腸内細菌はアンジオテンシンII誘発性動脈性高血圧と血管機能不全を促進する

哉百名


J Am Heart Assoc. 2016 Sep; 5(9): e003698. 2016年8月30日オンライン公開。doi: 10.1161/JAHA.116.003698
PMCID: PMC5079031PMID: 27577581
腸内細菌はアンジオテンシンII誘発性動脈性高血圧と血管機能不全を促進する

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5079031/


Susanne H. Karbach, MD, 1 , 2 Tanja Schönfelder, DVM, 1 Ines Brandão, MSc, 1 Eivor Wilms, Vet, 1 Nives Hörmann, MSc, 1 Sven Jäckel, DVM, 1 Rebecca Schüler, MSc, 1 , 4 Stefanie Finger, MSc, 1 Maike Knorr, MD, 1 , 2 Jeremy Lagrange, Moritz Brandt, MD, 1 , 2 Ari Waisman, PhD, 4 Sabine Kossmann, PhD, 1 , 2 Katrin Schäfer, MD, 1 , 2 Thomas Münzel, MD, 1 , 2 , 3 Christoph Reinhardt, PhD, 1 , 3 and Philip Wenzel, MDcorresponding author 1 , 2 , 3
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関連データ
補足資料
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要旨
背景
腸内細菌叢は、生理的な宿主反応や免疫機能の発達に不可欠である。免疫細胞の機能によって決定されるプロセスである血圧や全身血管機能に対する腸内細菌叢の影響については不明である。

方法と結果
未チャレンジの無菌マウス（GF）は、従来飼育（CONV-R）マウスと比較して、全身のTヘルパー細胞1型スキューが減衰していた。GFマウスに通常の腸内細菌を接種すると、T細胞におけるT-box発現のリンパ系mRNA転写が誘導され、軽度の内皮機能障害が認められた。CONV-Rマウスと比較して、アンジオテンシンII（AngII; 1 mg/kg/日、7日間）投与したGFマウスは、CONV-Rマウスと比較して、血管内での活性酸素の生成が抑えられ、単球走化性タンパク質1（MCP-1）の血管内mRNA発現が抑制されたことが示された。また、インターロイキン（IL）-17合成の主要な転写因子であるレチノイン酸受容体関連オーファン受容体γt（Rorγt）の発現が減少した。その結果、血管内白血球の接着が弱まり、Ly6G+好中球やLy6C+単球の大動脈血管壁への浸潤が減少し、腎臓の炎症からの保護、さらには内皮機能障害やAngIIに対する血圧上昇の減衰がもたらされた。重要なことは、GFマウスでは心臓の炎症、線維化、収縮機能不全が抑制され、AngIIによって引き起こされる心血管系の炎症ストレスから全身的に保護されていることが示された。

結論
腸内細菌は、MCP-1/IL-17による血管免疫細胞の浸潤と炎症をサポートすることによって、少なくとも部分的にはAngIIによる血管機能障害と高血圧を促進する。

キーワード：アンジオテンシンII、動脈性高血圧症、腸内細菌叢、炎症、単球、血管機能障害
テーマカテゴリー 炎症、血管生物学、高血圧、病態生理
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はじめに
無菌のフレキシブルフィルムアイソレーターで生まれ育った無菌（GF）マウスに微生物叢が存在しないことから、常在菌の存在が正常な免疫発達に不可欠であることが示された。1, 2 GFマウスの免疫プロファイルは、常在菌腸内細菌プロファイルがそのままのマウスと比較して、デフォルトのTヘルパー細胞タイプ2（Th2）バイアス、炎症性のインターロイキン（IL）-17産生CD4+T細胞3およびT制御細胞4が著しく減少、IL-12の形成5が低いことが特徴的である。さらに、粘膜免疫と腸内細菌は、骨髄単球系細胞を活性化し、炎症性表現型への発達を促し、主要組織適合性クラスII発現を促進し8、リポ多糖チャレンジ9や虚血再灌流障害後の全身性炎症反応に必須であることが示されている10。脾臓が炎症性単球のリザーバーとして機能する可能性について11、GFマウスの脾臓は、通常飼育（CONV-R）マウスの脾臓よりもマクロファージコロニー刺激因子依存性のコロニー形成が著しく少ないことが注目される8。

炎症性単球やマクロファージは、動脈性高血圧における炎症と酸化ストレスの強力なメディエーターであり、高血圧や血管機能障害の発症に重要な前提条件であることが確認されています。12, 13, 14, 15, 16, 17 リゾチームM陽性細胞のアブレーションにより、アンジオテンシンII（AngII）による血管壁へのミエロモノサイトの集積が減少し、AngIIに対する血圧上昇も減弱されました。我々は最近、Th1免疫反応に関わるサイトカインであるインターフェロンγ（IFN-γ）が、AngIIによる血管機能障害や炎症において単球を炎症性表現型に偏らせる決定的なサイトカインであることを突き止めた。さらに、IL-17A は、少なくとも部分的には、好中球顆粒球を大動脈血管壁に動員することによって、AngII 誘発動脈性高血圧19 および炎症関連血管機能障害20 のメディエーターとして働くことが知られている。さらに、腸における IL-17 産生 CD4+T細胞（Th17細胞）の発生は、腸内細菌叢に依存することが示されている21。門脈結紮モデルマウスにおいて、GFマウスは、コロニー形成したコントロールと比較して、門脈圧亢進から一部保護されている22。

