2つの異なる運動トレーニング法がマウスの過酷な運動による筋肉損傷に及ぼす対照的な影響は、腸内細菌叢の変化と関連している可能性がある

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2つの異なる運動トレーニング法がマウスの過酷な運動による筋肉損傷に及ぼす対照的な影響は、腸内細菌叢の変化と関連している可能性がある

The Contrasting Effects of Two Distinct Exercise Training Modalities on Exhaustive Exercise-Induced Muscle Damage in Mice May Be Associated with Alterations in the Gut Microbiota

による

張勇

†、

王 琢

†、

ヘドン・ラン

、

ホンタオ・ユー

、

ミン・チョウ

、

シン・ラオ

、

チャン・チアンヨン

、

ロン・イー

、

ジュンドン・チュー

*,‡そして

マンティアン・ミ

*,‡

重慶栄養健康重点実験室、栄養・食品安全研究センター、軍事予防医学研究所、第三軍事医学大学（陸軍医学大学）、中国重慶市沙坪坡区高炭岩街30号400038

*

連絡の対象となる著者。

†

これらの著者は、この研究に同等に貢献しました。

‡

これらの著者もこの研究に等しく貢献しました。

国際分子科学ジャーナル 2024 , 25 (14), 7837; https://doi.org/10.3390/ijms25147837

提出受付日: 2024年5月25日 / 改訂日: 2024年6月30日 / 受理日: 2024年7月12日 / 公開日: 2024年7月17日

（この記事は分子微生物学 セクションに属します）

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抽象的な

過酷な運動は、炎症と酸化ストレスを特徴とする筋肉損傷を引き起こすことが知られています。ヒトを対象とした研究では、「通常の」運動と「週末戦士」の運動療法は、全原因、心血管疾患 (CVD)、および癌による死亡率のリスク低下など、同等の健康上の利点をもたらすことが示されていますが、過酷な運動後の筋肉損傷に対するそれらの異なる影響は不明のままです。本研究の目的は、総運動量を一致させた長期中等度強度 (LTMI) および短期高強度 (STHI) のトレーニング様式が、マウスの腸内細菌叢、短鎖脂肪酸 (SCFA)、および過酷な運動による筋肉損傷に及ぼす影響を比較し、これらの要因間の相関関係を評価することです。LTMI は定期的な運動療法と見なされていますが、STHI は、運動強度を高め、トレーニング セッションを短期間に凝縮するなど、「週末戦士」パターンといくつかの類似点があります。我々の研究結果は、LTMIトレーニングによって、Akkermansia、Prevotellaceae_NK3B31_group、Odoribacter、Alistipes、LactobacillusなどのSCFA産生細菌の存在量が有意に増加し、それによってSCFAレベルが上昇し、激しい水泳後の筋肉損傷が緩和されることを示しています。対照的に、STHIトレーニングでは、SCFAレベルに変化はなく、 StaphylococcusやBilophilaなどの日和見病原体の存在量が増加し、筋肉損傷の悪化と関連していました。さらに、SCFA産生細菌の存在量とSCFAレベルと、激しい運動後のマウスの筋肉における炎症性サイトカインの発現との間には有意な負の相関関係が観察されました。逆に、StaphylococcusとBilophilaの数は、これらのサイトカインと顕著な正の相関関係を示しました。さらに、LTMI と STHI が過酷な運動によって誘発される筋肉損傷に及ぼす影響は、糞便微生物叢移植によって未訓練のマウスに伝染し、これらのトレーニング方法によって誘発される腸内微生物叢の変化が筋肉損傷に対する対照的な影響に寄与している可能性を示唆しています。これらの結果は、過酷な運動を行う前に適切なトレーニング方法を選択することの重要性を強調しており、運動トレーニングと怪我の予防に意味があります。

キーワード:

激しい運動、筋肉の損傷、腸内細菌叢、短鎖脂肪酸、炎症、酸化ストレス

1. はじめに

運動による健康効果の認識が高まり、自分自身に挑戦することの重要性が認識されるようになったことから、ここ数十年でマラソンやハーフマラソンなどの長距離持久力競技への参加が世界中で大幅に増加している [ 1 ]。しかし、マラソンは長時間にわたる激しい運動であるため、インターロイキン（IL）-6、IL-8、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）などの炎症性サイトカインの血漿レベルの大幅な上昇を引き起こす可能性がある。この身体運動は、血漿クレアチンキナーゼ（CK）および乳酸脱水素酵素（LDH）活性、およびミオグロビン濃度の上昇によって証明される骨格筋の損傷を引き起こす可能性もある。さらに、血漿中のトロポニンおよびN末端プロB型ナトリウム利尿ペプチド（proBNP）レベルの上昇から心筋障害が推測される可能性がある。これらの生理学的反応は、マラソンの大きな身体的ストレスが深刻な全身性炎症反応を引き起こし、心臓と骨格筋を中心に多臓器障害を引き起こす可能性があることを示唆している [ 2、3、4 ]。さらに、運動免疫学レビューに掲載が承認された最近のメタ分析によると、マラソンは上気道感染症のリスクを高める [ 5 ]。プロのランナーが行っているような定期的な運動トレーニングは、マラソンによって引き起こされる炎症や臓器の損傷を軽減する可能性がありますが [ 6、7 ]、多くのアマチュアランナーにはそのようなトレーニングを行う時間がありません。

