閉塞性睡眠時無呼吸症候群は、糞便中のマイクロバイオームの変化と腸管バリア機能の低下に関連している
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公開日：2023年1月15日
閉塞性睡眠時無呼吸症候群は、糞便中のマイクロバイオームの変化と腸管バリア機能の低下に関連している
Qianjun Li, Ting Xu, ...Taoping Li 著者名を表示する
Scientific Reports 13巻 記事番号：778 (2023) この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
閉塞性睡眠時無呼吸症候群（OSA）は、繰り返される上気道虚脱、間欠的な低酸素症、および腸管バリア機能障害に関連している。その結果、腸管バリアの損傷は、腸内細菌叢に影響を及ぼすか、または影響を受ける可能性がある。南方病院睡眠医療センターの被験者48名を含む前向き症例対照を使用した。睡眠時無呼吸症候群は、一晩の睡眠ポリグラフ検査によって診断された。被験者から糞便サンプルと血液サンプルを採取し、糞便マイクロバイオーム組成（16S rDNA遺伝子増幅および配列決定による）および腸管バリアバイオマーカーである腸管脂肪酸結合タンパク質（I-FABP）およびD-乳酸（D-LA）（それぞれELISAおよび比色測定による）の検出を実施した。OSA患者では、血漿D-LAおよびI-FABPが有意に上昇した。OSAの重症度は、糞便マイクロバイオームの構造および組成の違いと関連していた。重度OSA患者では、Fusobacterium、Megamonas、Lachnospiraceae_UCG_006が濃縮され、Anaerostipesの減少が認められた。腸管バリアーバイオマーカーが高い患者では、Ruminococcus_2、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG_006、およびAlloprevotellaが濃縮されていることが明らかになった。LachnoclostridiumとLachnospiraceae_UCG_006はOSAと腸管バリアー損傷の共通の支配菌であった。FusobacteriumとPeptoclostridiumは無呼吸-低呼吸指数（AHI）と独立して関連していた。また、重症OSAの優占菌は、グルコース、脂質、好中球、単球、BMIと関連していた。ネットワーク解析により、糞便マイクロバイオーム、腸管バリアバイオマーカー、AHIの間の関連性が確認された。本研究は、OSA患者において、腸内細菌叢の変化が腸管バリアバイオマーカーと関連していることを確認するものである。これらの変化は、OSAに関連する全身性炎症および代謝性併存疾患において病態生理学的役割を果たし、OSAの多臓器病変につながる可能性がある。
はじめに
閉塞性睡眠時無呼吸症候群（OSA）は、睡眠中に上気道の虚脱と気流の停止を繰り返し、間欠的低酸素症（IH）や睡眠の断片化（SF）を引き起こす、一般的な睡眠呼吸障害の一種です1,2。OSAは世界で10億人近くを苦しめており、その数は中国が最も多く、次いで米国、ブラジルの順となっています3。OSAは、末端臓器の罹患と多系統の機能不全を示す複雑な疾患です4。しかし、OSAによる多臓器疾患の病態生理学的メカニズムは未だ解明されていません。OSA の固有の表現型のバリエーションには、遺伝的および環境的要因が密接に関係しています5。しかし、それらはOSAの表現型の違いのごく一部を占めているに過ぎない。糞便マイクロバイオームは、人体で最大のゲノムです。その障害は、喘息、アレルギー、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患、心血管疾患、および全死因死亡率の増加などの多系統の疾患と関連しています6,7,8。糞便マイクロバイオームもまた、OSA および OSA に起因する多臓器疾患において本質的な役割を果たす可能性があります。腸内細菌叢の変化は、OSA を模擬した動物モデルで報告されています。ラットモデルでは、腸内細菌叢のアンバランスがOSA-誘発性高血圧の発生に関与していた9。Xueらは、OSAによって誘発された腸内細菌叢の変化が動脈硬化の発症に及ぼす潜在的な役割について調査した10。しかし、OSA 患者の腸内細菌叢を直接調査した研究はほとんどない。OSA 患者に腸内細菌叢の乱れがあることを発見した成人の臨床研究は 1 件のみであった11。この新しい研究では、一部の神経症状が腸内細菌叢の乱れと関連している可能性があることが提唱されています12。また、腸内細菌叢の変化は概日時計の乱れを引き起こし、代謝障害につながる可能性があります13。したがって、腸内細菌叢の変化は、ひいては宿主の表現型の変化を媒介し、末端臓器疾患として現れることになる。
現在、より多くの研究が、虚血の存在下、低酸素誘発性腸機能障害、腸粘膜上皮しばしば壊死、剥離14,15のような特定のリンクの存在に関連していることが判明している。特に、低酸素環境要因の影響により障害が発生し、高原の高度になるほどフリーラジカル反応の強さが増し、一度腸粘膜が損傷すると、そこに植え付けられた腸内フローラが必然的に障害されるようになる16。Lavieは、酸化ストレスが十二指腸のHIF-1αをアップレギュレートし、上皮タイトジャンクション蛋白の発現を低下させ、腸管バリアの透過性を変化させること、低酸素が炎症を誘発し、炎症反応のある組織はしばしば低酸素を増悪させる、正のフィードバック現象であることを明らかにした17。間欠的低酸素症の期間が長くなると、腸管粘膜が著しく損傷し、透過性が高まることが明らかになった。本研究では、腸内フローラの変位が腸間膜リンパ節の構造的損傷を悪化させ、酸化ストレスのレベルを高めることが報告されている18。
腸管バリアの破壊に伴う腸内細菌叢の変化も、全身性炎症の拡大、代謝異常19,20、多臓器不全21を引き起こす重要な要因のひとつである。腸管は微生物と宿主のインターフェースであり、腸内細菌および毒性媒体の腸管外への流出を制限しています。D-乳酸（D-LA）は、消化管内細菌の発酵産物であり、細菌の移動22、腸管損傷、腸管透過性23の指標として機能した。腸管脂肪酸結合蛋白（I-FABP）は、初期の上皮障害の血液マーカーとして認識されている。急性腸管虚血、炎症、低酸素の発作の後、このレベルは急速に上昇した19,24。血漿D-LAおよびI-FABPは、腸管バリア障害の最も有望かつ妥当なバイオマーカーと考えられている19,25。成人11および小児26の両方におけるOSAの研究により、これらの患者が重度の腸内細菌叢のアンバランスを有することも示されている。しかし、OSAの腸管バリア機能障害とマイクロバイオームを関連付けるヒトの研究からの証拠は不足している。
