幼少期の腸内細菌叢は酪酸-IL-18軸を介して肝臓に常駐するナチュラルキラー細胞の成熟を維持する

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発行：2023年3月27日
幼少期の腸内細菌叢は酪酸-IL-18軸を介して肝臓に常駐するナチュラルキラー細胞の成熟を維持する

Early life gut microbiota sustains liver-resident natural killer cells maturation via the butyrate-IL-18 axis - Nature Communications

パンパン・ティエン
ウェンウェン・ヤン
...
梁 暁紅（リャン シャオホン
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Nature Communications 14巻、記事番号：1710（2023） この記事を引用する
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肝臓に存在するユニークなリンパ球サブセットである肝臓常在ナチュラルキラー細胞は、局所的に発達し、多面的な免疫学的役割を担っています。しかし、肝常在型ナチュラルキラー細胞のホメオスタシス維持のメカニズムは不明である。本論文では、早期の抗生物質投与により、成人期になっても肝臓常在ナチュラルキラー細胞の機能成熟が阻害されることを示し、これは持続的な微生物叢異常の影響であることを明らかにした。早期の抗生物質投与は肝臓の酪酸濃度を著しく低下させ、その結果、細胞外から肝常在型ナチュラルキラー細胞の成熟に異常をきたすというメカニズムである。具体的には、酪酸の喪失は、受容体GPR109Aに作用してクッパー細胞や肝細胞でのIL-18産生を障害する。IL-18/IL-18Rシグナルが阻害されると、ミトコンドリア活性と肝実在ナチュラルキラー細胞の機能成熟が抑制される。驚くべきことに、実験的または臨床的に使用されたClostridium butyricumを食事で補給すると、早期の抗生物質投与によって引き起こされた肝常在型ナチュラルキラー細胞の成熟と機能の障害が回復する。これらの結果は、腸-肝臓軸の制御ネットワークを明らかにし、組織常在型免疫細胞の発達における初期生活微生物叢の重要性を浮き彫りにするものである。
はじめに
肝臓は重要な免疫臓器であり、特に自然リンパ球（ILC）、ナチュラルキラーT（NKT）細胞、マクロファージ、γδT細胞などの自然免疫細胞が豊富である1,2。これらの自然免疫細胞は、侵入してきた病原体を排除するとともに、肝機能の恒常性を維持するために協調的に作用している3。ILCは、定常状態ではマウスで約5%、ヒトで約25%の肝内リンパ球を占め、主に従来のナチュラルキラー（cNK）細胞と肝定着NK（LrNK）細胞からなり、後者は肝タイプ1ILC（ILC1s）とも呼ばれている4。表現型的には、マウスのLrNK細胞はNK1.1+NKp46+CD49a+CD49b-として識別でき、NK1.1+NKp46+CD49a-CD49b+ cNK細胞とは異なる4。同様に、CD56brightCD16lowCD49a+のLrNK細胞サブセットがヒト肝臓で同定された5。LrNK細胞は肝類洞に存在し、cNK細胞と比較して、発生、表現型、エフェクター機能の点で大きな違いを示している6。まず、cNK細胞は骨髄の前駆細胞から発生するが、LrNK細胞は肝臓のLin-CD122+CD49a+前駆細胞からインターフェロン（IFN）-γ依存性のループを経て発生する7．次に、LrNK細胞の発生と維持は、T-bet、PLZF、Hobit、AhR、RORαなどの特定の転写因子のパネルに依存している8,9,10,11,12,13,14. 機能的には、LrNK細胞はcNK細胞と比較して、高レベルの腫瘍壊死因子（TNF）-αを生成し、低レベルのIFN-γとパーフォリンを生成し、同レベルのグランザイムBを有している14。さらに、LrNK細胞は、抗腫瘍免疫に関与するだけでなく14、局所免疫寛容15や免疫記憶を媒介する16,17。このように、肝臓の微小環境がLrNK細胞の発達と機能特化をサポートするメカニズムをさらに解明することは、肝臓の生物学を理解し、肝臓疾患の治療戦略を開発するための洞察をもたらすと考えられます。
肝臓は、消化管から肝類洞を経由する連続的な血流を可能にする、そのユニークな解剖学的位置に関して、宿主と微生物との相互作用の結節点にある18. 重要なことは、腸内細菌が肝臓の免疫恒常性の確立と維持に重要な役割を果たしていることを解明する証拠が蓄積されていることである。腸内常在菌やリポ多糖（LPS）などの微生物産物は、持続的なMYD88依存性シグナルを誘導し、クッパー細胞やNKT細胞が肝周囲に集中して偏在し、効果的な宿主防御を最適化するよう制御する19．一方、常在菌はクッパー細胞を寛容な状態に保ち、肝再生時のNKT細胞の過剰活性化を防ぐのに重要である20。さらに、肝細胞が提示する常在性脂質抗原は、肝臓に常在するγδT-17細胞の活性化、生存、増殖などの恒常性を維持するために必要である21。しかし、無菌（GF）マウスは、特定の病原体を持たない（SPF）マウスと比較して、さまざまな感染モデルにおいて循環NK細胞の活性が低下または亢進しているにもかかわらず、肝NK細胞の制御における腸管常在菌の重要性は未解明であった22、23。
幼少期は、免疫系を形成する健康な腸内細菌叢を確立するのに重要な時期であり、成人期まで長く持続する24,25,26. しかし、1歳までに、特に抗生物質への曝露が原因で、最大50％の乳児が腸内細菌叢異常症に罹患することになる27。驚くべきことに、乳児マウスの腸内細菌叢異常は、ワクチンに対する抗体応答を損なう28。逆に、生後間もない頃の細菌叢の乱れは、腸管マクロファージの過活性化や細菌刺激に対する炎症性Th1反応の増強を引き起こし、炎症性腸疾患（IBD）29のリスク上昇につながる。同様に、新生児期に抗生物質を投与したマウスは、IL-22産生γδT細胞の増加により、実験的乾癬を増悪させることが知られている30。
肝臓におけるLrNK細胞の特殊な発生経路と、腸と肝臓の密接な相互作用を考慮すると、腸内細菌がLrNK細胞の恒常性に大きな影響を与えるという仮説が立てられた。母体抗生物質投与マウスモデルを用いて、我々は、早期の微生物叢の枯渇が、成人期においてもLrNK細胞の機能的成熟を持続的に阻害することを実証した。そのメカニズムとして、早期の抗生物質投与による持続的な微生物叢の異常は、肝酪酸レベルとクッパー細胞および肝細胞からのIL-18発現を著しく低下させ、その結果、LrNK細胞の機能的成熟を阻害することがわかった。驚くべきことに、実験的または臨床的に使用されたClostridium butyricumの食事による補充は、幼少期の抗生物質曝露によって引き起こされたLrNK細胞の成熟と機能の障害を回復させた。本研究は、LrNK細胞の成熟に関わる腸-肝臓軸の相互作用ネットワークを明らかにし、組織常在型免疫細胞の発達における幼少期の微生物叢の重要性を浮き彫りにするものである。
研究成果
LrNK細胞の機能的成熟には、早期の腸内細菌叢が重要であること
肝臓NK細胞の発達に対する腸内細菌叢の影響を調べるため、母体抗生物質投与マウスモデル28,31,32を使用しました。簡単に説明すると、ダムとその子マウスを、妊娠後期から離乳前の幼児期にかけて、抗生物質の組み合わせ（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾールを含むAbx）で飲料水処理し、その後通常の餌と飲料水を与えた（早期Abx）（図1a）。文献33と同様に、early-Abx処理によりマウスの体重はわずかに減少した（補足図1a）。次に、離乳時または成体時（8週齢）のコントロールマウスまたはearly-AbxマウスのLrNKおよびcNK細胞の特徴を明らかにした。初期Abxマウスとコントロールマウスでは、cNK細胞とLrNK細胞の割合と数に有意差はなかった（図1b、補足図1d）。また、LrNK細胞の増殖とアポトーシスにも、同様に差はなかった（補足図1e、f）。興味深いことに、コントロールマウスのLrNK細胞と比較して、離乳期または成体のearly-AbxマウスのLrNK細胞は、CD11bの平均蛍光強度（MFI）と割合が減少し、CD27が増加していた（図1c、d、補足図2a）。これは、より未熟な表現型であると証明された34。同様に、early-AbxマウスのLrNK細胞は、NK細胞の末端成熟に関連する分子であるkill cell lectin-like receptor subfamily G member 1 (KLRG1) を比較的低いレベルで発現した（図1c, d, Supplementary Fig 2a）。さらに、LrNK細胞の発生と成熟に関連する転写因子であるRorαとZfp683の発現も、早期AbxマウスのLrNK細胞では低下していた（補足図2b）。LrNK細胞とは対照的に、early-AbxマウスのcNK細胞は、CD11b、CD27、KLRG1がコントロールマウスと同レベルであった（補足図2c、d）。cNK細胞とは異なるLrNK細胞は、Lin-Sca-1+Mac-1+造血幹細胞（LSM）から局所的に発生し、Lin-CD122+CD49a+細胞へと分化し、LrNK7の前駆細胞であることから、肝臓と骨髄のLSM細胞および前駆細胞の検出を行いました。その結果、LSM細胞や前駆細胞における割合や数は、コントロールマウスとearly-Abxマウスの間で差がないことがわかった（補足図2e-g）。