実質的な健康効果を得るためには、成人は中程度の強度の有酸素運動を週に最低150～300分、または高強度の有酸素運動を75～150分、あるいはその両方を組み合わせることを目指すべきである。理想的には、定期的な運動パターンを維持し、一貫したレベルの身体活動を確保するために、有酸素運動は週を通して均等に分散されるべきである[ 8 ]。週末に1回または2回のセッションで激しい運動を行うことを特徴とする「週末戦士」運動パターンは、その時間効率から人気が高まっている[ 9 ]。最近の証拠は、この凝縮された身体活動パターンは、より少ない時間のコミットメントを必要とするにもかかわらず、全原因、心血管疾患（CVD）、および癌による死亡のリスクの低減など、定期的な運動と同様の健康効果をもたらす可能性があることを示唆している[ 10、11、12 ]。マラソントレーニングの文脈では、アマチュアランナーの中には、推奨される定期的な運動配分とは異なるパターンで、数日連続して高強度のトレーニングセッションを行う人もいます。このアプローチは、運動強度を高めたり、トレーニングセッションを短期間に圧縮したりするなど、「週末戦士」パターンといくつかの類似点がありますが、定期的な運動に匹敵する健康上の利点が当てはまるかどうかは不明です。特に、その後の過酷な運動によって引き起こされる炎症や臓器損傷の軽減という点ではそうです。この文脈で、凝縮された運動トレーニングと分散された運動トレーニングの具体的な影響を理解するには、さらなる研究が必要です。

運動トレーニングは腸内細菌叢と相互作用することが示されている [ 13 ]。腸内細菌叢は、性別、遺伝、年齢などの変更不可能な要因と、食事、身体活動、疾患などの変更可能な要因の両方の影響を受ける [ 14 ]。ヒトと動物の研究における新たな知見は、運動が腸内細菌叢の構成と機能に影響を及ぼす主要な変更可能な要因の1つであり、その影響は運動の強度、期間、頻度によって異なることを示している [ 15、16 ]。同時に、宿主の運動への適応は、代謝、酸化ストレス、炎症反応の調節を通じて腸内細菌叢の影響を受ける可能性がある [ 17、18 ]。しかし、同じ運動量での異なるトレーニングパターンが腸内細菌叢に及ぼす具体的な影響、およびこれらのパターンがその後マラソンのような消耗する運動への体の適応にどのように影響するかについては、まだ完全には解明されていない。

この研究では、2 つの異なるトレーニング方法が、マウスの腸内細菌叢、短鎖脂肪酸 (SCFA)、および過酷な運動による筋肉損傷に与える影響を明らかにすることを目的としました。また、腸内細菌叢の変化が、激しい運動後の筋肉損傷に対する運動療法の効果に影響を与えるかどうかも調査しました。比較対象とした方法は、総運動量が等しい、短期高強度 (STHI) パターンと長期中強度 (LTMI) パターンです。LTMI は一貫した定期的な運動ルーチンを表し、STHI は短期間に集中した激しいトレーニングを重視する「週末の戦士」アプローチを反映しています。

2. 結果

2.1. 2つの異なるトレーニング法がマウスの激しい運動後の筋肉損傷に与える影響

筋肉損傷に対する過度の水泳の影響は、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色したマウスの腓腹筋組織の形態学的変化を調べることによって評価されました。対照群と比較して、EE グループの筋線維は混乱と炎症性細胞浸潤を示しました。LTMI トレーニングを受けたマウスは、筋線維の混乱と炎症性細胞浸潤が減少し、過度の水泳による筋肉損傷に対する保護効果が示唆されました。逆に、STHI トレーニングはこれらの筋肉損傷の指標を悪化させました（図 1 A）。

図 1。2 種類のトレーニング方法が、激しい水泳を行ったマウスの筋肉損傷に及ぼす影響。( A ) 腓腹筋切片の H&E 染色の代表画像 ( n = 6 / グループ)。( B )腓腹筋切片中の全マクロファージと M1 マクロファージをそれぞれ識別するための、 F4/80 (赤) とiNOS (緑) の二重免疫蛍光染色の代表的合成画像。赤い矢印はマクロファージ、黄色い矢印は M1 マクロファージを示します。棒グラフは、異なるグループにおける M1 型マクロファージの定量 (各視野の全マクロファージの %) を示しています。( C ) 腓腹筋における炎症性サイトカインIL-1β、IL-6、およびTNF-αの mRNA レベル。( D ) 腓腹筋における筋萎縮関連遺伝子FoxO3、MAFbx、およびMuRF1 のmRNA レベル( n = 6 / グループ)。 ( E ) 腓腹筋における IL-1β、TNF-α、MAFbx、MuRF1 の代表的なウエスタンブロットと定量化されたタンパク質レベル ( n = 6 / グループ)。 ( F ) 腓腹筋における酸化ストレスバイオマーカー MDA および PC の含有量。データは平均 ± SD として提示されています。2 元配置分散分析多重比較検定を使用しました ( n = 6 / グループ)。 * p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001。CON、座位グループ、EE、徹底的な運動グループ、STHI_EE、短期高強度トレーニング後の徹底的な運動グループ、LTMI_EE、長期中強度トレーニング後の徹底的な運動グループ、H&E、ヘマトキシリンおよびエオシン、iNOS、誘導性一酸化窒素合成酵素、IL-1β、インターロイキン-1 ベータ。 IL-6、インターロイキン-6、TNF-α、腫瘍壊死因子アルファ、FoxO3、フォークヘッドボックスO3、MAFbx、筋萎縮Fボックス、MuRF1、筋肉特異的RINGフィンガータンパク質1、MDA、マロンジアルデヒド、PC、タンパク質カルボニル。

組織病理学的観察と一致して、激しい水泳は、免疫蛍光染色で測定されるように M1 マクロファージの浸潤を有意に増加させ (図 1 B )、腓腹筋内の mRNA レベルで炎症誘発性サイトカインIL-1β、IL-6、およびTNF-αの発現を増強しました。LTMI トレーニングはこれらの炎症反応を緩和しましたが、STHI トレーニングはそれらを増強しました (図 1 C )。IL-1β および TNF-α のタンパク質レベルは mRNA 発現パターンと平行しており、炎症傾向を確認しました (図 1 E )。

