揮発性脂肪酸生産のためのルーメン培養におけるシトラスポマス廃棄物にコロニー形成するルーメン微生物叢の動的変化の特性評価

2023年3月3日 09:45

2023年3月2日
揮発性脂肪酸生産のためのルーメン培養におけるシトラスポマス廃棄物にコロニー形成するルーメン微生物叢の動的変化の特性評価
著者 Shiqiang Yu, Liuxue Li, Huiying Zhao, Yan Tu, Ming Liu, Linshu Jiang https://orcid.org/0000-0002-9076-5749 jlsbua@126.com, Yuchao Zhao https://orcid.org/0000-0001-7489-2134 zhaoyuchao2019@126.comAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/spectrum.03517-22
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スペクトル
オンラインファースト
概要
序論
結果および考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
ABSTRACT
ルーメン微生物は、リグノセルロース系廃棄物をバイオ燃料や工業的に重要な製品に効率的にバイオ変換するための有望な微生物である。シトラスポメイス（CtP）にコロニーを形成するルーメン微生物群集の動的変化を調べることは、ルーメン液によるシトラス加工廃棄物の利用について理解を深めることになる。その結果、総揮発性脂肪酸濃度およびバレレートとイソバレレートの割合は、最初の12時間において経時的に増加した。CtP培養の初期に一次コロニー形成が起こり、微生物は消化しやすい成分の分解や廃棄物の利用のために競ってCtPに付着していることがわかった。16S rRNA遺伝子配列解析の結果、CTPに付着する微生物相の多様性と構造が各時点で明確に異なることがわかった。Fibrobacterota、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Butyrivibrioの存在量の増加は、揮発性脂肪酸濃度の上昇を説明する可能性がある。本研究は、48 時間のルーメン内培養において、シトラスポメイスに定着した代謝活性の高い主要な微生物分類群を明らかにし、CtP のバイオテクノロジーのプロセスを促進するための情報を提供するものであると考えられる。
重要性反芻動物のルーメン生態系は、天然の発酵システムとして植物セルロースを効率的に分解することができ、ルーメン微生物群はセルロースを含むバイオマス廃棄物を利用する嫌気性消化の機会を提供することが示されている。嫌気性発酵中のシトラスポマスに対する原位置の微生物群集の反応に関する知識は、シトラスバイオマス廃棄物の利用に関する現在の理解を深めるのに役立つであろう。その結果、非常に多様なルーメン細菌群集がシトラスポメイスに定着し、48時間の培養期間中に連続的に変化することが明らかとなった。これらの知見は、柑橘類搾りかすの嫌気性発酵効率を向上させるためのルーメン微生物の構築、操作、および濃縮に関する深い理解をもたらすと考えられる。
はじめに
世界的な人口増加に伴い、食品加工に対する需要が高まり、それに伴い廃棄物の発生量も増加した。そのため、食品廃棄物のバイオマス資源の利用がますます注目されている。生ごみの嫌気性消化は、バイオガス生産と固形物削減の消化性能を向上させるために広く研究されている（1, 2）。嫌気性消化では、複雑な嫌気性微生物群が有機廃棄物を揮発性脂肪酸（VFA）と再生可能なエネルギー源であるバイオガスに変換します（3）。柑橘類は、高い経済的価値と薬効を持ち、最も重要で広く消費されている果樹の1つです。柑橘類の廃棄物や副産物は、果物加工産業から毎年大量に排出されている。柑橘類の果汁や精油の生産から得られる主な廃棄物である柑橘類搾汁粕（CtP）は、主にペクチン、セルロース、ヘミセルロース、単糖類を多量に含んでいる（4）。しかし、ほとんどのCtPはリサイクルされたり、付加価値の高い製品に加工されることなく、廃棄物として処理されている(5)。そのため、廃棄物をバイオエネルギー生産に利用し、廃棄物処理による環境への悪影響を最小限に抑えるために、CtPの嫌気性消化が必要とされています。しかし、セルロースがヘミセルロース-ペクチン-リグニンのマトリックスに内包された難溶性構造は、セルロース系バイオマスの利用を妨げる大きな課題として残っている(6)。
反芻動物とルーメン微生物叢（ルーメンに生息する微生物のコミュニティ）は、何百万年もの間、互いに密接に関連しながら進化してきた。ルーメン微生物群は通常、植物バイオマスの発酵において最も複雑かつ効率的な嫌気性微生物生態系のひとつと考えられています（7）。ルーメン微生物は、コーン藁（8）、リッチ藁（9）、コーンストーバー（10）、小麦藁（11）などの様々なリグノセルロース系廃棄物からのバイオ燃料生産に利用されている。これらのリグノセルロース系廃棄物を処理し、液体および気体燃料を効率的に生産するために、前処理、バイオオーグメンテーション、濃縮ルーメン微生物群の利用などの様々な戦略が用いられてきた(12)。また、リグノセルロース消化の際、ルーメン微生物は浸出液などの他の微生物よりもはるかに速くセルロースにコロニー形成することが報告されている（9）。したがって、柑橘類廃棄物バイオマスの嫌気性発酵の際に、ルーメン微生物を効率的な接種物として利用することは魅力的である。
ルーメンは反芻動物の 4 つの胃区画の 1 つであり、ルーメン液は 1010 から 11 cells/mL の細菌、106cells/mL の古細菌、103 から 5 cells/mL の真菌、104 から 6 cells/mL の原虫 (13) からなる複雑な嫌気性微生物生態系を宿しており、これらは植物材料の活用に大きな影響を与える形で相互作用している。古細菌が支配するメタン生成は、継続的な微生物活動を可能にするルーメン内の細菌による植物バイオマス分解の固有の結果である(14)。柑橘類のバイオマスには、セルロースの他に、ポリフェノール、タンニン、フラボノイドなどの植物生理活性化合物が多く含まれている(15)。これらの化合物と微生物の相互作用は、宿主に有益な効果をもたらすだけでなく、メタン生成物質を抑制することができ（16）、ルーメン微生物による CtP 利用に影響を及ぼすと考えられている。