図1：早期の腸内細菌叢はLrNK細胞の成熟と機能を維持する。
a early-Abxマウスモデルの実験デザイン。 b コントロールマウスとearly-AbxマウスのLrNK細胞の割合と絶対数の代表的なFACSプロットと棒グラフ（離乳期マウス：n = 6/グループ、8週齢マウス：コントロールn = 6, early-Abx n = 7）。c, d 離乳期または成体のコントロールマウスおよび早期AbxマウスのLrNK細胞サブセットにおけるCD11b、CD27およびKLRG1の発現レベル（MFI）の代表的なFACSプロットと棒グラフ（離乳期マウス：コントロールn＝6、早期Abx n＝6、8週齢マウス：コントロールn＝6、早期Abx n＝7）。e, f 代表的なFACSプロット棒グラフと、離乳期または成体のコントロールおよび早期Abxマウス（離乳期マウス：1群あたりn＝6；8週齢マウス：コントロールn＝6、早期Abx n＝7）のPMAおよびイオン刺激LrNK細胞におけるエフェクター分子の発現（MFI）についてのもの。g 8週齢のコントロールマウスおよびearly-AbxマウスのIL-12／15またはポリ（I：C）-刺激LrNK細胞におけるIFN-γ発現（MFI）についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフ（1グループあたりn＝6）。 h CFSE標識YAC-1細胞に対するLrNK細胞の細胞傷害性。7-AAD+CFSE+細胞は死滅した細胞を表す（コントロールn = 6、early-Abx n = 8）。 i コントロールおよびearly-AbxマウスのLrNK細胞におけるTim-3、NKG2AおよびPD-1の発現（MFI）に関する代表FACSプロットと棒グラフ（コントロールn = 6、early-Abx n = 7）。各記号は個々のマウスからのデータを表し、エラーバーは1実験におけるグループごとのSEMを表す。データは両側Student's t-testを用いて分析した。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. すべての実験は、2つまたは3つの独立した実験を繰り返した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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次に、LrNK細胞およびcNK細胞の機能が、生後間もない抗生物質の投与によって影響を受けるかどうかを検討した。ホルボール12-ミリスチン酸13酢酸（PMA）とイオノマイシン（Ion）で刺激すると、離乳期または成体の早期AbxマウスのLrNK細胞は、コントロールマウスの細胞に比べてエフェクター分子の生産量が著しく低下した（図1e、f、補足図3a）。また、IL-12/IL-15またはポリリボイノシン酸：ポリリボシチジル酸（poly (I: C)）の刺激下で、早期AbxマウスのLrNK細胞においてIFN-γの発現低下が観察された（Fig. 1g）．in vitroのフローベースの殺傷アッセイを用いると、8週齢の早期AbxマウスのLrNK細胞は、Yac-1細胞に対する殺傷活性がコントロールマウスのものに比べて著しく低いことがわかった（図1h）。さらに、早期抗生物質曝露により、離乳期あるいは成体マウスのLrNK細胞では、抑制性受容体Tim-3、PD1、NKG2Aの発現が増加した（図1iおよび補足図3b）。LrNK細胞とは異なり、肝臓cNK細胞のエフェクター分子や阻害受容体の発現、細胞傷害活性は、コントロール成体マウスと早期Abxマウスの間で大きな変化はなかった（補足図3c-e）。さらに、妊娠中や授乳期の抗生物質曝露がLrNKの機能成熟に及ぼす影響をより明確にするために、子宮-Abxマウスや授乳-Abxマウスモデルを導入しました。その結果、妊娠中または授乳期の抗生物質投与も、LrNK細胞の成熟と機能を損なうことがわかった（補足図4a-f）。これらの結果は、早世した微生物がLrNK細胞の恒常性を維持することを強く示唆している。
NK細胞の成熟を阻害すると、その抗腫瘍能が損なわれることは、これまでの研究で十分に立証されている35,36。最近では、LrNK細胞のホメオスタシスが肝腫瘍の進行を抑制するのに重要であることが証明された14。したがって、我々は、早期の抗生物質への曝露が、LrNKを介した抗腫瘍効果を鈍らせるかどうかを考えている。そこで、c-myc/ACT駆動37,38（図2a）およびSTZ-HFD誘発39（補足図5a）の両肝細胞がん（HCC）モデルマウスを導入した。その結果、いずれの肝細胞癌モデルにおいても、early-Abxマウスはコントロールマウスよりも重度の肝腫瘍を発症することが判明した（図2b、c、補足図5b、c）。その結果、early-Abxマウスの腫瘍浸潤LrNK細胞は、コントロールマウスのものと比較して、エフェクター分子の発現が減少し、細胞傷害活性が低下していたが、阻害受容体のレベルは上昇していた（図2d-f、補足図5d）。重要なことは、抗NK1.1によるLrNKとcNKの両細胞の枯渇、および抗アジアロGM1によるcNKのみの枯渇は、HCCを持つAbxマウスの寿命の短縮をほぼ完全に無効化したことである。(図2g、h）。これらのことから、早期の微生物叢の枯渇によって引き起こされるLrNK細胞の機能成熟障害が、肝細胞癌の発症を促進する一因になっていることが示唆された。
図2：LrNK機能の低下は、早期AbxによるHCC進行の促進に寄与している。
a コントロールマウスまたはearly-Abxマウスにおけるc-myc/ACT/SB100誘発HCCモデルの実験デザイン。 b, c In vitro腫瘍イメージングおよび肝臓/体重を示した（各群n = 5）。d コントロールマウスおよびearly-Abx HCCマウスのLrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107aの発現（MFI）についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフ（各群につきn＝5）。 e CFSEラベルしたYAC-1細胞に対するコントロールまたはearly-Abx HCCマウスのLrNK細胞の細胞毒性についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフ（各群につきn＝5）。f コントロールまたはearly-Abx HCCマウスのLrNK細胞におけるTIGITおよびTim3の発現（MFI）の代表的なFACSプロットと棒グラフ（n = 5 per group）。 g, h AKT/Myc/SB100プラスミドを注射し、抗アジアロGM1または抗NK1.1で処理したコントロールおよびearly-Abxマウスの実験計画および生存曲線（n = 5 per group）。ドットは個々のマウスからのデータを表し、エラーバーは1つの実験におけるグループごとのSEMを表す。統計的有意性は、両側Studentのt検定（c-f）またはLong-Rank検定（h）により検定した。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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早期Abx治療マウスにおけるLrNK細胞成熟停止は、腸内細菌叢の持続的な変化が原因であること