そこで、OSA患者における腸内細菌叢の異常と腸管バリアー統合性の低下の関係について検討する。
方法
前向き症例対照研究を実施した。18～65歳のOSAが疑われる患者を本研究に連続的に登録した。参加者は全員、非ベジタリアンで伝統的な中華料理を食べていた。ポリソムノグラフィー（PSG）後の翌朝に糞便サンプルと空腹時静脈血を採取した。被験者は、心血管、脳血管、悪性腫瘍、呼吸器系、血液系、消化管、腎臓、甲状腺の疾患を患っておらず、持続気道陽圧（CPAP）治療を受けている者はいなかった。また、登録前2カ月間に抗生物質や微生物修飾剤の投与を受けている者はおらず、手術を受けている者もいなかった。各参加者のインフォームドコンセントのもと、南方病院倫理委員会から研究承認を得た（NFEC No.2019-091）。
ポリソムノグラフィー研究
すべての被験者が、脳波、眼電図、筋電図、心電図を含む標準的なPSGを1晩使用した。技師は午後10時から午前7時までPSGを実施し、訓練を受けた睡眠医が米国睡眠医学会ガイドライン27に基づきPSGデータを手動で採点した。AHIは、1時間あたりの無呼吸エピソード（ベースラインから90％以上の気流低下が10秒以上）と1時間あたりの低呼吸エピソード（10秒以上の気流低下と指脈酸素飽和度の低下3％以上）を合計した時間である。全参加者をAHIスコアにより4群に分けた。OSA なし（AHI＜5 回/時）、軽度 OSA（5≦AHI＜15回/時）、中度 OSA（15≦AHI＜30回/時）、重度の OSA（AHI ≧30回/時）28.
検体の採取と測定
ほぼ12時間の絶食後（午後8時から翌日午前8時まで）、新鮮な糞便試料1gを滅菌便管に採取して-80℃の冷蔵庫で保存し、その後の分析に備え、PSG後の午前7時から午前8時に空腹時静脈血を採取した。そのうちの2mlをヘパリン抗凝固チューブで採取し、遠心分離（3500×g、4℃、10分）して分離し、その後の腸管バリア機能解析のために-80℃で保存した。脂質、グルコースなどの他の血液指標は、自動生化学分析装置（Beckman AU5431、米国）で測定した。血液検査は、血液分析装置（UniCel DxH800、米国）により抵抗法（Coulter原理）で行った。
除外基準は以下の通りである。
インクルージョン 包含：18-65 歳の OSA 疑い患者、非菜食主義者、伝統的な中華料理。
除外項目：心臓血管、脳血管、悪性腫瘍、呼吸器系、血液系、消化器系、腎臓、甲状腺の疾患を有する者、持続気道陽圧（CPAP）治療を受けた者、登録前2ヶ月間に抗生物質または微生物修飾剤の投与を受けた者、外科手術を受けた者。
I-FABPとD-LAの血漿濃度は、製品の説明書に従って、高感度ELISA（Quantikine；米国；カタログ番号DFBP20）およびColorimetric Assay（BioVision；米国；カタログ番号K667）により測定された。I-FABPおよびD-LAの検出限界はそれぞれ2.12 pg/mLおよび0.01 mMであった。
ビーズビートアイソレーションは、QIAamp DNA Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) を用いて、製造者のプロトコールに従ってゲノムDNAの抽出を行った。抽出されたDNA濃度はQubit 2.0 Fluorometer (Life Technology, Carlsbad, CA)で測定した。DNAの品質は1.0%アガロースゲル電気泳動で検出した。その後、16S rDNA遺伝子領域（V3およびV4）をPCRで増幅した。16S rDNAライブラリーは、Illumina MiSeqプラットフォームPE300モード（Illumina、米国）で、V3試薬キットを用いて250 bpペアエンドランで配列決定された。配列は、Silva v128データベースの97%の同一性を用いて、運用可能な分類単位（OTU）に集約された29。
バイオインフォマティクスと統計解析
定量的データは平均値±標準偏差または中央値（四分位範囲）で表示し、比較はWilcox、Kruskal-Wallis順位和検定またはMann-WhitneyまたはANOVAで行った。定性的データは数量（率）で表示し、比較はカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定で行った。連続変数との相関は、スピアマンまたはピアソン相関検定で評価した。16Sデータをもとに、α(α)多様性指標（Observed OTU richness, Shannon Diversity）、PCoA（unweighted-Unifrac distance, Adonis）に基づくβ(β)多様性指標を用いて群間の差異を評価した。線形判別分析（LDA）とLDA効果量（LEfSe）（LEfSe 1.0）を用いて、グループ間の分類学的差異を評価した。重回帰を用いて、臨床変数（性別、年齢、BMI、AHIなど）と重症OSA群で確認された微生物叢の特徴との関係を分析した。その後、ネットワークを利用して、糞便マイクロバイオーム、腸管バリアバイオマーカー、AHIの関係を提示した（Cytoscape_v3.9.1）。データの統計解析は、SPSS（バージョン21.0）およびRソフトウェア（v3.5.1）で実施した。P < 0.05は、統計的に有意な差があったことを示す。
倫理的承認と参加への同意
南方病院倫理委員会から承認を得た（NFEC No.2019-091）。本研究で使用した手順は、ヘルシンキ宣言の教義を遵守している。本研究の各参加者からインフォームドコンセントを取得した。
結果
2019年5月から2019年11月にかけて、当睡眠センターで計193名の患者をスクリーニングし、最終的に48名が解析に含まれた（図1）。当睡眠センターにおけるOSAの有病率は高く（37/48人；77％）、参加者の31％が重度のOSAであった。OSAは男性、AHI、BMIと正の相関があり、SaO2とは負の相関があった。腸管バリアマーカーのレベルは、軽症群のI-FABPを除き、異なるOSAカテゴリーで対照群より高かった（P≦0.01）。D-LAのレベルはI-FABPと有意に関連していた（Spearman rho = 0.429, p = 0.002）。しかし、年齢、高血圧、糖尿病では有意差はなかった（表1）。
図1
図1
患者さんの流れ図
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表1 参加者のベースライン特性および腸管バリアマーカー。
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グループ内の微生物叢の特徴