また、AngIIがラットの腸内細菌叢の異常を誘発することが報告されている。Firmicutes属を減少させる抗生物質で治療すると、血圧が低下することが報告されている23。我々は、腸内細菌叢が、単球などの骨髄単球系細胞が血圧ホルモンであるAngIIに反応しやすくする役割を果たす可能性があると仮定している。そこで、GFマウスを用いて、AngIIによる血管機能障害および高血圧の病態における腸内細菌叢の役割について検討した。その結果、GFマウスはAngIIによる全身性血管炎から保護されており、腸内細菌叢が動脈性高血圧の血管緊張の制御に決定的な役割を果たすことを支持するものであった。

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材料と方法
マウス
マウスに対して行われたすべての処置は、ドイツの動物保護法に従い、Institutional Animal Care and Use Committee (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Germany; animal experimental approval 23-177-07/G 12-1-002) によって承認された。すべてのマウスは、12時間の明暗サイクルを持つ遮断施設（Translational Animal Research Center, University Medical Center Mainz, Mainz, Germany）で飼育し、EU Type II IVCケージで1ケージあたり2～5匹のマウスを、標準のオートクレーブ実験食（PMI, St.Louis, MO）と水を自給し、22±2℃室温の特定病原体なしまたはGF条件下で飼育した。マウスのGF状態は、16S rDNAの検出のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および培養に基づく方法によって週単位で検査された。Swiss WebsterおよびC57BL/6JをバックグラウンドとするCONV-Rマウスに対し、無菌のフレキシブルフィルムアイソレーターで生まれ育った10～16週齢の雄性GFマウスを使用した。GFマウスを正常な腸内細菌叢で14日間コロニー化し、従来型（CONV-D）マウスを得た。コロニー形成は、元GFマウスにCONV-Rマウスの糞便内容物を5mLのPBSに懸濁したものを経口投与することにより達成した。

CONV-Rマウス対GFマウスのAngII（1mg/kg/日、7日間）対偽薬のin vivo処置は、GFマウスの場合には、特定の無菌移植技術を用いた浸透圧ミニポンプによって達成された。簡単に言えば、Alzetミニ浸透圧ポンプ（モデル1007D；Alzet、Cupertino、CA）は、無菌フード下で製造者の説明書に従って充填および調製され、次に、0.9％NaCl溶液で満たされた無菌15ml FalconチューブでGFマウス隔離器に搬送され、隔離器のポートで二酸化塩素ベースの脱菌剤でスプレーすることによって滅菌された。イソフルランも鎮痛剤、鎮静剤とともに、準備した実験用アイソレータに移した。ポンプの埋め込みは、加熱滅菌した手術器具を用いて行った。麻酔および鎮痛のために、マウスはミダゾラム（5 mg/kg; Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany）、メデトミジン（0.5 mg/kg body weight; Pfizer Deutschland GmbH, Berlin, Germany）およびフェンタニル（0.05 mg/kg body weight; Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Germany）を腹腔内に注射された。手術後、動物にアチパメゾール（0.05 mg/kg）、フルマゼニル（0.01 mg/kg）、ナロキソン（0.024 mg/kg）を皮下投与して麻酔を拮抗させた。

血圧の測定は、マウス用非侵襲血圧装置（テールカフ法；Kent Scientific CODA-STD, Torrington, CT）を用いて行い、血管機能の評価（vascular relaxations studies ex vivo）も、先に述べたように行った12。GFマウスの血圧評価は、マウスを無菌環境から出してから120分以内に実施した。

実験群としては、AngII投与あり（n=15）、なし（n=17）、AngII投与あり（n=32）、なし（n=27）のCONV-Rマウス、Swiss Webster背景のCONV-D（n=5）、GFマウス（n=9）を分析対象としました。

血管緊張実験
GFマウスとCONV-RおよびCONV-Dマウスの単離大動脈輪の血管収縮剤および血管拡張剤（フェニレフリン、プロスタグランジンF2α、アセチルコリン、ニトログリセリンを10-9-10-4 mol/Lの範囲で増量）に対する血管反応性を検討した。単離大動脈を4mmセグメントに切断し、Krebs-Henseleit溶液（37℃、pH7.35、98.93mmol/LのNaCl、4.69mmのKClを含む）で満たされた器官室内の力変換器（Kent Scientific Corporation; Powerlab; ADInstruments, Spechbach, Germany）上に取りつけた。 69 mmol/L of KCl, 2.49 mmol/L of CaCl2, 1.2 mmol/L of MgSO4, 0.613 mmol/L of K2HPO4, 25 mmol/L of NaHCO3, and 11.1 mmol/L of d-glucose) に炭酸ガス (95% O2/5% CO2) バブをかけ、10 μmol/L of Indomethacin を含有させて、内因性のプロスタグランジン合成の防止に努めた。アセチルコリン（ACh）およびニトログリセリン（三硝酸グリセロール；GTN）に反応する血管弛緩を調べるために、大動脈セグメントを30分かけて徐々に伸ばし、1.0 gの安静時張力に到達させた。 3μmol/L）およびフェニレフリン（累積濃度-収縮-曲線、10-8-10-5.5 mol/L）でKClによって誘導された最大緊張の50％から80％に達するように予備収縮した後、濃度の増加するAChおよびGTN（10-9-10-4.5 mol/L）に対して累積濃度-緩和曲線が記録されました。