炎症と筋萎縮の関連を考慮して、萎縮関連遺伝子FoxO3、Atrogin-1、MuRF1の発現を評価しました。激しい水泳はこれらのマーカーを有意にアップレギュレーションしましたが、その効果は LTMI トレーニング群では弱まり、STHI トレーニング群では悪化しました (図 1 D、E)。

筋肉中のマロンジアルデヒド（MDA）とタンパク質カルボニル（PC）のレベルの上昇によって示される酸化ストレスは、消耗運動によって著しく誘発されました。この酸化ストレス反応は、LTMIトレーニングを受けているマウスでは顕著に減少し、STHIトレーニングを受けているマウスではさらに増加し​​ました（図1F）。

要約すると、2 つのトレーニング方法は、激しい運動後の筋肉損傷に顕著な影響を及ぼし、LTMI トレーニングは保護効果をもたらし、STHI トレーニングは筋肉損傷を悪化させる可能性があることがわかりました。

2.2. 2つの異なるトレーニング法がマウスの激しい運動後の血清CK、LDH、BUNレベルに与える影響

組織損傷を示す形態学的変化の観察に加え、筋肉損傷のバイオマーカーとして一般的に認識されている血清クレアチニンキナーゼ（CK）、乳酸脱水素酵素（LDH）、血中尿中窒素（BUN）のレベルの変化を測定することで、過酷な運動によって引き起こされる筋肉損傷の評価をさらに進めました。調査結果によると、過酷な水泳は血清中のCK、LDH、BUNレベルの大幅な上昇をもたらしました。しかし、この上昇はLTMIトレーニンググループでは著しく緩和されましたが、STHIトレーニンググループではさらに激化しました（図2A～C）。

図 2. 激しい水泳後のマウスの血清 CK、LDH、BUN レベル。( A ) CK 血清レベル、( B ) LDH 血清レベル、( C ) BUN 血清レベル。各データ ポイントは、測定値の平均 ± 標準偏差 (SD) を表します。グループ間の比較は、スチューデントのt検定を使用して実施し、統計的有意性はアスタリスクで示しました: * p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001 ( n = 6/グループ)。CON、座位グループ、EE、激しい運動グループ、STHI_EE、短期高強度トレーニング後の激しい運動グループ、LTMI_EE、長期中強度トレーニング後の激しい運動グループ、CK、クレアチニン キナーゼ、LDH、乳酸脱水素酵素、BUN、血中尿中窒素。

2.3. 2つの異なるトレーニング法がマウスの激しい運動前の糞便細菌叢とそのSCFA代謝物に与える影響

さまざまなトレーニング計画が腸内細菌叢に与える影響を調べるため、最後のトレーニングセッションの 24 時間後に糞便サンプルを採取しました。16S rRNA 可変遺伝子の V3 および V4 領域をターゲットに、Illumina MiSeq プラットフォームを使用して増幅および配列決定を行いました。Chao 指数および Shannon 指数で評価した微生物群集の α 多様性は、3 つのグループ間で豊かさと多様性に有意な変動を示しました (Kruskal–Wallis 検定、p < 0.05) (図 3 A)。Bray–Curtis 距離に基づく主座標分析 (PCoA) では、第 1 座標軸 (PC1) に沿ったグループ間の分離が明確に示され、観測された変動の 38.12% を説明しました (図 3 B)。各グループの種レベルでの細菌群集構造を図 3 C に示します。属レベルでのより詳細な分析により、LTMI グループでは、 EE グループおよび STHI グループと比較して、 Lactobacillus、Alistipes、Prevotellaceae_NK3B31_group、およびAkkermansiaの相対存在量が有意に増加していることが明らかになりました。一方、STHI グループでは、EE グループおよび LTMI グループと比較して、 StaphylococcusおよびBilophilaの相対存在量が著しく増加しています(図 3 D)。線形判別分析 (LDA) および効果サイズ (LEfSe) 分析により、3 つのグループ間で 70 の差異的に豊富な分類群が特定され、LDA スコアしきい値は 3.5 を超えています。LTMI グループでは、さまざまな微生物分類群、特にVerrucomicrobiota門およびCampilobacterota門の分類群が有意に存在していました。さらに、 Lactobacilliaceae、Rikenellaceae、Akkermansiaceae、Marinifilaceaeなど、いくつかの科が目立っていました。属レベルで注目すべきは、 Prevotellaceae_NK3B31_group、Akkermansia、Odoribacter、Alistipes、Lactobacillusで、いずれも比較的豊富に見つかりました。対照的に、 STHI グループは異なる微生物構成を示し、Firmicutes門とProteobacteria門のメンバーが著しく増加しました。 Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Staphylococccaceae、Bacteroidaceaeなどの科がこのグループ内で特に目立っていました。属レベルでは、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Staphylococcus、Bacteroides、RoseburiaおよびBilophilaが比較的豊富であることが確認されました (図 3 E)。これらの調査結果を総合すると、異なるトレーニング方法によって腸内細菌叢の構成が大きく変わる可能性があることが強調されます。

