アフリカのヒト科動物の口腔内微生物群の進化と生態の変化

哉百名

アフリカのヒト科動物の口腔内微生物群の進化と生態の変化
ジェームズ・A・フェロー・イエーツ、イリーナ・M・ヴェルスコ、［...］、クリスティーナ・ワリナー

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意義
マイクロバイオームは人間の健康に重要な役割を果たしているが、その進化についてはほとんど知られていない。我々は、過去10万年にわたるヒトとネアンデルタール人のデンタルバイオフィルムを分析し、チンパンジー、ゴリラ、ホエザルのものと比較することにより、アフリカのヒト科口腔マイクロバイオームの進化の歴史を調査している。その結果、ヒトのバイオフィルムに存在し、バイオフィルムの構造的な役割を担う10の細菌属が明らかになった。しかし、その多くはまだ研究されておらず、名前も知られていない。ホモとチンパンジーの口腔マイクロバイオームには分類学的・機能的に大きな違いがあるが、ネアンデルタール人と現代人の間には高い類似性があり、口腔レンサ球菌のデンプン消化能力は明らかにホモに特有で、宿主の食事と微生物の共同適応が示唆されることもわかった。

キーワード：歯石、マイクロバイオーム、ネアンデルタール人、霊長類、唾液アミラーゼ
概要
口腔マイクロバイオームは、ヒトの生物学、健康、疾患において重要な役割を果たしているが、この微生物群集の世界的な多様性、変動、進化についてはほとんどわかっていない。我々は、ヒトの口腔マイクロバイオームの進化と生態系の変化をよりよく理解するために、ネアンデルタール人、後期更新世から現代のヒト、チンパンジー、ゴリラ、および比較のために新世界ホエザルから得た124のデンタルバイオフィルムメタゲノムを解析した。また、これらの微生物群はホエザルとも共通しており、カタルーニャとプラティルヒトの分裂以前から口腔内の重要な構成員であったことが示唆された。また、これらの微生物群はホエザルとも共通である。しかし、群集構造や個々の微生物の系統は宿主との関係を密接に反映しておらず、ホモとチンパンジーのデンタルバイオフィルムは、分類学的・機能的に大きな差異によって区別されている。10万年前までの口腔内メタゲノムを再構築した結果、ネアンデルタール人と現代人の微生物プロファイルは非常によく似ており、栄養代謝における機能的適応を共有していることが明らかになった。これには、口腔内連鎖球菌が唾液アミラーゼ結合能をヒトに特異的に獲得したことが含まれ、宿主の食事と微生物の共適応が示唆されている。さらに、ネアンデルタール人と旧石器時代の現代人の口腔内細菌には、後の現代人集団では観察されない共通の遺伝的多様性の証拠が見いだされた。アフリカのヒト科動物の口腔内細菌群の違いは、人類の進化、ヒトの微生物群の祖先の状態、そして微生物の健康と病気を理解するための時間的枠組みについての洞察を与えてくれる。

口腔は、人体の中で最も多様な微生物群集の1つによってコロニー形成されており、現在、600を超える分類群が流行していると推定されています(1)。齲蝕や歯周炎などの歯科疾患は、衛生的な介入にもかかわらず、すべての人間集団における健康負荷として残っており（2, 3）、口腔微生物はしばしば口腔外炎症性疾患と関係している（4, 5）。今日まで、ほとんどの口腔マイクロバイオーム研究は、日常的に口腔衛生を保ち、抗生物質を利用できる先進国集団から得られた臨床サンプルに焦点を当ててきた（1、6）が、口腔マイクロバイオームのグローバルな多様性、特に過去と現在の多様な非工業化社会から得られたものについては、ほとんど知られていない（7）。口腔内には少なくとも6つの異なる生息環境があるが、歯肉縁上および歯肉縁下の歯垢を含むデンタルバイオフィルムは、最も多様で臨床的に重要な生息環境の一つである（1, 6, 8）。これらのデンタルバイオフィルムは、生存中に自然かつ繰り返し石灰化し、口腔マイクロバイオームの強固で長期的な記録である歯石（歯石）を形成します（9）（10）。考古学的歯石は、歴史上および先史時代の幅広い集団において、また5万年前までの口腔内細菌メタゲノムが保存されていることが示されている(10-13)。そのため、歯石はヒトのマイクロバイオームの進化を直接調査し、現代人の口腔マイクロバイオームの祖先の状態を再構築する機会を提供するものである。さらに、進化の形質、食事、文化的行動が、腸や皮膚のマイクロバイオームなど他の部位における現代人のマイクロバイオームの構造や機能を形成することが研究で示されているため（14-18）、古代の口腔メタゲノムを調べることは、現代人の進化や先史時代における主要イベント、例えばホモの種分化の際に予測された食事の変化（19-21）や更新世後期のネアンデルタールと現代人の直接的な交流（22）について貴重な情報をもたらす可能性を秘めていると言えるでしょう。

アフリカのヒト科微生物の進化生態をよりよく理解するために、我々は、現代の現代人（n = 8）、ゴリラ（Gorilla、n = 29）、チンパンジー（Pan、n = 20）、ネアンデルタール（n = 13）、およびライフスタイルの大きな変遷に関連した2群の考古学上の現代人（前農耕地、n = 20; preantibiotic, n = 14）、および比較のために新世界ホエザル（n = 5）を加えた（SI Appendix, Fig. S1). サンプリングバイアスの可能性を考慮し、アフリカの各大猿属については、C20年代またはC21年代に収集された博物館コレクションから得られた複数の亜種と個体群を分析し、現代人については、アフリカとヨーロッパの両方から複数の個体群をサンプリングした。これに、チンパンジー（n=1）（13）、ネアンデルタール（n=4）（13）、現生人類（n=10）（23）の既報のマイクロバイオームデータを加え、合計124人のデータセットとした（図1A、SI Appendix、表S1、Dataset S1）。また、考古学的個体の放射性炭素年代を新たに8件作成し、本研究では合計44件の古代個体の直接・間接年代を決定した（データセットS1）。

Fig.
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図1.古代の歯石を採取した場所と口腔マイクロバイオーム認証。(A) サンプル採取場所。(B)保存状態の良い古代および現代の歯石中の微生物属のユークリッド距離と環境プロキシコントロールを比較したPCoA ...
ヒトの口腔マイクロバイオームの構造・機能・コアメンバーについて、進化の枠組みの中で調査し、アフリカのヒト科グループごとにコアマイクロバイオームを定義できるか、コアは系統的に一貫しているか、コアの一部のメンバーは特定の宿主グループに特異的かどうかを明らかにしようとするものである。我々は、ヒト科動物の口腔マイクロバイオームが宿主の系統を反映しているかどうかを検証し、アフリカのヒト科動物の口腔マイクロバイオータは分類学的および機能的に大きな違いがあり、宿主との関係はほとんど反映されておらず、他の生理学的、食事、行動の要因に影響されていると思われることを発見した。ネアンデルタール人と現代人の微生物プロファイルを比較したところ、予想に反して（12, 13）、地理、時代、食事・生活習慣に関係なく、ホモの口腔マイクロバイオーム構造の高い一貫性が見いだされた。また、ネアンデルタール人と後期旧石器時代人の間で、1400年以前から共通の遺伝的多様性が存在し、氷河期ヨーロッパでの混血や相互作用を示す証拠が増えてきていることを裏付けている（24、25）。最後に、口腔内連鎖球菌のアミラーゼ結合能の進化史について調べることにより、我々の発見がHomo-Associated encephalization (19, 26) と人類の進化における食物デンプンの役割 (20, 21) に及ぼす可能性を探った。我々は、アミラーゼ結合は明らかにホモに特異的な形質であり、ヒト進化の初期にデンプンが豊富な食事に微生物が共適応したことを示唆していることを発見した。