L012増強化学発光と蛍光酸化マイクロトポグラフィーを用いた活性酸素種生成の検出
全血中の白血球の酸化バーストをL012 enhanced chemiluminescence（CL）で、血管系の酸化ストレスを大動脈凍結切片のdihydroxyethidium stainingで解析した。まず、200 IUのヘパリンをマウスの心臓に注入し、右心室から静脈血を採取した。ヘパリン処理した血液は室温で保存し，直ちにCLを測定した．L012強化化学発光（ECL）シグナルは、PdBU（10μmol／L）の存在下で100μmol／LのL012を添加した10μLサンプルにおいて、Berthold Technologies（Bad Wildbad、ドイツ）のLumat LB9507を用いて1分間隔で計数した。CLは10分間インキュベートした後、1分あたりのカウント数で表した。大動脈の胸部凍結切片は、蛍光酸化マイクロトポグラフィーのために、スーパーオキシド感受性色素、ジヒドロエチジウム（DHE；1μmol/L）で染色した12：大動脈を水洗して洗浄し、4mmに切断して、0を含むクレブスヘンセレイト溶液でインキュベートするために使用した。 1 mg/mL of aprotinin, 0.2 mg/mL of pepstatin, and 0.5 mg/mL of leupeptin を含む Krebs-Henseleit solution で 37℃、10 分間インキュベートし、Tissue-Tek で包埋後、液体窒素で凍結した。8μmの大動脈凍結切片を切り出し、DHEで染色し、37℃で30分間インキュベートした。大動脈ラミナからの緑の自家蛍光と活性酸素産生細胞内の赤のエチジウム蛍光を蛍光灯顕微鏡（Zeiss Axiovert 40 CFL microscope, Zeiss lenses and Axiocam MRm camera; Zeiss, Oberkochen, Germany）で検出し，データ取得ソフトウェア AxioVision（Zeiss） で解析した．

mRNA 発現解析
TissueLyser（Qiagen、Hilden、ドイツ）による制御破砕後、グアニジニウムチオシアネートを用いて、大動脈組織または脾臓CD4+リンパ球（5％FCSおよび1％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび抗CD28［1：500］を含むRPMI中の抗CD3コートプレートで一晩刺激）から全RNAを単離した。

リアルタイム定量的逆転写酵素PCR（qRT-PCR）は、ワンステップqRT-PCRを用いて行った：0.05μg/μLの総RNAを、QuantiTect Probe RT-PCR kit（Qiagen）による分析に使用した。表記プライマーのTaq-Man Gene Expressionアッセイをプローブとプライマーのセットとして使用した（Applied Biosystems、Foster City、CA）。

分析は、対応する転写因子、（T-bet；Mm0045090-m1）、フォークヘッドボックスタンパク質p3（Foxp3は制御性T細胞発生をマークする；Mm01351178_g1）、GATA結合タンパク質3（GATA-3；Th2細胞をマークする；Mm00484683_m1）、（レチノイン酸受容体関連のオーファン受容体γt（RORγt）はIL-17形成を指示する）のmRNA発現について実施された。Mm01261022_m1）、誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS；Mm00440485_m1）、NADPH酸化酵素2（Nox2；Mm00514478_m1）、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2（Ccl-2；Mm00514478_m1）がある。Mm00441242_m1), angiotensin type 1 receptor (Agtr1a; Mm01957722_s1), and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1; (Mm00449197_m1) の5種類である。内因性コントロールとしてのTATA-box binding protein（ハウスキーピング遺伝子）に対するそれぞれのサンプルの相対発現量は、delta-delta threshold cycle 法で算出した24。

サイトカイン形成
脾臓由来のリンパ球を分析することにより、全身免疫プロファイルの極性パターンを評価した。T細胞反応を誘発する抗CD3および抗CD28刺激後のこれらの細胞のサイトカイン形成を、公表されたプロトコルに従って、ELISAおよびビーズベースのBio-Plexアッセイ（96ウェルプレート、Luminex 200; Life Technologies, Carlsbad, CA）（IFN-γ、IL-4、IL-10）で計測した18。