現在、利用可能な嫌気性消化リアクターは、動物のルーメンに比べてはるかに効果が低い(17)。反芻動物におけるリグノセルロース消化メカニズムを深く理解することは、工業的に重要な酵素（セルラーゼ、ヘミセルロース、リグニナーゼ）、バイオ燃料（バイオ水素、バイオガス）、VFA (17) などの生産といった様々なバイオテクノロジー応用に貴重な示唆を与える可能性がある。ルーメン液を接種源とする研究の多くは、嫌気性消化器におけるバイオマス発酵中の液相に伴うルーメン微生物の動的変化に着目している（8, 18）。しかし、液相細菌は全微生物中の20〜30％を占めるに過ぎないことが報告されている(19)。したがって、in situ発酵中のルーメン固相菌を研究することは、CtPを分解するための優勢微生物の動的変化の理解に大いに役立つと思われる。本研究では、乳牛のルーメン内で CtP に付着している微生物の 16S rRNA 配列解析を行い、CtP 分解と VFA 産出に寄与する主要な微生物を同定することを試みた。
結果および考察
発酵パラメータ。
ルーメンは、実質的にセルロース分解のための嫌気性発酵槽である。48 時間の in situ 培養における発酵特性の動態を表 1 に示す。ルーメン液のpHは、発酵プロセスを評価するための重要な指標である。1時間後の値と比較して、その後の時点では、pHは数値的に低下していたが、有意な低下は見られなかった。ルーメン液 pH の低下は、通常、総 VFA 濃度の上昇と関連している可能性がある (20)。リグノセルロース系材料がルーメン微生物によって分解されると、VFA が生成される (21)。予想通り、総 VFA 濃度は CtP 発酵によって有意に増加し（P < 0.05）、8 時間から 24 時間で最大値を示し、24 時間から 48 時間で有意に減少した（P < 0.05）。植物性リグノセルロース材料をルーメンのマイクロバイオーム用の VFA に変換する能力は、宿主反芻動物の栄養にとって非常に重要であり、これらの代謝物は宿主の血流に容易に吸収され、主栄養源として同化する (21). TVFA の生成と消失にはダイナミックなバランスが存在するため、ルーメン内の TVFA 濃度が生成量を反映することはほとんどないと認識することが重要である（22）。本研究では、TVFA 濃度の増加は、ルーメン生物が CtP を発酵させて VFA を蓄積させる可能性があることを示唆した。酢酸、プロピオン酸、酪酸およびイソ酪酸の割合には、各時点で有意な差は見られなかった（P > 0.05）。しかし、バレレートとイソバレレートの割合は 1 時間から 8 時間まで増加した。分枝鎖 VFA はルーメン内の繊維分解微生物のほとんどに必要である（23）。したがって、イソバレートの増加は、セルロース分解菌の増殖に有利に働く可能性がある。
表 1
表 1 シトラスポメスを 48 時間ルーメンで培養した際のルーメン発酵パラメータの変化-c
項目時間 SEM P値
1 時間 2 時間 4 時間 8 時間 12 時間 24 時間 48 時間
pH 6.34 6.09 6.11 6.15 6.14 6.27 6.07 0.272 0.943
TVFAd, mmol/L 106.37c 115.62b 119.42ab 123.71a 122.42a 120.10a 107.01c 4.890 0.023
酢酸塩, % 60.17 60.28 58.62 57.89 59.00 59.29 59.68 1.357 0.945
プロピオン酸, % 21.63 20.92 20.34 20.08 20.28 22.44 22.43 0.989 0.779
酪酸エステル, % 11.90 11.95 13.87 14.33 12.86 11.62 11.89 1.335 0.314
イソ酪酸, % 2.10 1.94 1.71 1.93 1.87 1.96 1.59 0.780 0.996
バレレート, % 2.14c 2.54abc 2.65ab 2.94a 2.77ab 2.36bc 2.23c 0.205 0.015
イソバレレート, % 2.05c 2.36b 2.80a 2.83a 2.93a 2.34b 2.17bc 0.129 <0.001
NH3-Ne、mg/dL 13.14 12.78 12.62 11.37 10.89 11.75 12.06 1.148 0.463
酢酸/プロピオン酸 2.82 2.93 2.95 2.92 2.89 2.65 2.67 0.380 0.964
MCPf, mg/mL 1.44 1.53 1.58 1.49 1.46 1.57 1.54 0.106 0.760
a-c
異なる小文字が続く行内の平均値は互いに有意に異なる（P < 0.05）。
d
TVFA, 総揮発性脂肪酸.
e
NH3-N、アンモニア性窒素.
f
MCP、微生物粗タンパク質。
セルロースの酵素活性とバイオマス分解
セルロース系バイオマスは、化学的または生物学的に達成可能な酵素加水分解によってバイオ燃料に変換することができます。ルーメン微生物コンソーシアムは、セルロース分解に関与する広範な酵素を有する、非常に効果的な共進化生態系である。予想通り、CtPに付着する3つの主要なセルロース酵素の活性は、発酵初期に概して高く、その後、発酵プロセスの進行に伴って低下した（表2）。これらの酵素の活性は12時間後に著しく低下し、発酵後期には分解効率が著しく低下していることが示された。発酵期間中、CtPの乾物（DM）、中性デタージェント繊維（NDF）、酸性デタージェント繊維（ADF）を含む相対バイオマスは、時間の経過とともに減少していった。12 時間後に NDF と ADF のバイオマスの有意な減少が観察され、これに伴い TVFA が増加した。セルロースの分解は、植物バイオマスの嫌気性発酵へのアクセス性と消化性を高める可能性がある（24）。本研究では、CtP をルーメン内に設置し、in situ 発酵させることで、CtP を代謝的に活性な微生物群集と常に接触させることができた。この結果は、ルーメン微生物の補助を介した CtP バイオマスの最適な利用効率のための有効な参考資料となった。
表2
表 2 48 時間のルーメン内での培養による、シトラスポーマスの付着セルロース酵素活性とバイオマス分解度の変化
項目時間 SEM P値
1時間 2時間 4時間 8時間 12時間 24時間 48時間
セルロース酵素, U/g
ペクチナーゼ 2.14c 2.92b 3.73a 3.17ab 3.61a 2.23c 2.30c 0.239 <0.001
カルボキシメチルセルラーゼ 0.55e 2.29a 2.04b 1.60d 1.93c 0.61e 0.54e 0.389 <0.001
キシラナーゼ 0.43d 0.64cd 1.08a 0.83bc 0.95ab 0.39d 0.47cd 0.089 <0.001
相対的バイオマス量, % 1
DMf 90.22a 86.76ab 82.34b 77.32b 65.49c 46.21d 28.17e 4.871 <0.001
NDFg 95.38a 92.17a 87.43ab 83.87ab 74.19b 59.83c 42.36d 4.729 <0.001
ADFh 97.64a 94.55a 92.17ab 86.45ab 80.12b 68.56c 55.68d 4.011 <0.001
a-e
異なる小文字が続く行内の平均値は互いに有意に異なる（P < 0.05）。
f
DM、乾物。
g
NDF, 中性デタージェント繊維.