結果
歯石中の口腔微生物相の保存。古代DNA（aDNA）保存の認証は、すべての古ゲノム研究において必要かつ不可欠なステップである。しかし、古代のマイクロバイオームについては、これらの方法は十分に開発されていない。ここでは、従来の方法と新しい方法の両方を多段階に適用し、我々のデータセットにおける口腔マイクロバイオームの保存状態を評価・検証した（SI Appendix、図S2）。まず、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のnucleotide（nt）データベース（27）に対して、参照ベースのメタゲノムビニングを適用し（データセットS2）、次に口腔内および非口腔内の参照メタゲノムパネルと比較して、サンプル中の既知の口腔内分類群の累積割合の減少を評価する方法を開発し適用した（SI Appendix、図S3AおよびS3.4.1項）。これにより、口腔内由来と一致しない分類群構成を示す試料を除去することができました。次に、SourceTracker（28）を用いてこれらの結果を相互検証し（SI Appendix, 図S3B）、主座標分析（PCoA、SI Appendix, 図S5 A-D）による検査を実施しました。口腔マイクロバイオームが良好に保存されているサンプルには，Rパッケージのdecontam（29）を適用し，ダウンストリーム解析の前に実験室および環境汚染と思われる物質を検出・除去した（SI Appendix，セクションS3.6）．次に、各データセットを調べ、短い断片長やシトシンからチミンへの脱アミノ化レベルの上昇など、古代サンプルのDNA損傷の特徴を確認した（図1CおよびSI Appendix, 図S4）(30)。最後に、組成分析のための偽の割り当てを減らすために、異なる分類学的レベルで最適化された閾値を使用して、低存在の分類群を削除した（SI Appendix、図S7とS8、セクションS3.6とS5.2）。その結果、保存状態の良い89の歯石データセットが、現在から100Kaまでの試料から構成されている。
アフリカ原人口腔マイクロバイオームの中核的存在 このことは、アフリカのヒト科動物の間で宿主が分岐したという化石的・分子的証拠（31, 32）に基づき、またおそらくカタリ派とプラティリ派の分裂以前から8Mya以上にわたって維持されてきたコア微生物叢が存在することを示唆している（Fig.1B）。40Mya(33,34)である。同時に、Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) (35) により、各ホミニド属間の微生物属および種レベルでの小さいが有意な差が示された（100 bootstrap replicates, ɑ = 0.05; genus.F=5.22±1.0、Genus.F=0.25）。F = 5.22 ± 1.42, df = 3, R2 = 0.27 ± 0.05, P = 0.001; species: 種：F = 6.67 ± 2.52, df = 3, R2 = 0.32 ± 0.07, P = 0.001; SI Appendix, Fig. S5） また、このパターンはサンプルサイズの不同を制御した後でも強固であった（SI Appendix, Section S4.2)．
ヒトの歯垢バイオフィルムは、初期コロニー形成者、橋渡し役、後期コロニー形成者の微生物継承によって形成され（36）、微生物門レベルでの個人間変動が大きく（37）、短期および長期の時間スケールでの生存変化に敏感である（15、38、39）腸と対照的に、口腔微生物群は、特に属レベルで（40-42）より安定で一貫しており、抗生物質の挑戦を受けても（43）、発見されてきた。そこで、アフリカのヒト科動物の口腔マイクロバイオームについて、グループとして、また各属ごとに、個別に定義することを試みた。ある微生物分類群を「コア」と見なすには（44, 45）、与えられた宿主属を構成する集団の少なくとも3分の2に存在することが必要で、保存状態のばらつきを考慮し、少なくとも半数の個体に見られる集団のみを「存在」と数える（SI Appendix, 図 S9A および S5.2 項参照）。次に、すべての宿主分類群にわたって、各中核微生物属（図2A）と種（図2B）の交点を計算しました（データセットS3）。ほとんどの「コア」分類群はアフリカヒト科3属（ゴリラ、パン、ホモ）とホエザルに共通しているが、アフリカヒト科（ゴリラ、パン、ホモ）、パンとホモ、ホモにのみ「コア」なものは少ない（図2、SI Appendix, Fig.S1）。現代のマイクロバイオームの研究よりもサンプルサイズが小さいにもかかわらず、計算の一貫性を評価するためのブートストラップ解析は、ほとんどのコアマイクロバイオームの割り当てを支持し、低い値は、バイオフィルムの成熟度などの要因によって影響を受ける分類群を示す可能性がある（SI Appendix、セクションS5.3）。このことは、アフリカのヒト科、そしておそらくより広範な霊長類の宿主進化と種分化において、属レベルの微生物分類学的保存が高度に行われていることを示唆している。

図2.
図2.
アフリカヒト科の口腔マイクロバイオームのコアには、バイオフィルム構造が進化的に深く保存されていることが示されている。宿主グループおよびグループの組み合わせの中核となる微生物属（A）および種（B）の数を示すアップセット・プロット。(C) ヒト口腔内マイクロバイオームのコア分類群...。
属・種レベルのコア分類群には、プラークバイオフィルム形成の各段階でよく知られたメンバー（8, 36）が含まれており、初期コロニー形成者のStreptococcusとActinomyces、橋渡し分類群のFusobacteriumとCorynebacterium、後期コロニー形成者のPorphyromonasとTreponemaがいるが、後の2つはチンパンジーとヒトだけが「コア」である（図2C）。歯周病に関連する主要な病原体（ペリオパス）は、異なる宿主のコアとなる組み合わせの中に見出される。特に、今日の臨床的意義からポルフィロモナスとタンネレラに注目すると、その主要な病原因子は複数の霊長類に共通し、したがって現代人に特有ではないことが分かった（SI Appendix, 図S9 BおよびC）。コアマイクロバイオーム内に周産期病原体が存在することは、それらが従来の意味での病原体ではなく、最近の生態学的研究で示唆されているように、現代人の病原性はバイオフィルムと宿主の間のアンバランスに関係しているかもしれないという仮説を支持している(46)。アフリカヒト科の「コア」分類群の中には、周縁病原体やその近縁種もあるが、ほとんどのコアメンバーは、プラークの形成と成熟に重要な構造的・機能的役割を果たすことが今日知られており、これらの分類群と宿主との間に深い共進化的関係があることが示唆される。

