を示している。
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同様に、IgM値が低い患者では、IgM値が正常な患者と比較して、増加した分類群よりも減少した分類群の数が多いことが検出された。IgAまたはIgMレベルの低い患者からのサンプルは、Enterobacterales目に属する分類群の相対的存在量の増加を共有していたので、我々はIgAおよびIgM特異的な分類学的差異が交差する範囲に興味を持った。図7Bのベン図と補足表S6に示すように、IgAとIgMがCVID患者の腸内細菌叢で果たす役割はほぼ異なることが示唆された。
考察
本研究は、HDと比較した場合、CVID患者の便の微生物組成が著しく異なることを確認した[8, 11]。これまでの報告と同様に、CVID特有のディスバイオシスは、感染症のみのCVID患者群よりも、免疫異常のある患者群に多くみられました。LPSやsCD25などの全身性免疫活性化のマーカーは、免疫異常のあるCVID患者の血清で特に増加し、α多様性の低下やdysbiosisの増加と相関することが示されたことから[8]、腸内細菌叢のトランスロケーションが増加することがCVIDにおける免疫異常のドライバーとして提案されてきた[33]。
先行研究において、微生物の多様性の低下は、CVID患者におけるIgAの血清レベルの低下と相関しており[8, 11]、IgAの欠如がCVIDにおける腸内細菌叢の変化に寄与していることが示唆された。
我々は、CVID患者の便サンプルにおいて、HDと比較して、糞便中のIgAレベルが有意に低く、IgGレベルが高いことを測定したが、IgMレベルに差はなかった。選択的IgA欠損症では、呼吸器や消化管の粘膜でのIgMレベルの増加がIgAの不足を補うことができるが[34、35]、CVID患者の便サンプルではIgMレベルは増加しなかった。むしろ、IgAレベルが低下した患者群では、IgAレベルが正常な患者群と比較して、IgMレベルが有意に低下していました。このような糞便中のIgAレベルとIgMレベルの正の相関は、HDでも発見されたが、その程度はより低い。
IgAとIgMの両方の糞便レベルが低いことは、CVID患者において増加したディスバイオシスと微生物多様性の低下と独立して相関していた。数多くの研究により、分泌型IgAおよびIgMと微生物叢との結合が腸のホメオスタシスにとって重要であることが示されている[16,17,18,19,20]。コーティングプロセスは、微生物の刺激を制限するための微生物抗原の中和、補体系の活性化、およびより迅速なクリアランスのための細菌の凝集を誘導する [16, 36].
我々は、CVID患者における腸内細菌叢のIgA-だけでなくIgM-特異的なシグネチャーをここに記述する。糞便中のIgAまたはIgMが減少した患者の便サンプルは、α多様性の減少によって示されるように、多様性が低いだけでなく、特定の分類群の枯渇と富化の両方が見られた。増加した分類群には、Gammaproteobacteriaクラスとその目Enterobacteralesの細菌が含まれていた。Escherichia、Shigella、Salmonellaなど、Gammaproteobacteriaクラスの多くの分類群は、腸内病原体と考えられています[37]。IgAは、ガンマプロテオバクテリアを標的とする主要な役割を担っていると考えられています[36, 38]。腸の微生物組成は、生涯を通じて大きく変化します。出生後、プロテオバクテリアの存在量が最も多く、生後数ヶ月で減少する[39]。この成熟過程には、ガンマプロテオバクテリア特異的IgAの産生が必須であることが示された[39]。IgA欠損マウスでは、プロテオバクテリアの多さが持続し、DSS-colitisモデルで腸の炎症に対する感受性が高くなった[39]。Janzonらは、乳児の腸の成熟に関する縦断的研究において、IgMがIgAと同様の種類の細菌、例えば、Proteobacteriaに属するEnterobacteriacaeファミリーを被覆することを明らかにしている[40]。したがって、糞便中のIgAおよびIgMの産生が不十分であると、CVID患者においてこれらの病原体の増殖につながる可能性がある。これと同様に、Hoらは、CVID患者の血清中に、ほとんどがIgA-であることが知られている腸内細菌叢の16S rDNAの高存在を検出したが、IgMも被覆されていた[12]。
本研究では、便中IgG濃度はHDと比較してCVID患者で有意に増加し、ディスバイオシスや微生物多様性とは相関しなかった。サンプル採取時、2名を除くすべての患者はIgG補充療法を受けていた。このIgGの増加は、治療的に補充されたIgGが腸管バリアの機能不全により腸管から失われることで説明できる。実際、CVID患者の血清中には、健常対照者と比較して、腸管上皮バリアのタンパク質である腸脂肪酸結合タンパク質（I-FABP）のレベルが上昇していることが測定された[12]。重要なことは、これが腸症の有無と関連しなかったことで、CVIDに共通する腸管バリアの欠陥があることが示されました[12]。同様に、腸疾患の有無と便中IgG濃度の上昇との関連も見いだせなかった。
IgG補充療法は、CVID患者の気道の感染症に対する防御に有効である[7、41]。CVID患者における内毒素血症の結果としてCD4 T細胞の疲弊を示唆したPerreauらの研究では、免疫グロブリン補充療法によりCD4 T細胞の機能が回復し、エンドトキシンのレベルが減少した[42]。しかし、Fadlallahらのデータは、腸内細菌叢による全身感染からの保護におけるIgG補充療法の有効性に疑問を呈している。選択的IgA欠乏症の患者は、血清中の抗共同体特異的IgGの産生の増加により、糞便中IgAの不足を補うことが示された。しかし、CVID患者では、IgG補充療法によって投与された血清IgGは、CVIDの腸内細菌と弱い結合しかしなかったことから、腸内細菌による感染を防ぐためには、常在菌特異的IgGを自己生成することが重要であることが示された [43]. 便サンプルにおけるIgAの減少とIgGの増加という我々の発見は、健常対照者と比較して免疫不全患者の喀痰におけるIgAの減少、IgGの増加、および微生物の多様性の低下を示した最近発表された研究のデータと一致する[44]。