h
ADF、酸性デタージェント繊維
リアルタイムqPCRによる特定ルーメン微生物の相対的存在量
特定のルーメン微生物の相対量をqPCRによって定量化した。9種類の微生物の相対存在量の推移を表3に示す。メタン生成菌は、固体付着バイオフィルムの重要な一部として、セルロース分解菌からの代謝産物によって飼料粒子に引き寄せられる（25）。発酵を延長すると、メタン生成菌の現存量は継続的に減少した。これは、CtPに含まれるタンニンやポリフェノールが、メタン生成菌の増殖や活性を直接的に阻害しているためと考えられる（26）。Rumicoccus albus、Ruminococcus flavefaciens、Butyrivibrio fibrisolvens、Fibrobacter succinogenes は、通常ルーメン内の主要なセルロース分解菌と考えられている (27)．本研究では、Butyrivibrio fibrisolvensの相対量が最初に増加し、その後減少し、24時間後に最大値を示した。この結果は、Butyrivibrio fibrisolvensがCtPバイオマスの分解に重要であることを示唆している。また、qPCR を用いたルーメン微生物の解析から、CTP の分解には微生物群の動的な変化が介在していることが示唆された。したがって、ハイスループット技術を用いた詳細な調査が必要である。
表3
表 3 48 時間のルーメン内での培養による、柑橘類の搾りかすに付着した複数の特定ルーメン微生物の相対存在量（全細菌の割合）の変化
項目時間 SEM P値
1時間 2時間 4時間 8時間 12時間 24時間 48時間
メタノゲン、×10-3 3.68ab 3.66ab 4.28a 3.18b 1.50c 2.26c 1.66c 0.384 <0.001
Anaerovibrio lipolytica, ×10-3 6.51 8.85 8.03 4.39 6.82 3.87 4.52 0.228 0.270
Butyrivibrio fibrisolvens, ×10-1 0.58b 0.54b 0.87ab 0.82ab 1.01a 1.04a 0.67b 0.404 0.022
フィブロバクター・サクシノゲネス、×10-2 1.75 1.89 1.82 1.23 2.16 1.79 1.78 0.086 0.648
メガスフィラ（Megaspheara elsdenii） ×10-3 1.04 1.26 1.29 0.94 1.16 1.89 1.47 0.138 0.857
Prevotella brevis, ×10-2 1.44b 0.96b 1.91b 2.38ab 2.49ab 3.38a 3.78a 0.069 0.012
Rumicoccus albus, ×10-2 0.99 1.76 1.54 0.83 1.14 0.92 0.85 0.611 0.645
Rumicoccus flavefaciens, ×10-3 1.71 2.45 2.38 2.60 2.17 2.12 1.35 1.784 0.992
Streptococcus bovis, ×10-3 3.31 4.22 3.23 2.26 2.26 1.64 1.97 1.923 0.833
a-c
行中の異なる小文字の平均値は、互いに有意に異なる（P < 0.05）。
CtPに付着したルーミン細菌群集の分類学的プロファイリング。
CtPに付着したルーミン細菌のアンプリコンシークエンスにより、合計1,261,552本の生リードが得られた。スクリーニングの結果、1,153,139の高品質な配列が得られ、平均リード長は413塩基であった。各グループのGood's coverageは99%以上であり、同定された配列が細菌の大部分を代表していることが示された。全サンプルの希釈曲線をFig.1Aに示す。すべての曲線がプラトーに近づいていることから、シーケンスの深さは十分であり、運用分類単位（OTU）を増やしても曲線の傾きに変化はないことが明らかになった。高品質リードは、3%の分岐度で2,752の微生物OTUにクラスタリングされ、そのうち726 OTUは全グループに見られ、全OTUの26.38%を占め、典型的なマイクロバイオームが存在することが示された（図1B）。1～48時間の群では、それぞれ26、82、50、92、54、73の排他的OTUがあった。
図1

図1 シトラスポマースにコロニーを形成するルーミナル細菌の構造の動的な変化。(A) 希釈曲線、(B) OTUレベルのベン図、(C) 重みなしユニトラック距離に基づくPCoAプロット、(D) 重みありユニトラック距離に基づくPCoAプロット。
微生物群集の豊度評価にはAce指数とChao指数が、微生物群集の多様性評価にはShannon指数とSimpson指数がよく使われる(28)。細菌αの多様性については、観察されたOTU、Ace、Chao、Shannon指数は、まず1時間から24時間まで増加し、その後24時間から48時間まで減少した（表4）。このことから、CtPには多様性の高いルーメン細菌群集が定着しており、48時間の培養期間中に連続的に変化することが示唆された。ルーメン微生物は、その機能性や植物資源を利用する能力が異なる。多様性指数が高いほど、微生物群集の代謝機能多様性が高いことを示す(29)。多様性と豊かさが高い微生物群は、より安定で、より効率的に資源を利用できると考えられています(30)。ルーメン細菌群集のベータ多様性を特徴付けるために、非重み付けおよび重み付けされた UniFrac 距離に基づく主座標分析 (PCoA) を使用した (Fig. 1C および D)。8 時間、12 時間、24 時間のサンプルは、PCoA プロットでは 1 時間、2 時間、4 時間、48 時間のサンプルと分離された。類似性分析（ANOSIM）により、CtPに付着する細菌群集は、異なる時間帯で有意に異なることが明らかになった（P < 0.05）。
TABLE 4
TABLE 4 48時間のルーメン内in situ培養におけるシトラスポーマスに付着した細菌および古細菌のα多様性の変化
項目時間 SEM P値
1時間 2時間 4時間 8時間 12時間 24時間 48時間
細菌
観察されたOTU 825b 822b 1039ab 1372a 1372a 1446a 1038ab 64.0 0.013
Ace 980b 973b 1229b 1590ab 1572ab 1655a 1192ab 73.8 0.019
チャオ 988b 974b 1239ab 1614ab 1590ab 1659a 1187ab 75.4 0.016
シャノン 4.97ab 4.46b 4.68b 5.76a 5.55a 5.81a 5.12ab 0.564 0.017
シンプソン 0.018 0.042 0.041 0.008 0.015 0.009 0.018 0.0034 0.078
古細菌
観測されたOTU 39 35 30 15 29 18 33 2.5 0.051
エース 41 40 32 17 34 29 35 2.4 0.138
チャオ 40 37 30 16 31 22 35 2.4 0.068
シャノン 1.46ab 1.49a 1.19ab 1.20ab 1.21ab 1.10b 1.39ab 0.040 0.025
シンプソン 0.314 0.329 0.395 0.380 0.388 0.411 0.355 0.0114 0.077
a-b
異なる小文字が続く行内の平均値は、互いに有意に異なる（P < 0.05）。
CtPに付着した微生物群集は、28の細菌門に属していた。Fig. 2Aは、主な細菌門の平均相対存在量を示している。Firmicutes（平均61.15%）とBacteroidota（平均34.12%）が最も多く、群集の平均95.3%を占めた（Fig. 2A）。48時間以内にCtPに定着した主な細菌属をFig. 2Bに示すが、そのうち19属（相対存在度>1%）は豊富なコア属とみなされた。ファーミキューテス門ではRuminococcus（15.07%）が最も多く、次いでunclassified_f__Ruminococcaceae（6.63%）、CAG-352（5.21%）、NK4A214_group（3.62%）となり、プレボテラ（13. 90%）が最も多く、次いでnorank_f__F082 (4.37%), norank_f__Muribaculaceae (4.32%), Rikenellaceae_RC9_gut_group (3.48%) であった。ルーメン微生物によるコロニー形成と利用可能なバイオマスは、ルーメン発酵活動の基礎となるものである(31)。積み重ねられた列プロットは、非常に多様なルーメン微生物叢がCtPを迅速にコロニー化し、48時間の培養期間内に持続的に変化することを示した。
図2

図 2 シトラスポマースにコロニーを形成するルーメン細菌組成の動的変化。(A）門レベルの細菌動態の相対量、（B）属レベルの細菌動態の相対量、（C）門レベルの細菌分類群の違い、（D）属レベルの細菌分類群の違い。