アフリカ原人口腔微生物群の構造は、宿主の系統と弱い関係を示す。階層的クラスタリングにより、歯石メタゲノムが宿主属ごとにクラスタリングされる傾向があり、グループ内の類似性が確認されたが、これらの関係は宿主系統学とは異なることが示された（図3）。例えば、ホエザルとゴリラは1つのクレードで一緒になり、ホモのサブセットはチンパンジーとクラスターを形成することがわかった。後者については、入手可能なメタデータからは、このパターンを説明する地理、時代、病気などの要因との明確な関連付けが得られない（SI Appendix, section S4.3）。全体として、ゴリラとホエザルは好気性および通性嫌気性の多様な分類群によって特徴づけられるが、チンパンジーは嫌気性の分類群がより多く、多くの推定周辺病原体（例えば、Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia, Filifactor alocis, およびFretibacterium fastidosum）も含まれる。ネアンデルタール人は一貫して現代人の多様性の中に入っている。ホモはStreptococcus属が多いことが特徴的であるが、パンではこの属はかなり少ないレベルである。
図3.
図3.
アフリカのヒト科歯石微生物の宿主属やその他の要因によるクラスタリング。ホエザル、チンパンジー、ゴリラ、ネアンデルタール人、そして古代および現代の現代人の、種レベルの原核生物分類学に基づく階層的クラスタリング...
ヒトおよび非ヒト霊長類の歯石において同定された分類群の多くは、その特性評価が不十分であり、さらなる探索を困難にしている。実際、ヒトの中心的な属の中のいくつかの種は、名前がないまま（Ottowia sp.口腔内分類群894、Olsenella sp.口腔内分類群807）、あるいは研究が不十分であり（Pseudopropionibacterium propionicum, F. fastidiosum）、いくつかは属名すらない（Eubacterium ] minutum, TM7x, Anaerolinaceae bacterium口腔内分類群439）。現代のヒトの口腔マイクロバイオームに関するほとんどの議論にこれらの種が含まれていないことは、現在の口腔微生物学研究における大きなギャップを示しており、プラークバイオフィルム内での機能的および構造的役割を特定するために、これらの種を対象とした調査が必要である（47-49）。群集構造における宿主属のパターンは、唾液の流量または組成の違い（50）、ならびに食物の質、品質、および栄養分の違い（51）の影響を受ける可能性がある（SI Appendix, Section S1, S5.1, and S5.6）。また、現代人内の微生物群集構造についても調査したが、先行研究（13）とは異なり、幅広い食事パターンや時代による違いは認められなかった（SI Appendix, 図S6、セクションS4.5）。これらの知見は、現代の口腔マイクロバイオーム研究の結果と一致する。これらの研究も、食事に反応して広範かつ持続的な組成変化があったとしても、最小限にとどまっている（例えば、参考文献41、52、53）。口腔マイクロバイオームが比較的安定しているのは、口腔マイクロバイオータのほとんどのメンバーにとって主要な栄養源である複雑な宿主唾液糖タンパク質を代謝するために、これらのバイオフィルム内で発達した広範囲なコミュニティの相互依存性（54、55）に一部起因すると思われる（56）。これは、現代の腸内細菌叢における食事と分類学的／機能的組成との間に強い関連性を示す研究とは対照的である（57, 58）。

口腔内細菌種の進化史は、ホモとの相互作用を反映している。次に、宿主の進化関係が微生物ゲノムレベルに反映されているかどうかを調べるために、個々の微生物分類群の系統樹を調べた。ゲノムカバレッジを向上させ、DNA損傷による潜在的なノイズを減らすために、すべての宿主属にわたって保存状態の良い歯石サンプルの代表的なサブセットを選び（n = 19; SI Appendix, Table S1 and Dataset S1）、ウラシル-DNAグリコシラーゼ処理（UDG）ライブラリを構築して脱アミノ化シトシンを取り除き（59）、現生人類のサブセットと合わせて深くシーケンスし分析しました。多様性に富む古代のマイクロバイオームからゲノムレベルの配列を再構築することは、aDNAが非常に断片的であることと、各生物種の相対量が少ないために株の分離が困難であることの両方により困難である（SI Appendix, Section S6）。さらに、多くの口腔内常在菌の参照ゲノムが十分にないため、一塩基多型（SNP）を同定する際にミスマッピングやノイズアーチファクトが増加します（SI Appendix、図S10）。しかしながら、これらの課題にもかかわらず、またコアな分類群の代表的なゲノムを用いることにより、8つの口腔内細菌について内部ノードで高いブートストラップサポートを持つ系統樹を再構成することができた（図4およびSI Appendix、図S11）。
図4.
図4.
アフリカのヒト科口腔内細菌は、宿主属によって系統的にクラスター化する。深部配列決定された臼歯部メタゲノムから代表的な口腔マイクロバイオーム中核ゲノムを選択した近傍結合SNPベースの系統樹クラドグラム（SI Appendix、セクションS6.6）。Actinomyces ...
組成解析と同様に、再構成されたゲノムレベルの配列は、同じ宿主属に由来する配列とクラスター化する傾向があるが、宿主の系統を密接に反映していない（図4およびSI Appendix、図S11、S12）。全体として、ゴリラとチンパンジーから再構築されたゲノムレベルの配列は、チンパンジーとホモの配列よりも互いに近い位置にあることがわかった。このパターンには、現代人由来の微生物参照ゲノムを用いたことによるバイアスもあるが、ゴリラとチンパンジーの進化における縄張りの重複による微生物交換も一因である可能性がある。ホモの中では、ネアンデルタール人は一貫してグループ化されており、種内の微生物多様性が共有されていることがわかる。しかし、イベリア半島のエル・ミロンで見つかった後期旧石器時代の個体（18.6 ka）は、アフリカ後期石器時代の他の更新世狩猟採集民や最近の完新世のヨーロッパまたはアフリカ集団ではなく、すべての木でネアンデルタール人とクラスターを作っていることにも注目される。最近発表されたこの個体を含むヒトゲノムデータから、この個体に関連する遺伝的祖先成分は、後氷期の温暖化の中で14Ka以降にヨーロッパ全域に大きく移動したことが明らかになった(24, 60)。我々の低カバレッジのメタゲノム・データセットに着目し、ヨーロッパの後旧石器時代および中石器時代の集団をさらに評価したところ（SI Appendix、セクションS6.6）、（低解像度ではあるが）同様のパターンを示し、14 ka以前の個体の口腔分類はほとんどがネアンデルタール人に、14 ka以降のものはほとんどが現在の現代人に集まっていることがわかった（24, 60）。このパターンは、エル・ミロンから復元された口腔細菌ゲノムが、中・後期旧石器時代にヨーロッパに存在したホモの常在微生物多様性を反映していることを示唆している。口腔内細菌叢は主に介護者を通じて遺伝するため（61, 62）、旧石器時代のヨーロッパおよびアジアの歯石をさらに採取して超深度配列を決定すれば、古代の人々と現代の人々の間で十分に理解されていない相互作用の力学について情報を得られる可能性がある。

口腔バイオフィルムのヒト特有の変化は、食事で摂取できるデンプン量と関連している。微生物群集の代謝能は、その総遺伝子量から推測され、分類学だけでは理解できないバイオフィルムの生態と機能に関する洞察を提供することができます。ヒトの口腔内バイオフィルムの代謝的・機能的な差異をより明確にするため、大規模シークエンスデータセットの保存状態の良いサンプルから得られた歯石メタゲノムの遺伝子量を、機能分類の異なる2つの手法、HUMAnN2（63）およびAADDER（64）を用いて比較し、全体の結果に中程度の一致を見いだしました。タンパク質レベルの機能分類の主成分分析（PCA）では、宿主と機能内容の間に高い分離度があり、宿主属を明確にクラスタリングした（図5AおよびSI Appendix、図S13、S14）。一方、分類学的PCoAでは、中程度の分離度しか観察されず（図1B）、ホミニドが共有する分類群の遺伝子内容は、分類学の割り当てよりも宿主固有であると考えられ、他の微生物システムにも見られるパターンである(65). ヒトと霊長類の分離を促す遺伝子は一貫して糖質処理に関連し（SI付録、図S14）、ヒトではより豊富で、大部分がStreptococcusに由来する（SI付録、図S13）、これは霊長類の腸内細菌群でも観察されることである（66）。そこで、生化学的特性と遺伝的近縁性に基づく分類システムを用いて、サンプル全体のStreptococcusの分布を調べた（図5B）(67)。その結果、ホモではMitis、Sanguinis、Salivariusグループに属するStreptococcus属が優勢であるのに対し、チンパンジーではこれらのグループは事実上存在せず、非ヒト霊長類全般ではAnginosus、Mutans、PyogenicグループのStreptococcus属の割合が非常に高いことがわかった（Fig. 5B）。
Fig.
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アフリカのヒト科動物の口腔マイクロバイオームには、代謝機能とストレプトコッカス・アミラーゼ結合遺伝子の含有量に違いがある。(A) 微生物遺伝子機能のPCA（SEED分類）により、保存状態の良い試料を宿主属ごとにクラスタリングした（PERMANOVA R2 = 0.345）。ホモ ...
Mitis、Sanguinis、Salivariusの各グループは、アミラーゼ結合タンパク質を発現して唾液中のɑ-アミラーゼを捕捉し（68、69）、それを食事中のデンプンから自身の栄養摂取に利用したり、歯の接着に利用する（70、71）ことが特徴的である。アミラーゼ結合タンパク質遺伝子（例えばabpAとabpB）は相同性を持たず、むしろ収斂進化によって同様の表現型を付与し、口腔内のStreptococcus属にほぼ限定して見出されている(68)。α-アミラーゼは現代人の唾液中に最も多く含まれる酵素であり、現代人は他のどのヒト科の動物よりも高いレベルでこれを発現している(50, 72)。他のほとんどの非ヒト霊長類とは対照的に、現代人は高い唾液中の%-アミラーゼ（AMY1）コピー数の変動を示し、その範囲は最大30二倍体コピーまでと報告されている（16, 73, 74）。このコピー数の拡大は、中期更新世にネアンデルタール人と分岐した後、現代人の系統に沿って起こったと推定されている（75, 76）。この増加は、現代人の進化史における食生活の変化、特にデンプンを多く含む食品への依存度の上昇と関係があると主張されている(20, 21)。