免疫細胞の蛍光活性化セルソーティング解析
マウスの免疫学的表現型は、全血、脾臓、大動脈、腎臓の B220+ および TCRß+ リンパ系細胞（B 細胞および T 細胞）、ならびに CD11b+, Gr-1+ (Ly6G+, Ly6C+) および F4/80+ ミエロイド細胞（好中球および単球／マクロファージ）のフローサイト解析によって検討された。血液中の赤血球はBD社（BD Biosciences, San Jose, CA）の蛍光活性化セルソーティング（FACS）溶解液で溶血させた。マウス大動脈の細胞解析のために、コラゲナーゼII（1mg／mL）およびDNase I（50μg／mL）またはリベラーゼ（1mg／mL）を用いて37℃で30分間、全大動脈を消化した。腎臓細胞のフローサイトメトリー分析のために、腎臓を無血で流し、コラゲナーゼD（2mg／mL）およびDNase（100μg／mL）を用いて37℃で30分間消化し、さらにgentleMACS Cチューブ（Miltenyi Biotenc, Cambridge, MA）により均質化させた。非特異的なFc受容体を介した結合部位をブロックするために、細胞をCD16/CD32に対する非標識抗体と10分間プレインキュベーションした（Fc-block）。また、GF対CONV-Rマウスの血管免疫細胞の表現型も検討した。

眼窩内蛍光顕微鏡検査
マウスはミダゾラム（5 mg/kg; Ratiopharm GmbH）、メデトミジン（0.5 mg/kg体重; Pfizer Deutschland GmbH）、フェンタニル（0.05 mg/kg体重; Janssen-Cilag GmbH）により腹腔内注射で麻酔した。各マウスの右総頸動脈と左総頸動脈を自由に剥離した。まず、頸静脈カテーテル（内径0.28mm、外径0.61mm；Smiths Medical Deutschland GmbH, Grasbrunn, Germany）により100μLのアクリジンオレンジ（0.5mg/mL；Sigma-Aldrich, St.Louis, MO）を注入して生体内の循環白血球の染色を行った。顕微鏡解析には、長距離コンデンサーと10× (NA 0.3) 水浸対物レンズを用いた高速広視野蛍光顕微鏡Olympus BX51WI、モノクロメーター (MT 20E; Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Germany) 、電荷結合素子カメラ (ORCA-R2; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan) が使用されました。画像の取得と解析は、Realtime Imaging System eXcellence RT (Olympus Deutschland GmbH) ソフトウェアを使用して行った。白血球は、頸動脈あたり4視野（150×100μm）で定量され、付着性白血球とローリング性白血球に区分けすることができた25。

組織学および免疫組織学
心臓の線維化は、左心室を通るパラフィン包埋断面について、マッソン三色染色（MTC） を用いて決定した。マクロファージは、マウスMac2に対するモノクローナル抗体（クローンM3/38；BIOZOL Diagnostic、ミュンヘン、ドイツ）を用いて可視化した。好中球は、マウス好中球エラスターゼ（ELANE; abcam, Cambridge, MA）に対するポリクローナル抗体を用いて検出された。結果は、画像解析ソフトウェア（Image ProPlus, version 7.0; Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD）を用いて陽性領域（MTCは青信号、Mac2は赤茶信号）を自動的に決定するか、または陽性細胞の数（ELANE）を手動で数えることによって定量化された。それぞれの場合において、2つ以上の200×顕微鏡視野を評価し、結果はマウスごとに平均した。

心筋細胞膜は、FITC標識小麦胚芽アグルチニン（WGA；Molecular Probes、Eugene、OR）を用いてアセトン固定した心臓凍結切片上で可視化し、続いて単一心筋細胞断面積を決定した。1断面あたり、無作為に選んだ100個の心筋細胞を評価し、結果を平均した。

心臓超音波測定
マウスの麻酔はチャンバー内で行い（2-4% イソフルランと0.2 L/min 100%O2の混合）、フェイスマスクで維持した（1-2% イソフルランと0.2 L/min 100%O2）。動物はレールシステム（VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada）に取り付けられた加熱テーブルの上で飼育された。超音波は、Vevo 770 Systemと40MHzマウストランスデューサ（VisualSonics）を用いて実施した。心拍数は測定し、体温は直腸プローブを用いてモニターし、37℃に維持した。左心室壁厚、心室内中隔厚、左心室拡張末期体積、収縮末期体積、左心室短縮率を測定した。GFマウスの心機能評価は、マウスを無菌環境から出してから120分以内に行った。

統計解析
統計解析は、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン5；GraphPad Software, Inc.、La Jolla, CA）を用いて行った。データは、Kolmogorow-Smirnow検定で正規分布の解析を行った。

正規分布が与えられた場合、2-tailed unpaired Student's t-test, 1-way ANOVA test with Bonferroni post-hoc test or 2-way-ANOVA が適用された。正規分布がない場合は、Wilcoxon-Mann-Whitney、Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較、または選択した列の比較を適宜用い、図の説明文に記載した。

データは中央値と四分位範囲を示した箱ひげ図である。<0.001、<0.01、<0.05のP値は統計的に有意とみなし、それぞれ3、2、1のアスタリスクで印をつけた。