本研究では，0時間後のCtPに付着していた細菌群集を明らかにしなかった．これまでの研究では，0時間後に飼料表面に優勢であったProteobacteriaは，最初のシフト時にFirmicutesとBacteroidetesに置き換わることが示されている（29，32，33）．本研究では、1時間後のCtPに付着する細菌群集もFirmicutesとBacteroidetesが主体であった。FirmicutesとBacteroidetesに属する嫌気性菌は、植物細胞壁多糖類を分解することが知られている(34)。7つの時点においてFirmicutesとBacteroidetesの時間的変動が見られたが、CtPサンプルに付着しているのはこの2つの系統が支配的であった。この結果は、牛のルーメン内で培養した稲わら、小麦わら、アルファルファ干草について報告されたデータ (29, 35) と一致する。したがって、これらの菌相は CtP 発酵中の VFA 産生の効率維持に重要な役割を果たす可能性がある。また、Prevotellaはオリゴ糖やヘミセルロースの分解に関与することが報告されている(36)。Ruminococcusは高い繊維分解能力を持つことがよく知られており(37, 38)、本属はルーメン内で最も大きな割合でセルラーゼを生産し、また多量のヘミセルラーゼやオリゴ糖分解酵素を生産すると報告されている(36)。本研究では、Ruminococcus属とPrevotella属がCtPに付着する細菌群集で優勢であることが明らかになり、これらの分類群が繊維やオリゴ糖を分解する上で重要な役割を担っていることが示唆された。
図2Cに示すように、アクチノバクテリオタ、ヴェルコミクロビオタ、デスルホバクテラ、フィブロバクタータ、クロロフレキシ、アルマティモナドタ、およびキャンピロバクタータの相対存在量は48時間の発酵期間に最初に増加し、その後減少した（P < 0.05）。このような異なる時点における微生物群集の違いは、CtPの化学組成の劇的な変化と関連していると思われる。しかし、ルーメン内のActinobacteriotaとVerrucomicrobiotaの生態と生物学に関する理解はごくわずかである。これらの2つの分類群がCtP発酵に関連しているかどうかを評価するためには、ルーメンのActinobacteriotaとVerrucomicrobiotaの中でこれらの細菌の機能を特徴付けるためのさらなる研究が必要である。Fibrobacter succinogenes は、Fibrobacterota 属の中で唯一知られている種であり、この種はルーメン内の主要なセルロース分解菌で、プロピオン酸前駆体であるコハク酸を生産する(39)。本研究では、CtP バイオマスに付着する Fibrobacterota の動的特性は、セルロース分解活性の変化を大きく反映することが示された。Desulfobacterota に属する細菌種は、ルーメン内で酢酸を主要基質として硫化水素を生成することができる (40)。本研究では、CtPに付着するDesulfobacterotaが大きく変化したのは、主にDesulfobacterotaと酢酸菌の相互作用が増加したためではないかと推測した。
本研究で同定された CtP に付着する主要な細菌分類群のうち、ほとんどの微生物は共通して安定であった。線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）を用いて、順位和検定と分類学的情報を組み合わせ、群集構造に最も影響を与えるバイオマーカー分類群（対数LDAスコア>3.0）を特定しました。LDAヒストグラム（図S1）によると、1時間後に1個、2時間後に3個、4時間後に1個、8時間後に19個、12時間後に7個、24時間後に33個、48時間後に2個と、66個のバイオマーカーが存在することが明らかになりました。また、CAG-352属、NK4A214_group、Rikenellaceae_RC9_gut_group、UCG-001、Lachnospiraceae_NK3A20_group、UCG-002、Acutitomaculum、Butyrivibrio、Succinivibrionaceae_UCG-001、Family_XIII_AD3011_groupは経時変化において有意（P < 0.05）の相対量変化が見られた（Fig. 2D）. NK4A214_groupはOscillospiraceae科に属し、植物の複合糖質を分解することができる(41)。したがって、CtPはNK4A214_groupの細菌種がコロニー形成し増殖するための炭素源として機能した。CAG-352、UCG-001、UCG-002 などの一部の細菌は、ルーメンでの機能が不明である。これらの属は、ルーメン内で植物繊維の分解に必須の役割を果たすことが知られているRuminococcaceaeに属している(42)。Lachnospiraceae_NK3A20_groupとButyrivibrio属はLachnospiraceae科に属し、この科の種はルーメン内の主要な酪酸産生菌である(43)。Rikenellaceae_RC9_gut_groupはRikenellaceae科に属し、構造糖質の一次分解または二次分解のいずれかに関連している(44)。つまり、Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Rikenellaceaeのメンバーは、CtPバイオマスのコロニー形成と分解に重要な役割を担っていることが明らかとなった。
CtPに付着したルーミン古細菌群集の分類学的プロファイリング。
図3Aに示すように、レアファクション曲線はプラトーに達する傾向があり、配列決定深度が解析に十分であることが示された。Venn Diagramでは、1, 2, 4, 8, 12, 24, 48時間にそれぞれ41, 29, 21, 5, 17, 5, 19の特異的OTUが存在し、5つのOTUが共有されていた（Fig. 3B）。2時間から24時間までは、シャノン指数が増加し、24時間以降は減少した（表4）。観察されたOTU、Ace、Chao、Simpsonなどの他のα-diversity指標は、経時的に変化しなかった。Unifrac距離によるPCoAでは、プロット上で異なる発酵ステージが明らかに分離されていた（図3B）。ANOSIMでは、群間で顕著な差があることが確認された（P < 0.05）。これらの結果から、CtPはアーキアに急速にコロニー化し、CtPに付着したアーキアの群集構造が経時的に変化していることが示唆された。
図3

図3 シトラスポマースにコロニーを形成するルーミナルアーカイアの構造の動的変化。(A) 希釈曲線、(B) OTUレベルのベン図、(C) 重みなしユニフラック距離によるPCoAプロット、(D) 重みありユニフラック距離によるPCoAプロット。
LDAヒストグラム（Fig. S2）より、アーキアのバイオマーカー分類群は2時間後に1種、4時間後に4種、12時間後に10種、48時間後に2種と、合計17種であることがわかった。アーキアの相対的な存在量については、EuryarchaeotaとMethanobrevibacterは0.5時間から48時間にかけて著しく減少したが、MethanosphaeraやMethanobacteriumなどの他の主要なアーキアは異なる時間帯で同程度に推移した。動物の腸内では細菌とメタン生成菌が共生しており、メタン生成菌はセルロース分解菌が生成する水素を電子供与体としてメタンを生成する(45)。これらの古細菌のうち、MethanobrevibacterとMethanosphaeraは、ルーメンのメタン生成において優勢である(45)。Euryarchaeota と Methanobrevibacter が、ルーメンからのメタン排出量と正の相関があることが報告されている (46)。これらの減少は、フラボノイドなどの CtP の植物化学物質による抑制効果に起因する可能性がある。しかし、本研究では、液相アーキアとルーメン内のメタン濃度は測定されていない。したがって、CtP 発酵中のメタン生成について、さらなる研究が必要である。
図 4

図 4 シトラスポマースに定着するルーメンアーカイアの組成の動的な変化。(A) 門レベルのアーキア動態の相対量、(B) 属レベルのアーキア動態の相対量、(C) 門レベルのアーキア分類群の差分、(D) 属レベルのアーキア分類群の差分。
微生物群集のネットワーク解析。
微生物間の共起相関は、群集構造を決定する役割を果たすと考えられている(47)。Fig. 5A と Fig. B に示すように、共起ネットワークは 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 時間で有意に異なるトポロジー構造を示唆した。さらに Fig. 5C と Fig. S3 には、細菌群集（上位 30 属）と古細菌群集（上位 20 属）の相関ネットワークが描かれている。バクテリアのネットワークは、古細菌のネットワークよりも複雑であった。細菌ネットワークにおけるサンプルノードの連結次数の値は、1,166 (1 h) から 2,037 (8 h) まで変化しており、CtP発酵の開始後、より複雑な微生物ネットワークへと変化していることが示された。ルーメンは非常に動的な環境であり（48）、微生物相はCtPバイオマス分解に即座に適応・反応することが可能である。細菌相関ネットワークは27のノード（属）と276のエッジで構成され、有意な正と負の相関は細菌ネットワークの68.5％と31.5％を占めた。また，Firmicutes属のAcetitomaculum, Rikenellaceae_RC9_gut_group, Christensenellaceae_R-7_group, Butyrivibrioといった属の間では正の相関が多く，UCG-001, Colidextribacter, Ruminococcusといった属から負の相関が多くみられた．一般に、正の相関は相互摂食やニッチの重複を表し、負の相関はネットワーク内の競合に起因する(49)。これらの結果は、Firmicutesのメンバーが、CtPをコロニー化し分解する様々な微生物相の相対量を調節する上で重要な役割を担っていることを示唆するものであった。