幼少期の微生物叢のコロニー形成は、腸内微生物群集の多様性と安定性に長期的な影響を与えることが実証されている。そこで、我々は、生後間もない抗生物質曝露マウスにおいて、持続的な腸内細菌異常がLrNK細胞の成熟障害に関与しているかどうかを検討した。我々は、8週齢のコントロールマウスとearly-Abxマウスの糞便を用い、16 S rRNA配列決定法を用いて腸内細菌叢を解析した。初期Abxマウスの糞便は、対照群に比べα-diversityが有意に少なく、operational taxonomic unit（OTU）レベルの指標の減少として示された（図3a）。血液寒天培地での微生物培養、糞便中の細菌DNA量と総16 S rRNAのqPCR分析でも、早期抗生物質投与が腸内細菌叢の総量に持続的な変化を与えることが確認された（補足図6a-c）。また、主座標分析（PCoA）プロットでは、対照群と早期Abx群の微生物群集構造（β-diversity）に有意な離散的クラスタリングが見られた（図3b）。さらに、線形判別分析効果量（LEfSe）により、上位15種類の豊富な細菌の平均相対存在量が、コントロールマウスとearly-Abxマウスで有意に異なることが示された（図3c、d）。特に、Akkermansia、Bifidobacterium、Prevotellaceae、Allobaculumといったいくつかのプロバイオティクス細菌は、早期Abxマウスで著しく減少した（図3c, d）。これらのことから、早期の抗生物質投与が成人期の微生物群集組成を大きく変化させることが確認された。次に、既報30と同様に、離乳直後のearly-Abxマウスをコントロール同腹子と5週間同居させた（図3e）。予想通り、同居処理により、LrNK細胞におけるCD27、CD11b、KLRG1の発現は、コントロールマウスとearly-Abxマウスの間で差がなくなった（図3f、補足図6d）。一貫して、LrNK細胞のIFN-γ産生およびCD107a動員は、同居するコントロールマウスとearly-Abxマウスの間で同程度であった（図3g、補足的図6e）。これらの結果は、早期の抗生物質投与による常在細菌叢の破壊が、LrNK細胞の機能成熟の障害に関与していることを示唆した。
図3：早期Abx治療マウスにおけるLrNK細胞の成熟停止は、持続的な微生物叢のディスバイオシスが原因であることがわかった。
a-d コントロールマウスとearly-Abxマウス（コントロールn = 11、early-Abx n = 10）の糞便を用いて16 S rRNAシーケンシングを実施した。c コントロールマウス（赤）とearly-Abxマウス（青）の腸内常在菌叢の属レベル比較。 d コントロールマウス（赤）とearly-Abxマウス（青）の糞便ペレット中の細菌ファミリーのLEFSe（線形判別分析サイズ効果）予測値を示す。f 4群のマウス（各群n = 6）のLrNK細胞におけるCD27、CD11b、KLRG1の発現（MFI）の代表的なFACSプロットと棒グラフ。 g 4群のマウス（各群n = 8）のPMAおよびイオン刺激LrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107aの発現（MFI）の代表的なFACSプロットと棒グラフ。ドットは個々のマウスからのデータを表し、エラーバーは1実験における1群あたりのSEMを表す。統計解析は、両側スチューデントt検定（a）、両側ウィルコクソン順位和検定（c）、ノンパラメトリック要因分解クラスカル・ワリス（KW）順位和検定（d）またはTukeyの多重比較検定付き一元配置分散分析（f、g）により行った。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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微生物叢由来の酪酸はLrNK細胞の機能成熟を促進する
腸内細菌は、豊富な常在菌代謝物を生成することにより、宿主の生理機能に影響を与えることができる40。そこで、我々は、初期AbxマウスのLrNK成熟障害における微生物叢由来の代謝産物の役割を評価することにした。液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）により、8週齢のコントロールマウスとearly-Abxマウスの間で、糞便中の代謝物の存在量とクラスタリングに差があることがわかった（補足図7a、b）。KEGGパスウェイでは、脂質代謝、アミノ酸代謝、糖質代謝など、複数の代謝経路で発現量の異なる代謝物が濃縮されていることが示された（補足図7c）。免疫恒常性制御における短鎖脂肪酸（SCFA）の重要性に鑑み、さらにガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）を用いてコントロールマウスおよびearly-Abxマウスの糞便中のSCFA濃度を検出した。その結果、酪酸などのいくつかのSCFAは、early-Abxマウスの糞便中で有意に減少していた（図4a）。特に、酪酸は、酢酸やプロピオン酸ではなく、初期Abxマウスの優勢菌の存在量と密接な相関があった（図4b）。さらに、対照マウスの糞便と比較すると、Faecalibacterium、Roseburia、Fusobacteria、Eubacterium41などの酪酸産生微生物群の存在量は有意に減少していた（図4c）。これらのことから、早期Abx投与は成体マウスにおいて酪酸の産生を低下させることが示された。
図4：微生物叢由来の酪酸は、LrNK細胞の機能的成熟を促進する。
a コントロールマウスおよびearly-Abxマウス（コントロールn=11、early-Abx n=10）の糞便を用いて短鎖脂肪酸（SCFAs）のGC -MS分析を行った。 b 相関数値可視化により糞便中の優勢菌とSCFAsとの相関ヒートマップを示した。 c コントロールマウスおよびearly-Abxマウス（コントロールn=11、early-Abx n=10）の糞便の16 S rRNAシーケンスによる属レベルの酪酸生産菌の比率を示した。d GC-MS分析によるコントロールマウスおよびearly-Abxマウスの肝臓および脾臓組織中の酪酸のレベル（各群n = 5）。e 酪酸投与マウスモデルの実験スキーム。 f 異なるグループのマウスから採取したLrNK細胞上のCD27、CD11b、KLRG1の発現（MFI）についての代表的FACSプロットと棒グラフ（n = 6/グループ）。g 異なるグループのマウスから採取したPMAおよびイオン刺激LrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107aの発現（MFI）についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフ（各グループにつきn = 6）。 h 肝血管腫患者からの正常肝組織における酪酸レベルによるグループ分け。i, j 酪酸レベルの高い患者と低い患者からのLrNK細胞におけるCD27、IFN-γおよびCD107aの割合の代表的なFACSプロットおよび棒グラフである。ドットは個々のマウスまたはヒト患者からのデータを表し、エラーバーは1つの実験におけるグループごとのSEMを表す。統計解析は、両側Student's t-test（a、d）、パラメトリック因子Kruskal-Wallis（KW）sum-rank test（b）またはTukeyの多重比較検定付き一元配置分散分析（f、g）により行った。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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次に、微生物叢由来の酪酸がLrNK細胞の成熟に関与しているのかどうかを考えてみた。興味深いことに、Abxマウスの肝臓の酪酸含量はコントロールマウスに比べて有意に低かったが、2群のマウスの脾臓には同程度の酪酸が存在した（図4d）。さらに、酪酸の投与（図4e）により、初期AbxマウスのLrNK細胞におけるCD27、CD11bおよびKLRG1の発現は、一部または完全にコントロールマウスのレベルまで回復した（図4f、補足図7d）。それに伴い、酪酸の補給は、early-AbxマウスのLrNK細胞のIFN-γ発現とCD107a動員を改善した（図4g, 補足図7e）。さらに、肝血管腫患者から採取した正常肝組織において、LrNK細胞の成熟度と機能の酪酸値との相関を解析した。その結果、マウス実験データと同様に、酪酸値の高い肝臓組織由来のLrNK細胞は、酪酸値の低い肝臓由来の細胞よりもCD27の発現量が少ないが、IFN-γの発現量とCD107aの動員量は高いことがわかった（図4h-j）。これらの結果は、微生物群の代謝産物である酪酸がLrNK細胞の成熟を促進するという仮説を支持するものである。
酪酸はGPR109Aによってクッパー細胞や肝細胞に作用し、間接的にLrNK細胞の機能成熟を促進する。