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結果
GFマウスではAngIIによる血管炎症が抑制される
未抗弁動物における腸内細菌叢の血管緊張への影響に取り組むため、スイス・ウェブスターを背景にしたGFマウスとCONV-Rマウスを研究した。フェニレフリンに反応する血管収縮、ならびに内皮依存性（ACh）および内皮非依存性（GTN）の血管弛緩は、GFとCONV-R Swiss Websterマウスの間で統計的に差がなかった（図S1AからS1C）。興味深いことに、単離脾臓細胞におけるT-box 21（Tbx21）mRNAの発現は、CONV-Rマウスと比較してGFマウスで減少していた。CONV-Rマウスの状態を導き出すために腸内細菌叢で再コロニー化したGFマウス（CONV-Dマウス）は、CONV-Rマウスと同等の脾臓細胞Tbx21 mRNA発現レベルを有していた（図S1D）。したがって、タイプ1免疫応答のシグネチャーサイトカインであるIFN-γは、GFマウスから分離した抗CD3-および抗CD28刺激脾臓細胞の上清においてCONV-R対応マウスと比較して著しく減少し、CONV-Dでは部分的に回復していた。IL-4とIL-10についても同じ傾向がみられた（図S1E）。IFN-γの炎症促進的な役割は、血管弛緩に負の影響を与える。その結果、CONV-Dでは、CONV-RやGFマウスと比較して、血管収縮の増大と軽度の内皮機能障害が観察された（図S1A、S1B）。これらの結果は、マイクロバイオータによる血管のタイプ1免疫反応の増強と、内皮機能に対するマイクロバイオータの役割を示している。

タイプ1免疫応答がAngII誘発血管傷害を促進するという概念に基づき、18, 26, 27我々はさらに、血管機能障害に対する微生物叢の影響を調べた。この目的のために，我々は C57BL/6 マウスを用いた．なぜなら，このマウス系統は，例えば動脈硬化のより早い進展に見られるように，Th1 細胞の偏りに起因する動脈疾患の研究に最も適した近交系であることが知られているからである28, 29 AngII注入（1mg/kg/日，7 日）GF C57BL/6 マウスは CONV-R マウスと比較して血管壁および全血中の ROS 形成から保護されていた（図1A および1B）1B）．AngII注入CONV-Rマウスでは，IL-17A形成を指令するレチノイン酸受容体関連オーファン受容体γt（Rorγt）およびTh2細胞転写因子GATA-3の大動脈mRNA発現が増加していたが，GFマウスモデルでは変化がなかった（図1C）．また、AngII注入GFマウスでは、食細胞型NADPH酸化酵素nox2と誘導型一酸化窒素合成酵素（inducible nitric oxide synthase）の血管mRNAレベルが、CONV-Rマウスと比較して低下しており、ともに炎症細胞の侵入と活性窒素の生成を示していた（図1D）。これらの結果は、GFマウスの伝導性血管はAngIIチャレンジにより血管の炎症および血管の活性酸素の産生が少なく、これはT細胞の偏向の変化に起因している可能性があることを示唆している。




図1
ジャームフリー（GF）マウスはAngIIによる血管酸化ストレスと炎症性遺伝子発現から保護される。C57BL/6バックグラウンド±AngII（1mg/kg/日）投与7日後のCONV-R対GFマウスを調査した。A, 大動脈スーパーオキシド形成。左：大動脈凍結切片の代表的なジヒドロエチジウム光顕像；スーパーオキシド形成は赤で表示される。右。定量、各群3〜6匹、Kruskal-Wallis検定とDunn′s多重比較。B、ホルボレステロール、PDBu（100 nmol/L）存在下での全血の呼吸バースト、L012（100μmol/L）ECLで測定した。1-way ANOVAとBonferroni post-hoc test、1群あたりn=5から13匹のマウス。C、大動脈Ror-γtおよびGATA-3 mRNAの発現。Rorγt：各群n＝3〜10，CONV-R vs CONV-R＋AngII，GF vs GF＋AngIIを比較した．GATA-3：各群n=3～8，CONV-R+AngIIとGF+AngIIを比較）．D, 大動脈のiNOSおよびNox2 mRNAの発現．Dunn′s多重比較によるKruskal-Wallis検定，iNOS：n=4〜12マウス/群，Nox2：n=4〜12マウス/群．AngIIはアンジオテンシンII、CONV-Rはconventionally raised、ECLはenhanced chemiluminescence、GATA-3はGATA binding protein 3、iNOSはinducible nitric oxide synthase、Nox2はNADPH oxidase 2、RorγtはRetinoic acid-related orphan nuclear receptor gamma t.を示す。



AngIIによる骨髄単球系細胞の大動脈への動員は、ジャームフリーマウスでは減少している。
30, 31, 32 高血圧における単球誘引に最も関連するケモカインである単球走化性タンパク質 1 (MCP-1) をコードする Ccl-2 の大動脈 mRNA 発現 15 は AngII に応答して増加し、GF マウスでは抑制された。一方，AngII の血管への直接作用や白血球の接着に重要な Agtr や VCAM-1 の大動脈 mRNA 発現量は，微生物群の欠如によって影響を受けなかった（図 2A および図 S2A）．AngIIを投与したCONV-RおよびGFマウスの頸動脈を眼窩内ビデオ顕微鏡（IVM；図2Bおよび図S2B）で分析したところ、白血球のローリングと接着が減弱していることが確認された。これらの結果は、白血球の動脈血管壁への動員におけるCcl-2の役割と、コロニー形成されたマウスの血管機能障害に対する役割を示している。GFマウスにおける骨髄単球系細胞の動員減少に伴い、AngII投与CONV-Rマウスの大動脈にCD45+炎症性細胞の著しい集積が検出されたが、GFマウスでは鈍化していた（図2C）。さらに、単離大動脈組織のフローサイトメトリー解析により、AngIIに応答してCD11b+骨髄単球、CD11b+Ly6G+好中球および炎症性CD11b+Ly6G-Ly6Chi単球が増加し（図2D）、これは腸内細菌叢がない場合には減弱されることがわかった。これらの結果から、GFマウスでは骨髄単球系細胞のMCP-1依存性の走化性が緩和され、血管の炎症が抑制されることが示唆された。