図5

図 5 シトラスポマースにコロニー形成するルーメン微生物分類群のネットワーク分析。(A) OTUレベルの細菌群集の共起ネットワーク、(B) OTUレベルの古細菌群集の共起ネットワーク、(C) 上位30属のルーメン細菌分類群間のスピアマンの相関、(D) ルーメン発酵パラメーターと上位50属のルーメン細菌分類群間のスピアマンの相関。有意な関係（P < 0.05; |r|>0.65）のみを示す。ノードの大きさは平均存在量に比例する。
CtP発酵中の発酵パラメータと上位30細菌属の動態の関係をよりよく理解するために、スピアマン相関分析を行った。図5Dに示すように、pHはAnaerovorax、Rikenellaceae_RC9_gut_groupと正の相関を示し、Ruminococcusと負の相関を示しました。酢酸塩はSuccinivibrionaceae_UCG-002と正の相関を示した。酪酸はPapillibacterと正の相関を示し、Succinivibrionaceae_UCG-002と負の相関を示した。IsovalerateはPapillibacterと負の相関を示した。バレレートはuccinivibrionaceae_UCG-001およびLachnobacteriumと正の相関を示した。つまり、pH、酢酸塩、酪酸塩、イソバレレート、バレレートは、付着したルーミン細菌と密接な関係があった。一般に、ルミノールpHの低下はVFA蓄積と関連している（50）。ルーミナルのセルロース分解菌の多くは pH 感受性が高く (51)、VFA の蓄積は微生物発酵、特にバッチ発酵における制限因子である (8)。しかし、生体内の VFA は宿主のルーメン壁に連続的に吸収されており、VFA の蓄積は見られない。したがって、VFA を分離することで、in vitro での効率的な VFA 生産を維持することが可能かもしれない。メンブレンバイオリアクターは、長期間のルーメン液発酵中に VFA を分離し、ルーメン微生物の高い活性を維持するために使用することができる（52）。
結論
ルーメン内の多様な微生物とその共生的相互作用は、食品廃棄物から付加価値のある製品を持続的に生産するための宝庫である。本研究では、CtPの発酵性能とルーメン内の付着微生物群集の動的な変化を解析した。CtPは、ルーメン内の微生物によって急速にコロニー化される。化学的分析から、CtPのセルロースバイオマスの減少は、ルーメン内のVFA産生の増加と関連していることが示された。微生物分析では、Ruminococcus、Prevotella、CAG-352、NK4A214_group、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Methanobrevibacter属が発酵期間中に優勢となることが示された。また、Actinobacteriota, Verrucomicrobiota, Desulfobacterota, Fibrobacterota, Euryarchaeotaの相対量が各時点で有意に異なることがわかった。これらの知見は、ルーメン微生物コンソーシアムを構築、操作、濃縮することにより、新鮮なルーメン液を用いた嫌気性消化における柑橘類廃棄物のVFA生産のための利用を加速するための深い理解をもたらすと思われる。将来的には、マルチオミクス、バイオインフォマティクス、微生物純培養技術の開発が、CtP消化を支配するルーメン微生物の機能と相互関係を探り、柑橘類廃棄物の加水分解、酸生成、メタン生成の複雑な過程を明らかにするのに役立つと思われる。
材料および方法
実験デザイン。
動物の手順および使用は、北京農業大学動物愛護委員会の承認を得た（プロトコル番号 BUA2021146; 中国、北京）。永久ルーメン瘻を有する 3 頭の成熟した非泌乳の中国産ホルスタイン牛（平均体重 540 ± 11 kg）を、人工孵化の実験動物として使用した。牛はタイストール牛舎に収容し、自由に水を飲めるようにした。すべての牛に、同じ混合飼料を1日1回、自由摂取で与えた。飼料には以下のものが含まれていた（DM ベース）。アルファルファサイレージ 31.7%、コーンサイレージ 21.2%、チャイニーズワイルドリー 24.3%、トウモロコシ粉 8.2%、大豆粕 6.6%、大豆皮 5.3%、炭酸カルシウム 0.7%、オルトリン酸カルシウム 0.5%、塩化ナトリウム 0.5% およびミネラル・ビタミンプレミックス 1%であった。牛は個別に牛舎内の 3 個のストールに収容された。実験実施前に、ルーメン内の個体群を平衡させるため、1 ヶ月以上この飼料を与えていた。試験期間中、牛の管理は変更しなかった。
CtP は Shaanxi Xiazhou Biotechnology (Xi'an, China) から入手した。CtPのサンプルは、65℃で48時間オーブン乾燥させ、Wileyミル（Thomas Scientific, Swedesboro, NJ）で2mmのふるいを通して粉砕した。CFEの化学組成を表S1に示す。100グラムのCtPをナイロンバッグ（10×20cm；孔径＝50μm）に封入した。このナイロン袋（1頭当たり合計21袋、各時点で3袋）を、朝の給餌前に乳牛のルーメン内に設置した。発酵パラメータの測定のために、乳牛のルーメン内の複数の部位（すなわち、前背側、前腹側、中腹側、後背側、後腹側）からカニューレを通して1、2、4、8、12、24、及び48時間にルーメン消化物サンプルを採取した。ルーメン内容物は、4層のチーズクロスで濾した後、デジタルpHメーター（PHS-3C；Shanghai Yueping Scientific Instrument Co.）すべてのルーメン液サンプルはサブサンプル（10 mL）とし、分析まで-80℃で保存した。セルラーゼ活性とCtPに定着した微生物の分析には、1、2、4、8、12、24、48時間培養後にナイロンバッグを取り出し、滅菌生理食塩水を用いてすすぎ、一過性およびゆるく付着した微生物を除去した。サンプルはDNA抽出まで-80℃で保存した。
ルーメン発酵特性。
キャピラリーカラム（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm; DB-FFAP; Agilent Technologies）と炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフ（GC-7890B; Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いてルーメン液サンプルの VFA 濃度を分析した。オーブン温度は170℃で4分間保持した後、5℃/分の速度で185℃まで昇温し、その後3℃/分で240℃まで昇温し、この温度を1分間維持した。インジェクターおよび検出器の温度は、それぞれ250℃および300℃に維持された。VFA分析では、絞ったルーメン液4 mLを25%メタリン酸1 mLと混合した。ルーメン抽出液を20,000×gで遠心分離し、上清を回収してGC分析まで-20℃で保存した。サンプルは、オートサンプラーにより、スプリット法、25:1の分割比率で、1μLの注入サイズで投与された。キャリアガスとして窒素を使用した。ルーメンアンモニア性窒素は、マイクロプレートリーダー（Multiskan FC, Thermo Fisher, NY）でBroderickとKangの方法（53）に従って測定された。ルーミナルの微生物粗タンパク質は、Makkar ら（54）の記述に従って分析した。
微生物セルロース酵素活性。ナイロンバッグ内のCtP残留物1グラムを遠心分離管に入れた。20ミリリットルのリン酸ナトリウム緩衝液（0.01 mol/L, pH 6.8）と2.5 mLの四塩化炭素を試料に添加した。遠心管を37℃で一定に振盪しながらインキュベートした後、29,000×g、4℃で15分間遠心分離して酵素含有上清を得た。ペクチナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、キシラナーゼ活性は、Agarwalら（55）に従って、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キシラン（北京太陽生物科学技術有限公司、北京、中国）を基質として測定された。
バイオマスの分解 CtP の DM (method 930.15), 粗タンパク質 (method 973.48), 灰分 (method 942.05) およびエーテル抽出物 (method 920.39) は AOAC (56) に従って定量した。NDF および ADF は、Ankom200 繊維分析装置（ANKOM Technology Corp.、Macedon、NY）を用いて、 ANKOM フィルターバッグ法で逐次分析した。異なる時点の DM、NDF、および ADF の相対的なバイオマス分解を計算し、0 時間の CtP サンプルをバイオマス 100%の基準として使用した。
リアルタイムqPCRによる特定ルーメン微生物の相対的存在量。
