糞便微生物叢移植は大腸癌の進行を抑制する： 腸内細菌ディスバイオシスの回復による抗がん免疫応答の増強
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ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. Microbiol.、2023年4月18日
第2部 微生物共生
第14巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1126808
この記事は、「研究テーマ」の一部です。
微生物叢と宿主粘膜のクロストーク：粘膜の発達・機能不全・疾患への影響
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糞便微生物叢移植は大腸癌の進行を抑制する： 腸内細菌ディスバイオシスの回復による抗がん免疫応答の増強
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1126808/full
Hao Yu1,2,3†, Xing-Xiu Li1†, Xing Han1,2,3, Bin-Xin Chen1, Xing-Hua Zhang1,2,3, Shan Gao4, Dan-Qi Xu1,2,3, Yao Wang1,2、 3, Zhan-Kui Gao1,2,3, Lei Yu5, Song-Ling Zhu1,2, Li-Chen Yao1, Gui-Rong Liu1,2,3*, Shu-Lin Liu1,2,3,6* and Xiao-Qin Mu1,2,3*.
1中国ハルビン医科大学薬学院ゲノム研究センター（黒龍江省腸内細菌叢・薬理ゲノム重点実験室）（中国ハルビン市
2中国黒龍江省ハルビン市、ハルビン医科大学、感染症・ゲノムセンター
3黒龍江省医学院中国北部トランスレーショナル医学研究協力センター（中国黒龍江省ハルビン市
4ハルビン医科大学第二附属病院病理部（中国黒龍江省ハルビン市
5ハルビン医科大学第二付属病院大腸肛門外科（中国黒龍江省ハルビン市
6カナダ・カルガリー大学微生物学・免疫学・感染症学部
大腸がん（CRC）と腸内細菌異常症との関連は、多くの証拠によって証明されている。最近の報告では、微生物叢と宿主の恒常性を維持することがCRC患者にとって有益である可能性が示唆されているが、その基礎となるメカニズムは依然として不明である。本研究では、腸内細菌叢異常のCRCマウスモデルを確立し、CRCの進行に対する便内細菌叢移植（FMT）の効果を評価しました。アゾメタンとデキストラン硫酸ナトリウムを用いて、マウスにCRCと微生物異常症を誘発させた。健康なマウスの腸内細菌を浣腸によりCRCマウスに移植した。CRCマウスの大きく乱れた腸内細菌叢は、FMTによって大きく回復した。正常マウスの腸内細菌叢は、がん病巣の直径と数を測定することで評価されるがんの進行を効果的に抑制し、CRCマウスの生存期間を有意に延長しました。FMTを受けたマウスの腸内では、CD8+ TやCD49b+ NKなどの免疫細胞が大量に浸潤しており、がん細胞を直接死滅させることができた。さらに、CRCマウスで見られた免疫抑制細胞であるFoxp3+ Treg細胞の蓄積は、FMT後に大きく減少した。さらに、FMTはCRCマウスの炎症性サイトカインの発現を制御し、IL1a、IL6、IL12a、IL12b、IL17aの低下とIL10の上昇を示した。これらのサイトカインは、Azospirillum_sp._47_25、Clostridium_sensu_stricto_1、大腸菌群、Akkermansia、Turicibacterと正の相関があり、Muribaculum、Anaeroplasma、Candidatus_Arthromitus、 Candidatus Saccharimonasとは負の相関があった。さらに、TGFb、STAT3の発現抑制とTNFa、IFNg、CXCR4の発現上昇は、ともに抗がん作用を促進した。これらの発現は、Odoribacter、Lachnospiraceae-UCG-006、Desulfovibrioと正の相関があり、Alloprevotella、Ruminococcaceae UCG-014, Ruminiclostridium, Prevotellaceae UCG-001, Oscillibacterとは負の相関があった。本研究により、FMTは腸内微生物の乱れを回復させ、過剰な腸内炎症を改善し、抗がん免疫反応に協力することでCRCの発症を抑制することが示されました。
はじめに
大腸がん（CRC）の治療法として、外科手術による組織の切除、化学療法や放射線療法によるがん細胞の破壊・抑制などの従来の方法は、患者の延命を図ることはできても、その間に正常な組織や器官、特に免疫系を損傷することが避けられず、患者は感染症や新たな悪性腫瘍に対してさらに弱くなることがしばしばあります。さらに、化学療法や放射線療法はしばしば耐性を誘発する。このような状況は、着実に増加する罹患率と相まって、CRCの治療に対する新しい治療戦略を求めています。