図2
腸内細菌叢の欠如は、AngIIによる骨髄単球細胞の大動脈血管壁への浸潤を減弱させる。C57BL/6背景のCONV-R対GFマウス±AngII（1mg/kg/日）を7日間in vivo投与した後に検討した。A、大動脈Ccl-2 mRNA発現。Kruskal-Wallis test with Dunn′s multiple comparison test, n=4 to 12 mice per group. B, AngII注入GFおよびCONV-Rマウスの頸動脈におけるローリング白血球の眼窩内ビデオ顕微鏡イメージング．左図：代表写真，右図：定量化．Kruskal-Wallis test with Dunn′s multiple comparison test, n=3 to 5 mice per group. C、大動脈あたりのCD45.2+細胞総数のフローサイトメトリー解析。Dunn′s多重比較試験によるKruskal-Wallis検定、1群あたりn=10〜11マウス。D、大動脈あたりのCD11b+細胞、CD11b+Ly6G+細胞およびCD11b+Ly6G-Ly6C+細胞のフローサイトメトリー解析。生きているCD45+細胞でプレゲート。総細胞数は棒グラフで示す。Kruskal-Wallis test with Dunn′s multiple comparison test, n=10 to 12 mice per group. 以下、代表的な蛍光活性化セルソーティングのプロットを示す。AngIIはアンジオテンシンII、Ccl-2はケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2、CONV-Rはconventionally raised、GFはgerm-freeを示す。


AngIIによる血管機能障害、動脈性高血圧、および内臓障害は、腸内細菌叢の欠如により抑制される。
CONV-Rマウスとは対照的に、GFマウスはAngII誘発の血管内皮および平滑筋機能障害から保護された（それぞれAChおよびGTNに反応する分離大動脈輪の濃度-緩和曲線で評価；図3Aおよび3B）.3B）。重要なことは、GFマウスの鈍化した免疫表現型は、血管機能の改善と関連しているだけでなく、CONV-Rマウスと比較して、GFマウスではAngIIによる血圧上昇を防いだことである（図3C）。並行して、AngII処置したGFマウスの腎臓では、AngII処置したCONV-Rマウスと比較して、浸潤CD45.2+およびCD11b+細胞のレベルが減少した（図3Dおよびand33E）。

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オブジェクト名はJAH3-5-e003698-g003.jpg。
図3
無菌（GF）マウスはAngIIによる血管機能障害および血圧上昇から保護される。C57BL/6バックグラウンド±AngII（1mg/kg/日）投与7日後のCONV-R対GFマウスを検討した．AおよびB、内皮依存性（ACh）および内皮非依存性血管拡張剤（GTN）に反応した単離大動脈輪の累積濃度弛緩曲線。二元配置分散分析、いずれも1群あたりn=6〜15匹のマウス。*P<0.05 vs CONV-R; † P<0.05 vs GF; ‡ P<0.05 vs GF+AngII．これらの結果から，CONV-Rの血圧は，GF+AngIIに対して0.05以下であった．C, AngIIチャレンジの有無によるCONV-RおよびGFマウスの血圧をテールカフ法で測定した。Dunnの多重比較によるKruskal-Wallis検定，n=4〜5/群．D、CONV-RコントロールマウスおよびGFマウスの腎臓のAngII処理有無のフローサイトメトリー分析。CONV-RコントロールマウスおよびGFマウス±AngII処理における腎臓あたりのCD45＋およびCD11b＋細胞（生きているCD45＋細胞で前計算）を棒グラフに示す。統計解析は1-way ANOVAとBonferroni post-hoc testで行い、1群あたりn=5〜8匹のマウスを用いた。以下、代表的な蛍光活性化セルソーティングのプロットを示す。AChはアセチルコリン、AngIIはアンジオテンシンII、CONV-Rはconventionally raised、GTNはglyceryl trinitrateを示す。

動脈性高血圧患者の臨床的転帰は，高血圧性心疾患や腎疾患などの末端臓器障害に大きく左右される．AngIIの注入は，CONV-Rマウスの心臓の線維化を増加させ，ELANE+だけでなくMAC-2+の骨髄単球細胞の蓄積を引き起こし，これはGFコントロールでは減衰した（図4A）．また，AngIIを注入したCONV-Rマウスでは心筋細胞が肥大していたが，GFマウスでは認められなかった（図4B）．したがって、心臓のAngII誘発性肥大および-収縮性は、CONV-Rマウスに比べ、GFマウスで減少し、高血圧誘発性末端器官損傷が腸内細菌叢の欠如によって減衰することが示された(図5)。