DNA は、DNA キット (E.Z.N.A. Soil DNA kit, Omega Biotek, Norcross, GA) を用いて、製造者の推奨する方法で抽出した。抽出した DNA の純度と濃度は NanoDrop 1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Rockland, DE) と 1% agarose gel electrophoresis によって評価した。対象微生物は、Methanogens、Anaerovibrio lipolytica、Butyrivibrio fibrisolvens、Fibrobacter succinogenes、Megaspheara elsdenii、Plevotella brevis、Rumicoccus albus、Rumicoccus flavefaciens および Streptococcus bovis であった。これらの標的微生物のプライマー配列を表S2に示す。各サンプルについて、0.8μLの各プライマー（10μmol/L）、10μLのSYBR green（北京太陽生物科学技術有限公司、中国、北京）、および総容量（20μL）に調整したDNA/RNN自由水を含む反応系に合計2μLのDNAテンプレート（10ng/μL）を3重で添加した。反応はRoche LightCycler96 system (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germany)を用いて、以下の手順で実施した。95℃で1分、95℃で15秒、60℃で30秒を40サイクル（またはプライマーのTmに基づく）、68℃で1分伸長した。サイクル閾値（Ct）を用いて、総菌量に対する各ルーメン微生物の倍率変化を算出した。相対量＝2-[Ct(target)-Ct(total bacteria)]により、these標的微生物の相対量を算出した。その後、データは統計解析の前にlog-2変換された。
細菌および古細菌群集の解析
ルーメンインキュベーションしたCtPサンプル（各時点につき3つの生物学的複製）の細菌及び古細菌群集を、Illumina MiSeqプラットフォームを介して16S rRNA遺伝子を配列決定することにより分析した。細菌については、V3-V4領域からの16S rRNAの増幅のために、固有の8塩基の「バーコード」配列を有するプライマー338F（5′-バーコード-ACTCCTRCGGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACCVGGTATCTAAT-3′）が使用された。古細菌については、524F10extF (5′-TGYCAGCCGCCGCGTAA-3′) とArch958RmodR (5′-YCCGCGTTGAVTCCAATT-3′) をプライマーとして、16S rRNAのV4-V5領域が増幅されるように使用された。PCR増幅は、2μLのDNAテンプレート、12.5μLの2×Taq PCR MasterMix、2.5μLの各プライマー、および最終容量を調整するためのddH2Oからなる25μL反応混合物で3連で行った。PCR産物は2%アガロースゲル電気泳動で評価し、QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した。その後、アンプリコンを等モル比でプールし、アンプリコンライブラリーを作製した。アンプリコンシーケンス（2×300bp）は、Illumina MiSeqシーケンスシステム（Illumina, San Diego, CA）で実施した。
ペアエンドリードをFLASH（Version 1.2.11）でマージした。シーケンスリードはQuantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) pipeline software (Version 1.9.1) を用いて処理・解析された。平均連結クラスタリングにより、97%の類似性に基づいてリードをOTUに割り当てた。OTUのraw read数はquality-filtered readの総数に対して正規化し、相対的な存在量を算出した。各OTUの分類は、SLIVA 16S rRNAデータベース（Version 138）に対してRDP classifier（Version 2.13）を用いて実施した。Mothur (Version 1.30.2) を用いて、ACE、Chao1、Shannon、Simpsonのα-多様性指標を算出した。ベータ多様性はQIIMEを用い、加重および非加重UniFrac距離に基づくPCoAで解析した。グループ間のβ多様性における統計的有意性を確認するため、ANOSIM統計検定を行った。
統計解析の結果
ルーメン発酵パラメータ、微生物セルロース酵素活性、バイオマス損失、及びリアルタイムqPCRデータを含む物理化学データの統計的有意差は、SAS 9.4（SAS Institute Inc.）を使用して、一元配置分散分析及び一般線形モデル手順で分析された。すべての値は最小二乗平均で報告された。有意性はP≤0.05とした。平均値間の有意差は、Duncanの多重範囲検定を用いて調査した。異なる時点における微生物分類群の相対存在度の変化を評価するために、偽発見率補正（FDR）を用いた Kruskal-Wallis 検定を用い、FDR 補正後の P 値が 0.05 未満の場合を有意とみなした。細菌属とルーメン発酵パラメータの関係を評価するために、スピアマンの順位相関を使用した。
データの入手
得られた生配列は、NCBI Sequence Read Archiveにアクセッション番号PRJNA832488で寄託されている。
謝辞
本研究は、北京市教育委員会分類発展プロジェクト2022（10066092022）、および中国ポストドクター科学財団（2022M710181）から資金的な支援を受けたものである。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解釈、または論文を出版するための投稿の決定には一切関与していない。
また、申告すべき利益相反はない。
補足資料
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参考文献
1.
Gou C, Yang Z, Huang J, Wang H, Xu H, Wang L. 2014. Effects of temperature and organic loading rate on the performance and microbial community of anaerobic co-digestion of waste activated sludge and food waste. Chemosphere 105:146-151.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
2.
Valenti F, Zhong Y, Sun M, Porto SMC, Toscano A, Dale BE, Sibilla F, Liao W. 2018. 南イタリアにおけるバイオガス生産を強化するための複数の農業残渣の嫌気性共消化。Waste Manag 78:151-157.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
3.
地中海沿岸の農業残渣の微生物群集と嫌気性消化性能への影響。地中海沿岸の農業残渣が微生物群集と嫌気性消化性能に及ぼす影響。Biofuels Bioprod Bioref 16:523-536.
引用元へ
クロスリファレンス
国際標準化機構
Google Scholar
4.
Zannini D, Dal Poggetto G, Malinconico M, Santagata G, Immirzi B. 2021. ペクチンおよびリグノセルロース繊維の供給源としての柑橘類搾りかすバイオマス：廃棄物からマルチング用途の改良型バイオコンポジットまで。Polymers (Basel) 13:1280.
引用元へ
クロスリファレンス
パブコメ
Google Scholar
5.
Erdogan E, Atila B, Mumme J, Reza MT, Toptas A, Elibol M, Yanik J. 2015. Characterization of products from hydrothermal carbonization of orange pomace including anaerobic digestibility of process liquor.オレンジかすの水熱炭化からの生成物の特性評価。Bioresour Technol 196:35-42.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
6.
Sawatdeenarunat C, Surendra KC, Takara D, Oechsner H, Khanal SK. 2015. Anaerobic Digion of lignocellulosic biomass: Challenges and Opportunities. Bioresour Technol 178:178-186.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
7.
Jones DR, Uddin MS, Gruninger RJ, Pham TTM, Thomas D, Boraston AB, Briggs J, Pluvinage B, McAllister TA, Forster RJ, Tsang A, Selinger LB, Abbott DW. 2017年. 希少なアラビノシル基質に多特異的な活性を有するルーメン嫌気性真菌由来のファミリー39グリコシドヒドロラーゼの発見と特徴付け。J Biol Chem 292:12606-12620.
引用元へ
クロスリファレンス
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
8.