合計3980179個のペアエンドリードが達成され、平均117491個のノンキメラタグとサンプルあたり平均421個のOTUが得られました。糞便サンプルの属レベルで最も多い分類群のヒートマップでは、腸内細菌叢はほとんどのサンプルでBacteroides、Faecalibacterium、Blautia、Lachnospiraの相対存在度が高いことが示された（図2）。
図2
図2
48の便サンプルの属レベルでのヒートマップ。Bacteroides、Faecalibacterium、Blautia、Lachnospiraの比率が高いことがわかる（比率0.5%以上をアノテーション、0.5%未満をその他として分類）。
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次に、OSAの重症度が様々な参加者の間で、OSAなしと比較して、糞便マイクロバイオームの違いを評価した。α多様性解析では、Observed OTU richnessとShannon diversity indexに、対照被験者とOSAの間で差がないことが示された（補足図S1）。他の種の多様性指標（Simpson）および豊かさ（ACE、Chao）も統計的に有意ではなかった（補足表S1）。PCoAに基づくβ多様性解析では、重症度の異なるOSAの構成に有意差が認められた（図3A；Adonis p = 0.044）。さらにペアワイズ解析（重症度の異なるOSA群とOSAなし群の比較）では、重症OSA被験者のマイクロバイオーム特性はOSAなし群のそれと有意に分離していた（図3B；Adonis p＝0.008）。同時に、他のOSA群とOSAなし群における差も同様であった（補足図S2）。Unweighted uniFrac distanceは、サンプル間の組成の類似性の程度を示す指標であった。距離が近いほど、サンプルの種組成はより類似しており、その逆もまた然りである。
図3
図3
OSAと重度OSAの異なる重症度グループにおけるβ多様性の違い。(A) OSAの異なる重症度グループとOSAなしとの間のPCOA（Unweigther-Unifrac距離） (Adonis P = 0.044) および (B) 重症OSAとOSAなしとの間 (Adonis P = 0.005)．
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群間における分類群の違い
腸内細菌の分類群の違いを明らかにするために、LDAとLEfSeを使用しました。OSA被験者の異なる重症度からの上位4属の腸内細菌叢は、OSA被験者なしと比較して、Fusobacterium、Lachnoclostridiumに富み、Ruminococcaceae_UCG_013に減少した（図4A、補図S3A）。重度OSA患者の微生物叢はFusobacterium, Megamonas, Lachnospiraceae_UCG_006に富み、Anaerostipesに減少した（図4B、補図S3B）。軽症群ではTuricibacterとLachnoclostridiumが増加し、HoldemanelleとEnterococcusが減少した（図4C, 補足図S3C）。一方、中等度OSAではFusobacterium, Megamonas, Lachnoclostridiumで増加し、Eubacterium_rectale_groupで減少した（図4D, 付録図S3D)。さらに、重症OSAの全サンプルにおいて相対存在量が0.5%以上の上位4属の分類群を相対存在量の散布図によって解析した（図4E）。菌門レベルでは、Fusobacteriaが4つのグループ間で有意差を示した（P = 0.0173）。しかし、Firmicutes、Bacteroides、Actinobacteria、Proteobacteriaは有意差を認めず（補足表S2、Firmicutes（F）/Bacteroides（B）比率も同様）（補足図S4）、また、Proteobacteriaは4群間で有意差を認めなかった。
図4
図4
重症度の異なるOSAにおける分類群の違い。LEfSeは、（A）OSA対OSAなしの異なる重症度グループ（クラスカル・ウォリス）、（B）重症OSA対OSAなし（ウィルコックス）における微生物相の違いを同定している。(C)軽度OSA対OSAなし(Wilcox)。(D)中等度OSA対OSAなし(Wilcox)。(E) 重症OSA参加者のすべてのサンプルで相対存在量が0.5%以上の属レベルの細菌の散布図(Wilcox)。
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相関分析および回帰分析
臨床変数と、重症OSAの全サンプルで相対存在度が0.5％より大きい微生物叢特性との間の潜在的な関係を推定するために、スピアマン分析を実施した。微生物叢の特性とAHI、SaO2、BMI、グルコース、TG、TCHO、HDL、LDL、腸管上皮バリアマーカーの間に有意な関連性が認められた。D-LAレベルは、Lachnoclostridium、Megamonas、Fusobacteriumの存在量と正の相関があり、PeptoclostridiumとAnaerostipesとは負の相関があった（表2）。一方、I-FABPレベルはPeptoclostridiumと負の相関があった。さらに、ペプトクロストリジウムはNeutrophilsおよびMonocytesと有意な相関があった（表2）。重症OSAと上記の微生物叢特性との独立した関係をさらに調べるために、重回帰分析を行った。重度OSAとの有意な関連性が確認された。AHIが高いほど、年齢、BMI、および性別とは独立して、Fusobacterium（B = 0.538, P = 0.041）およびPeptoclostridium（B = - 0.491, P = 0.046）の相対存在度が高くなると予測した（Table 3）。
表2 重症OSAの変数と微生物叢の特性の相関分析。
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表3 重症OSAの微生物叢シグネチャとベースライン特性との間の重回帰分析。
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腸管バリアバイオマーカーと微生物叢