過去数十年にわたり、ヒトの腸内には微生物と宿主の恒常性が存在し、免疫系と協力して病気、特に感染症や悪性腫瘍を防いでいることを示す証拠が増えています。感染症などの自然現象だけでなく、抗菌薬の乱用や不健康な食事など、物理化学的または生物学的な要因によってこのような恒常性が乱されると、がんや他の多くの疾患と関連することがわかっています（Ansaldo et al., 2021; Pan et al., 2021; Sepich-Poore et al.） そのため、がん治療のために微生物-宿主の恒常性を回復させる糞便微生物叢移植（FMT）に研究関心が高まっています。しかし、乱れた腸内細菌叢や回復した腸内細菌叢がCRCの発症にどのように影響するかは、依然として不明である。
ヒトの腸内には、平均質量1.5kg、細胞数1014個以上の数千種類の細菌が生息しています。これらの多様な微生物は動的なバランスを保ち、微生物-宿主のホメオスタシスの安定に重要な役割を担っている。しかし、腸内細菌叢の系統構成や集団構造は、CRC患者と健常者の間で大きく異なっている（Cheng et al.、2020）。CRC患者では、Porphyromonas、Enterococcus、Streptococcus、またはPeptostreptococcusなど、存在量の増加を示す細菌があり、逆にRoseburiaやLachnospiraceae科の他の酪酸産生細菌など、存在量の減少を示す細菌もあった（Alhinai et al., 2019）。これらの微生物相のうち、CRC患者では発がん性細菌が報告されています。例えば、Streptococcus bovis biotype Iの細菌は、大腸腺腫やCRCと関連することが知られている：腸管上皮細胞に侵入し、その間に免疫系の監視を逃れることがある（Agnes et al.、2021）。その他、CRC関連菌として、pks遺伝子島を保有する大腸菌（Liu et al., 2021）、DNA損傷を引き起こす毒素を分泌するBacteroides fragilis（Alhinai et al., 2019; Cao et al., 2021）などが報告されています。一方、CRCに対して保護的な役割を果たす腸内細菌も報告されており、Lactobacillus plantarum YYC-3（Yue et al., 2020）、Lactobacillus acidophilus（Li S. et al., 2019）などは、宿主が生成しない有益な代謝産物を生成している。また、化学療法（5-fluorouracil/oxaliplatin）は、Firmicutes/Bacteroidetesの相対存在比を著しく増加させ、腸内細菌叢の大きな乱れを誘発する（Chang et al.、2020）。標的治療（ベバシズマブ／セツキシマブ）で部分奏効した患者の腸内細菌叢は、進行性疾患群よりも有意に高いα多様性を示すが、全体の腸内細菌叢はまだ乱れている（Chen et al.、2022）。腸内細菌叢の変化はグリセロリン脂質の代謝経路に影響を与え、それによってMSS型CRC腫瘍担癌マウスにおける免疫療法（PD-1抗体）の治療能力を調節する（Xu et al., 2020）。これらの知見を総合すると、CRCなどの悪性腫瘍に対する防御・予防には、健康な腸内細菌叢が重要であることが強く示唆されます。
我々は、化学的に腸内細菌異常症とCRCを誘導し、健康マウスからCRCマウスへのFMTを実施し、腸内細菌の変化とCRC発症の関連性を評価した結果、FMTにより腸内細菌異常症を回復させ、腸内炎症や免疫反応のレベルを調節することで、CRCマウスの重症度を緩和し生存率を有意に向上させることを明らかにしました。材料と方法
2.1. CRCマウスモデル
8週齢の雄Balb/cマウスをBeijing Vital River Lab（中国・北京）から購入し、SPF実験動物センターで1週間馴化した（Suzuki et al.、2006）。実験1週目に、マウスに発がん性物質のアゾキシメタン（AOM、10 mg/kg、Sigma）を腹腔内注射した。2週目には、炎症促進剤であるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS, 2.5%, MP Biomedicals）を含む水をマウスに自由に飲ませた。3週目と4週目には、DSSを含まない飲料水をマウスに与えた。このような2週目から4週目までの処置をさらに2サイクル繰り返し（図1A）、先に述べたようにCRCマウスモデルを確立した（Neufert et al.、2007）。マウスは3つの実験群にランダムに割り当てられ、1ケージあたり4匹、各群で5ケージとした。本研究は、ハルビン医科大学の倫理委員会（HMUIRB20180013）により承認されました。
図1
図1. CRCの進行に対するFMTの抑制効果。(A) 実験手順のタイムライン。(B）正常対照マウス（Ctl）、大腸がんモデルマウス（CRC）、陰性対照としてPBSを投与したCRCマウス（PBS）、便中微生物移植（FMT）を受けたCRCマウスなど、各実験群の腸内組織の写真である。(C-E）各群の平均数、がん巣の直径、腸管組織の長さを示した。*p < 0.05 (Ctl, n = 20; CRC, n = 11; PBS, n = 12; FMT, n = 16). (F,G）各週におけるマウスの平均体重と生存率である。*p < 0.05 (Ctl, n = 20; CRC, n = 11; PBS, n = 12; FMT, n = 16). (H) 腸管組織のHE染色。(I）赤色蛍光の強度で示した腸内のスーパーオキシドの産生。**p < 0.01, n = 3.