Liang J, Fang W, Wang Q, Zubair M, Zhang G, Ma W, Cai Y, Zhang P. 2021. 揮発性脂肪酸生産のためのルーメン微生物によるトウモロコシ藁発酵時の群集、酵素、代謝経路のメタゲノム解析。Bioresour Technol 342:126004.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
9.
Zhang H, Zhang P, Ye J, Wu Y, Fang W, Gou X, Zeng G. 2016. ルーメン液前処理による稲わらからのメタン生成の改善：フィージビリティスタディ。Int Biodeter Biodegr 113:9-16.

クロスリファレンス
国際標準化機構
Google Scholar
10.
Li F, Zhang P, Zhang G, Tang X, Wang S, Jin S. 2017. 異なる固体含量でのルーメン液前処理によるトウモロコシ茎葉の加水分解の促進：効果、構造変化、酵素の関与。Int Biodeter Biodegr 119:405-412.
引用元へ
Crossref
ISI
Google Scholar
11.
Li K, Zhu H, Zhang Y, Zhang H. 2017. 小麦わらのバイオガス消化のためのルーメン液植菌リアクターにおける微生物群集の特性評価。Sustainability 9:243.
引用元へ移動
Crossref
Google Scholar
12.
Bhujbal SK, Ghosh P, Vijay VK, Rathour R, Kumar M, Singh L, Kapley A. 2022. リグノセルロース系廃棄物のバイオ燃料および付加価値製品への持続可能なバイオコンバージョンに向けたルーメン微生物群のバイオテクノロジー的可能性。Sci Total Environ 814:152773.
引用元へ
クロスリファレンス
パブコメ
国際研究交流大学校
Google Scholar
13.
Morgavi DP, Kelly WJ, Janssen PH, Attwood GT. 2013. ルーメン微生物（メタ）ゲノミクスとその反芻動物生産への応用. 動物 7:184-201.
引用元へ
クロスリファレンス
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
14.
Leahy SC, Kelly WJ, Ronimus RS, Wedlock N, Altermann E, Attwood GT. 2013. ルーメン細菌および古細菌のゲノム配列決定とメタン軽減戦略への応用。Animal 7:235-243.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
15.
Chhikara N, Kour R, Jaglan S, Gupta P, Gat Y, Panghal A. 2018. Citrus medica: nutritional, phytochemical composition and health benefits - a review. フードFunct 9:1978-1992。
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
16.
Rs AALCJVDFMBJ. 2014. 高濃縮飼料を与えた去勢牛のルーメン液のin vitro発酵パラメータとメタン生成に対するバイオフレーベックスとその純粋なフラボノイド成分の効果。Anim Feed Sci Technol 197:85-91.
引用元へ
クロスリファレンス
国際標準化機構
Google Scholar
17.
Liang J, Nabi M, Zhang P, Zhang G, Cai Y, Wang Q, Zhou Z, Ding Y. 2020. リグノセルロース系バイオマスのルーメン微生物による再生可能エネルギーへの有望な生物学的変換：包括的レビュー. Renew Sust Energ Rev 134:110335.

クロスリファレンス
国際標準化機構
Google Scholar
18.
Xing B-S, Han Y, Cao S, Wen J, Zhang K, Yuan H, Wang XC. 2020. リグノセルロースの分解を促進するための共基質戦略 in vitro ルーメン発酵：特性および微生物組成. Chemosphere 250:126104.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
19.
Miron J, Ben-Ghedalia D, Morrison M. 2001. ルーメンセルロース分解菌の付着メカニズム。J Dairy Sci 84:1294-1309.
引用元へ
Crossref
PubMed
ISI
Google Scholar
20.
アレンMS。1997. ルーメンでの発酵酸生産と物理的有効繊維の要求量との関係。J Dairy Sci 80:1447-1462.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
21.
バーグマンEN。1990. 様々な種における消化管からの揮発性脂肪酸のエネルギー貢献。Physiol Rev 70:567-590。

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
22.
Shen Y, Wang H, Ran T, Yoon I, Saleem AM, Yang W. 2018. 高穀物飼料を給与した牛未経産牛のルミナル発酵および消化の部位と程度に対する酵母培養と飼料用抗生物質の影響1. J Anim Sci 96:3916-3927.
引用元へ
クロスレフ
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
23.
Ribeiro GO, Gruninger RJ, Jones DR, Beauchemin KA, Yang WZ, Wang Y, Abbott DW, Tsang A, McAllister TA. 2020. アンモニア繊維膨張処理した麦わらと組み換え繊維分解酵素が子羊のルーメン微生物叢と発酵パラメータ、全経路消化率、成績に与える影響。J Anim Sci 98:skaa116.
引用元へ
クロスリファレンス
PubMed
国際学会
Google Scholar
24.
He L, Lv H, Wang C, Zhou W, Pian R, Zhang Q, Chen X. 2020. 高水分のコーンストーバーを硫酸または水酸化ナトリウムでエンサイルした場合の発酵品質、物理化学的特性、酵素加水分解のダイナミクス。Bioresour Technol 298:122510.
引用元へ
クロスリファレンス
パブコメ
国際学会
Google Scholar
25.
Bowen JM, McCabe MS, Lister SJ, Cormican P, Dewhurst RJ. 2018. ペレニアルライグラスまたはシロツメクサの飼料を与えられた牛のルーメンの液相および固相に関連する微生物群集の評価。Front Microbiol 9:2389.
引用元へ移動
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
26.
Min BR, Solaiman S, Waldrip HM, Parker D, Todd RW, Brauer D. 2020. 反芻動物からの腸内メタン排出の食事による緩和：植物タンニンの緩和オプションのレビュー。Anim Nutr 6:231-246.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
27.
Wang L, Liu K, Wang Z, Bai X, Peng Q, Jin L. 2019. ヤギの消化管における窒素の異なる利用効率に関連する細菌群集の多様性。Front Microbiol 10:239.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
28.
Chen J, Xu Q, Li Y, Tang Z, Sun W, Zhang X, Sun J, Sun Z. 2019. 妊娠後期および授乳期における酪酸ナトリウム、中鎖脂肪酸、n-3多価不飽和脂肪酸の飼料補給が母豚の繁殖成績および乳飲み子豚の成長成績に与える比較効果。J Anim Sci 97:4256-4267.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際研究交流大学校
Google Scholar
29.
Liu J, Zhang M, Xue C, Zhu W, Mao S. 2016. 反芻動物内の稲わらとアルファルファ干草にコロニー形成するルーミナル細菌微生物叢の時間的動態の特性評価と比較。J Dairy Sci 99:9668-9681.

Crossref
PubMed
アイエスアイ
Google Scholar
30.
Khafipour E, Li S, Tun HM, Derakhshani H, Moossavi S, Plaizier JC. 2016. 穀物給与が牛の消化管内微生物叢に及ぼす影響. Anim Front 6:13-19.
引用元へ
Crossref
Google Scholar
31.
Lv F, Wang X, Pang X, Liu G. 2020. 子羊のルーメン形態と細菌多様性に及ぼす補助給餌の効果。PeerJ 8:e9353.
引用元へ
Crossref
PubMed
Google Scholar
32.
Piao H, Lachman M, Malfatti S, Sczyrba A, Knierim B, Auer M, Tringe SG, Mackie RI, Yeoman CJ, Hess M. 2014年. 16S rRNA遺伝子プロファイリングによって決定されたスイッチグラスのin situ培養中の繊維分解およびメタン生成ルーメン微生物の時間的動態。Front Microbiol 5:307.