微生物叢由来の酪酸がLrNK細胞の機能成熟に細胞内在的または外在的に影響を及ぼすかどうかをさらに明らかにするために、成体のコントロールマウスまたは早期Abxマウス（CD45.2）から精製NK細胞をレシピエントCD45.1マウスに移植し、ポリ（I：C）適用後のドナー由来LrNK細胞の活性を計測した（図5a）。その結果、コントロールマウスとearly-Abxマウスから移植したLrNK細胞は、IFN-γの発現とCD107aの動員は同等であった（図5b）。一方、NK細胞（CD45.2）をコントロールマウスまたはearly-Abxマウス（CD45.1）に別々に移植すると（図5c）、early-AbxマウスのドナーLrNK細胞はコントロールマウスのものと比較してIFN-γとCD107aのレベルが低かった（図5d）。また、酪酸の生体外投与は、LrNK細胞のIFN-γとCD107aのレベルを変化させなかった（図5e）。これらのデータは、早世した腸内細菌叢が、細胞外来的にLrNK細胞の機能成熟に影響を与えることを示唆している。
図5：酪酸はGPR109Aを介してクッパー細胞や肝細胞に作用し、間接的にLrNKの機能を高める。
a, b poly(I:C)注射後のコントロールマウスまたはearly-Abxマウス（CD45.2）から移植したLrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107a発現の実験スキームおよびFACS解析（各群n = 6）c, d LrNK細胞におけるIFN-γとCD107a発現の実験スキームおよびFACS解析（CD45. 2）をポリ（I：C）注射後にコントロールまたは初期Abxマウス（CD45.1）に移植した（1グループあたりn＝6）。 e LrNK細胞におけるIFN-γおよびTNF-αの発現（MFI）についての代表FACSプロットと棒グラフは、DDWまたはブチレート中で示した。(n＝6／群）。 f 異なる群のLrNK細胞におけるIFN-γの発現（MFI）についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフを示した（n＝6／群）。g LMNCsまたは肝細胞におけるGPR41、GPR43およびGPR109A発現レベルについてのRT-qPCR分析（各群につきn＝6）。 h C57BL／6マウスからの精製LrNK細胞を、GPR109A shRNAレンチウイルス（Lv-shGPR109A）を感染させた肝細胞と共培養してDDWまたはブチレートで治療した。LrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107aの発現（MFI）の代表的なFACSプロットおよび棒グラフを示した（1群あたりn＝6）。 i 肝臓の異なる免疫細胞サブセットにおけるGPR109A発現レベルのRT-qPCR分析（1群あたりn＝6）。j LrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107aの発現（MFI）についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフを、クッパー細胞と共培養して示した（グループあたりn＝5）。 k C57BL／6マウスからの精製LrNK細胞を、GPR109A shRNAレンチウイルス（Lv-shGPR109A）で感染したクッパー細胞とともに共培養し、DDWまたはブチレートと処置した。LrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107aの発現（MFI）についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフを示した（1群あたりn＝6）。ドットは個々のマウスからのデータを表し、エラーバーは1つの実験におけるグループごとのSEMを表す。データは、両側Studentのt検定（b、d、e、h、j、k）またはTukeyの多重比較検定付き一元配置分散分析（f）を用いて分析された。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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肝細胞や肝単核球（LMNC）を含む複数の細胞成分が、複雑な肝マイクロ環境を構成しています。そこで、LrNK細胞を精製し、肝細胞またはLMNCとそれぞれ酪酸の存在下/非存在下で共培養を行った。その結果、酪酸塩処理により、肝細胞およびLMNCと共培養したLrNK細胞のIFN-γ産生が実際に増加した（図5f）。酪酸は、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）を阻害するか、GPR41、GPR43、GPR109a42、43、44などのGタンパク質共役受容体（GPCR）を介して作用すると考えられる。しかし、HDAC阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）は、酪酸処理によって共培養LrNK細胞で上昇したIFN-γの発現に影響を与えなかった（図5f、補足図8a）。そこで、GPCRがこのプロセスに影響を及ぼしているのかどうかが気になる。RT-qPCRの結果、LMNCではGPR41、GPR43、GPR109Aの全てが発現していたが、肝細胞ではGPR109Aのみが検出された（図5g）。さらに、肝細胞のGPR109Aをノックダウンすると、酪酸処理により共培養したLrNK細胞におけるIFN-γおよびCD107a発現の増大が抑制された（図5h、補足図8b）。LMNCと共培養したLrNK細胞については、GPR109AアゴニストMK-0354は、GPR41およびGPR43のアゴニスト（AR-420626および4-CMTB）ではなく、IFN-γおよびCD107aの発現を増加させた（補足的図8c）。特に、LMNCsの異なるサブセットの中で、GPR109AはKupffer細胞で高発現していた（図5i）。さらに、LrNK細胞とクッパー細胞を共培養すると、酪酸処理によりLrNK細胞のエフェクター分子の発現が上昇し（図5j、補足図8d）、GPR109Aサイレンシングによりこの促進効果が消失した（図5k、補足図8e）。これらのことから、微生物叢-酪酸軸は、肝細胞およびクッパー細胞のGPR109Aに作用して、間接的にLrNK機能を促進するという見解が支持される。
酪酸は肝細胞／クッパー細胞におけるIL-18産生を誘発し、LrNK細胞の機能成熟を改善する
LrNK細胞の機能成熟に対する微生物酪酸の間接的な作用の基礎となるメカニズムについて洞察するために、コントロールまたはearly-Abxマウスの肝臓組織におけるサイトカイン/ケモカインのパネルの発現を調査した。RT-qPCR解析の結果、IL-18の発現はearly-Abxマウスで明らかに低下していた（図6a）。それに伴い、IL-18タンパク質はearly-Abxマウスの肝臓と小腸の両方で減少し、肝臓のIL-18レベルは小腸のそれよりも有意に高かった（図6b）。興味深いことに、リコンビナントIL-18タンパク質（rIL-18）の腹腔内注射は、早期AbxマウスのLrNK細胞における成熟マーカー、CD11bとKLRG1の発現、およびエフェクター分子のレベルを著しく改善した（図6c、d、補足図9a、b）。これらの結果は、腸内細菌叢を介したLrNK成熟の制御におけるIL-18の重要な役割を示唆している。
図6：酪酸は肝細胞／クッパー細胞におけるIL-18産生を誘発し、LrNK細胞の機能的成熟を改善する。