図 3。 激しい運動を行う前のマウスにおける 2 種類のトレーニング様式による腸内細菌叢の構成と糞便中の短鎖脂肪酸への影響。( A ) Chao および Shannon 指数を使用した腸内細菌叢の多様性 ( n = 5/群)。( B ) Hellinger に基づく主座標分析 (PCoA) により明確な分離が観察された( n = 5/群)。( C ) 異なるグループ間の種レベルの細菌群集構造 ( n = 5/群)。( D ) 属レベルでの Kruskal–Wallis H 検定棒グラフ ( n = 5/群)。( E ) 線形判別分析 (LDA) スコアの棒グラフ。バイオマーカー分類群 (LDA スコア > 3.5、 Wilcoxon 符号順位検定によりp < 0.05の有意性) を表示( n = 5/群)。( F ) 短鎖脂肪酸の存在量の変動。 * p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001。（スチューデントのt検定、n、有意差なし）。EE、徹底的な運動グループ、STHI_EE、短期高強度トレーニング後の徹底的な運動グループ、LTMI_EE、長期中強度トレーニング後の徹底的な運動グループ。

2 つの異なる運動トレーニング レジメンが腸内細菌叢に与える影響をさらに評価するために、酢酸、プロピオン酸、酪酸など、腸内細菌叢によって生成される主要な短鎖脂肪酸 (SCFA) のレベルを糞便サンプルで測定しました。結果は、LTMI トレーニングによって糞便中の酢酸、プロピオン酸、酪酸のレベルが大幅に増加したことを示しました。しかし、STHI トレーニングではこれらの SCFA のレベルに有意な影響はありませんでした (図 3 F)。

これらの結果を総合すると、2 つの異なるトレーニング方法が腸内細菌叢と SCFA の生成に異なる影響を及ぼすことが示唆されます。

2.4. 筋肉損傷と腸内細菌叢の属レベルおよび短鎖脂肪酸との相関関係の分析

腸内細菌叢の変化が、激しい運動後の筋肉損傷に対するさまざまな運動トレーニング法の異なる効果にどのように寄与しているかを調べるために、炎症性サイトカインの発現レベルに反映される筋肉損傷のマーカーと、属レベルでの特定の腸内微生物群集の存在、および糞便中の短鎖脂肪酸のレベルとの関係を決定する分析を実施しました。 調査結果により、特定の炎症性サイトカインの発現レベルと特定の腸内微生物属の存在量との間に有意な相関関係があることが明らかになりました。 特に、IL-6およびTNFα mRNAの発現レベルは、 Akkermansia、Prevotellaceae_NK3B31_group、Odoribacter、Alistipes、およびLactobacillusの存在量と強い負の相関関係を示しました。さらに、 IL-1β mRNAの発現は、Akkermansia、Prevotellaceae_NK3B31_group、およびOdoribacterの存在量と顕著に負の相関関係にあった(図 4 A )。逆に、 IL-1β、IL-6、およびTNFα mRNAの発現レベルは、StaphylococcusおよびBilophilaの存在量と有意な正の相関関係にあることがわかった(図 4 B )。さらに分析したところ、 IL-1β、IL-6、およびTNFαの mRNA 発現レベルは、図 5 A～Cに示すように、糞便中の酢酸、プロピオン酸、および酪酸の含有量と有意に逆相関していることがわかった。

図 4。 炎症性サイトカインの発現レベルによって示される筋肉損傷と属レベルでの腸内微生物群集との相関分析。( A ) プロットは、 IL-1β、IL-6、およびTNFα mRNAレベルとAkkermansia、Prevotellaceae_NK3B31_group、Odoribacter、Alistipes、およびLactobacillusの存在量との関係を示しており、95% 信頼区間（網掛け領域）の平滑化スプラインとして表されています。( B ) プロットは、 IL-1β、IL-6、およびTNFα mRNAレベルとStaphylococcusおよびBilophilaの存在量との関係を示しており、95% 信頼区間（網掛け領域）の平滑化スプラインとして表されています。(( A、B )、ピアソンの相関)。IL-1β、インターロイキン-1 ベータ。IL-6、インターロイキン-6、TNF-α、腫瘍壊死因子アルファ。

図 5. 炎症誘発性サイトカインの発現レベルと糞便中の短鎖脂肪酸レベルによって示される筋肉損傷の相関分析。 ( A – C ) プロットは、 IL-1β、IL-6、およびTNFα mRNAレベルと糞便中の酢酸、プロピオン酸、および酪酸含有量との関係を示し、95% 信頼区間 (網掛け領域) を持つ平滑化スプラインとして表されます。 ( ( A – C )、ピアソンの相関)。IL-1β、インターロイキン-1 ベータ; IL-6、インターロイキン-6; TNF-α、腫瘍壊死因子アルファ。

2.5. 異なる運動トレーニング法を受けたマウスからの糞便微生物移植がレシピエントマウスの消耗運動誘発性筋肉損傷に及ぼす影響

さまざまな運動トレーニング法が消耗運動による筋肉損傷に及ぼす異なる影響における腸内細菌叢の役割を解明するため、糞便細菌叢移植 (FMT) 実験を実施しました。この実験では、研究 1 で説明したさまざまな運動トレーニング法を受けたマウスの糞便サンプルを使用しました。4 週間の FMT 期間後、受容マウスは、順応するための 5 日間の適応水泳トレーニング段階に先立って、消耗水泳プロトコルを完了しました。研究 1 で概説したように、消耗水泳後の筋肉損傷指標が評価されました。

LTMI_FMT グループは、LTMI トレーニングを受けたマウスで観察されたものと同様に、消耗する水泳によって引き起こされる筋肉損傷に対する保護効果を示しました。対照的に、STHI-FMT グループは、STHI トレーニングを受けたマウスの結果と一致して、筋肉損傷の悪化を示しました (図 6 A ～ F)。これらの結果は、運動トレーニングによる腸内細菌叢の変化が、消耗する運動後の筋肉損傷に対するこれらのモダリティの異なる影響において重要な役割を果たしている可能性があることを示しています。