腸管バリアー機能障害と腸内細菌叢機能障害の関係の可能性を調べるため、腸管バリアーバイオマーカーの高値および低値と腸内細菌の変化の関連性を評価した。D-LAおよびI-FABPの高値および低値のサブグループを定義した。高バイオマーカーサブグループはバイオマーカー値が第4四分位値（最高25％）、低バイオマーカーサブグループは第3四分位値（0～75％）である。Unweighted-Unifracに基づくPCoAでは、D-LAの高低で腸内フローラの構成に有意差があったが（図5A；Adonis P = 0.049）、α多様性に差はなかった（補足図S5）。I-FABP群ではα、βの多様性ともに差はなかった（補足図S5B、図5B）。LEfSe解析により、グループ間で濃縮された分類群が異なることがわかった。D-LAが高い試料は、Ruminococcus_2、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG_006に富み、Senegalimasciliaが減少していた（図5C）。I-FABPが高い試料は、Alloprevotelleに濃縮されていた（Fig.5D）。したがって、本研究では、OSAにおける腸内細菌叢の濃縮と腸管バリアの関係が示された。
図5
図5
腸内細菌叢の変化と腸管バリア機能不全の相関。A）D-LA高値対低値（Adonis p = 0.049）、（B）I-FABP高値対低値（Adonis p = ns）間のベータダイバーシティを示す。(C）D-LAが高い腸内細菌叢は、Ruminococcus_2、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG_006に富み、Senegalimasciliaが減少していた（Wilcox）。(D）I-FABPが高い腸内細菌叢はAlloprevotellaに富んでいた（Wilcox）。
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ネットワーク解析
腸内細菌叢、腸管バリア、AHIの関係をさらに探るため、属レベルで共起ネットワークを構築した（＞相対的存在量0.5％種）。グラフは正の相関がある特徴を表した。ネットワーク解析により、腸内細菌叢に共存する傾向のあるメタコミュニティが定義され、その分類群が同定された。その結果、Ruminococaceae_NK4A214_group、Olsenella、Ruminococcaceae_UCG_014、Alloprevotellaが共起しているメタコミュニティが存在することが明らかになった。AHI、D-LA、I-FABPはそれぞれ固有の腸内細菌叢と関連していた。Streptobacillus、Prevotellaceae_UCG_003、Rikenellaceae_RC9_gut_groupは3つの属の中で相互に関連していた（図6）。このように、腸内細菌叢はOSAや腸管バリアーに関連していることが示唆された。
図6
図6
分類群、AHI、腸管バリアバイオマーカーの間のネットワーク。SparCCを使用して、属分類ネットワークを構築した。正の相関を持つ変数がネットワークに保持された（細菌と臨床指標の相関係数は≥0.4、細菌と細菌の相関係数は≥0.7であった）。AHI，D-.LA，I-FABPは固有の分類群に関連していた。Streptobacillus属，Prevotellaceae_UCG_003属，Rikenellaceae_RC9_gut_groupが一般的な属として挙げられた。腸内常在菌はAHIと腸管バリアバイオマーカー（D-LAとI-FABP）を共起していた。
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さらに、異なる重症度レベル（軽度／中等度／重度OSA）における腸管バリア、AHI、マイクロバイオーム間の共起ネットワークを補足図S6に示した。この図から、軽度OSAでは、Megamonas、Peptoclostridium、Senegalimassiliaが3つの相互属であり（補足図S6A）、中度OSAでは、Alloprevotellaが3つの相互属である（補足図S6B）ことが分かる。重度OSAでは、Lachnospiraceae_UCG_001、Ruminiclostridium_6、Eubacterium_xylanophilum_groupが3つの属間関係となった（補足図S6C）。このように、異なる属の菌が共存していることから、今後さらに研究を進める必要がある。
考察
OSAは、心血管疾患や代謝異常を伴う全身性の包括的な疾患である。IHは、OSAおよびそれに関連する多臓器病態において重要な役割を果たすが、その作用機序は十分に解明されていない。本研究では、OSA患者において腸内細菌群の変化が腸管バリアバイオマーカーと関連し、重症OSAの優占種がグルコース、脂質、好中球、単球、BMIとも関連することが確認されました。ネットワーク解析により、腸内細菌叢、腸管バリアバイオマーカー、AHIの間の関連性が確認された。これらの変化は、OSAに関連する全身性炎症および代謝性併存疾患において病態生理学的役割を果たし、OSAの多臓器病変につながる可能性がある。
本研究では、OSAと腸管バリアバイオマーカーの増加との間に関連性があることを発見したが、これはユニークなマイクロバイオームプロファイルとも関連しており、D-LAレベルはLachnoclostridium、Megamonas、Fusobacteriumと正の相関、PeptoclostridiumおよびAnaerostipesとは負の相関があった。I-FABPレベルはPeptoclostridiumと負の相関を示した。β-Diversityでは、D-LA高値群と低値群で微生物群集組成に有意差があり、血漿D-LA高値はRuminococcus_2、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG_006と正に、Senegalimasciliaと負に相関したが、I-FABP高の便中微生物相はAlloprevotellaに濃縮されていた。このことから、上皮バリアの障害は特定の微生物叢の濃縮と関連していることが示唆された。OSAにおける腸管バリアの変化の増加は、循環血中I-FABP、D-LAおよびリポポリサッカライド結合タンパク質が増加することなど、よく知られている23,30,31。我々は以前、循環血中 D-LA および I-FABP が健常者と比較して OSA で有意に上昇していることを報告した19。