2.2. 糞便微生物叢の移植
FMT用の糞便サンプルは、健康で無処置かつ年齢が一致したBalb/cドナーマウスから新鮮に採取した。採取した糞便サンプルをPBS（200mg/ml）中で十分に混合し、1,500rpmで1分間遠心分離を行った。その後、上清を移植のために分離した。各レシピエントマウスは、1mlの微生物溶液を3日に1回、9週間にわたって浣腸で投与された。FMTのネガティブコントロールとして、同量のPBSの浣腸を行った。
2.3. HE染色
大腸組織のパラフィン切片をヘマトキシリンで2分間、エオシンで1分間染色した。エタノールとキシレンでそれぞれ脱水とヒアリン化を行った後、組織を中性樹脂で封入し、画像化した。
2.4. ジヒドロエチジウム染色によるスーパーオキシドの検出
RPMI 1640培地（HyClone）で解剖したばかりの大腸組織を、暗所で30μMのジヒドロエチジウム（DHE、Invitrogen）で5分間、室温で染色した。その後、組織を洗浄し、直ちにレーザー走査型共焦点顕微鏡で420/590 nmで撮像した。DHEは細胞質で青色蛍光を呈した。それが酸化され、DNAとインターカレートすると、細胞核の蛍光は明るい蛍光赤色に変化した。相対的な赤色蛍光強度は、蛍光顕微鏡解析システム（オリンパス社製）で解析した。
2.5. 腸内細菌叢の全長16S rDNAのハイスループット配列決定とバイオインフォマティクス解析
移植液が腸内細菌叢の解析に悪影響を与えないよう、FMT全計画終了後、1週間無処置でマウスを飼育した。その後、マウスを清潔なケージに移し、新鮮な糞便サンプルの採取を行った。1ケージあたり2本の糞便を採取し、同じ実験グループの異なるケージから5〜6本の糞便を腸内細菌叢のハイスループットシーケンス（GENEWIZ、蘇州、中国）に使用した。16S rDNAの全長の取得には、遺伝子リードの長さが長く、精度が高いという利点があるPacBioシーケンシングプラットフォームが採用された。したがって、解析用データには、各実験グループで5～6個の複製が含まれ、NCBIに提出された（PRJNA606977）。微生物の多様性は、類似度97％の代表的なOTUの配列に基づいて解析した。
2.6. 免疫細胞の免疫組織化学的検出
パラフィン切片は、それぞれキシレンで脱脂し、エタノールで再水和した。抗原賦活は、電子レンジで高出力2分、低出力10分行い、その後室温まで冷却した。内因性ペルオキシダーゼの活性は、3％H2O2で10分間クエンチした。組織ブロッキングはヤギ血清で室温で1時間行った。次に、組織切片を、Tリンパ球（CD3、ARG52744、Arigo）、ヘルパーTリンパ球（CD4、ab183685、Abcam）に対する一次抗体とともに4℃で一晩中インキュベートした、 細胞傷害性Tリンパ球（CD8、ab217344、Abcam）、Tregリンパ球（FOXP3、GB11093、Servicebio）、ナチュラルキラー細胞（CD49b、AGR57601）、またはマクロファージ（F4/80、ARG22476、Arigo）。その後、試料をホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（1：500）と37℃で1時間インキュベートした。発色は、DABペルオキシダーゼ基質キット（ZSGB-BIO）を用いて、製造者の指示に従い行った。切片は最後にエタノールとキシレンで脱水し、中性樹脂で封をした。顕微鏡で記録した画像信号をImage Jでデジタル信号に変換し、陽性マーカーの分布と染色強度を解析した。
2.7. マウスがん炎症・免疫クロストークPCRアレイ
CRCマウスの腸管炎症反応に対する腸内細菌叢の影響を探るため、Mouse Cancer Inflammation & Immunity Crosstalk RT2 Profiler PCR Array（QIAGEN）により炎症と免疫の細胞メディエーターをコードする遺伝子の発現を検出しました。その遺伝子は以下の通りである： Ackr3、Aicda、Bcl2、Bcl2l1、Ccl2、Ccl20、Ccl22、Ccl28、Ccl4、Ccl5、Ccr1、Ccr10、Ccr2、Ccr4、Ccr5、Ccr7、Ccr9、Cd274、Csf1、Csf2、Csf3、Ctla4．Cxcl1、Cxcl10、Cxcl11、Cxcl12、Cxcl2、Cxcl5、Cxcl9、Cxcr1、Cxcr2、Cxcr3、Cxcr4、Cxcr5、Egf、Egfr、Fasl、Foxp3、Gbp2b Gzma、Gzmb H2-D1、 H2-K1、Hif1a、Ido1、Ifng、IGF1、Il10、Il12a、Il12b、Il13、Il15、Il17a、Il1a、Il1b、Il1r1、Il2、Il22、Il23a、Il4、Il5、Il6、Irf1、Kitl、 Mif、Myc、Myd88、Nfkb1、Nos2、Pdcd1、Ptgs2、Spp1、Stat1、Stat3、Tgfb1、Tlr2、Tlr3、Tlr4、Tlr7、Tlr9、Tnf、Tnfsf10、Trp53、Vegfa。
2.8. ウェスタンブロット
各サンプルの組織タンパク質を5×SDS-PAGEローディングバッファーで変性させ、12%トリスグリシンアガロースゲルで電気泳動した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、5%脱脂乳で室温で2時間ブロッキングした。次に、IFNg（ARG21502、Arigo）、IL1a（ARG56667、Arigo）、IL6（ARG56625、Arigo）、IL12a（bs-0767R、Bios）、IL12b（bs-10641R）に関する一次抗体を用いて膜を4℃でオーバーナイトでインキュベートした、 Bioss）、IL17a（ARG55256、Arigo）、TNFa（ARG10158、Arigo）、IL10（ARG21475、Arigo）、TGFb（ARG10002、Arigo）、CXCR4（ARG54674、Arigo）、STAT3（ARG54150、Arigo）およびTubulin（AC015、Ablonal）。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（AS028, AS014, Abclonal; bs-0296G-HRP, Bioss）を用いて室温で2時間インキュベートした。バンド強度は、Tanon-5200およびTanon MPで測定した。