図 6。 さまざまな運動トレーニング法を受けたマウスからの糞便微生物移植が、消耗運動によって誘発される筋肉損傷に及ぼす影響。( A ) 腓腹筋切片の H&E 染色の代表画像 ( n = 6/群)。( B ) 腓腹筋切片中の総マクロファージと M1 マクロファージをそれぞれ識別するためのF4/80 (赤) とiNOS (緑)の二重免疫蛍光染色の代表的合成画像。赤矢印はマクロファージ、黄矢印は M1 マクロファージを示す。棒グラフは、さまざまな群における M1 型マクロファージの定量 (各視野の総マクロファージの %) を示す。( C ) 腓腹筋における炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、およびIL-6の mRNA レベル。 ( D ) 腓腹筋における筋萎縮関連遺伝子FoxO3、MAFbx、MuRF1の mRNA レベル( n = 6 / グループ)。( E ) 腓腹筋におけるIL-1β、TNF-α、MuRF1、MAFbxの代表的なウエスタンブロットと定量化されたタンパク質レベル( n = 6 / グループ)。( F ) 腓腹筋における酸化ストレスバイオマーカー MDA および PC の含有量。データは平均 ± SD として提示されています。二元配置分散分析多重比較検定を使用しました ( n = 6 / グループ)。* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001、**** p < 0.0001。CON_FMT、研究 1 の運動不足マウスの糞便微生物叢の移植。STHI_FMT、研究 1 の STHI トレーニングマウスの糞便微生物叢の移植。 LTMI_FMT、研究 1 の LTMI トレーニング マウスの糞便微生物叢の移植。H&E、ヘマトキシリンおよびエオシン。iNOS、誘導性一酸化窒素合成酵素。IL-1β、インターロイキン-1 ベータ。IL-6、インターロイキン-6。TNF-α、腫瘍壊死因子アルファ。FoxO3、フォークヘッド ボックス O3。MAFbx、筋萎縮 F ボックス。MuRF1、筋肉特異的 RING フィンガー タンパク質 1。MDA、マロンジアルデヒド。PC、タンパク質カルボニル。

3. 議論

近年、ハーフマラソンやフルマラソンなどの長距離走が世界中で急速に人気を集めています。しかし、長距離走のような長時間の激しい運動は、消耗運動であるため、特にアマチュアランナーの間で、骨格筋、心臓、肝臓など複数の臓器で酸化ストレスや炎症反応の増加につながる可能性があることを示す証拠がますます増えています。長距離走に参加する前に、アマチュアランナーの中には、運動のプレコンディショニングの一形態として LTMI トレーニングを行う人もいれば、時間の制約があるため、プレコンディショニング戦略として STHI トレーニングを採用する人もいます。しかし、長時間の激しい運動によって引き起こされる筋肉損傷を防ぐ上で、これら 2 つの異なる運動トレーニング様式の有効性は不明です。本研究では、消耗する水泳のマウスモデルを使用して、これら 2 つの異なる運動トレーニング様式が、その後の消耗する運動によって引き起こされる骨格筋損傷に及ぼす影響と、この文脈での腸内細菌叢の役割を調査しました。結果から、LTMI トレーニングは過酷な運動によって引き起こされる骨格筋の損傷を軽減できるのに対し、STHI トレーニングはそのような損傷を悪化させる可能性があり、この相反する効果はいずれも腸内細菌叢のそれぞれの変化に関連していることが明らかになりました。

運動誘発性筋障害（EIMD）は、筋肉の炎症、酸化ストレス、ミオグロビン、CK、LDH、BUNなどの血清バイオマーカーの上昇を特徴とする。マラソンやトレッドミルでの消耗の激しいランニングや水泳などの長時間の激しい運動は、ヒトと動物の両方のモデルで筋肉の損傷を引き起こす可能性がある[ 19、20、21、22 ] 。運動によるプレコンディショニングは、さまざまな有益な生理学的適応を誘導することでEIMDを軽減すると考えられている。WHOの2020年のガイドラインでは、1週間あたり150 ～300分の中強度の有酸素運動、または75～150分の高強度の有酸素運動が推奨されており、これら2つの強度の同等の組み合わせも許容されるとされている。できれば、定期的な運動パターンを維持するために、有酸素運動は週を通して行うべきである[ 8 ]。最近の研究では、同じ量の身体活動を週に1回か2回に凝縮した「週末戦士」アプローチと、同じ活動を週を通して複数回に分けて行う「定期的な運動」パターンとの間には、健康上の利点に大きな違いがない可能性があることが示唆されています[ 23、24、25 ] 。ただし、マラソンなどの激しい持久力イベント後の筋肉損傷への影響という観点から、これら2つの運動パターンを直接比較した研究は限られています。私たちの研究では、過酷な水泳により、骨格筋の筋線維の混乱、炎症性細胞浸潤、M1マクロファージ浸潤の増加、炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、TNF-α ）の上方制御、および萎縮関連遺伝子（ FoxO3、MAFbx、MuRF1 ）の発現増加が引き起こされることがわかりました。これらの変化に加えて、血清中のCK、LDH、BUN値の上昇も観察されました。これらは通常、EIMDのバイオマーカーとみなされています。これらの知見は、以前の研究[22、26、27]と一致しています。さらに、STHIとLTMIトレーニングが、過酷な運動による筋肉損傷に与える影響を比較しました。STHIはLTMIとは対照的に筋肉損傷を増加させることがわかりました。これは、週末に運動するアプローチでは、激しい運動後の筋肉損傷を防げず、むしろ悪化させる可能性があることを示唆しています。