次に、深層配列データセット中の全連鎖球菌のリードと比較して、abpAとabpBの配列にアライメントするリードの比率を計算した。その結果、abpAとabpBのリードは非ヒト群ではほとんど存在しないが、ホモでは広く存在し、有意に多いことがわかった（Mann-Whitney U test Homo vs non-Homo: abpB, α = 0.05, U = 128, P = < 0.001, 95% CI = 0.686 to 0.851; abpA, α = 0.05, U = 112, P = < 0.001, 95% CI = 0.398 to 0.861 ）。特に、abpBは深く配列が決定されたすべてのホモ個体に存在し、abpAは現代人に特に多く存在する（図5C）。このことは、口腔内連鎖球菌が宿主の食生活の変化と関連して進化したことを示唆しており、ホモの進化においてデンプンを多く含む食物が早期に重要であったことを裏付けている。

考察
口腔マイクロバイオームの共存微生物は、宿主の進化的・生態的差異に関する独立した情報源として、十分に活用されていない（15, 77）。微生物は、宿主よりも世代数が桁違いに短く、遠縁のグループ間で遺伝子の水平伝播により新しい機能を獲得することができるため、人類の進化を理解する上で特にダイナミックで時間的に解決されたシステムであると言える。我々は、100万年前までの保存状態の良い歯石試料の同定、汚染除去、真正性確認を厳格に行い、アフリカのヒト科霊長類の口腔微生物群から、ホエザルとも共通する10属のコアグループを同定しました。40Mya(33,34)。今日、これらのコア分類群は、主に歯垢バイオフィルムの構造的支持に関与しており、その研究は、ヒトの祖先のマイクロバイオームにおけるバイオフィルムの成長と成熟を理解する上で有望である（78,79）。このような分類群の役割を明らかにすることは、歯や歯周病で見られるような異種バイオフィルムの長期的な治療、予防、制御を成功させるために重要である(80)。

さらに、ホモの口腔マイクロバイオームには27の属が存在し、その中には、Streptococcus、P. gingivalis、T. forsythia、T. denticolaなど、よく知られ、臨床的に関連する分類群も多く含まれています。唯一、Veillonella parvulaは、虫歯菌Streptococcus mutans（81）と相乗的な関係を持つことが知られている常在菌で、主にヒトに生息している。驚くべきことに、ホモの口腔マイクロバイオームの中心的な構成員すべてがよく知られているわけではなく、3種は属名がなく、数種は種名がない。これは口腔微生物学研究における大きなギャップであり、これらの微生物の培養や増殖の難しさにも一部関係している。

私たちは、ホモの口腔微生物群の進化に着目し、100年前のネアンデルタール人と30年前の現代人の口腔メタゲノムを復元し、微生物群構造に高い類似性を見出すとともに、主要分類群に株レベルの違いがあることも明らかにしました。興味深いことに、ネアンデルタール人に関連する菌株レベルの配列変異は、後期旧石器時代のヨーロッパ人には一貫して存在するが、それ以降には存在しないことがわかった。これは、14 ka前後に報告されている現代人のゲノムターンオーバー（24、60）と一致するものである。ヒトと霊長類の比較から、レンサ球菌のうちアミラーゼ結合型は、ホモの口腔バイオフィルムにおいて中心的な役割を果たしており、歯列に定着する能力が高いことと、食事のデンプンを独占的に摂取できることが、その理由である可能性が高いことが明らかになった。これらのStreptococcusグループとabpBはホモの一般的な特徴であり、おそらく調理によって改良されたデンプンを多く含む食品（SI Appendix, section S5.8） が、ネアンデルタール人と現代人の系統が600 ka以上分岐する前のホモ進化の初期に初めて重要になったことを示唆する（82、83）。この発見は、ホモ関連脳形成のエネルギー論に影響を与える可能性を秘めている（19-21、26）。その後、現代人ゲノムにおけるAMY1のコピー数拡大と口腔内連鎖球菌におけるabpAの増加は、現代人がデンプンを多く含む食品にさらに依存するようになったことを示唆しているのかもしれない。

abpA、abpB、およびその他のアミラーゼ結合タンパク質の進化について、系統的再構成や人口動態モデリングなどの研究をさらに進めることで、バイオフィルム形成やホモの食生活変化の性質と時期に関する疑問がより明確になると期待される。さらに、アフリカ以外のヒト科（オランウータン）およびカタユウレイボヤ科、特に唾液アミラーゼの発現量が多い、あるいは特異的であるジェラダやハマドリアヒヒ（73、84、85）のようなcercopitheceneに関する今後の研究により、生息地や食性の変化に応じた霊長類の口腔マイクロバイオームの多様な進化の軌跡に関するさらなる知見が得られる可能性があります。さらに、ヒト科の口腔内バイオフィルムにおいて高度に保存され、重要な構造的分類群の多くは、研究が不十分であり、正式な名称さえないため、中核となる属に関するさらなる研究が緊急に必要であることは明白である。さらに、ヒトの系統におけるマイクロバイオームの進化と適応を理解するためには、種内ゲノムの多様性に焦点を当てた今後の配列決定プロジェクトが不可欠となる。本研究は、現代人のマイクロバイオームの進化的研究を野生霊長類および古代ホモのメタゲノム・データと統合することで、ヒト口腔マイクロバイオームの祖先の状態、微生物-宿主関係の性質、現代人とネアンデルタール人の進化における主要な出来事について貴重な知見が得られることを実証している。