2.9. 統計解析
統計解析はStudent-Newman-Keuls-q testおよびLog-rank testにより行い、統計比較はGraphpad Prism v5により行った。 すべてのデータは平均±SDで表した。統計的有意性を示すために、p＜0.05の両側値をとった。結果
3.1. FMTはCRCマウスのがん巣の肥大化を抑制し、生存期間を延長させる
大腸がんマウスモデルの作成と腸内細菌叢移植の実施スケジュールを図1Aに示す。CRCマウスの腸内には、平均17.6個、平均直径4.4mmという多数のがん巣が観察されたが、FMTを受け入れたCRCマウスでは、平均9.8個、平均直径2.3mmに減少した（図1B-D）。また、CRCマウスでは、炎症性癒着と上皮過形成によって引き起こされる腸管組織の短縮という典型的な特徴が見られたが、FMTは腸管組織の短縮を有意に抑制した（図1E）。FMTの有無にかかわらず、CRCマウスでは、細胞の異形成や過形成を伴う腸管陰窩の乱れが明確に観察された（図1F）。体重の減少は、CRCの大きな特徴である。その結果、CRCマウスの体重は、同じ給餌時点において、正常対照群のマウスに比べて有意に減少し、実験終了時には4.5gもの差があった。しかし、この差はFMTの処理によって減少した（図1G）。FMTで処理したCRCマウスの生存期間は、5週目から著しく延長した。実験終了時には、この値はFMTの処置によって55％（11/20）から80％（16/20）へと上昇した（図1H）。スーパーオキシドは、がん細胞が急速に分裂する際に大量に生成され、発がんを大きく促進する。CRCマウスでは、クリプト周辺の明るいDHE蛍光で示されるように、コントロール群のマウスと比較して腸内でスーパーオキシドの放出が著しく増加していたのに対し、FMTを受け入れたCRCマウスでは、薄赤色蛍光で示されるように、放出が著しく減少していた（図1I）。
3.2. FMTはCRCマウスの腸内細菌叢のディスバイオシスを逆転させる
合計291,444個の遺伝子リードが得られ、品質フィルターで処理した結果、サンプルあたり平均12,301リード、3,589OTUが得られた。腸内細菌叢は、15門、23類、31目、60科、148属、203種に分類された。正常対照マウスと比較して、CRCマウスでは腸内細菌叢の存在量が、それぞれ系統、科、属、種のレベルで有意に変化していた（図2A-D）。また、アノシム解析により、CRC群とコントロール群のマウスの間で、微生物の多様性が統計的に異なることが示された（図2E,F）。FMTによる治療によって、CRCマウスの微生物量と多様性は、シャノン指数解析で示されるように、いずれも有意に改善された（図2G）。CRCマウスの微生物叢の系統構造も正常マウスとは大きく異なっていたが、FMTによりCRCマウスの微生物構造は正常対照マウスのそれへと変化した（図2H,I）。CRCマウスと比較して、PBS処理マウスは腸内細菌叢の存在量、多様性、系統構造に有意な改善を認めなかった。
図2
図2. FMTはCRCマウスの腸内微生物の存在量と多様性を回復させた。門（A）、科（B）、属（C）、種（D）を含む異なる分類における腸内細菌叢の分布。(E,F) サンプル間のアノシム解析。R値が1に近いほど、グループ間の差がグループ内の差よりも大きいことを示す。p < 0.05 (Ctl, n = 5; CRC, n = 6; FMT, n = 6). (G）シャノン指数分析は、微生物の豊かさと均等性の両方を含む、腸内細菌叢の多様性を反映します。**p < 0.01、（Ctl、n = 5; PBS、n = 6; CRC、n = 6; FMT、n = 6）. (H,I) 門と属のレベルでそれぞれ重み付けしたユニフラック分析。(J) 受信動作特性曲線は、感度と特異度の連続変数を反映する。曲線下の面積値が1になりやすいことから、腸内細菌がCRCマウスのマーカーとして考慮できることがわかる。(K) LefSe解析により、各群の代表的な細菌を特定した。
16秒rDNA配列データから、腸内細菌の分類は概ね属レベルで正確であることがわかった。属レベルで見ると、正常対照群のマウスでは、Lactobacillus（9.19%）、Alistipes（3.69%）、Alloprevotella（4.99%）、Ruminiclostridium（1.50%）、Saccharimonas（1.11%）、Oscillibacter（0.55%）、Roseburia（0.47%）、Muribaculum（0。 45%）、Anaeroplasma（0.44%）、Arthromitus（0.27%）、そしてMuribaculaceae（25.53%）、Lachnospiraceae（20.52%）、Prevotellaceae（7.51%）、Ruminococcaceae（4.55%）、Erysipelotrichaceae （0.18 ）の属はCRCマウスでは有意に減少していました。FMT後、これらの分類群のほとんどは増加し、正常値に近づいた。一方、CRCマウスでは、一部の細菌が腸内細菌叢の大きな割合を占め、Akkermansia（40.72%）、Bacteroides（13.83%）、E. coli complex（9. 79%）、Clostridium（0.60%）、Turicibacter（0.54%）、Azospirillum（0.29%）、Paeniclostridium（0.20%）、Mucispirillum（0.16%）、Parabacteroides（0.15%）、Erysipelatoclostridium （0. 