本研究および関連文献の報告から、反復的な低酸素症が上皮障害の原因となり、腸内細菌叢の異常が生じ、これらの有害因子が腸管透過性を高めることで腸の機能を損なうと推測される。繰り返される低酸素症は、腸内細菌叢のディスバイオーシスにつながる上皮障害の原因である。低酸素と再酸素の繰り返しは、腸管透過性の増加、細菌の移動、およびタイトジャンクションの完全性の低下により、腸管機能を損なう可能性がある25,26。OSA における腸管バリアの変化は、循環血液中の I-FABP、D-LA、リポポリサッカライド結合タンパク質の増加など、よく知られています18,27,28。睡眠時無呼吸症候群のマウスモデルでは、PrevotellaとDesulfovibrioによる腸内コロニー形成が腸管透過性の上昇に寄与していることが示されている29。ヒトでは、慢性疲労症候群患者の顔面からStreptococcusやEnterococcusなどのD-乳酸産生菌が検出されている12。さらに、腸内細菌転化産物（エンドトキシンおよびD-乳酸）の著しい増加は、全身性の炎症と関連しており、有害な心血管イベントを予測することが可能であった30。我々は以前、OSAにおいて循環血中D-LAおよびI-FABPが健常者と比較して有意に上昇していることを報告した14。今回の調査でも、OSAと腸管バリアバイオマーカーの増加の間に関係があることが判明した。これらのバイオマーカーは、固有のマイクロバイオーム・プロファイルとも関連していた。D-LAレベルは、Lachnoclostridium、Megamonas、Fusobacteriumと正の相関があり、Peptoclostridium、Anaerostipesと負の相関があった。I-FABPのレベルはPeptoclostridiumと負の相関があった。β-ダイバーシティでは、D-LA高値群と低値群で微生物群集組成に有意差が見られた。血漿D-LA高値はRuminococcus_2、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG_006と正相関、Senegalimasciliaと負相関があり、I-FABP高値の糞便の微生物相はAlloprevotellaに富むことが示された。このことから、上皮バリアーの損傷と特定の微生物相の濃縮が関連していることが示唆された。FusobacteriumとLachnoclostridiumはいずれも差分菌であり、DESeqとLEFseの両手法で再度確認された。
さらに、低酸素は腸内細菌叢の異常に直接影響を与える。Morenos-Indiasらは、OSAを模倣した動物モデルにおいて、腸内細菌群集構造の著しい変化を見出した32。マウスモデルで暴露されたIHは、累積的に糞便中の微生物相と代謝を破壊した33。これらの動物モデルは、慢性的な OSA の場合と類似しており、通常のレベルの酸素と比較して腸内細菌叢に変化が見られました。ヒトにおいても、腸内酸素濃度の上昇は、糞便および粘膜付着微生物叢（例えば、ProteobacteriaおよびActinobacteria）の構成に影響を与える30。また、上気道閉塞による低酸素の繰り返しは、血液灌流するすべての臓器に局所的な発現をもたらす可能性がある34。したがって、OSAでは異なる粘膜でマイクロバイオームの変化が起こる可能性があります。たとえば、鼻のマイクロバイオームの変化は、OSAおよび炎症性バイオマーカーに関連している35。OSA の肺のマイクロバイオータは、対照被験者のものとは異なっている36。小児OSA患者では口腔内細菌叢が著しく乱れ、OSA関連のメタボロミクスを引き起こしている37。OSA の 2 つの本質的な特徴である IH と SF は、消化管の多くの部分で低酸素環境も確立していた38。Albenberg らは、宿主の酸素供給が腸管内腔の酸素供給に影響を与え、腸内細菌学の組成を変化させることを観察した30。腸内の酸素が減少すると、偏性嫌気性微生物（ProteobacteriaやActinobacteriaなど）の競争力が増し、過剰増殖が可能になった30。同時に、組織の酸素化が進むと、還元性嫌気性菌などの微生物に直接影響を与えることができる39。したがって、腸は好気性および通性嫌気性生物の生存を助長するユニークな環境を提供している可能性がある。
我々の研究では、OSAは、糞便マイクロバイオームのβ多様性の変化と関連していた。重症度の異なるOSA被験者では、OSAでない場合と比較して、FusobacteriumとLachnoclostridiumの腸内細菌叢が濃縮され、Ruminococcaceae_UCG_013が減少していた。重症のOSAでは、Fusobacterium、Megamonas、Lachnospiraceae_UCG_006が豊富で、Ruminococcaceae_UCG_013が減少していた。これはKo C.らと一致しており、Ruminococcaceaeの相対的存在量は対照群で多かった11。これは、DNA抽出キットやPCR増幅プライマー、クラスタリング方法が異なるため、あるいは参加者の生活圏やライフスタイルが異なるため、あるいは我々のサンプルが比較的小さいためかもしれない。しかし、我々は、重度グループでMegamonasが濃縮されているだけでなく、中度グループでも増加していることを見いだした。一方、Ko C.らは、重度群ではメガモナの減少しか認めなかった。今回の結果を検証するためには、今後の臨床研究が必要である。それから、FusobacteriumとPeptoclostridiumは、重症OSAと独立した関係を示したので、OSAに関連する腸内細菌叢障害のリスクのある被験者の特定に有用かもしれません。また、LachnoclostridiumやLachnospiraceae_UCG_006など、上記の糞便マイクロバイオームの違いのいくつかは、腸管バリアバイオマーカーとの関連も見られた。さらに、中等度群のマイクロバイオータのシグネチャーの違いは、重度群のそれと非常に近いものであった。したがって、軽症群を研究に含めずに、中等症群と重症群を一つのOSA群としてOSAなし群と比較することの妥当性を支持するものであった40。
さらに、重症OSAの微生物叢の特徴は、睡眠パラメータと有意な相関があるだけでなく、脂質やBMIとも関連があった。Anaerostipesは空腹時血糖値と、Peptoclostridiumは好中球および単球と相関していた。したがって、これらの微生物相の変化は、低悪性度の慢性炎症41、免疫異常、代謝異常を引き起こす可能性がある。フソバクテリウムは、心血管疾患42、大腸がん43、口腔および肺の感染症44,45と関連していることが知られています。メガモナス（Megamonas）は、慢性腎臓病と相関がある46。Alloprevotellaは、感染症や糖尿病と相関している47,48。したがって、これらの微生物の変化は、OSAによって引き起こされる多系統および多臓器疾患において重要な役割を果たす可能性があります。また、我々の研究では、重症OSA群の微生物叢の特徴は、腸管バリアバイオマーカーと有意な相関があることがわかった。共起ネットワーク分析により、糞便マイクロバイオーム、腸管バリアバイオマーカー、AHIの間に関連性があることが確認されました。これらの結果は、OSAにおける腸管バリア機能不全が細菌機能不全と関連していることを示唆するものであった。