材料と方法
材料 我々のサンプリング戦略は、宿主属と現代人の生活様式グループ（Alouattaを除く）ごとに、少なくとも5個体からなる独立した2つの集団から歯石を採取することを目的とした（SI Appendix, Table S1 and Dataset S1）。歯石は、20世紀の野生Alouatta（A. palliata）、Gorilla（G. berengei beringei; G. berengei graueri; G. gorilla gorilla）、および Pan（P.troglodytes）の遺骨からサンプリングされました。troglodytes schweinfurthii; P. troglodytes ellioti; P. troglodytes verus）、および考古学的ネアンデルタール人と現代人から、確立したプロトコル（DOI: 10.17504/protocols.io.7, 10.1750/protocols.ios.7）を用いて採取しました。 vrhn56 および 10.17504/protocols.io.7hphj5n). 現代人の歯垢データは多数公開されているが、歯石とは直接比較できないことが示されている(23)ため、現代人の歯石データを作成した。本研究は、オクラホマ大学のInstitutional Review Board for Human Research Participant Protection（IRB番号4543）によって承認された。すべてのサンプルは、インフォームド・コンセントのもと、歯科医による定期的な歯のクリーニングの際に採取された。サンプルの背景の説明と倫理的承認の追加情報については、SI Appendix の S2.1 項を参照されたい。
ラボラトリーメソッド すべての博物館・野外調査所サンプルについて、専用のクリーンルーム施設において、劣化・断片化したDNAの回収に最適化したプロトコルを用いてDNA抽出を行った(86)。現生の石器は、以前に記述したように抽出した（23）。すべてのサンプルについて、DNAをデュアルインデックスのイルミナライブラリー（87）に構築し、ショットガンシーケンスを行った。さらに、サンプルのサブセットを別途UDG処理（88）に供し、その後ディープシーケンスを行った。ネガティブコントロールは、すべての抽出およびライブラリー構築バッチに含まれていた。配列決定は、Illumina NextSeq. 500またはHiSeq. 4000プラットフォームで行った。詳細については、SI Appendix、セクションS2.2-S2.4およびDOI: 10.17504/protocols.io.bq7wmzpe下のprotocols.ioを参照されたい。
データ処理と品質フィルタリング。前処理と解析手順の詳細な説明（コードを含む）については、SI Appendixと外部データリポジトリ（GitHubリポジトリ：https://github.com/jfy133/Hominid_Calculus_Microbiome_Evolution; Archive DOI: 10.5281/zenodo.3740493）を参照してください。先行研究による古代（13）および現代の歯石（23）の追加データは、それぞれOnline Ancient Genome Repository (OAGR) (https://www.oagr.org.au/) およびEuropean Bioinformatics Institute (EBI) European Nucleotide Archive (ENA) (https://www.ebi.ac.uk/ena/) データベースからダウンロードした。また、現代の現代人のマイクロバイオームと環境由来の比較メタゲノムについては、National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (SRA) データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) から追加でダウンロードした。すべてのFASTQファイルのアクセッション番号とダウンロード方法は、SI AppendixのS3.1節に記載されている。EAGERパイプライン（89）を用いてシーケンスデータの初期前処理を行い、分類学的プロファイリングを妨害する可能性のある現代人のDNA配列を（微生物参照ゲノムにおける現在の現代人のDNA汚染に起因して）除去した。aDNAのマッピングパラメータにはrelaxed bwa aln (90) (-n 0.01) を用い、複製サンプルおよびライブラリから得られた非ヒトのリードを個体ごとに連結した。ヒトにマッピングされた配列は、マッピング統計の報告前にポリGクリップされた。処理統計はSI AppendixのS3.2節に記載されています。
分類学的ビニングと保存性評価 分類学的ビニングのために、我々は、NCBI ntデータベース（2017年10月；DOI：10.5281/zenodo.4382154の下でZenodoにアップロード）およびカスタムNCBI RefSeqデータベース（細菌、古細菌、およびホモサピエンス含む、2018年10月、SI Appendix、セクションS3.3）とともにaDNA最適高解像度アライナーMALT（27，91）を用い、85％のリラックスしたパーセント同一パラメータおよび0.01％のベーステールカットオフ（「最低支援」）を採用した。結果のRMA6ファイルをMEGAN6 CE（64）にロードし、原核生物のOperational Taxonomic Unit（OTU）テーブルをエクスポートした（データセットS2）。2つのデータベースの比較はSI AppendixのS3.3節に記載されている。古代マイクロバイオーム研究における低保存と汚染という課題を考慮し、UDG処理をしていないデータセットから保存状態の悪いサンプルと汚染OTUをスクリーニングして除去する多段階手順を実施した（SI Appendix、図S2）。口腔マイクロバイオームのシグネチャーが弱い歯石試料を同定するための可視化を開発した（SI Appendix、図S3）。この手順では、同定された分類群を以前に報告された分離源と比較し、これらの分類群を最も多いものから少ないものへとランク付けし、このランクに沿って口腔内分類群の累積割合を追跡します（ここでは「崩壊」と呼んでいます）。曲線変動の安定化に基づく最初の「バーンイン」の後、口腔内分類群の割合が低いサンプルは、下流の分析から除外されました。詳細はSI Appendix, S3.4項を参照。この方法を、EAGERを用いてショットガンデータからフィルタリングした16Sマップリード（比較現代人・環境メタゲノムがソース）を用い、QIIMEを用いて閉参照クラスタリングを行ったSourceTracker（28）を用いた結果（92）と比較し、両者の間に一致を認めた（SI Appendix、図S3）。次に、Rパッケージのdecontam（29）を用いて、推定される実験室および環境汚染物質（陰性コントロールおよび一連の考古学的骨サンプルに存在するもの-SI Appendix、セクションS3.6）を統計的に検出し、下流解析の前にこれらを除去した。残りのOTUを認証するために、MaltExtract（93）の出力をMaltExtract-Interactive Plotting App（MEx-IPA）ツール（DOI: 10.5281/zenodo.3380011） で利用した。これは、シトシン→チミン付加、短い断片長、参照からの編集距離といった特徴あるaDNAパターンを迅速に可視化するために我々が開発したものだ（SI Appendix, 図 S4 および S3.5 章）。EAGERでよく知られた口腔内分類群にマッピングした後、DamageProfiler（図1C）を用いてDNA損傷パターンも検証した（94）。