a コントロールマウスおよびearly-Abxマウス（n = 8/グループ）の肝臓組織におけるサイトカイン/ケモカイン発現レベルのRT-qPCR解析 b コントロールマウス（n = 6/グループ）およびearly-Abxマウス（n = 5/グループ）の肝臓および小腸のIL-18レベルのELISAアッセイ．c, d 組換えIL-18処理の有無にかかわらず、コントロールマウスまたは早期AbxマウスのLrNK細胞における成熟マーカーまたはエフェクター分子の発現（MFI）についての代表的なFACSプロットおよび棒グラフ（1グループあたりn＝6）。e, f 酪酸および／または抗IL-18存在下で肝細胞またはクッパー細胞と共培養したLrNK細胞におけるKLRG1、IFN-γおよびTNF-αまたはパーフォリンの発現（MFI）についての代表FACSプロットと棒グラフ（n = 6 per group）。ドットは個々のマウスのデータを表し、エラーバーは1実験におけるグループごとのSEMを表す。統計解析は、両側Student's t-test（a、b）またはTukeyの多重比較検定付き一元配置分散分析（c-f）により行った。**P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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そこで、微生物叢-酪酸軸が肝臓微小環境におけるIL-18のアップレギュレーションを通じてLrNK成熟を促進するかどうかを検討した。酪酸の補給は肝臓のIL-18レベルを上昇させた（補足図9c）。酪酸を介したLrNKの機能成熟促進における肝細胞とクッパー細胞の関与と一致して、酪酸添加は生体外での肝細胞とクッパー細胞の両方でIL-18レベルを上昇させた（補足図9d、e）。重要なことは、肝細胞やクッパー細胞と共培養したLrNK細胞において、特異的IL-18抗体（抗IL-18）による遮断が、酪酸によるKLRG1やエフェクター分子の上昇をほぼ抑制したことである（図6e、f）。これらのデータは、IL-18が微生物叢-酪酸軸を介したLrNK細胞成熟の改善に不可欠であることを示唆している。
IL-18 / IL18Rはミトコンドリアの酸化的リン酸化を改善することでLrNKの成熟を促進する。
IL-18は、NK細胞の活性を高めることはよく知られている45。しかし、LrNK細胞の成熟におけるIL-18の制御作用やメカニズムについては、ほとんど知られていない。成熟マーカーのプロファイリングから、IL-18受容体α鎖を発現するLrNK細胞（IL-18Rα+ LrNK）は、IL-18Rα- LrNK細胞に比べてCD11bとKLRG1の発現量が高いことがわかった（図7a）。したがって、IL-18Rα-サブセットと比較して、IL-18Rα+ LrNK細胞では、IFN-γおよびCD107aのレベルが比較的高かった（図7b）。さらに、IL-18Rα欠損LrNK細胞をコントロールマウスまたはearly-Abxマウスに移植すると、IFN-γとCD107aが同程度に発現した（図7c、d）。これらの結果は、IL-18 / IL18R軸が、early-Abx処理によって破壊されるLrNK細胞の成熟に関与しているという仮説をさらに裏付けるものである。
図7：IL-18 / IL18Rは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の改善を通じてLrNKの成熟を促進する。
a, b C57BL/6マウスのIL-18Rα- LrNKおよびIL-18Rα+ LrNKにおける成熟マーカー（A）またはエフェクター分子（B）の発現（MFI）についての代表的FACSプロットと棒グラフ（各群n = 6）。c, d コントロールマウスまたは初期Abxマウス（CD45.1）マウスに移植したIL-18Rα欠損LrNK細胞（CD45.2）におけるIFN-γおよびCD107aの発現（MFI）についての実験スキームおよび代表FACSプロットおよび棒グラフ（1グループにつきn = 6）。e IL-15で刺激した精製IL-18Rα＋およびIL-18Rα-LrNK細胞をex vivoで酸素消費率（OCR）解析し、基礎呼吸、最大呼吸およびATP生成を解析した代表画像（n＝6／グループ）。f, g IL-18Rα- LrNK細胞とIL-18Rα+ LrNK細胞におけるMitotracker Red染色で示したミトコンドリア膜電位とMitoSOXで測定したミトコンドリアROSレベルについての代表的なFACSプロットと棒グラフ（1グループにつきn = 5）。h DMSOまたはロテノンで処理した精製IL-18Rα-LrNKまたはIL-18Rα＋LrNK細胞におけるKLRG1およびIFN-γの発現（MFI）についての代表的FACSプロットおよび棒グラフ（1グループにつきn＝6）。ドットは個々のマウスからのデータを表し、エラーバーは1つの実験におけるグループごとのSEMを表す。統計解析は、両側Student's t-test（a-g）またはTukeyの多重比較検定付き一元配置分散分析（h）により行った。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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IL-18 / IL-18RがLrNK細胞の機能的成熟を促進する仕組みをより理解するために、IL-18Rα陽性および陰性の肝臓CD3-NK1.1+細胞についてRNAシークエンシングを行った。このデータセットを解析した結果、2420個の差次発現遺伝子（偽発見率[FDR]<0.05；2倍以上の変化）が同定され（補足図10a）、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）によって、ミトコンドリアの酸化的リン酸化経路に関連する転写シグニチャーはIL-18Rα+ CD3-NK1.1+ 細胞で正の濃縮が認められた（補足図10b）。そこで、オリゴマイシン（Oligo）、フルオロカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン［FCCP］、ロテノン［Rot］、アンチマイシンA［AA］）の添加前後におけるIL-15活性化IL-18Rα＋およびIL-18Rα-LrNK細胞のミトコンドリア酸化的リン酸化を測定した（図7e）。IL-18Rα+ LrNK細胞において、基礎および最大酸素消費率（OCR）、ならびにATP産生が比較的高いレベルで検出された（図7e）。さらに、フローサイトメトリー分析により、IL-18Rα＋LrNK細胞は、IL-18Rα-LrNK細胞よりも、Mitotracker Red染色で示されるミトコンドリア膜電位（MMP）が高く（図7f）、一方でMitoSOXで測定したミトコンドリアROSレベルは低い（図7g）。逆に、early-AbxマウスのLrNK細胞は、コントロールマウスの細胞と比較して、MMPの低下とミトコンドリア活性酸素の増加を示した（補足図10c、d）。興味深いことに、Rotenoneによるミトコンドリア酸化的リン酸化活性の阻害は、IFN-γ産生を有意に減少させ、IL-18Rα+とIL-18Rα-LrNK細胞間の差を消失させた（図7h、補足図10e）。同様の結果が、コントロールマウスおよびearly-AbxマウスのLrNK細胞で観察された（補足図10f）。これらの結果から、IL-18/IL-18Rはミトコンドリア活性の改善を通じてLrNKの機能成熟を促進することが示された。
食餌性Clostridium butyricumはearly-Abx処置マウスのLrNK細胞の成熟障害を救済する
そこで、我々は、酪酸産生菌の食事による補充が、early-Abx処理マウスのLrNK細胞の状態を回復させることができるかどうかを実証することにした。酪酸産生菌であり、プロバイオティクスとして何十年も安全に使用されているClostridium butyricum (C. butyricum)を離乳後のearly-Abxマウスに投与した（図8a）。驚くべきことに、C. butyricumの投与は、早期AbxマウスのLrNK細胞のCD27の発現を有意に減少させ、CD11bとKLRG1レベルを増加させた（図8b、補足図11a）。これに伴い、C. butyricumの補充は、early-AbxマウスのLrNK細胞のIFN-γ産生およびCD107a動員を促進した（図8c、補足図11b）。さらに、C. butyricumを投与したearly-Abxマウスの肝IL-18発現は、コントロールマウスと同等のレベルまでほぼ回復していた（図8d）。興味深いことに、市販のプロバイオティクスであるClostridium butyricum Powder (2 × 106/0.2 ml per day) (商品名: Baolean, Qingdao Donghai Pharmaceutical Co., Ltd.) を食事で摂取させると、肝臓のIL-18発現がほぼ回復した、 また、臨床で乳児下痢症の治療によく使用されている市販のプロバイオティクス製剤であるClostridium butyricum powder（2×106/0.2ml/日）（商品名：宝蘭、青島東海製薬株式会社）は、初期AbxマウスのLrNK細胞におけるCD27、CD11b、KLRG1の発現、およびIFN-γレベルの一部または完全に回復した（図8e、f、補図11c、d）。これらの結果から、C. butyricumの食事による補充は、Abxに早期曝露した後のLrNK細胞の成熟を回復させるための介入戦略である可能性があることが、予備的に示唆された。
図8：クロストリジウム・ブチリカムの食事療法は、Abx早期投与マウスにおけるLrNK成熟障害を救済する。