最近、Mashaqi Sは、OSAと腸内細菌異常症に関するレビューで、ほとんどの研究がF/B比が増加した動物モデルで実施されていることを発見した41。また、小児では、いびきをかく人のF/B比は対照群より高かった26。これまでの動物モデルや小児の研究とは異なり、OSA患者におけるα多様性やF/B比率に有意差は認められなかった。しかし、我々の結果は、別の成人OSA研究11と一致している。これは、ヒトと動物では腸内環境が異なるからかもしれません。Colladoらは、いびきをかく子供をアンケートで登録し、PSG検査を行わなかったため、この検査を行わない子供では、いびきやOSAを診断する能力に欠ける。さらに、小児の腸は十分に発達していない可能性があり49、食事構成や低酸素に対する耐性が成人とは異なる可能性がある。我々の知見を裏付けるために、成人のOSAの腸内細菌叢に関するさらなる研究が今後必要である。
本研究の利点は、腸内細菌叢とOSAの関係の臨床的評価だけでなく、D-LAおよびI-FABPの血中濃縮との関連性の新規評価も含まれていることである。OSAにおける腸内細菌叢の病態生理学的役割と腸管バリアの変化を支持した。しかし、いくつかの欠点もある。第一の欠点は、対象としたサンプルサイズが比較的小さいことである。OSAの腸内フローラはOSAなしと統計的に有意な差があったが、軽度および中等度のOSAではαおよびβの多様性に差は見られなかった。第二に、腸内細菌叢に影響を与える可能性のある参加者の詳細な食習慣と身体活動を収集していない50,51。第三に、我々は最も重要な睡眠パラメータに焦点を当て、睡眠段階や睡眠効率などの他の睡眠指標は含まれておらず、今後これらを考慮する必要がある。さらに、腸管バリアバイオマーカーと腸内細菌叢に対する微生物叢修正戦略（CPAP、マイクロエコロジーモジュレーターなど）の効果については評価しなかった。今後の研究では、因果関係を評価するために、より縦断的で介入的な調査が必要かもしれない。個別化された疾患治療プロトコルの開発において精密医療が重要な役割を果たす中。腸内細菌組成と代謝成分へのアプローチも、OSAの個別化治療において重要な役割を果たすようになるだろう。本研究は、OSAと病態への腸内フローラの関与に科学的根拠を与えるものであり、OSAが腸内フローラを通じてどのように宿主代謝を調節しているかは今後の研究に値すると考えられ、関連臨床研究の報告は国内外ともにほとんどない。そのため、今後さらに多施設・大規模サンプルでの臨床研究が必要である。
おわりに
本研究では、OSAが腸内細菌叢の構造に大きな変化をもたらし、それによって宿主と腸内細菌叢の間の恒常性関係が変化し、最終的には疾患だけでなく多臓器障害につながる可能性さえあることを、ヒト検体を用いてモデルを構築することでさらに証明することができた。この知見は、患者固有の微生物叢プロファイルを対象とした標的治療法を開発する臨床的機会を提供する可能性があります。
データの利用可能性
本研究で取り上げたデータセットはNCBIのSequence Read Archive（SRA）に寄託されており、SRAシリーズのアクセッション番号PRJNA851918でアクセス可能である。本研究で作成または解析された他のデータセットは、本論文およびその補足情報ファイルに含まれている。
参考文献
Young, T., Peppard, P. E. & Gottlieb, D. J. Epidemiology of Obstructive sleep apnea（閉塞性睡眠時無呼吸症候群の疫学）: 集団衛生の観点から。Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165(9), 1217-1239 (2002).
論文
Google Scholar
Douglas, N. J. & Polo, O. Pathogenesis of Obstructive sleep apnoea/hypopnoea syndrome（閉塞性睡眠時無呼吸症候群の病態）. Lancet 344(8923), 653-655 (1994)です。
論文
CAS
Google Scholar
Benjafield, A. V. et al.閉塞性睡眠時無呼吸症候群の世界的な有病率と負担の見積もり。文献に基づく分析。Lancet Respir. Med. 7(8), 687-698 (2019).
論文
Google Scholar
Farré, N., Farré, R. & Gozal, D. Sleep Apnea morbidity. Chest 154(4), 754-759 (2018)に掲載されています。
論文
Google Scholar
Riha, R. L., Gislasson, T. & Diefenbach, K. The phenotype and genotype of adult obstructive sleep apnoea/hypopnoea syndrome（成人の閉塞性睡眠時無呼吸・呼吸低下症候群の表現型と遺伝子型。ユーロ。Respir. J. 33(3), 646-655 (2009).
論文
CAS
Google Scholar
Carmen Collado, M., Rautava, S., Isolauri, E. & Salminen, S. Gut microbiota（腸内細菌叢）。ヒトの疾病リスクを低減するための新規ツールの源か？小児科医。Res. 77(12), 182-188 (2015)に掲載されています。
論文
Google Scholar
Everard, A. & Cani, P. D. Diabetes, obesity and gut microbiota. ベストプラクティス。Res. Clin. Gastroenterol. 27(1), 73-83 (2013).
論文
CAS
Google Scholar
Heianza, Y., Ma, W., Manson, J. E., Rexrode, K. M. & Qi, L. Gut microbiota metabolites and risk of major adverse cardiovascular disease events and death（腸内細菌叢代謝産物と主要な有害心血管疾患イベントおよび死亡リスク）: 前向き研究のシステマティックレビューとメタアナリシス。J. Am. Heart Assoc. 6, e0049477 (2017)に掲載されています。
論文
Google Scholar
Durgan, D. J. et al. 閉塞性睡眠時無呼吸症候群による高血圧における腸内細菌叢の役割. Hypertension 67(2), 469-474 (2016).