微生物組成の解析 低存在量の環境汚染物質や偽ヒットを除去するため、最小存在量カットオフを、属レベルのアライメントでは0.07％、種レベルの同定では0.04％とした（SI Appendix、図S7およびS8、セクション5.2）。存在量フィルタリングされたOTUテーブルの系統的等対数比変換（95）によりプロファイルを正規化し、得られたユークリッド距離に対してPCoAを実行した（SI Appendix 図S5 CおよびD、SI Appendix、セクションS4.1）。宿主属クラスターを統計的に検証するために、Rパッケージveganのadonis関数を使用し、不等間隔のサンプルサイズから制御した後にPERMANOVA（35）分析を行った（SI Appendix、セクションS4.2）。保存状態の悪いサンプルを除去した結果，口腔内コミュニティは宿主属ごとに明確なセントロイドを示した（bootstrapped PERMANOVA, ɑ = 0.05, P = 0.001, pseudo-F = 5.23, R2 = 0.28 ）；Alouattaはサンプル数が少ないため除外した．中心対数比変換したOTU表のユークリッド距離に対してブートストラップ階層型クラスタリング（96）を行い、結果をヒートマップの形で可視化した（図3、SI AppendixセクションS4.3）。サンプルとタクソンのクラスタリングはMcQuitty階層型クラスタリングアルゴリズムで行い、ヒートマップ内のタクソンブロックは目視により選択した。サンプルのクラスタのブートストラップ値は、Rパッケージpvclust (96)を用いて推定した。種の酸素耐性メタデータは、BacDiveデータベース（97）からBacDiveR Rパッケージ（DOI: 10.5281/zenodo.1308060）を介して取得した。ヒートマップで得られた観察結果の検証のため、グループ化指標分析（98）も行った（SI Appendix、セクションS4.4）。時間、地理、食生活などの変数によるヒト口腔内マイクロバイオームのクラスタリングは、PCoA、PERMANOVA、階層的クラスタリングを用いて評価した（SI Appendix, Section S4）。
コアマイクロバイオーム解析。保存状態の良いサンプルの汚染物質フィルター済みOTU表を使用して、最小支持閾値以上のすべての分類群を存在／非存在プロファイルに変換した。集団の中核と見なされるためには、その集団のメンバーの少なくとも半分（50%）に分類群が存在する必要があり、宿主グループの中核と見なされるためには、集団の少なくとも2/3（66%）に存在する必要がありました（SI Appendix、図S9、パラメータ実験の詳細についてはSI Appendix、セクションS5.2参照）。次に、UpSetプロット（99）を作成して、各宿主グループの微生物交雑を種および属レベルで可視化し（図2 AおよびB）、また両データベース間で結果を比較した。コア属から一般的な土壌属Mycobacteriumを除外したことに関するさらなる考察は、SI AppendixのS5.2節に記載されています。より少ないサンプルサイズによる結果の検証は、ブートストラップ分析によって行われた。これは、各宿主属からランダムにサブサンプリング（置換あり）した個体を、コア計算手順を1,000回の複製に再実行することによって行われた（SI Appendix、セクションS5.3）。ヒト歯垢の公表されている蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）画像に基づいて、ヒト口腔内マイクロバイオームのコア図（図2C）を作成した（8, 100）。これらの出版物で分析されていない種/属については、免疫組織化学、免疫蛍光、またはFISHに基づく歯垢内の局在の証拠を見つけるために文献検索を行った（SI Appendix、セクションS5.1およびS5.4）。ヒトのコアマイクロバイオームの全メンバーを示し、他のアフリカのヒト科動物やホエザルとも共有しているものを含んでいる。詳細については、SI Appendix, S5.3項を参照。
ゲノム解析。EAGERを用いて、深配列化したUDG処理データセットと現代人由来の4サンプル（Alouatta, 3; Gorilla, 3; Pan, 4; Neanderthal, 3; ancient modern human, 6; present-day modern human, 4; total: 23）をTannerella forsythiaとPorphyromonas gingivalisの参照ゲノムに対してマップ（詳細後述）した（SI Appendix, Section S5.5）. この2つの分類群について、bedtools（101）を用いて、既知の病原性因子のセットの広さと深さのカバー率を計算した。保存配列のクロスマッピングなどによる偽アラインメントのリスクを減らすため、カバー率の幅が70％未満である遺伝子、および／またはゲノムの残りの部分と比較してカバー率の深さが強く異なっていると思われる遺伝子を除外した（詳細はSI Appendix、セクションS5.5を参照）。得られた遺伝子は、比較のためにヒートマップとして可視化した（SI Appendix、図S9）。浅い配列のデータセットからすべての種レベルのStreptococcusのアライメントを最小サポートフィルターNCBI nt-MALT OTUテーブルから選択し、文献（67）に基づき8つの種グループのいずれかに割り当てた（グループの定義はSI Appendix、S5.6項を参照）。次に、各サンプルのすべての分類学的アラインメントに対する各生物種のグループのアラインメントの割合を計算した（図5B）。さらに、この結果を検証するために、166の連鎖球菌ゲノムのスーパーリファレンスに対する深配列データセットのマッピングに基づいて、同様の比率を計算した（下記参照）。panX（102）を用いてスーパーリファレンスからabpAおよびabpB様遺伝子の座標を同定し、これらのアノテーションにマッピングされたリードの数を抽出し、すべてのStreptococcusスーパーリファレンスにマッピングされたリードに対するこれらのリードの割合を計算した。次に、マン・ホイットニーのU検定を適用して、ホモと非ヒト霊長類の比率の分布に差がないという帰無仮説を検定するとともに、これらの結果をランダムにシャッフルした100のグループ割り当てのP値の分布と比較した（詳細はSI Appendix、S5.7項を参照）。abpAとabpBの参照配列はRefSeqのStreptococcusゲノムから抽出し、マッピングのためにインデックスを作成した。すべてのシャローシークエンスデータセットサンプルは、すべての参照株に対してマッピングされた。1×で少なくとも40%の遺伝子カバレッジを持つサンプルについては、コンセンサス配列をIntegrative Genome Viewer (IGV) からエクスポートした(103)。コンセンサス配列とリファレンスの入力ファイルをBEAUTiで作成し、BEAST2 (104)を実行してベイズスカイラインプロット解析に使用した。詳細は、SI Appendix, S5.9 節を参照。
微生物系統学。まず、同定されたコアタクサの属単位のスーパーリファレンスに対して競合マッピング戦略を試みたが（参考SI Appendix, セクションS6.1およびS6.2）、このアプローチでは限られた結果しか得られなかった（SI Appendix 図S10およびセクションS6.3）。そこで、代わりに、同じデータセットを各属の単一の代表ゲノムにマッピングし、関連する分類群の集団を代表しているとみなして系統樹の再構築を行いました。低カバレッジの古代データの課題を考慮し、MultiVCFAnalyzerを用いてSNPをコールし、各SNPコールは最低2×カバレッジとリードの70%以上のサポートを必要とした（SI Appendix、セクションS6.5）。1,000SNP未満のサンプルは削除し、JC69モデルに基づいてペアワイズ距離を計算した（105）。Rパッケージape (106)のブートストラップ近傍結合アルゴリズムを100反復で距離行列に適用した（SI Appendix, section S6.6）。樹木は ggtree (107)で可視化した。最後に、基底となる内部ノードがブートストラップ支持率70%以上である木を保持した（SI Appendix, 図S11）。次に、同じ手順を、本文で上述した追加サンプルを含む浅い配列のデータセットに適用した（SI Appendix、図S12）。14 ka以前の個体が参照バイアスのためにネアンデルタール人とクラスター化したかどうかを検証するために、すべての現代人個体間のペアワイズ比較の中央値のヒストグラムに対して、EMN001とネアンデルタール人で共有されていたポジション数の中央値を計算した（SI Appendix、セクションS6.6）。