14%）、Rikenellaceae属（0.41%）のうち、受信者動作特性曲線解析によりCRCマウスのマーカーとみなされたのは、Akkermansia、Escherichia-Shigella、Rikenellaceae RC9-gut-group, Clostridium_sensu_stricto_1, Parabacteroides, Turicibacterの一部（図2C、J）。これらの優勢な分類群の割合は、FMT処理後に著しく減少した。また、PacBioプラットフォームでより長い遺伝子配列を検出することで、より正確に細菌を種レベルで分類できる利点を活かし、対照群のマウスでは、Lactobacillus murinus（0.24%）、Bacteroides acidifaciens（0.12%）、Lactobacillus reuter（0.77%）、 Azospirillum sp.-47 など90種を得た。 -25（0.02%）、Clostridium sp.-Clone-27（0.42%）であり、これらの遺伝子配列を含む菌株は現在のデータベースに含まれていないため、正式な種レベルでの分類のために113の分類群（OTU）が残されている。特に、正常マウスやFMT治療マウスではコロニー形成されない細菌が、CRCマウスではClostridium_perfringens（0.20%）、Escherichia_coli_DEC14A（0.06%）、Odoribacter_sp. _N54.MGS-14（0.02%） および Escherichia_coli_TOP291（0.02%; Figure 2D） などとして検出されています。
CRCマウスの微生物障害はほぼ回復しているが、FMTにより腸内でコロニー形成が困難な腸内細菌が残っており、それはLefSe解析により明らかになったAlloprevotella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lachnospiraceae_UCG-001、Marvinbryantia、Eubacterium-xylanophilumグループである（図2K）。これらの細菌を分離・培養し、複数回の移植を行い、コロニー形成の確率を高めることが必要である。
3.3. FMTは腸内の免疫細胞のリクルートに影響を与え、CRCに対する免疫応答が増強される
腸管免疫細胞は、不透過性バリアとして外部環境と身体を隔てている腸管上皮に位置しています。このため、腸管免疫細胞は腸管細胞に直接接触し、腸管内腔に存在する抗原に近接している。腸内細菌叢の異常は、腸内の免疫細胞の異常な動員を介し、免疫障害を引き起こす可能性がある。腸内細菌叢異常のあるCRCマウスでは、CD3ラベル陽性細胞で示されるように、ほぼすべてのT細胞の浸潤が有意に増加し、強固な免疫応答を示すことがわかりました。これらの増加した腫瘍浸潤リンパ球には、CD4+ T細胞、Foxp3+ Treg細胞が含まれています。適応免疫に加えて、自然免疫も関与しており、F4/80+マクロファージとCD49b+NK細胞の集積の上昇として明らかになった。興味深いことに、FMTを投与したCRCマウスでは、CD8+ T細胞の濃縮、CD4+ T細胞、CD49b+ NK細胞の凝集が観察され、Foxp3+ Treg細胞、F4/80+ マクロファージの集団が減少し、抗がん作用が増強されたことが示された（図3）。
図3
図3. FMTは免疫細胞を介した抗がん作用を増強した。陽性細胞の細胞膜と細胞質は茶色に染色されていた。顕微鏡写真走査システム（Zeiss）を用いて、Ctl、CRC、PBSおよびFMT群のマウスの腸管組織切片の画像を、それぞれ記録した。免疫組織化学的に染色されたすべての標本の平均光学密度を、Image Jシステムで解析した。*p < 0.05, **p < 0.01, n = 3.
3.4. FMTはCRC微小環境中のサイトカイン発現に影響を与え、CRCに対する免疫応答を増強する。
腸管腫瘍の発生に伴い、腸内細菌は変化した上皮を通過し、免疫細胞の動員を刺激してサイトカインを放出する。CRCの微小環境におけるこれらの分子は、微生物と宿主のホメオスタシスを示す敏感な指標となる。本研究では、CRCマウスの腸内に濃縮された数十の遺伝子を同定した。炎症促進因子Ifng, Il1a, Il6, Il12a, Il12b, Il17a, Tnf、免疫抑制因子Il13とTgfb1； 酵素調節因子Gzma、ケモカインおよびインターロイキンレセプターCcr5、Cxcr3、Cxcr4、その他のサイトカインSpp1、Tnfsf10、toll様レセプターTlr3、転写因子Foxp3、およびStat3です。FMTの投与により、Il1a、Il6、Il12a、Il12b、Il17a、Tgfb1、Cxcr4、Spp1、Foxp3、Stat3の発現が抑制され、Tnf、IL10、Ccr5の発現が増大するなど、一部の分子の遺伝子発現が大きく変化していた（図4A）。
図4
図4. FMTはCRC微小環境におけるサイトカインの発現を制御し、抗炎症および抗がん作用を増強することがわかった。(A) CRC微小環境におけるサイトカインのPCRアレイ解析。(B）遺伝子チップでスクリーニングした発現量の異なるサイトカインのタンパク質画像。炎症性サイトカインIL1a、IL6、IL12a、IL12b、IL17a、IL10と抗がん免疫制御因子TGFb、STAT3、TNFa、IFNg、CXCR4の相対タンパク質発現量を示す。*p < 0.05, n = 3. (C) 炎症性サイトカインと抗がん免疫分子に関連する腸内細菌の存在量。*p < 0.05, Ctl vs. CRC, +p < 0.05, CRC vs PBS, #p < 0.05, PBS vs FMT, n = 6. (D) 腸内細菌叢とサイトカインとの相関解析結果. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n = 3.