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図4
GFマウスでは、AngIIをトリガーとする心筋線維化、および骨髄単球系細胞の集積が抑制される。CONV-R対GFマウス±AngII（1mg/kg/日）を7日間in vivo投与した後、検討した。A, 心臓切片をマッソントリクローム（MTC）染色して線維化を評価し、マクロファージだけでなく好中球の蓄積を評価するためにELANE +細胞と同様にMAC-2 +細胞の免疫組織化学染色によってそれぞれ解析した。B、心臓切片の心筋細胞断面積の代表画像。FITC標識した小麦胚芽アグルチニンプローブした心筋膜は緑色に表示される。C, 定量化。MAC-2、ELANE、およびMTC：選択した列のDunn′s多重比較によるクラスカル-ウォリス検定（CONV-R対CONV-R AngII、GF対GF AngII）、n＝3〜4マウス/グループ。心筋細胞(CM)面積。心筋細胞（CM）面積：選択した列のDunn′s多重比較によるクラスカル・ワリス検定（GF vs GF AngII, CONV-R AngII vs GF AngII）、各群3～4匹。AngIIはアンジオテンシンII、CONV-Rはconventionally raised、GFはgerm-freeを示す。

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図5
AngII誘発高血圧における末端臓器障害はGFマウスで減弱される。CONV-R対GFマウス±AngII（1mg/kg/日）in vivo投与7日後を調査した。A～C, 左室駆出率（LVEF; %）、LV質量（g）、拡張期の心室内中隔（IVS）厚（mm）を高周波超音波で測定し、描出した。Dunn′s多重比較によるKruskal-Wallis検定。D、拡張期（500ms以上）のIVS、左心室内径（LVID）、および左心室後壁（LVPW）を含む代表的な超音波画像である。AngIIはアンジオテンシンIIを示し、CONV-Rはconventionally raisedを示し、GFはgerm-freeを示す。

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考察
我々は、腸内細菌叢の欠如が、AngII誘発性動脈性高血圧、血管機能障害、および高血圧誘発性末端臓器障害からマウスを保護することをここに証明した。この保護は、血管系における炎症性骨髄単球細胞の蓄積の抑制によってもたらされるようである。最近、腸管リンパ組織において、T-bet勾配がRORγtを発現する自然リンパ系細胞（ILC）の発生を決定することが発見された。これらのILCは、IFN-γ（T-betにより制御）およびIL-17（RORγtにより制御）を形成することができ、ナチュラルキラー細胞および細胞障害性T細胞の特徴を共有している33。GFマウスは、IL-12の形成、T-bet/IFN-γシグナル、33およびRORγt/IL-17シグナルの変化により特徴づけられる3。逆に、GFマウスは、CONV-Rマウスと比較して、CD11b+細胞の肺浸潤と肺胞マクロファージが少なく、アレルギー性気道炎症モデルにおいてTh2免疫応答を誇張している35。

重要なことは、上記のサイトカインシグナルはすべて、AngIIによる血管機能障害と動脈性高血圧に因果関係があることが示されていることである。18, 19, 36 我々のデータは、このシグナル伝達がAngIIによる血管機能障害にメカニズム的に関与し、腸内細菌叢がない場合は減弱することを示している。

血圧は、ベースライン条件下でGFマウスとCONV-Rマウスの間に差はなかった。このことは、抗生物質治療により腸内細菌叢が減少したマウスでの観察と一致する37, 38。しかし、腸内細菌叢の非存在は、in vivoでのAngIIに応答した血圧上昇を保護することが確認された。このように、Ly6G+およびLy6Chi骨髄単球細胞の動員、活性化、血管浸潤を引き起こすIL-17およびIFN-γ経路の両方が、AngII注入GFマウスで減衰したという観察は、少なくとも部分的には、全身性炎症反応の促進に対する腸内細菌叢の重要な役割を説明するものであった。GFマウスの1型免疫反応の表現型が弱まった結果、血管の酸化ストレスが鈍化し、血管のnox2やinosの発現が減少した。これは、主に血管系に蓄積した炎症細胞によって引き起こされる12, 39

また、AngII に対する骨髄単球の動員において最も重要なケモカイン受容体 CCR-2 のリガンドである MCP-1 をコードする Ccl-2 の大動脈 mRNA 発現は CONV-R マウスに比べ GF で減少していた15, 16。また、腸内細菌叢の欠如は血管内Agtr1濃度に影響を与えず、IL-17Aと同様にMCP-1によって化学吸引される浸潤骨髄球細胞は、AngIIに対する血圧上昇を媒介することが知られている12, 19 興味深いことに、骨髄部門におけるT-betの欠如は、IL-12の形成を減少させ、血管系におけるMCP-1/CCR-2軸の減衰をもたらし、AngII誘発性高血圧に影響を与えることになる18。逆に、CCR-2 の発現が増加した単球は、より血管内皮に接着することが最近明らかになった25 。したがって、GF マウスの T-bet/IFN-γ33 と RORγt/IL-173、21 および MCP-1/CCR-2 シグナルが全身的に減衰することは、AngII による血管障害の減衰に寄与する可能性が極めて高いと考えられる。