機能的・代謝的パスウェイ解析。我々は、踵骨メタゲノムの機能プロファイルを特徴付けるために、2つのアプローチをとった。まず、HUMANn2（63）［MetaPhlAn2（108）が生成した分類プロファイルを使用］を使用して、UniRef90（109）およびChocoPhlAn（2018年7月）（63）データベースに基づいて機能プロファイルを生成しました。保存は、パスウェイの豊富さとKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）オーソログ機能プロファイル、SI Appendix、セクションS7.1について独立して評価された。パスウェイの存在量（n = 94）およびPCAを用いてKEGGオルソログに変換した遺伝子ファミリー（n = 109）を用いて、保存状態の良い結節の機能プロファイルを宿主グループ間で比較した（SI Appendix、図S13）。最も強いローディングを持つオルソログをバイプロットで可視化し（SI Appendix, 図S13 A-C）、これらのオルソログが由来する種を決定した（SI Appendix, 図S13 B-D）。また、特定のパスウェイ（糖質、アミノ酸、脂質）のオーソログのみを用いたPCAにおける宿主属のクラスタリングも検討した（SI Appendix, Fig.S10 A-C）。詳細は、SI Appendix, S7.1.4項を参照。次に、AADDER（MEGAN6 CEに含まれる）（64）を用いて、MALT（上記参照）でアライメントしたカスタムRefSeqデータベースに存在するアノテーションへのアライメント数をプロファイリングした。次に、MEGAN6 を使用して、SEED カテゴリ (110) プロファイルをエクスポートしました。保存性は、SEEDタンパク質機能プロファイルについて独立して評価した（参考SI Appendix、セクションS7.2）。よく保存された結石（n = 95）の機能プロファイルを、高次パスウェイではなくタンパク質を用いて宿主グループ間で比較した（SI Appendix、図S13）。最も負荷の強いタンパク質をバイプロットで可視化し（SI Appendix, Fig. S13 E-G）、これらのタンパク質が由来する種を決定した（SI Appendix, Fig. S13 F-H）。また、特定のパスウェイ（糖質、アミノ酸、脂質）のタンパク質のみを用いたPCAにおける宿主属のクラスタリングについても検討した（SI Appendix, Fig.S14 D-F）。詳細は、SI Appendix, S7.2.3 節を参照。
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謝辞
エチオピア文化遺産研究保存局（ARCCH）、Museu de Prehistòria de València、Burgos MuseumのMarta Negra、Naturmuseum SenckenbergのOttmar Kullmer、 Cleveland Museum of Natural HistoryのLyman Jellema、Madelas Rainforest ConservancyのReneé Molina、Ometepe Biological Field Station、 Daniela C. Daniela、Emman Kalthoff、Sweden Museum of Natural HistoryのEmman C. Daniela、Dr. Kalthoff、王立中央アフリカ博物館の Emmanuel Gilissen、ベルギー王立自然科学研究所の Tom Geerinckx と Patrick Semal、国立考古学・文化財研究所（INSAP）の Abdeljalil Bouzouggar には考古学と博物館収蔵に協力いただいた。キバレ国立公園のチンパンジーを対象とした研究を許可してくれたウガンダ野生生物局に感謝する。Miriam Carbo Toran、Alicia Hernández Fuster、Juan Bautista Rodriguez Martinez、Eros Chavesによる現生計算機サンプリング支援に感謝する。Rigney 1の下顎を最初に調査してくれたDominique Henry-Gambier (University of Bordeaux I)博士に感謝する。Dawn Mulhern博士とJaelle Brealeyには、非ヒト霊長類の試料について相談にのっていただき、感謝します。Rachel Carmodyには、初期の草稿に対する示唆をいただいた。Alex Hübnerにはデータ解析に関する助言をいただいた。Zandra Fagernäs, Richard Hagan, Maria Spyrou, Antje Wissgottには研究室での追加的な支援に謝意を表する。デ・ナダレ洞窟での調査は、文化省-西ヴェネト州考古学監督局、Soprintendenza Archeologia, belle Arti e Paesaggio per le Provincie di Verona, Rovigo e Vicenza (SABAP) および Zovencedo Municipality の支援によるプロジェクトの枠内で Ferrara 大学が調整し、 H. Obermaier Society、地元の私企業（ RAASM および Saf）および地元スポンサーが資金を提供する形で行われたものである。カレバ財団は、タフォラルトの石灰のサンプリングが実施された発掘調査と研究を支援しました。このプロジェクトは、米国国立科学財団（NSF）からの助成金（C.W. と C.M.L. に BSC-1516633; K.W.A., M.C.C., J.W.A. に BSC-1027607; R.W.W. に SBR-0416125 ）、米国国立衛生研究所（NIH）（2R01 GM089886 を C.M.L., C.W..., C.S..., and K.S.; R37DE016937 and R01DE024468 to F.E.D.), European Research Council (ERC) (ERC-STG 677576 "HARVEST" to A.G.H.; ERC-CG 617627 "ADaPt" to J.T.S.), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR 2237 to K.H..; EXC 2051-3907), the Douche Dresden (ERC) (ERC) (HARVEST to K.H.), DFG (ERC) (ERC) (F.D.E.S., F.H.C, K.H.) ; EXC 2051-390713860 to C.W.）、南アフリカ国立研究財団（NRF 115257 and 12081 to V.E.G.）、カナダ自然科学・工学研究会議（RGPIN-2017-04702 and RGPIN-2019-04113 to M.R.,）、カナダ国立研究財団（RGPIN-2017-04702 and RGPIN-2019-04113 to M.R.）。 )、チェコ国立機関支援(RVO 68081758 to S.S.)、セルビア共和国文化情報省および教育科学技術開発省(177023 to D.M.)、Junta de Castilla y León (BU028A09 to J. C.D.F-L.）、スウェーデン研究評議会Formas（2016-00835 and 2019-00275 to K.G.）、南フロリダ大学、オクラホマ大学、Werner Siemens Foundation（Paleobiotechnology to C.W）、マックスプランク 協会。この研究で示された意見、発見、結論はすべて著者のものであり、必ずしも助成機関の見解を反映するものではありません。