これらの遺伝子の発現差は、さらにタンパク質レベルでも確認された。正常対照マウスと比較して、CRCマウスではIL1a、IL6、IL12a、IL12b、IL17a、TGFb、STAT3、TNFa、IFNg、CXCR4のタンパク質発現が著しく上昇し、血便や嗜眠などの激しい炎症反応や、がん遺伝子の転写が活性化した。興味深いことに、FMTを受けたマウスでは、これらのタンパク質の発現が著しく変化し、炎症性因子IL1a、IL6、IL12a、IL12b、IL17aが低下、抗炎症因子IL10が上昇し、腸の炎症が明らかに抑制された。さらに、成長因子TGFb、転写因子STAT3の発現抑制とTNFa、IFNg、CXCR4の発現上昇は、共に抗がん作用を促進した（図4B）。
炎症性因子IL1a、IL6、IL12a、IL12b、IL17a、成長因子TGFb、転写因子STAT3の発現は、Azospirillum sp.-47-25, Clostridium sensu stricto-1, Escherichia-Shigella, Akkermansia, Turicibacter, Bacteroides, Mucispirillum, Rikenellaceae RC9_gut_group およびErysipelatoclostridiumと正相関した。その結果、TGFbおよびSTAT3の発現は、炎症に関連する腸内細菌によって影響を受け、炎症環境とこれらの微生物との相互作用が発がんプロセスを促進する可能性があることが示されました。従って、これらの微生物は、抗炎症および抗癌のターゲットとなる可能性が高い。一方、Ruminococcaceae UCG-014, Ruminiclostridium_9, Muribaculum, Anaeroplasma, Candidatus_Arthromitus, Candidatus_Saccharimonasとは発現が負の相関を示し、大腸炎やCRC治療のためのマイクロエコロジー薬剤として開発できる可能性を示している。また、PBS処理マウスにおけるMuribaculumとCandidatus_Arthromitusの存在量は、CRCマウスよりも比較的多く、これらは腸内でコロニー形成しやすく、PBS洗浄によりコロニー形成のためのスペースが広くなる。そのため、PBS処理マウスではIL12bやTGFbのタンパク質発現が低下している可能性がある。さらに、TNFa、IFNg、CXCR4といったがん細胞を直接死滅させるサイトカインの発現は、Odoribacter、Lachnospiraceae UCG-006、Desulfovibrioと正の相関があり、Aloprevotella、Ruminiclostridium、Prebotellaceae UCG-001、Oscillibacter、Lachnospiraceae NK4A136とは負の相関があることがわかった。これらの腸内細菌は、マイクロエコロジー剤や抗がん剤ターゲットとして開発される可能性も示している（図4C,D）。考察
宿主の生理的および病理的状態における重要な制御要素として、腸内細菌叢が極めて重要な役割を果たすことを支持するエビデンスが増えてきている。我々は、悪性疾患と腸内細菌叢異常の関連性（Zhuang et al., 2019）、低大腸菌遺伝的多様性と悪性腫瘍の相関（Tang et al., 2020）、食事性リグナンによる腸内細菌叢改善による腸悪性腫瘍の治療成功（Wu H. et al., 2021）を報告している。今回、我々はこれまでの知見を実験的に検証し、正常な腸内細菌叢のCRCに対する強力な活性を示す実験的証拠を提供しました。我々の結果は、このような抗がん作用が、腸内細菌と宿主の免疫応答の協力に基づくことを実証している。
本研究の正常マウスでは、Lactobacillus, Alistipes, Saccharimonas, Alloprevotella, Ruminiclostridium, Oscillibacter, Anaeroplasma, Muribaculum, Arthromitus, Roseburia, Muribaculaceae, Lachnospiraceae, Prevotellaceae, RuminococcaceaeおよびErysipelotrichaceae属などの腸内微生物が優勢を占めている。乳酸菌は、抗酸化物質であるグルタチオンや抗血管新生因子の産生を促すポリアミン成分のダウンレギュレーションを通じて、炎症、DNA損傷、腫瘍負荷を軽減することが報告されています（Kim et al., 2021）。さらに、乳酸菌は、NK細胞、CD8+ T細胞の浸潤およびがん微小環境におけるIFNgの生産を増加させることにより、腫瘍の発生を遅らせる（Lau et al.、2021； Yang et al.、2021）。また、乳酸菌は、血清中の抗炎症因子IL10の過剰産生により、肝障害の治療効果を発揮することが示されている（Lv et al.、2014）。ケモカイン受容体の過剰発現は、T細胞集団の浸潤に関連する。本研究では、FMTを受けたCRCマウスにおいてケモカイン受容体CXCR4が過剰発現しており、一般的に細胞傷害性CD8+T細胞で発現するCXCL12との結合を促進し、CD8+T細胞の著しい浸潤をもたらすことを見いだした。驚くべきことに、ケモカイン受容体は初代がん細胞よりもin vitro培養CRC細胞株の方が発現量が少なく、がん細胞におけるケモカイン受容体の発現が、腸内細菌などのin vitroに存在しない腸内微環境因子によって刺激される可能性を示しています（Cremonesi et al., 2018）。CD8+ T細胞の大量浸潤は、Ruminiclostridium、Prevotellaceae_UCG_001の存在量の減少に加え、Lachnospiraceaeの濃縮を伴い、これは我々の研究結果でも示された（Yu et al, 2020; Jing et al, 2021）。