a クロストリジウム・ブチリカム（C. butyricum）経口投与マウスモデルの実験スキーム。 b、c 異なる群のマウス（各群n＝5）のLrNK細胞における成熟マーカーおよびエフェクター分子の発現（MFI）についての代表FACSプロットおよび棒グラフ。d マウスの異なるグループ（グループあたりn = 5）から得た肝臓組織におけるIL-18レベルのELISAアッセイ。 e, f マウスの異なるグループ（グループあたりn = 8）から得たLrNK細胞における成熟マーカーおよびエフェクター分子の発現（MFI）についての代表FACSプロットおよび棒グラフである。ドットは個々のマウスからのデータを表し、エラーバーは1つの実験におけるグループごとのSEMを表す。統計解析は、一元配置分散分析とTukeyの多重比較検定によって行った。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; ns, no significance. ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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ディスカッション
生後1年間の腸内細菌の発達は、私たちの免疫システムの確立と同時に起こり、相互作用的なシグナル伝達ネットワークを形成している47。LrNK細胞は肝類洞に存在し、常在菌やその代謝物によって制御される可能性があると考えられている。本研究では、幼少期の腸内細菌がLrNK細胞の機能的成熟を維持することを明らかにした。この制御効果は、酪酸産生とそれに続く肝細胞およびクッパー細胞によるIL-18産生によって達成されることがメカニズム的に判明した。このデータは、腸内細菌が肝免疫のホメオスタシスに影響を与えるメカニズムを明らかにし、幼少期の抗生物質投与がもたらす長期的な影響を強調するものである。
LrNK細胞は、肝臓のLin-CD122+CD49a+前駆細胞7から発生し、CD27+前駆細胞を経てCD27-集団に成熟します34。LrNK細胞の局所発生モデルは、肝臓の微小環境がこのプロセスに重要であることを示唆しているが、その制御機構はまだほとんどわかっていない。門脈から排出される腸内細菌とその代謝物は、肝臓の生理学と免疫のホメオスタシスに大きな影響を与える。本研究では、初期の抗生物質投与により、成体になってもLrNK細胞の成熟と抗腫瘍活性が阻害され、肝cNK細胞と脾NK細胞には影響がないことを見いだした。一方、肝臓のcNK細胞や脾臓のNK細胞は影響を受けませんでした。共同飼育は、LrNK細胞に対する早期Abx曝露の阻害効果を無効にし、腸内常在菌ディスバイオシスが決定的な役割を果たすことを示しました。このように、LrNK細胞の成熟に対する早期Abx処理の持続的な影響は、免疫系の発達における早期の微生物叢のコロニー形成の重要性をさらに立証するものである。さらに、養子縁組実験により、早期AbxマウスにはLrNK細胞の内在性欠損がないことが明らかになった。これらの結果から、早期の抗生物質曝露が肝臓の微小環境を破壊し、LrNK細胞の持続的な成熟停止につながることが明らかになった。しかし、早期の腸内細菌叢によるLrNK細胞とcNK細胞の制御の相違については、さらなる研究が必要であり、ヒトの早期の腸内細菌叢の擾乱に関連する他の要因、例えば出生方法、摂食の有無がLrNK細胞の制御に果たす役割は、まだほとんど分かっていません。さらに、抗生物質への曝露は、HCC48を含む腫瘍の発生率上昇と潜在的に関連することが報告されており、これは、HCCの発生にLrNK細胞の機能低下が関与していることと一致している14. 早期Abx治療によるLrNK成熟阻害が、ヒトHCCのリスク上昇と相関しているかどうかをさらに調査することは興味深いことである。
微生物代謝産物は、微生物叢による宿主免疫応答を調節する重要なメディエーターである49。腸内の多くの細菌代謝物のうち、酢酸、プロピオン酸、酪酸を含むSCFAは最も多く、免疫応答の重要な制御因子として浮上してきた50。我々は、Abxの早期投与により、糞便と肝臓の酪酸が有意に減少することを見出したが、脾臓の酪酸は減少しない。さらに、酪酸または酪酸産生共生生物であるC. butyricumの補給は、初期AbxマウスにおいてLrNK細胞の成熟と機能を若返らせた。近年、酪酸は免疫制御における多様な役割を担っているため、大きな注目を集めている。酪酸の生体内投与は、抗腫瘍CD8+T細胞応答を高めるだけでなく51、抗原活性化CD8+T細胞の記憶能力を促進し52、強力な抗菌機能を有するマクロファージの分化を誘導する53。しかし、予想に反して、精製LrNK細胞の生体内機能に対する酪酸の明らかな改善作用は検出されなかった。しかし、肝細胞やクッパー細胞と共培養したLrNK細胞では、酪酸の促進作用が再現された。CD4+T細胞やNKT細胞ではなく、CD8+T細胞が存在しない場合、LrNK細胞の成熟が大きく損なわれることが以前に報告されている34。今回の結果を合わせると、肝臓の微小環境がLrNK細胞の成熟を協調的にサポートしていることが明確に示された。さらに、肝微小環境におけるLrNK細胞成熟の制御ネットワークにおける腸内細菌叢の重要性を強調する。しかし、酪酸以外に、早期Abx曝露は、脂質代謝、アミノ酸代謝、炭水化物代謝といった様々な微生物代謝物に顕著な影響を及ぼし、これら全てが免疫恒常性の制御に関与することが証明されている54,55,56. 他の代謝物もこの抑制に関与している可能性は否定できない。
NK細胞の発生と成熟を順次制御するサイトカインが報告されており2、LrNK細胞が産生するIFN-γは、前駆細胞からの発生を促進することが証明されている7。LrNK細胞と肝細胞またはクッパー細胞とのトランスウェル共培養実験から、酪酸を介したLrNK細胞の成熟と機能の改善に可溶性因子が関与していることが明らかになった。初期Abxマウスでは、肝組織におけるIL-18の著しい減少が検出されたが、酪酸の補充はGPR109A依存的にこの欠乏を修正した。さらに、組換えIL-18タンパク質は、early-AbxマウスのLrNK細胞の成熟と機能を回復させた。IL-18はNK細胞活性の刺激因子としてよく知られている45,57。IL-18R欠損のNK細胞は、IL-12によるex vivo刺激に応答してIFN-γを分泌することができず、IL-18シグナルがNK細胞のプライミングに必須であることが示された58。肝転移性大腸がんモデルでは、IL-18は腫瘍増殖に伴うNlrp3インフラマソームの抑制と腫瘍内NK細胞の成熟および殺腫瘍活性の促進に必要である59。しかし、NK細胞の機能的成熟におけるIL-18の正確な役割については、未だ不明な点が多い。我々は、IL-18Rα＋のLrNK細胞と比較して、IL-18Rα-のLrNK細胞は未熟な表現型を示し、比較的低いミトコンドリア活性を伴うことを発見した。さらに、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を阻害することで、IL-18Rα+とIL-18Rα-LrNK細胞の機能差を中和することができました。今後、LrNK細胞のミトコンドリア活性に対するIL-18制御の分子回路をさらに解明することは興味深いことである。さらに、臨床研究では、IL-18がヒト肝NK細胞の機能を増強する能力を有することが示され60、ヒトIL-18遺伝子多型がHCC61のリスクおよび重症度と関連することが報告された。したがって、IL-18の欠乏が、早期の生活習慣病によって誘発されるヒトLrNKの成熟とHCC感受性にも寄与しているかどうかも、さらなる調査に値すると考えられる。
以上のことから、本研究では、早期の腸内細菌叢が、酪酸/IL-18依存的に肝臓微小環境を細かく調節することにより、LrNK細胞の機能的成熟を維持することを明らかにした。この結果は、腸-肝臓軸における微生物叢と免疫のクロストークを明らかにし、幼少期に抗生物質にさらされた後の介入戦略の可能性を提供するものである。
研究方法
人体サンプル
本研究に含まれるヒト肝組織は、2022年5月から2022年9月にかけて山東大学斉魯病院および山東省病院で肝性血管腫患者10名（女性5名、男性5名、年齢：26-65）から得られた。本研究で使用したすべてのヒト組織は、山東大学基礎医学院倫理委員会（ECSBMSSDU2019-1-41）の承認を受け、すべての患者からインフォームド・ライセンスを得た。
細胞株