動物と人間の両方の研究で、運動は腸内細菌叢の構成と機能に変化を引き起こすことが示されており、具体的な効果はさまざまな運動トレーニング様式によって異なる [ 28 , 29 , 30 ]。運動が腸内細菌叢に与える影響は明らかになりつつあるが、特に激しい運動後の筋肉損傷との関連で、腸内細菌叢の形成におけるさまざまな運動トレーニングパターンの正確な役割はまだ完全には解明されていない。本研究では、チャオ指数とシャノン指数によって証明された腸内細菌叢の豊かさと多様性が、対照群と2つのトレーニンググループ間で有意に異なることを示しました。STHIグループのチャオ指数とシャノン指数によって示されたα多様性の増加は予想外であり、多くの文献と矛盾していました [ 31 ]。以前の研究では、短期間の激しい軍事訓練が若い兵士のシャノン指数の上昇につながったことが示されている。この増加は、 Staphylococcus、Peptoniphilus、Acidaminococcus、Fusobacteriumなどの潜在的に有害で感染性のある分類群を含む、あまり優勢でない分類群の存在量の増加に起因していました。同時に、 Bacteroidesなどのより優勢な分類群は減少しました。その結果、より少なく潜在的に有害な分類群と有益な分類群の比率の増加は、軍事訓練中のシャノン指数のより大きな増加が腸管透過性のより大きな増加と相関しているという予期せぬ観察を説明できるかもしれません [ 32 ]。同様に、私たちの研究では、STHI訓練により、 StaphylococcusやBilophilaなどの炎症を促進すると考えられるあまり優勢でない分類群の存在量が増加し、norank_f: Muribaculaceaeなどのより優勢な分類群の存在量が減少することがわかりました。さらに、StaphylococcusとBilophilaは、激しい運動後の炎症レベルと正の相関関係にあった。したがって、我々の調査結果は、前述の研究の文脈で解釈できるかもしれない。これはもっともらしい説明を提供するが、我々はまた、他の要因がα多様性の観察された変化に寄与している可能性を認める。ブレイ・カーティス距離に基づくPCoAは、腸内細菌叢の構成が3つのグループ間で有意に異なることを明らかにした。さらに、LEfSe分析はこれらの違いを確認し、門、科、属レベルでの異なる分類構成を浮き彫りにした。SCFAは細菌代謝物の主要なクラスであることを考慮して、酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む糞便中のSCFAのレベルをさらに調べた。結果は、LTMIトレーニングが酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む糞便中のSCFAのレベルを有意に増加させたのに対し、STHIトレーニングではこれらのレベルに統計的に有意な変化をもたらさなかったことを示した。腸内細菌叢とSCFAなどの代謝物は、運動によって引き起こされるさまざまな生理学的適応に重要な役割を果たしていることを示唆する研究証拠が増えています[ 33、34 ]。以前の研究では、有酸素運動によって引き起こされる腸内細菌叢の変化は、運動能力と筋肉のミトコンドリアのエネルギー代謝の向上に関連していることがわかりました[ 35 ] 。別の研究では、エリートマラソンランナーの腸内にVeillonellaが豊富に存在し、この細菌による乳酸の代謝から生成されるプロピオン酸が運動持久力を高めることがわかりました[ 36 ]。したがって、腸内細菌叢とそのSCFA代謝物は2つの異なるトレーニング様式によって独自の影響を受け、これらの変化が激しい運動によって引き起こされる筋肉の損傷に対する対照的な効果に寄与している可能性があります。

腸内細菌叢とその SCFA 代謝物は、特定の条件下では炎症と密接に相関していることを示す証拠が増え続けている [ 37 , 38 ]。本研究では、炎症性サイトカインの発現レベルによって示される筋肉の損傷と、属レベルでの特定の腸内微生物群集の存在、および SCFA のレベルとの関係を調べるために相関分析を行った。結果、Akkermansia、Prevotellaceae_NK3B31_group、Odoribacter、Alistipes、およびLactobacillusの存在量、および酢酸、プロピオン酸、および酪酸を含む SCFA のレベルが、炎症性サイトカインの発現レベルと有意に負の相関関係にあることが示された。対照的に、 StaphylococcusおよびBilophilaの存在量は、炎症性サイトカインの発現レベルと顕著に正の相関関係にあった。SCFAを産生する主要な腸内細菌であるAkkermansia、Prevotellaceae_NK3B31_group、Odoribacter、Alistipes、およびLactobacillus [ 39、40、41 ]は、多くのこれまでの研究で抗炎症作用があることが実証されていることは注目に値します[ 42、43、44、45、46、47、48 ] 。さらに、蓄積された証拠は、腸内微生物叢由来のSCFAが様々な健康上の利点を発揮する重要なメディエーターであることを示唆しています[ 49、50 ] 。腸内日和見病原体として分類されるStaphylococcusとBilophilaは、炎症を促進することが示されている[ 51、52、53、54、55 ]。総合的に、私たちの研究結果は、LTMI トレーニングによる過酷な運動による筋肉損傷の保護効果は、SCFA レベルの増加によるものであり、これは特定の SCFA 産生腸内細菌叢の増加によるものである可能性があることを示唆しています。逆に、STHI トレーニングによる過酷な運動による筋肉損傷の悪化効果は、腸内の日和見病原体の増加によるものである可能性があります。