ディスバイオシス」という用語は、ますます増えていますが、文献によって使い分けがなされています[45]。患者の腸内細菌叢を健康な研究コホートのものと比較することで、最も頻繁に変化する微生物叢をCVID特有のdysbiosisとして人為的に定義しました。同様に、微生物のα多様性をどのように評価するかについても議論が続いている[28]。その計算方法は複数あり、時には結果が分かれることもあります[46]。そこで、我々は3つの異なる指標を提示した。健康な研究集団の中でも、微生物叢と糞便免疫グロブリンレベルはばらつきがありました。このような格差があるため、代表的なデータを得るためには、できるだけ多くのHDと患者を含めることが重要である。私たちの研究コホートは比較的少数の研究参加者で構成されており、患者のサブグループ解析の解釈は困難である。
以上のことから、CVIDにおける腸内細菌叢のシグネチャーは、ほとんどがIgA-であるが、IgM-にも特異的であることが明らかにされた。このことは、分泌型IgAとIgMが腸のホメオスタシスにとって重要な役割を担っていることを強調している。CVIDでは、分泌型IgAおよびIgMの不足が、腸内細菌叢の変化や微生物の移動の増加に寄与し、おそらく免疫調節障害をもたらすと考えられる。
結論
本研究は、CVIDにおける腸内細菌叢と腸管免疫グロブリンの役割に関する知見を広げるものです。我々は、CVID患者において、HDと比較して腸内細菌叢の組成が変化していることを確認した。マイクロバイオームデータと糞便中の免疫グロブリンレベルを関連付けると、微生物の多様性の低下、ディスバイオシス、糞便中のIgAおよびIgMの減少の間に関連性があることが確認されました。重要な知見として、我々は、CVID患者における腸内細菌叢の潜在的な修正因子として糞便免疫グロブリンを特定した。
データの入手方法
本研究で作成されたデータセットおよび/または解析されたデータセットは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。
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謝辞
本研究に参加していただいた患者さん、健常対照者の方々に感謝します。Theresa Nöltner博士の科学的インプットと原稿の批判的読解、Alexander Stehli博士のデータ解析のサポートに感謝します。また、Jorrell Rush-Kittle氏による原稿の校正、Andrea Sacconi氏によるFDR解析のサポートに感謝する。
資金提供
オープンアクセスの資金調達が可能になり、Projekt DEALによって組織された。M.P.はDeutsche Forschungsgemeinschaft (RESIST-EXC 2155)から資金援助を受けています。B.G.は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (GR1617/14-1/iPAD; SFB1160/2_B5; RESIST-EXC 2155-Project ID 390874280); EU-H2020-MSCA-COFUND EURIdoc programme (No. 101034170) and the BMBF (GAIN 01GM1910A) から資金援助を受けています。
著者情報
著者ノート
Bodo GrimbacherとMichele Proiettiは同等に貢献した。
著者と所属
フライブルグアルベルト・ルートヴィヒ大学医学部医療センター免疫不全研究所、慢性免疫不全センター、Breisacher Str.115, 79106, Freiburg, Germany
Christina Nöltner、Alla Bulashevska、Katrin Hübscher、Hanna Haberstroh、Bodo Grimbacher & Michele Proietti
DZIF-ドイツ感染症研究センター、サテライトセンター・フライブルク、ドイツ・フライブルク
ボド・グリンバッハ
CIBSS- Centre for Integrative Biological Signalling Studies, Albert-Ludwigs-University, Freiburg, Germany
ボド・グリンバッハ
クラスター・オブ・エクセレンス RESIST（EXC 2155）、ハノーファー医科大学、ハノーファー、ドイツ
ボド・グリンバッハ＆ミケーレ・プロイエッティ
ロイヤルフリー病院免疫・移植研究所、ユニバーシティカレッジロンドン、ロンドン、英国
ボド・グリンバッハ
ハノーファー医科大学リウマチ・免疫学教室（ドイツ・ハノーファー
ミケーレ・プロイエッティ
貢献度
B.G.、M.P.、C.N.が企画・設計した。C.N.はM.P.、K.H.、H.H.のサポートのもと、便サンプルの採取と実験を行った。A.B.は配列解析と多様性指数の算出を行った。C.N.は、データ解析、図のデザイン、原稿の執筆を行った。すべての著者がこの原稿の最終版を確認し、承認して掲載した。
コレスポンディング・オーサー
ミケーレ・プロイエッティに対応する。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に沿って実施されました。フライブルク大学の倫理委員会から承認を得た（プロトコル番号526/14）。本研究に含まれるすべての研究参加者から、書面によるインフォームドコンセントを得た。
論文発表の同意
この研究において、個人を特定できる情報は公表されていません。
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
追加情報
出版社ノート
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Nöltner, C., Bulashevska, A., Hübscher, K. et al. Fecal Immunoglobulin Levels as a Modifier of Gut Microbiome in Patients with Common Variable Immunodeficiency. J Clin Immunol (2023). https://doi.org/10.1007/s10875-023-01469-9
引用元：ダウンロード
2022年11月24日受理
2023年3月6日受理
2023年3月24日発行
DOIhttps://doi.org/10.1007/s10875-023-01469-9
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