GF ApoE-/- マウスは、慢性炎症性血管疾患の古典的動物モデルである高脂肪食誘発アテローム性動脈硬化症から保護されるという予備的データがある40。広域抗生物質で駆除した ApoE-/- マウスにコリンを豊富に含む食事を与えたところ、血管病変形成と F4/80+ マクロファージの大動脈浸潤から一部保護された41。腸内細菌叢の枯渇は、実験的心筋梗塞の心筋障害を軽減することが証明されている42。我々は、GFマウスにおいて、腎臓におけるCD11b+ミエロモノサイト細胞のAngII誘導性拡大が減少することを示した。腎臓は血圧を調節する部位であると同時に、高血圧に関係する MCP-1-, IL-17A-, IFN-γ 駆動性炎症44 によって損傷を受ける臓器であることから、これは重要なことである。同様に、GFマウスはAngIIによって誘発される心臓の炎症とリモデリングから保護された。さらに、AngII および IFN-γ 依存性の免疫細胞の浸潤によって損なわれる心機能26, 45 は、GF マウスでは部分的に維持されていた。このことは、微生物がAngIIによって引き起こされる全身性の炎症性変化を促進し、それによって生体内で高血圧の発症を促進するという概念をさらに裏付けるものである。したがって、生後直接的に獲得される生態系である常在菌の形成は、AngII による高血圧を促進し、AngII による心肥大の発生を支持する環境因子である可能性がある。以上より、腸内細菌叢が引き金となる全身性炎症の分子経路を標的とすることで、将来的に高血圧治療の選択肢が増える可能性がある。

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資金源
この研究は、ドイツ心臓研究財団（F/34/14）とドイツ研究財団（DFG WE 4361/4-1）からWenzelに、Naturwissenschaftlich-Medizinisches Forschungszentrum（NMFZ）からReinhardtとWenzelに学内プロジェクト助成金により支援されています。KarbachとReinhardtは、この研究に関連してドイツ研究財団（DFG KA 4035/1-1, RE 3450/3-1 and 3450/5-1）から資金援助を受けている。Karbach, Brandão, Kossmann, Knorr, Brandt, Reinhardt, Schäfer, Münzel, and Wenzelはこの研究に関連して連邦教育研究省（BMBF 01EO1003 and 01EO1503) から資金援助を受けている。

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開示事項
なし

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参考情報
図S1. 腸内細菌叢が存在するマウスと存在しないマウスの血管機能。A〜C、フェニレフリンでインキュベートした後のGF、従来飼育（CONV-R）、従来飼育（CONV-D）マウスの大動脈輪で誘発した力（血管収縮、A）、アセチルコリンでインキュベートした後のGF、CONV-R、CONV-Dマウスの大動脈の血管緩和カーブ（Ach; 内皮依存性血管弛緩作用，B），三硝酸グリセリル（GTN），一酸化窒素（NO），内皮非依存性血管弛緩作用，C）を加えた後のGF，CONV-R，CONV-Dマウスの大動脈の血管弛緩曲線を示している．血管収縮と内皮機能とは対照的に、平滑筋依存性弛緩は再コロニー化によって影響を受けなかった（図1C）。累積曲線は2ウェイANOVAで解析し、最大大動脈誘発力は1ウェイANOVAとボンフェローニポストホック検定で解析した、n=8から15の大動脈輪を各群ごとに。*P<0.05 vs GF; # P<0.05 vs CONV-R。D, GF、CONV-R、CONV-DマウスのCD4+脾臓細胞におけるT-box 21 (Tbx21) mRNA発現をCONV-Rマウス（左グラフ）およびGFマウス（右グラフ）に対する割合で示したものである。Student t test, n=5-8 per group (left) および Mann-Whitney test, n=16 per group (right)。E、血清のELISA法によるインターフェロン（IFN）-γ、インターロイキン（IL）-4、およびIL-10の検出、Dunn´s多重比較によるKruskal-Wallis検定、各群n=4〜6マウス。

図S2. A、大動脈血管細胞接着分子（VCAM）-1およびアンジオテンシン1型受容体（Agtr1）mRNAの発現。Dunn´s多重比較試験によるKruskal-Wallis検定、1群あたりn＝4〜12匹のマウス。B、白血球のローリングは、頸動脈の眼窩内顕微鏡イメージングで評価した。

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謝辞
Kathy PeriusとKlaus-Peter Derrethの素晴らしい技術サポートに感謝する。また、Fredrik Bäckhed, Wallenberg Laboratory, University of Gothenburg, Swedenには、科学的な議論と支援をしていただいた。無菌マウスのコロニーを提供してくれたWallenberg LaboratoryのCarina ArvidssonとAnna Hallénに感謝の意を表したい。

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ノート
(J Am Heart Assoc. 2016;5:e003698 doi: 10.1161/JAHA.116.003698) [Google Scholar].

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  44. このような場合、「臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行ってください。リンパ球アダプタータンパク質LNKの欠損は、高血圧と末端器官の炎症を悪化させる。J Clin Invest. 2015;125:1189-1202. [PMCフリーアーティクル] [PubMed] [Google Scholar].

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