脚注
著者らは競合する利害関係を宣言しない。

本論文はPNAS Direct Submissionである。R.R.D.は編集委員会から招聘されたゲストエディターである。

本論文は、https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.2021655118/-/DCSupplemental のオンラインサポート情報を含んでいます。

データの利用可能性
新たに生成されたすべてのシーケンスデータは、プロジェクト・アクセッションID PRJEB34569でENAリポジトリ（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home）に寄託されています。Rノートブック、バイオインフォマティクススクリプト、補足図、中間解析ファイルは、GitHub (http://github.com/jfy133/Hominid_Calculus_Microbiome_Evolution) でホストされている外部データレポジトリで提供され、ZenodoでDOI: 10.5281/zenodo.3740493の下にアーカイブ化されています。

変更履歴
2021年5月12日。著者行を更新しました。

論文情報
Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 May 18; 118(20): e2021655118.
2021年5月10日オンライン公開 doi: 10.1073/pnas.2021655118.
PMCID：PMC8157933
PMID：33972424
人類学
James A. Fellows Yates,corresponding author a , b , 1 Irina M. Velsko, a Franziska Aron, a Cosimo Posth, a , c Courtney A. Hofman, d , e Rita M. Austin, d , e , f Cody E. Parker, a , g Allison E. Mann, h Kathrin Nägele, a Kathryn Weedman Arthur, i John W. Arthur, i Catherine C. Bauer, j Isabelle Crevecoeur, k Christophe Cupillard, l, m Matthew C. Curtis, n Love Dalén, o , p Marta Díaz-Zorita Bonilla, q , r J. Carlos Díez Fernández-Lomana, s Dorothée G. Drucker, t Elena Escribano Escrivá, u Michael Francken, v Victoria E. Gibbon, w Manuel R. González Morales, x Ana Grande Mateu, y Katerina Harvati, t , z , aa Amanda G. Henry, ab Louise Humphrey, ac Mario Menéndez, ad Dušan Mihailović, ae Marco Peresani, af , ag Sofía Rodríguez Moroder, ah Mirjana Roksandic, ai Hélène Rougier, aj Sandra Sázelová, ak Jay T. Stock, al , am , an Lawrence Guy Straus, ao Jiří Svoboda, ak , ap Barbara Teßmann, aq, ar Michael J. Walker, as Robert C. Power, b , at Cecil M. Lewis, d Krithivasan Sankaranarayan, au Katerina Guschanski, av , aw , ba Richard W. Wrangham, ax Floyd E. Dewhirst, ay , az Domingo C. Salazar-García, at , bb , bc , bd Johannes Krause, a , be Alexander Herbig, a and Christina Warinnercorresponding Author a , d , bf, 1
aマックス・プランク人類史科学研究所考古遺伝学部門，07745 イエナ，ドイツ。
bルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン校（ドイツ、80539）先史・原始考古学およびローマ帝国考古学研究所。
cエバーハルト・カールス大学考古学研究所、72070テュービンゲン、ドイツ。
dオクラホマ大学人類学部、ノーマン、OK、73019。
eLaboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019（オクラホマ大学分子人類学およびマイクロバイオーム研究室
fオスロ大学自然史博物館、0562オスロ、ノルウェー。
gアリゾナ州立大学人類進化・社会変動学部、Tempe、AZ 85287。
hDepartment of Microbiology, Immunology and Genetics（ノーステキサス大学ヘルスサイエンスセンター微生物学・免疫学・遺伝学部門）, University of North Texas Health Science Center（Fort Worth, TX, 76107）;
iDepartment of Anthropology, University of South Florida, St.Petersburg, FL, 33701;
jEberhard Karls University of Tübingen, 72074 Tübingen, Germany, Department of Geosciences, Palaeobiology, Biogeology;
kDe la Préhistoire à l'Actuel: 文化・環境・人類学（PACEA）, CNRS UMR 5199, Université de Bordeaux, 33615 Pessac, France;
lLaboratoire Chronoenvironnement, CNRS UMR 6249, 25030 Besançon, France;
mService Régional d'Archéologie de Bourgogne-Franche-Comté, Direction Régionale des Affaires Culturelles (DRAC) Bourgogne-Franche-Comté, 25043 Besançon, France;
nカリフォルニア州立大学チャネルアイランド校人類学プログラム、カマリロ、カリフォルニア州、93012。
oCentre for Palaeogenetics, 10691 Stockholm, Sweden;
pDepartment of Bioinformatics and Genetics, Swedish Museum of Natural History, 10405 Stockholm, Sweden;
qInstitut für Ur- und Frühgeschichte und Archäologie des Mittelalters, Eberhard Karls University of Tübingen, 72074 Tübingen, Germany;
rSonderforschungsbereiche 1070 Ressourcen Kulturen、Eberhard Karls University of Tübingen、72074 Tübingen、Germany。
sPrehistoria, Departamento de Historia, Geografía y Comunicación, Universidad de Burgos, 09001 Burgos, Spain;
tSenckenberg Centre for Human Evolution and Palaeoenviroment, Eberhard Karls University of Tübingen, 72074 Tübingen, Germany;
uEscribano Escrivá Clínica Dental, 38003 Santa Cruz de Tenerife, Spain;
vLandesamt für Denkmalpflege im Regierungspräsidium Stuttgart, 78467 Konstanz, Germany;
wDivision of Clinical Anatomy and Biological Anthropology, Department of Human Biology, University of Cape Town, Cape Town 7925, South Africa;
xInstituto Internacional de Investigaciones Prehistóricas de Cantabria, Universidad de Cantabria-Gobierno de Cantabria-Banco, 39071 Santander, Spain;
yClínica Dental Grande Mateu, 46004 València, Spain;
z古人類学、考古科学研究所、エバーハルト・カールス大学、72070 テュービンゲン、ドイツ。
aaDeutsche Forschungsgemeinschaft Centre for Advanced Studies "Words, Bones, Genes, Tools," Eberhard Karls University of Tübingen, 72070 Tübingen, Germany;
ライデン大学考古学学部、2333CC ライデン、オランダ。
acCentre for Human Evolution Research, The Natural History Museum, London SW7 5BD, United Kingdom;
adDepartamento de Prehistòria y Arqueología, Universidad Nacional de Educación, 28040 Madrid, Spain;
aeDepartment of Archaeology, Faculty of Philosophy, University of Belgrade, 11000 Belgrade, Serbia;
afフェラーラ大学人文学部、44121フェラーラ、イタリア。
ag国立研究評議会環境地質学・地球工学研究所、ミラノ、ロンバルディア、20126、イタリア。
ahClínica Alboraya 10, 46010 València, Spain;
aiウィニペグ大学人類学部、ウィニペグ、MB R3T 3C7、カナダ。
カリフォルニア州立大学ノースリッジ校人類学部（91330
akチェコ科学アカデミー・ブルノ考古学研究所、60200ブルノ、チェコ共和国。
alDepartment of Anthropology, Western University, London, ON N6A 5C2, Canada;
amDepartment of Archaeology, Max Planck Institute for the Science of Human History, 07745 Jena, Germany;
anMcDonald Institute for Archaeological Research, University of Cambridge, Cambridge CB2 3ER, United Kingdom（マクドナルド考古学研究所、ケンブリッジ大学、英国）。
aoDepartment of Anthropology, University of New Mexico, Albuquerque, NM, 87131;
apマサリク大学人類学部、61137ブルノ、チェコ共和国。
aqMuseum für Vor- und Frühgeschichte Berlin, Stiftung Preussischer Kulturbesitz, 10117 Berlin, Germany;
arBerliner Gesellschaft für Anthropologie, Ethnologie und Urgeschichte, 10117 Berlin, Germany（ベルリン人類学・民族学・歴史学研究所）。
asDepartamento de Zoología y Antropología Física, Universidad de Murcia, 30100 Murcia, Spain;
マックス・プランク進化人類学研究所人類進化学部門、04103ライプチヒ、ドイツ。
auオクラホマ大学微生物・植物生物学部、ノーマン、OK、73019。
av動物生態学、ウプサラ大学生態学・遺伝学部門、75236ウプサラ、スウェーデン。
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ayDepartment of Microbiology, The Forsyth Institute, Cambridge, MA, 02142（フォーサイス研究所・微生物学部門）。
az口腔医学・感染・免疫、ハーバード大学歯科医学部、MA、Boston、02115。
baInstitute of Evolutionary Biology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, Edinburgh EH9 3FL, United Kingdom;
bbGrupo de Investigación en Prehistòria IT-1223-19 (Universidad del País Vasco-Euskal Herriko Unibertsitatea), Ikerbasque, Basque Foundation for Science, 01006 Vitoria-Gasteiz、Spain。
bcDepartament de Prehistòria, Historia i Arqueología, Universitat de València, 46010 València, Spain;
bdケープタウン大学地質科学科、ロンデボッシュ7701、南アフリカ共和国。
beDepartment of Archaeogenetics, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology, 04103 Leipzig, Germany;
bfハーバード大学人類学科，マサチューセッツ州ケンブリッジ，02138
corresponding authorCorresponding author.
1宛先はこちら。電子メール：ed.gpm.hhs@swollef または ed.gpm.hhs@renniraw.
編集：Robert R. Dunn, North Carolina State University, Raleigh, NC, and accepted by Editorial Board Member James F. O'Connell March 22, 2021 (received for review October 16, 2020)
著者による寄稿。J.A.F.Y., I.M.V., C.A.H., C.M.L., K.S., J.K., A.H., and C.W. designed research; J.K., A.H., and C.W. codirected research; J.A.F.Y., I.M.V., F.A., C.P., C.A.H.., R.M.A., C.E.P., A.E.M., K.N., K.W.A., J.W.A., C.C.B., I.C., C.C., M.C.C., L.D., M.D.-Z.B., J.C.D.F.L., D.G.D., E.E.e., M.F., V.E.g., M.R.g.m., A.g.m., K.H.., a.g.h., l.h., m.m., d.m., m.p., s.r.m., m.r., h.r., s.s., j.t.s., l.g.s., j.s., b.t., m.j.w., r.c.p., c.m.l., k.s., k.g., r.w.w, d.c.s. -g.である。とC.W.が研究を行い、J.A.F.Y.が新しい試薬/分析ツールを提供し、J.A.F.Y., I.M.V., F.E.D., A.H., and C.W. がデータを分析し、J.A.F.Y., I.M.V., and C.W. は論文を書きました。

Copyright © 2021 the Author(s). PNASにより発行されました。
このオープンアクセス論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示-非営利-改変禁止ライセンス 4.0 (CC BY-NC-ND) の下で配布されています。
Ben-Dor et al.への返信」をご覧ください。Volume 118, e2112526118 の「ネアンデルタール人と現代人の口腔内細菌はデンプン適応の証拠を示している」。
letter "Human oral microbiome cannot predict Pleistocene starch dietary level, and dietary glucose consumption is not essential for brain growth" in volume 118, e2110764118 をご覧ください。
Volume 118, eiti2021118 の「In This Issue」を参照。
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americaの記事は、National Academy of Sciencesの好意によりここに提供されます。
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