さらに、Helicobacter hepaticusを導入すると、細胞傷害性リンパ球による腫瘍浸潤が増加し、抗腫瘍免疫はCD4+ T細胞とNK細胞に依存する（Overacre-Delgoffe et al.、2021）。LachnospiraceaeとRoseburiaが産生する短鎖脂肪酸は、腸壁の完全性を維持し、がん細胞のアポトーシスを直接誘導するだけでなく、腸内のFFAR2受容体に作用してケモカインの分泌に影響を与え、免疫細胞の分布を変化させる、あるいはTリンパ球に直接作用してその分化、リクルート、活性化、サイトカイン分泌を制御します（Koh et al., 2016; Makki et al., 2018）．また、Lachnospiraceaeの細菌は、腸上皮細胞のタイトジャンクションを強化し、ムチンの産生を増加させることにより、腸のバリアを強化する（Verstrepen et al.、2021）。抑制的なJAK2/STAT3シグナルは、大腸好中球のS100a8/9産生を制限して、腸内微生物の生態と大腸の恒常性を維持することに関与していました（Loh et al.、2021）。さらに、ルミノコックス科の一部の細菌は酢酸を生産し、それをRoseburiaが酪酸に変換する。酪酸は腸管上皮細胞の主なエネルギー源であるだけでなく、炎症性サイトカインのシグナル伝達経路の阻害剤でもあります（Nogal et al.、2021）。In vivoおよびin vitroの研究では、Roseburia intestinalisがIL17の発現を低下させることで抗炎症作用を発揮することが示されました（Zhu et al.、2018）。
本研究のCRCマウスでは、これらの優勢な腸内微生物の存在量が減少し、腸内細菌叢のバランスが著しく損なわれていました。さらに、CD8+ T細胞の浸潤が減少し、腸内のIL10のダウンレギュレーションとIL17、STAT3のアップレギュレーションとともに、炎症を起こしやすく、大腸がんの発生・進展が起こりやすい腸内微環境が形成されています。FMTによるCRCマウス治療では、これらの腸内細菌の存在量が有意に増加し、腸内フローラの乱れが緩和された。また、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD49b+ NK細胞の増加、IFNg、IL10、CXCR4の発現量の増加、IL17、STAT3の発現量の減少が遺伝子レベル、タンパク質レベルからスクリーニングされ、大腸がんの進行を抑制するための微小環境を共同で作り出しています。
逆に、CRCマウスでは、Akkermansia、Bacteroides、E. coli complex、Azospirillum、Mucispirillum、Erysipelatoclostridium、Clostridium、Parabacteroides、Turicibacter、Paeniclostridium、Rikenellaceae属などの腸内細菌が優占していた。Akkermansia muciniphilaは腸管ムチンを分解して腸管粘膜のバリア機能を破壊し、免疫細胞の連続的な刺激を促して腸炎を誘発する（Patel et al.、2022）。バリア機能の破壊は、発がん性細菌が腸管粘膜に接触する頻度を高め、ひいてはがんの発病を促進します。アッカーマンシアのムチン分解物は、TNFa、IFNg、IL10などのシグナルを通じて宿主免疫系を調節する（Li F. et al., 2019）。Bacteroidesは、腸上皮細胞のDNA構造を損傷し、EGFRおよびWnt/β-canteninシグナル伝達経路を活性化することにより、CRC発症を促進します（Caoら、2014；Dossaら、2016）。Bacteroides fragilisは、Foxp3+ Treg細胞の発生を指示し、Tregの抑制能力を高める（Round and Mazmanian, 2010）。エモジン投与によるF4/80+マクロファージの浸潤の減少は、大腸炎に関連した腸腫瘍の発生を抑制する（Zhangら、2021）。また、バクテロイデスは腸内胆汁酸の代謝に関与し、その後マクロファージのTGR5シグナル経路を誘導し、炎症の開始または悪化、アポトーシスのダウンレギュレーションに寄与し、それゆえCRCの発症のための環境を作り出す（Jia et al.、2018）。大腸菌複合体は、マクロファージにおけるCOX2およびPGE2の発現を刺激することにより、がんの進行を促進する（Mola et al.、2020年）。付着性大腸菌および浸潤性大腸菌の持続的な感染は、慢性末梢性炎症を生じさせる（Schmitz et al.、2019）。大腸菌複合体の存在量の変化は、炎症性因子IL6の発現と正の相関がある（Cattaneo et al.、2017）。さらに、炎症状態では、IL12の発現低下は、腸内の微生物転流の減少とともにあり、腸内細菌叢のβ多様性の変化と有意に相関する（O'Connor et al.、2018；Pernomian et al.、2020）。また、クロストリジウム感染症患者の40%までがCRCを患っています。CRC患者では、がん細胞の嫌気性解糖に起因する酸性・低酸素環境がClostridium septicumの胞子発芽を促進し、深刻な感染症を引き起こす（Mohammadi et al.、2022）。そして、CRCの進展に伴い、TGFbは正常な腸管上皮細胞の増殖を抑制するのではなく、増殖促進因子に変化し、悪性化を促進します（Guzinska-Ustymowicz and Kemona, 2005）。クロストリジウム・パーフリンゲンス感染による酸化ストレスは、腸管粘膜の炎症と重度の病理変化を誘発する（Liu et al.、2018）。Turicibacterの相対的な存在量は、炎症性サイトカインIL1と相関することが報告されている（Grant et al.、2021）。FMTを受けたCRCマウスでは、これらの微生物の存在量が有意に減少し、腸内細菌異常症の回復に寄与していた。さらに、Foxp3+ Treg細胞やF4/80+マクロファージの蓄積の減少、TNFa、IFNg、IL10のアップレギュレーション、IL1、IL6、IL12、TGFbのダウンレギュレーション、スーパーオキシドの放出の減少は、腸の炎症とCRC進行を抑制するFMTの役割を説明できると考えられます。