マウス細胞株Yac-1細胞（BFN608006355）はShandong Academy of Medical Sciencesから寄贈され、DMEM（Gibco）＋10％FBS（Gibco）＋1％Penicillin-Streptomycin（solarbio）中で培養されました。細胞は37℃、5％CO2の恒温槽で培養した。
バクテリアの調製
クロストリジウム・ブチリカム（C. butyricum）は、中国総合微生物文化収集センターから供給され、強化クロストリジウム培地で嫌気条件下、37℃、72時間培養した。遠心分離（3000g×5分）により菌体を採取し、PBSに再懸濁して最終実験濃度2×109CFU/0.2mlとし、離乳後の初期Abxマウスに8週齢まで週3回2×109CFU/0.2mlをガベージした。
Clostridium butyricum Powder（商品名：Baolean、青島東海製薬有限公司）をShuYu Civilian Pharmacyで購入し、離乳後のearly-Abxマウスに1日2×106/0.2mlを8週齢までガベージした。
実験動物
C57BL/6マウス（6-8週齢）は、Beijing Vital River Laboratory Animal Technologyから購入した。IL-18Rαノックアウトマウスは、四川大学のWei Wang教授から贈られた。Wei Wang from Sichuan Universityから贈られた。CD45.1マウスは、Dr. Xiaolong Liu (Center for Excellence in Molecular Cell Science, CAS)の好意により提供された。マウスは8週齢以降に交配され、離乳後、少なくとも2匹のダムから4~5匹のオスの同腹子がランダムに異なるケージに割り当てられた。すべてのマウスは、12時間の明暗サイクルで病原体のない特定の条件下で維持され、餌と水に自由にアクセスできるようにされた。実験は、山東大学実験動物センターの承認のもとで実施した。動物倫理番号 ECSBMSSDU2020-2-86。
抗生物質投与
宿主微生物は、既報の通り抗生物質を用いて枯渇させた32。具体的には、アンピシリン（1g/l）（ソラビオ）、バンコマイシン（0.5g/l）（ソラビオ）、硫酸ネオマイシン（1g/l）（ソラビオ）、メトロニダゾール（1g/l）（ソラビオ）の4種類の抗生物質を無菌水に溶解し、4℃で1週間以上保存してから使用しました。この抗生物質含有水を妊娠、授乳中のマウスに飲料水として供給し、3日ごとに交換した。一方、抗生物質を投与していない妊娠中のC57BL/6ダムからの子マウスは、各実験においてコントロールとして並行して維持した。早期Abxモデルについては、8週齢のコントロールまたは早期Abx雄性マウス（体重18~22g）をHCCモデル、16 S rRNA配列決定および微生物叢代謝または肝臓NK細胞解析に供した（1群5~11匹、2~4種類のダムから生まれ、2~3種類のケージで給餌）。
肝細胞癌モデルマウス
AKT/Mycモデルについては、8週齢のコントロールまたはearly-Abx雄マウスにsleeping-beauty transposition systemとAKT/Mycプラスミド（1μg pCMV-SB100、8μg pT3-AKT、16μg pT3-cmyc含む生理食塩水2ml）を水力学的に注射した。6週間後、マウスを犠牲にして肝組織を撮影し、LrNK細胞の表現型と機能を分析した。NK細胞とILC1の両方、またはcNK細胞のみの枯渇には、それぞれ200μgの抗NK1.1（BioXcell）または200μgの抗アジアロGM1（WAKO）、または同量のIgG（BioXcell）を4週間、3日おきにマウスに腹腔内注入した。
非アルコール性脂肪肝疾患関連HCC39を模倣したマウスモデルであるSTZ-HFD誘発HCCモデルについては、コントロールまたはearly-Abx雄性マウスに、生後2日目に200μg Streptozocin（Sigma）を単回皮下注射し、4週齢以降HFD（猫#：D12492、脂肪60kcal%のRodent diet）で飼育することにより誘発した。5ヶ月目にマウスを犠牲にし、マウス肝臓の腫瘍節を写真撮影し、LrNK細胞の表現型と機能を解析した。
最大腫瘍重量は、山東大学実験動物センターの倫理委員会が規定するように、選択した動物の10％重量を超えないようにした。
養子縁組移植モデル
8週齢のコントロールマウスまたはearly-Abxマウス（CD45.2）からCD3-NK1.1+細胞を精製しました。その後、精製した1×106個の細胞をCD45.1マウスに移植した。24時間後、レシピエントマウスに150μgのpoly（I：C）（Sigma）を腹腔内注射してNK細胞の活性化を刺激し62,63、16時間後にCD45.2+CD49a+CD3-NK1.1+細胞の機能を分析した。一方、CD45.2野生型マウスまたはIL-18Rα欠損マウスからCD3-NK1.1+細胞またはLrNK細胞を精製し、別途コントロールマウスまたは早期Abxマウス（CD45.1）に移入した。そして、ポリ（I:C）を16時間注入した後、レシピエントマウスにおいてCD45.2+CD49a+CD3-NK1.1+細胞の機能を分析した。
肝単核球（LMNC）、骨髄単核球の単離と細胞サブセットの精製
簡単に説明すると、マウス肝臓を洗浄し、200ゲージのステンレスメッシュに通した。単細胞を洗浄し、赤血球を溶解した後、細胞懸濁液を40％パーコール勾配培地上で遠心分離した。骨髄単核球については、大腿骨と脛骨をフラッシングして骨髄を得た後、赤血球を溶解し、PBSで洗浄した。
LrNK細胞、クッパー細胞、IL-18Rα-LrNK細胞、IL-18Rα+LrNK細胞の精製には、LMNCを特異的抗体で染色し、Moflo Astrios EQに供した。
肝血管腫患者からの肝単核球（LMNC）の分離は、新鮮な組織をPBSで洗浄し、小片に切り、RPMI1640培地（Gibco）中でコラゲナーゼII型（1 mg/mL, Worthington）およびDNaseI（0.01 mg/mL, ThermoFisher Scientific）で37℃、1時間消化させた。その後、30%Percoll密度勾配でリンパ球を分離し、PBSで2回洗浄した。
フローサイトメトリー解析
細胞表面の染色には、細胞懸濁液を特異的な標識抗体と4℃で30分間インキュベートした。細胞内染色については、単離したばかりの細胞をPMA（50ng/ml）（Sigma）およびIon（1μg/ml）（Biolegend）で2時間、またはIL-12（20ng/ml）（Proteintech）およびIL-15（50ng/ml）（Proteintech）で16時間刺激し、Brefeldin A (BFA) (Biolegend) で終濃度10μg/mLの培養物を4時間与えた。表面染色後、細胞を細胞内固定バッファーで20分間固定し、その後、透過バッファーで10分間透過させた。細胞内染色は、透過化バッファーに希釈した抗体で行った。CD107a染色については、細胞をCD107a抗体と4時間インキュベートした。フローサイトメトリーは、Cytoflex S（Beckman coulter）で実施し、FlowJo 10.6.2 または CytExpert 2.3.0 で解析した。
フローサイトメトリー染色用の全抗体は、補足表1に示す。
16 S rRNA配列決定および微生物叢の代謝解析
糞便は直ちに氷上で培養し、採取後速やかに-80℃に移して保存した。菌の検査は、Majorbio社（中国・上海）のIllumina Hiseqプラットフォームでの遺伝子配列決定により行った。16SrRNA遺伝子のV3-V4領域は、ユニバーサルプライマー（338 F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA, 806 R: GGACTACHVGGTWTCTAAT）を用いて増幅した。データは、Majorbio Cloud Platform（www.majorbio.com）のオンラインプラットフォームで解析した。
糞便微生物叢代謝物の分析については、糞便（～10 mg）をShanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co.,Ltd. によるLC-MSにかけた。糞便（〜10 mg）または肝臓および脾臓組織（〜100 mg）は、短鎖脂肪酸レベルを定量化するために標的GC-MS分析に供された。
肝細胞の単離と培養