論文
キャス
Google Scholar
Xue, J. et al. 間欠的な低酸素および高炭酸は、部分的にトリメチルアミンオキシドを介して動脈硬化を加速する。Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 57(5), 581-588 (2017)に掲載されています。
論文
キャス
Google Scholar
Ko, C. et al. 閉塞性睡眠時無呼吸-低呼吸症候群における腸内細菌叢。疾患関連ディスバイオーシスと代謝性併存疾患。Clin. Sci. 133(7), 905-917 (2019)に掲載されています。
論文紹介
キャス
Google Scholar
Sheedy, J. R. et al. 慢性疲労症候群患者におけるd-乳酸腸内細菌の増加。In Vivo 23(4), 621-628 (2009)。
CAS
Google Scholar
Thaiss, C. A. et al. Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis（微生物叢の日内振動のトランスキングダムコントロールは代謝の恒常性を促進する）。Cell 159(3), 514-529 (2014)です。
論文
CAS
Google Scholar
Luo, H., Guo, P. & Zhou, Q. Q. 低酸素に曝されたラットの腸粘膜バリア機能の損傷と細菌のトランスロケーションにおけるTLR4/NF-κBの役割. PLoS ONE 7(10), e46291 (2012).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Kayser, B. & Verges, S. 低酸素症、エネルギーバランス、および肥満。アップデート。Obes. Rev. 22(2), 1 (2021).
Google Scholar
Zhang, J. H. et al. Plateau hypoxia attenuates the metabolic activity of intestinal flora to enhance the bioavailability of nifedipine.高原低酸素は腸内細菌叢の代謝活性を減衰させ、ニフェジピンのバイオアベイラビリティを高める。Drug Deliv. 25(1), 1175-1181 (2018).
論文
キャス
Google Scholar
Lavie, L. Oxidative stress-A unifying paradigm in obstructive sleep apnea and comorbidities（酸化ストレス-閉塞性睡眠時無呼吸症候群と併存症における統一的なパラダイム）。Prog. Cardiovasc. Dis. 51(4), 303-312 (2009).
論文
CAS
Google Scholar
Han, N. et al. Hypoxia: The invisible pusher of gut microbiota（低酸素：腸内細菌叢の「見えない押し手」）. Front. Microbiol. 12, 690600 (2021).
論文
Google Scholar
Li, Q. et al. Impaired intestinal barrier in patients with obstructive sleep apnea.（閉塞性睡眠時無呼吸症候群患者における腸管バリアー障害）。スリープブレス。25(2), 749-756 (2021).
論文
Google Scholar
Mehra, R. & Teodorescu, M. 睡眠、概日リズムの乱れ、および微生物と免疫の相互作用。Chest 154(4), 740-742 (2018)です。
論文
Google Scholar
Swank, G. M. & Deitch, E. A. Role of the gut in multiple organ failure（多臓器不全における腸の役割）。バクテリアのトランスロケーションと透過性の変化。World J. Surg. 20(4), 411-417 (1996).
論文
CAS
Google Scholar
Clausen, M. R., Bonnén, H., Tvede, M. & Mortensen, P. B. antibiotic-associated diarrheaにおいて短鎖脂肪酸に対する大腸発酵が低下していること。Gastroenterology 101(6), 1497-1504 (1991).
論文
CAS
Google Scholar
Heizati, M. et al. 血清d-lactateの増加は、OSAを有する中年非肥満男性における腸管バリアの潜在的過透過性を意味するのか？Medicine (Baltimore) 96(49), e9144 (2017).
論文
キャス
グーグル スカラー
Derikx, J. P. M., Schellekens, D. H. S. M. & Acosta, S. Serological markers for human intestinal ischemia（ヒト腸管虚血の血清マーカー）: システマティックレビュー。ベストプラクティス。Res. Clin. Gastroenterol. 31(1), 69-74 (2017).
論文
CAS
Google Scholar
Evennett, N. J., Petrov, M. S., Mittal, A. & Windsor, J A. Systematic review and pooled estimates for the diagnostic accuracy of serological markers for intestinal ischemia.腸管虚血の血清学的マーカーの診断精度に関する系統的レビューとプール推定。World J. Surg. 33(7), 1374-1383 (2009).
論文
Google Scholar
Collado, M. C. et al. いびきをかく子供におけるディスバイオーシス。J.小児科。Gastr. Nutr. 68(2), 272-277 (2019)に掲載されました。
論文
Google Scholar
Kapur, V. K. et al. Clinical Practice Guideline for diagnostic testing for adult obstructive sleep apnea（成人の閉塞性睡眠時無呼吸症候群の診断検査に関する臨床実践ガイドライン）。米国睡眠医学学会臨床実践ガイドライン（American Academy of sleep medicine clinical practice guideline）。J. Clin. Sleep Med. 13(3), 479-504 (2017).
論文
Google Scholar
de la Hoz, R. E. et al. Snoring and obstructive sleep apnea among former World Trade Center rescue workers and volunteers（世界貿易センタービルの元救助員とボランティアにおけるいびきと閉塞性睡眠時無呼吸症候群）。J. Occup. Environ. Med. 52(1), 29-32 (2010).
論文
Google Scholar
Quast, C. et al. SILVAリボソームRNA遺伝子データベースプロジェクト。データ処理の改善とWebベースのツール。Nucleic Acids Res. 41, 590-596 (2013).
論文
Google Scholar
Barceló, A. et al. 閉塞性睡眠時無呼吸症候群の患者における腸管上皮バリアマーカー。Sleep Med. 26, 12-15 (2016).
論文
Google Scholar
Kheirandish-Gozal、L.ら、小児のリポポリサッカライド結合タンパク質の血漿レベル。閉塞性睡眠時無呼吸症候群と肥満の影響。J. Clin. Endocrinol. Metab. 99(2), 656-663 (2014).
論文
CAS
Google Scholar
Moreno-Indias、I.ら、睡眠時無呼吸症候群のマウスモデルにおいて、間欠的な低酸素が腸内細菌叢の多様性を変化させる。Eur. Respir. J. 45(4), 1055-1065 (2015).
論文
Google Scholar
Tripathi, A. et al. 閉塞性睡眠時無呼吸症候群の特徴である間欠的な低酸素および過呼吸は、腸内細菌叢およびメタボロームを変化させる。Msystems. 3(3), e18-20 (2018).