大量の腸内細菌が腸内微小環境の制御に関与していることが判明している。しかし、腸の正常な機能を維持するためには、単一株ではなく、腸内細菌叢の相互作用と動的バランスが重要である。健康な腸内細菌叢を移植する方法として、糞便微生物叢移植が有効であると考えられている。そのためには、個々人の腸内細菌叢の組成や質は大きく異なり、食事や環境、遺伝など多くの要因に影響されるため、「理想的な」腸内細菌叢を選択することが、FMT成功への重要なステップとなる。現在、糞便微生物叢移植の方法として、洗浄微生物叢移植や人工培養式細菌叢がより安全で効果的な方法として開発されています（Wu X. et al., 2021）。さらに、移植の頻度もFMTを成功させるための重要なポイントである。FMTの過程では、菌の接着力やコロニー形成抵抗力が弱いため、一部の菌が剥離し、導入した菌のコロニー形成がうまくいかないことがあります。そのため、複数回の移植が菌のコロニー形成に有効であると考えられる。本研究では、10週間の移植により、腸内細菌叢が安定的にコロニー形成されることが確認されました。しかし、患者のコンプライアンスを考慮すると、微生物が安定的にコロニー形成される最低の頻度と期間時間を追求する必要がある。結論
以上のことから、腸内細菌叢移植は、CRCマウスの腸内細菌異常症を回復させる効果があることが示されました。腸内細菌叢のバランスは、腸の炎症を抑制し、免疫細胞や炎症性サイトカインを介した抗がん免疫応答を高めることで、CRCの進行を緩和する。この結果は、CRCと腸内細菌叢の相互作用を評価し、FMTを臨床治療に応用するための貴重な情報を提供するものである。
データの利用可能性に関する声明
本研究で紹介したデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができます。リポジトリ名とアクセッション番号は、論文・補足資料に記載されています。
倫理に関する声明
動物実験については、ハルビン医科大学のInstitutional Research Boardによる審査と承認を得た。
著者の貢献
XQM、SLL：概念化。HY、XXL、XH、BXC、XHZ、DQX、YW、およびZKG：実験。SG、LY、LCY：方法論とデータ収集。HY、XXL、SLZ：データ解析。XQM、GRL、およびSLL：資金獲得。SLL：監督、執筆、編集。XQMとXXL：原稿の起草。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（NSFC81903631、NSFC81971910、NSFC81871623、NSFC82020108022）、黒龍江大学青年革新基金（UNPYSCT-2018065）、黒龍江省博士研究起動基金（LBH-Q15080）から支援を受けた。
利益相反
著者らは、本研究が、潜在的な利益相反と解釈されうる商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
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キーワード：大腸がん、腸内細菌叢、糞便微生物叢移植、炎症、抗がん作用免疫応答
引用元 Yu H, Li X-X, Han X, Chen B-X, Zhang X-H, Gao S, Xu D-Q, Wang Y, Gao Z-K, Yu L, Zhu S-L, Yao L-C, Liu G-R, Liu S-L and Mu X-Q (2023) 便微生物移植は大腸がん進行を抑制する： 腸内微生物のディスバイオシスを回復させ、抗がん免疫応答を強化する。Front. Microbiol. 14:1126808. doi: 10.3389/fmicb.2023.1126808.
受理された： 2022年12月18日、受理：2023年3月27日；
発行：2023年4月18日
編集者
中国・四川大学 李玉清（りぎょくせい）氏
レビューした人
Madalina Preda, Marius Nasta Institute of Pneumology, ルーマニア
ルーマニア、カロル・ダヴィラ医科薬科大学 Adelina Silvana Gheorghe氏
Copyright © 2023 Yu, Li, Han, Chen, Zhang, Gao, Xu, Wang, Gao, Yu, Zhu, Yao, Liu, Liu and Mu. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。他のフォーラムでの使用、配布、複製は、原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣例に従って許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： Xiao-Qin Mu, muxiaoqin@ems.hrbmu.edu.cn; Shu-Lin Liu, slliu@hrbmu.edu.cn; Gui-Rong Liu, grliu@hrbmu.edu.cn
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