マウスを麻酔し、門脈にA液（0.5mM EGTA（Santa）、10mM HEPEs（Coolaber）を含むCa2+とMg2+のないD-hanks）を8ml/minで滴下した。肝臓が飽和した時点で、下大静脈を開き、マウスをさらに20mlのA液と20mlのB液（10mM HEPEs、0.5mg/ml IV型コラゲナーゼ（Gibco）を含むハンクス液）で灌流した。その後、肝臓を取り出し、洗浄し、ピンセットで引き裂き、37℃のインキュベーター内で10mlの溶液Aと溶液Bの混合液で20分間消化した。細胞懸濁液を濾過し、47gで遠心分離し、細胞ペレットを10％ウシ胎児血清（Gbico）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン液（Solarbio）、2uMピルビン酸ナトリウム（Sigma）、0を含むDMEM（Gbico）に再懸濁した。 4 μg/mlデキサメタゾン（Sigma）、14 U/Lインスリン（Solarbio）で3時間培養し、その後、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、2 μMピルビン酸ナトリウム、0.04 μg/mlデキサメタゾン、0.14 U/Lインスリンは含むDMEMで培養。
トランスウェル共培養アッセイ
トランスウェルシステムを用いて、LrNK細胞とLMNC、肝細胞、クッパー細胞との共培養アッセイを実施した。簡単に説明すると、1×104個の精製LrNK細胞をトランスウェルインサート（上部コンパートメント）にプレーティングし、1×105個のLMNC、肝細胞またはクッパー細胞をトランスウェル下部（下部コンパートメント）で24時間共培養し、ポリ（I：C）、GPCRアゴニストAR-420626（R＆D）、4-CMTB（TOPSCIENCE）またはMK-0354（MCE）または酪酸（Sigma）は指示した実験時に加えた。
GPR109Aノックダウンについては、単離肝細胞またはクッパー細胞（1×105細胞）を12ウェルプレートで一晩培養し、ネガティブコントロールまたはGPR109A shRNAレンチウイルス（Shanghai Genechem Co.,Ltd. ）に感染させて72時間インキュベートした。ノックダウン効率はRT-qPCRによって検証し、共培養実験に使用した。
細胞毒性アッセイ
CFSEで標識したYAC-1細胞を、精製LrNK細胞とIL-2（100U/mL）をエフェクター：ターゲット比5：1で37℃、5％CO2インキュベーター内で4時間共培養し、7-ADを染色し、FCMで溶解した細胞をCFSE+7-AD+と識別した。
シーホース解析
2×106個の精製LrNK細胞をIL-12（20ng／ml）およびIL-15（50ng／ml）で12時間前処理した後、Cell-Tak溶液（コーニング）でコーティングしたSeahorse Bioscience培養プレートに播き、25mMグルコース、2mMグルタミンおよび1mMピルベート含有XF Base Medium Minimal DMEM medium（ Agilent）で非CO2培養器中で1時間培養をした。基礎、最大OCRおよびATP産生は、XF96 Seahorse Extracellular Flux Analyzer（Agilent）により、製造者の指示に従い測定した。
逆転写-定量的PCR(RT-qPCR)
肝組織または細胞からTRIzol試薬を用いてTotal RNAを抽出した。 cDNA合成は、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kitとランダムプライマーを用いてメーカーの説明書に従って行った。PCRは、SYBR® Green Real-Time-qPCR Master Mixを使用して行った。標的遺伝子のプライマーペアは、補足表2に示す。
統計解析
統計的有意性は、Prism 8を使用して決定した。有意性の判定には、2群間のStudentのt検定（両側不対）、またはTukeyの多重比較検定による一元配置分散分析（ANOVA）を使用した。全生存期間の差は、ログランク検定を用いて検証した。16 s rRNAの結果は、Wilcoxon順位和検定およびノンパラメトリック要因分解Kruskal-Wallis（KW）順位和検定を使用して検定した。データは、平均値±SEMで示した。統計的有意性は、*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; および ns, no significance として報告された。
報告書の要約
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
ソースデータは本論文とともに提供される。本研究の16 S rRNAシーケンスデータセットは、SRA、アクセッションでNCBIデータベースに寄託されている： PRJNA890468。RNA-seqデータはNCBIデータベースの制限付きアクセスで利用可能で、アクセスはアクセッション番号PRJNA884315で取得できる。生データはSource Dataファイルとして提供される。著者らは、本研究の結果を裏付けるすべてのデータが、本論文およびその補足情報ファイル内で、または合理的な要求に応じて対応する著者から入手できることを宣言する。ソースデータは本論文に添付されています。
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謝辞
本研究は、国家重点研究開発プログラム（No.2022YFA1103402（X.L.）、2021YFC2300603（C.M.）、2018YFE0126500（X.L））、中国国家科学基金（No.82171805 (X.L.), 81830017 (C.M.), 81970508 (X.) ）の助成を受けている。 L.)）、泰山奨学金（No.tspd20181201(C.M.)）、山東大学学際研究革新若手チーム（2020QNQT001（X.L.)）、山東自然科学基金主要基礎研究プロジェクト（No. ZR2k020ZD12(C.M.)). 山東大学トランスレーショナル・メディシン・コアファシリティーによる相談と機器の提供の支援に感謝する。IL-18R αノックアウトマウスを提供してくださった四川大学のWang Wei教授に感謝する。
著者情報
著者と所属
教育部実験奇形学重点実験室、山東省感染・免疫重点実験室、山東省済南市250012山東大学済魯医学院基礎医学院免疫学講座
田攀攀、楊文文、郭暁偉、王錫孝、譚思宇、孫仁慧、蕭栄、王玉貞、焦徳安、徐亜晨、魏延飛、呉壮昌、高麗芬、馬春紅、梁孝亨
中国山東省済南市250012山東大学生物診断・治療技術・設備共同革新センター
呉壮昌、高麗芬、馬春宏、梁暁宏
中国済南市山東大学基礎医学院組織・発生学部門教育部実験奇形学重点実験室
李春陽（リ・チュンヤン
貢献度
X.L.とP.T.は、研究のコンセプトを策定した。X.L.とP.T.は研究をデザインした。P.T.、W.Y.がX.G.、T.W.、S.T.、R.X.、R.S、Y.W、D.J、Xu、Y.Wからの支援を受けて実験を行い、その結果をX.L. とP.Tが分析しました。X.L.、Z.W.、C.L.、L.G.、C.M.は、結果を解釈した。P.T.、X.L.、L.G.、C.M.は原稿を書き、編集した。
対応する著者
Chunhong MaまたはXiaohong Liangに対応する。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者らは競合する利害関係を宣言しない
ピアレビュー
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Nature Communicationsは、Domenico Mavilioと他の匿名査読者に、この作品の査読に貢献したことを感謝します。査読者の報告書はこちらです。
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Tian, P., Yang, W., Guo, X. et al. Early life gut microbiota sustises liver-resident natural killer cells maturation via the butyrate-IL-18 axis. Nat Commun 14, 1710 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37419-7
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2022年4月20日受領
2023年3月16日受理
2023年3月27日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-37419-7
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