糞便微生物移植（FMT）は、腸内細菌叢の生理的および病理学的役割を理解するための科学的研究における貴重なモデルとして役立ちます [ 56 , 57 ]。本研究では、2つの異なるトレーニング様式によって引き起こされる腸内細菌叢の変化が、FMTの方法を介して、消耗運動による筋肉損傷に影響を及ぼす役割をさらに明らかにしました。異なる運動パターンでトレーニングしたマウスの糞便サンプルを使用してFMT実験を行い、レシピエントマウスの消耗水泳による筋肉損傷への影響を評価しました。注目すべきことに、異なる様式でトレーニングしたマウスの微生物叢を移植されたマウスは、座位コントロールの微生物叢を移植されたマウスと比較して、消耗水泳後の筋肉損傷が軽減または悪化しました。これらの結果は研究1の調査結果と一致しており、FMTは消耗水泳後の筋肉損傷に対するさまざまな運動トレーニングパターンの影響を再現できることを示唆しています。 [ 58 ] は、中程度の強度の有酸素運動が、APP/PS1トランスジェニックアルツハイマー病（AD）マウスの腸内アロバキュラムなどの病原細菌の減少とアッカーマンシアなどのプロバイオティクス細菌の増加につながることを実証しました。この調節により、リポ多糖（LPS）の置換が減少し、最終的にAD関連の神経炎症が緩和されます。ランニングホイールを使用した運動前処理により、マウスのラクトバチルス属とアリスティペス属が大幅に増加しました。これは、炎症を緩和することで虚血性脳卒中後の認知機能障害の改善に寄与する腸内細菌叢の調節効果です [ 59 ]。Lai et al. [ 60 ] は、トレッドミルランニング（1日30分、週5日）によりオドリバクター属の量が有意に増加し、食事誘発性肥満マウスの炎症の減少に寄与する可能性があると報告しました。注目すべきは、前述の微生物叢が短鎖脂肪酸の産生者として知られており、短鎖脂肪酸はTNF-α、IL-6、IL-10などのサイトカイン、エイコサノイド、ケモカインの産生を含むいくつかの白血球機能を調節し、白血球が炎症の焦点に遊走して微生物病原体を破壊する能力に影響を与えることである[ 61 ]。研究1では、LTMIトレーニングにより、アッカーマンシア、オドリバクター、アリスティペス、ラクトバチルスが豊富に存在することがわかりました。、ならびに酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む短鎖脂肪酸の糞便レベルも上昇し、これらの変化は、消耗する運動後のマウスにおける特定の炎症性サイトカインの発現レベルと負の相関関係にあった。Karlら[ 32 ]は、4日間の高強度クロススキー行進などの短期間の激しい運動が、兵士の健康に有益な微生物の相対的存在量の減少と、潜在的に炎症を引き起こす細菌の増加につながることを実証した。具体的には、ペプトストレプトコッカス、ブドウ球菌、ペプトニフィルス、アシダアミノコッカス、およびフソバクテリウムの存在量が増加することが判明した。研究1では、STHIトレーニングにより、マウスのLachnospiraceae_NK4A136_group、ブドウ球菌、バクテロイデス、ロゼブリア、およびビロフィラの存在量が増加することが観察された。具体的には、ブドウ球菌とビロフィラの変化は、激しい運動後の特定の炎症性サイトカインの発現レベルと正の相関関係にあった。Youら[ 62 ]は、外傷性脳損傷（TBI）誘発性の腸内細菌叢の異常が胆汁酸プロファイルを変化させることで腸の炎症に寄与する可能性があり、ブドウ球菌やラクノスピラ科などの特定の細菌分類群が関与していると報告した。さらに、高脂肪食を与えられたマウスでは、炎症の増加は、オシロスピラ、デスルフォビブリオ、コプロバチルス、エンテロコッカス、インテスティニモナス、ブラウティア、ビロフィラなどの細菌属の増加と関連していた。対照的に、ピスタチオとポリフェノールが豊富なウーロン茶の摂取はこれらの細菌の量を減らし、それによって炎症を改善した[ 63 , 64 ]。 FMT 実験の結果と合わせて、腸内細菌叢の変化が、LTMI および STHI トレーニングが過酷な運動によって引き起こされる骨格筋の損傷に及ぼす相反する影響に寄与していると推測できます。

我々の研究結果は、LTMI および STHI トレーニング レジメンが、腸内細菌叢の変化によって媒介される可能性のある、消耗運動後の筋肉損傷に対して逆の効果をもたらす可能性があることを示唆していますが、この結論には限界があることも認識しています。本研究の関連分析は比較的少ない動物サンプル サイズで実施されたため、結果の再現性や一般化が制限される可能性があります。さらに、FMT 実験は、腸内細菌叢のメディエーター効果の調査に貴重な洞察を提供しますが、FMT 後の受容マウスの糞便 16S rRNA 配列と組み合わせると、より強力な証拠が得られます。さらに、「週末の戦士」運動パターンが消耗運動後の筋肉損傷を悪化させると推論することはできません。本研究の STHI トレーニング レジメンは、「週末の戦士」パターンと同様に、運動強度を高め、短期間でトレーニング時間を凝縮しましたが、「週末の戦士」運動パターンと完全には一致しませんでした。

要約すると、LTMIトレーニングとSTHIトレーニングという2つの異なる運動トレーニング様式は、どちらも総運動量が同等であるにもかかわらず、腸内細菌叢とそのSCFA代謝物に異なる変化をもたらし、マウスの消耗運動後の筋肉損傷をそれぞれ軽減または悪化させた。2つのトレーニングパターンによって引き起こされた腸内細菌叢の変化は、消耗運動誘発性筋肉損傷に対する相反する効果に少なくとも部分的に寄与した可能性がある。私たちの研究結果は、消耗運動に参加する前に適切なトレーニングモードをとることの重要性を強調している。STHIトレーニングレジメンは、運動強度を高めたり、トレーニングセッションを短期間に凝縮したりするなど、実際によく見られる「週末戦士」パターンといくつかの類似点を共有している。しかし、このアプローチは、マラソンなどの長時間の激しい運動にアスリートを準備するための最適な戦略ではないかもしれない。