論文
Google Scholar
Almendros, I. et al. 閉塞性無呼吸症候群の動物モデルにおける脳組織の酸素分圧の変化. Respir. Res. 11(1), 3 (2010)に掲載されました。
論文
Google Scholar
Wu, B. G. et al. 重症閉塞性睡眠時無呼吸症候群は、鼻腔内マイクロバイオームの変化と炎症の増加と関連している。Am. J. Respir. Crit. Care. 199(1), 99-109 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Lu, D. et al. 閉塞性睡眠時無呼吸症候群の患者における肺の微生物叢のプロファイリング。Medicine (Baltimore) 97(26), e11175 (2018).
論文
Google Scholar
Xu, H. et al. Pediatric obstructive sleep apnea is associated with changes in the oral microbiome and urinary metabolomics profile.小児閉塞性睡眠時無呼吸症候群は、口腔内マイクロバイオームと尿メタボロームプロファイルの変化と関連している。パイロットスタディ。J. Clin. Sleep Med. 14(9), 1559-1567 (2018).
論文
Google Scholar
Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R. & Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms（微生物バイオフィルム）. Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).
論文
CAS
Google Scholar
高気圧酸素：そのメカニズムと有効性．Plast. Reconstr. Surg. 127(Suppl 1), 131S-141S (2011).
論文
CAS
Google Scholar
Yang, W. et al. 閉塞性睡眠時無呼吸症候群における口腔咽頭マイクロバイオーム。多様性と豊富さが減少している。J. Clin. Sleep Med. 15(12), 1777-1788 (2019).
論文
Google Scholar
Mashaqi, S. & Gozal, D. Obstructive sleep apnea and systemic hypertension: 腸内細菌のメディエーターとして？J. Clin. 睡眠医学。15(10), 1517-1527 (2019).
論文
Google Scholar
Ford, P. J. et al. Atherosclerosisにおける炎症、熱ショックタンパク質、歯周病菌。免疫組織学的研究。Oral. Microbiol. Immunol. 21(4), 206-211 (2006).
論文
CAS
Google Scholar
Kostic, A. D. et al. Genomic analysis identifies a association of Fusobacterium with colorectal carcinoma（ゲノム解析によるフソバクテリウムと大腸癌の関連性の特定）. ゲノム研究 22(2), 292-298 (2012).
論文
CAS
Google Scholar
Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S. & Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance（口腔内における多種類バイオフィルムの形成と細胞間距離の重要性）. Nat. Rev. Microbiol. 8(7), 471-480 (2010).
論文
CAS
Google Scholar
Bartlett, J. G. 肺および胸膜腔の嫌気性細菌感染症. Clin. Infect. Dis. 16(Suppl 4), S248-255 (1993).
論文
Google Scholar
Lun, H. et al. Altered gut microbiota and microbial biomarkers associated with chronic kidney disease（慢性腎臓病に関連する腸内細菌叢の変化と微生物バイオマーカー）。Microbiologyopen. 8(4), e678 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Wu, W. et al. Akkermansia muciniphilaのマウスモデルにおける免疫介在性肝障害に対する保護効果. Front. Microbiol. 8, 1804 (2017).
論文
Google Scholar
Wei, X. et al. 謝心湯は、腸内細菌叢の調節により2型糖尿病ラットの症状を改善する。サイエンス・リップ 8(1), 3685 (2018).
論文
ADS
グーグル・スカラー
Giusy, R. et al. 幼少期の腸内細菌叢と小児の肺の健康。J. Immunol. Res. 2017, 1-5 (2017).
Google Scholar
Singh, R. K. et al. 食事が腸内細菌叢に与える影響とヒトの健康への影響. J. Transl. Med. 15(1), 73 (2017).
論文
Google Scholar
Dorelli, B. et al. 身体活動は食事とは無関係にヒトの腸内細菌叢の構成に影響を与えることができるのか？システマティックレビュー。ニュートリエンツ 13, 1890 (2021).
論文
CAS
Google Scholar
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資金提供
本研究は、広東省科学技術計画プロジェクト（K20206002）、農業と社会発展分野における寧波科学技術プロジェクト（2019AS0020）、中国寧波市公共福祉科学技術計画（2021S175）の支援を受けて実施したものです。
著者情報
著者および所属
中国浙江省寧波市寧波銀州第二病院呼吸器・臨界医学科 〒315192
李乾軍、王明命、董永泉、呂飛傑
南医科大学南方病院睡眠医学センター、広州、510600、中国
Qianjun Li, Ting Xu, Danqing Li, Huanyu Tan, Yin Jiang, Qinge Xie, Lijie Feng & Taoping Li
寧波医療センター黎慧力病院呼吸器・重症患者管理科（中国寧波市
邵 傳
蘇州大学第一附属病院特需部
邵傳(Chuan Shao)
中国浙江省寧波市杭州湾病院循環器科
高文慧
杭州医科大学薬学院（中国杭州市
王秀珉
広州華陰保健医療集団有限公司ハイスループット部 中国広州市
蔡 鳳波
寄稿
Q.L., T.L., T.X., M.W. は、研究デザインに大きく貢献した。Q.L., T.L., C.S., W.G., Y.D., X.W., F.L. はデータの取得と解析に大きく貢献した。Q.L., T.X., T.L., C.S., W.G., Y.D., X.W., M.W., T.L., F.L. がデータ解釈、原稿執筆、論文修正に実質的に貢献した。Q.L., D.L., H.T., Y.J., Q.X., L.F. は被験者を募集し、サンプルとデータを収集した。Q.L.、T.X.、F.C.は、実験の実施と16Sデータの生物学的解析に大きく貢献した。最終原稿は全著者が読み、承認して提出した。患者は、データおよび写真の公開についてインフォームドコンセントに署名した。
対応する著者
Qianjun LiまたはTaoping Liにご連絡ください。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。
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出版社からのコメント
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この記事の引用
Li, Q., Xu, T., Shao, C. et al. Obstructive sleep apnea is related to alter in fecal microbiome and impaired intestinal barrier function.閉塞性睡眠時無呼吸症候群は、糞便マイクロバイオームの変化と腸管バリア機能の障害に関連している。Sci Rep 13, 778 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41598-023-27784-0。
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受領日
2022年9月10日
受理済
2023年1月9日
公開
2023年1月15日発行
DOI
https://doi.org/10.1038/s41598-023-27784-0
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