引用元へ
クロスリファレンス
PubMed
国際学会
Google Scholar
33.
Huws SA, Edwards JE, Creevey CJ, Stevens PR, Lin WC, Girdwood SE, Pachebat JA, Kingston-Smith AH. 2016. 新鮮なペレニアルライグラスにコロニー形成する代謝活性の高いルーメンバクテリアの時間的動態。FEMS Microbiol Ecol 92:fiv137.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際研究交流大学校
Google Scholar
34.
Gharechahi J, Salekdeh GH. 2018. ラクダのルーメンのマイクロバイオームのメタゲノム解析により、リグノセルロースの分解と発酵を担う主要な微生物を特定した。バイオテクノル・バイオフューエルズ11:216.
引用元へ
Crossref
PubMed
ISI
Google Scholar
35.
Jin W, Wang Y, Li Y, Cheng Y, Zhu W. 2018. 牛のルーメンにおける麦わらをコロニー化する細菌群集の時間的変化。Anaerobe 50:1-8.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
36.
Dai X, Tian Y, Li J, Luo Y, Liu D, Zheng H, Wang J, Dong Z, Hu S, Huang L.2015年. 牛のルーメンにおける微生物による植物細胞壁多糖類分解のメタトランススクリプトーム解析。Appl Environ Microbiol 81:1375-1386.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
37.
Latham MJ, Wolin MJ. 1977. Ruminococcus flavefaciens によるセルロースの発酵、Methanobacterium ruminantium の存在下および非存在下。Appl Environ Microbiol 34:297-301.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
38.
Christopherson MR, Dawson JA, Stevenson DM, Cunningham AC, Bramhacharya S, Weimer PJ, Kendziorski C, Suen G. 2014. Unique aspects of fiber degradation by the ruminal ethanologen Ruminococcus albus 7 revealed by physiological and transcriptomic analysis. BMC Genomics 15:1066.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
39.
Li F, Wang Z, Dong C, Li F, Wang W, Yuan Z, Mo F, Weng X. 2017. 亜急性ルーミナルアシドーシスリスクが低いまたは高い肥育子羊のルーメン細菌群集とパフォーマンス。Front Microbiol 8:2506.
引用元へ移動
Crossref
PubMed
ISI
Google Scholar
40.
Hinsley AP, Berks BC. 2002. Salmonella Entericaによる硫黄化合物の還元に関与する呼吸経路の特異性(Specificity of respiratory pathways involved in the reduction of sulfur compounds by Salmonella Enterica). Microbiology (Reading) 148:3631-3638.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
41.
Konikoff T, Gophna U. 2016. Oscillospira: a central, enigmatic component of the human gut microbiota（オシロスピラ：ヒト腸内細菌叢の中心的な謎の成分）。Trends Microbiol 24:523-524.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
42.
Couch CE, Arnold HK, Crowhurst RS, Jolles AE, Sharpton TJ, Witczak MF, Epps CW, Beechler BR.2020年。Bighorn sheep gut microbiomes associated with genetic and spatial structure across a metapopulation. Sci Rep 10:6582.
引用元へ
Crossref
PubMed
Google Scholar
43.
Amy B, Lucy S, Jeffrey B, Susan L. 2013. Untangling the genetic basis of fibrolytic specialization by lachnospiraceae and ruminococcaceae in diverse gut communities（多様な腸内コミュニティにおけるlachnospiraceaeとruminococcaceaeによる繊維分解特化の遺伝的基盤）。多様性 5:627-640.
引用元へ
クロスリファレンス
Google Scholar
44.
Pitta DW, Pinchak E, Dowd SE, Osterstock J, Gontcharova V, Youn E, Dorton K, Yoon I, Min BR, Fulford JD, Wickersham TA, Malinowski DP. 2010. Rumen bacterial Diversity dynamics associated to changing from bermudagrass hay to grazed winter wheat diet. Microb Ecol 59:511-522.
引用元へ
Crossref
PubMed
ISI
Google Scholar
45.
Kumar S, Indugu N, Vecchiarelli B, Pitta DW. 2015. 乳牛のルーメンにおける飼料と年齢の変化に応じた嫌気性真菌、メタン生成アーキア、および細菌群集の関連パターン。Front Microbiol 6:781.

Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
46.
グランジャ＝サルセド YT、フェルナンデス RM、デ・アラウージョ RC、岸 LT、ベルチエリ TT、デ・レセンデ FD、ベルント A、シケイラ GR. 2019. 長期カプセル化硝酸塩補給は、ルーメン微生物多様性とルーメン発酵を調節し、放牧牛のメタン排出を減少させる。フロント・マイクロバイオル 10:614.
引用元へ移動
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
47.
Chen W, Ren K, Isabwe A, Chen H, Liu M, Yang J. 2019. 確率的なプロセスは、雨季と乾季をまたぐ亜熱帯の河川における微核生物群集の集合を形成する。マイクロバイオーム 7:138.
引用元へ
Crossref
PubMed
Google Scholar
48.
De Nardi R, Marchesini G, Li S, Khafipour E, Plaizier KJ, Gianesella M, Ricci R, Andrighetto I, Segato S.2016年。ジカルボン酸またはポリフェノールを添加した高穀物飼料を給与した乳牛のルーメン微生物集団のメタゲノム解析。BMC Vet Res 12:29.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際研究交流大学校
Google Scholar
49.
Zheng W, Xue D, Li X, Deng Y, Rui J, Feng K, Wang ZL. 2017. 農地土壌の塩分に対する微生物群集の反応と適応：分子生態学的ネットワーク分析。Appl Soil Ecol 120:239-246.
引用元へ移動
クロスリファレンス
アイエスアイ
Google Scholar
50.
Li F, Yang XJ, Cao YC, Li SX, Yao JH, Li ZJ, Sun FF. 2014. 乳用ヤギの亜急性ルーミナルアシドーシスのリスクとルーメン内容脂肪酸組成に及ぼす飼料有効繊維とルーメン分解性デンプンの比率の影響。Anim Feed Sci Technol 189:54-62.
引用元へ
クロスリファレンス
ISI
Google Scholar
51.
ラッセルJB、ウィルソンDB。1996. なぜルーミナルのセルロース分解菌は低 pH ではセルロースを消化できないのか？J Dairy Sci 79:1503-1509.
引用元へ
Crossref
PubMed
ISI
Google Scholar
52.
このような場合、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」、「堆肥化」の4つの方法が考えられる。揮発性脂肪酸産生のためのトウモロコシ茎葉の長期ルーメン微生物発酵 in vitro。Bioresour Technol 358:127447.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際研究交流大学校
Google Scholar
53.
ブロデリックGA、カンJH. 1980. ルーミン液および試験管内培地中のアンモニアおよび全アミノ酸の自動同時測定。J Dairy Sci 63:64-75.
引用元へ
Crossref
PubMed
ISI
Google Scholar
54.
Makkar HP, Sharma OP, Dawra RK, Negi SS. 1982. ルーメン液中の微生物タンパク質の簡易測定法。J Dairy Sci 65:2170-2173.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
55.
アガーワル N、カムラ DN、チャウダリー LC、アガーワル I、サフー A、パタック NN. 2002. 異なる微生物飼料添加物を与えた交雑子牛の微生物状態およびルーメン酵素プロファイル。Lett Appl Microbiol 34:329-336.
引用元へ
Crossref
PubMed
国際学会
Google Scholar
56.
AOAC. 2005. AOAC International の公定分析法、第 18 版 Association of Official Analytical Chemists、Gaithersburg、MD。
引用元へ
Google Scholar
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