4. 材料と方法

4.1. 動物

7 週齢の雄 C57BL/6J マウス (7 週、19～21 g) を陸軍医科大学実験動物センター (中国、重慶) から購入しました。すべてのマウスは、制御された環境 (室温 22～25 °C、相対湿度 50～55%、12 時間の明暗サイクル) で飼育され、実験開始前の 1 週間、環境に順応させるために固形飼料と蒸留水を自由に与えられました。

4.2. 倫理声明

動物実験プロトコルは陸軍医科大学の倫理委員会によって承認されました。動物の飼育は、中国の実験動物管理規則および実験動物の飼育および使用に関するガイドライン（米国ワシントン DC の実験動物研究所）に従って実施されました。

4.3. 実験デザイン

研究 1: 32 匹のマウスを 8 匹ずつ 4 つのグループにランダムに分けました。グループは、座位グループ (コントロール、CON)、消耗運動グループ (EE)、短期高強度トレーニング後の消耗運動グループ (STHI-EE)、長期中強度トレーニング後の消耗運動グループ (LTMI-EE) です。コントロール グループのマウスはケージ内で安静にしていました。他のグループのマウスは、対応する介入の前に 5 日間、1 日 10 分の適応水泳を行いました。STHI-EE グループのマウスは、1 週間、1 日 1 回午前中に 2 時間の連続水泳を課され、LTMI-EE グループのマウスは、4 週間、1 日 1 回午前中に 30 分の水泳を課され、両グループで合計 14 時間の水泳トレーニングが行われました。水泳は、水を満たした円形のタンク (直径 100 cm、深さ 50 cm) で行われ、水温はサーモスタットで制御され、約 35 °C に保たれました。動物が活発に泳ぐのをやめてしまった場合に対処するため、マウスの近くの水面を柔らかいブラシで優しく刺激し、泳ぎを再開するよう促した。この非侵襲的な技術は最小限であり、研究における動物の倫理的扱いに沿ったものである[ 65 ]。消耗する水泳を行う前に、マウスは1日休養した。マウスが5秒間水中に留まり、トーマスとマーシャルの基準に従って立ち直り反射が鈍くなったときに疲労と判定した[ 65 ]。実験スケジュールの概略を図7に示す。

図 7. 実験スケジュールの概略図。AS、アダプティブスイミング、CON、コントロール、EE、消耗運動、STHI、短期高強度トレーニング、LTMI、長期中強度トレーニング、CON_FMT、研究 1 の運動不足マウスの糞便微生物叢の移植、STHI_FMT、研究 1 の短期高強度トレーニングマウスの糞便微生物叢の移植、LTMI_FMT、研究 1 の長期中強度トレーニングマウスの糞便微生物叢の移植。

すべてのグループの糞便サンプルは 34 日目に採取されました。35 日目に、コントロール グループのマウスは午前中に殺処分され、他のグループのマウスは激しい水泳の直後に殺処分されました。血液サンプルは眼窩静脈叢から迅速に採取され、1500× gで 15 分間遠心分離されて血清が採取されました。腓腹筋組織が採取され、組織の一部は組織病理学的検査のために 4% パラホルムアルデヒドで固定され、残りの組織は直ちに液体窒素で保存され、その後 -80 °C の冷蔵庫に移されました。

研究2（糞便微生物叢移植）：FMTは、動物実験で広く利用されている方法である糞便微生物叢懸濁液の経口投与によって実施されました[ 66、67 ]。1週間の環境順応後、7週齢のC57BL/6J雄レシピエントマウスを、6匹ずつ3つのグループにランダムに分けました：研究1の運動不足マウスの糞便微生物叢移植（CON_FMT）、研究1のSTHIトレーニングマウスの糞便微生物叢移植（STHI_FMT）、研究1のLTMIトレーニングマウスの糞便微生物叢移植（LTMI_FMT）。レシピエントマウスの腸内細菌叢は、アンピシリン（1 g/L、A830931、Macklin Biochemical Technology、中国上海）、バンコマイシン（0.5 g/L、V105495、Aladdin Biochemical Technology、中国上海）、メトロニダゾール（1 g/L、M109874、Aladdin Biochemical Technology、中国上海）、およびネオマイシン（1 g/L、N109017、Aladdin Biochemical Technology、中国上海）の抗生物質配合剤を飲料水に2週間投与することで枯渇させた。その後、レシピエントマウスは、対応するFMT接種剤を合計200 μL、1日1回、4週間経口投与された。移植後、すべてのマウスは5日間、1日10分間の水泳に慣れさせられた。その後、3つのグループのすべてのマウスは1日休養し、その後、徹底的な水泳に供された。実験後、マウスは麻酔により殺処分され、血液と腓腹筋組織が採取され、さらなる分析が行われた。実験スケジュールの概略図も図 7に示す。

4.4. 組織病理学的分析

腓腹筋の筋肉組織は、まず 4% パラホルムアルデヒド溶液 (Beyotime Biotechnology、中国、上海) に保存されました。その後、組織は一連のエタノール洗浄によって脱水され、その後パラフィンに包埋されました。続いて、包埋された組織は 5 μm の厚さの切片に切断されました。染色の前に、切片はパラフィンを除去し、エタノールからキシレンまでの段階的な処理によって組織を再水和する処理が行われました。次に、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色が行われ、組織構造が可視化されました。染色された切片は、Leica DM750 光学顕微鏡 (Leica Microsystems、ドイツ、ウェッツラー) を使用して検査されました。記録用に、画像は 20 倍対物レンズで撮影され、Leica MC170 HD デジタル画像システムを使用して記録されました。

4.5. 免疫蛍光染色

スライドは、F4/80 (1:100、AB204467、Abcam、ケンブリッジ、英国) および iNOS (1:20、AB3523、Abcam、ケンブリッジ、英国) に対する一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートされました。次に、スライドは二次抗体とともに 4 °C で 1 時間インキュベートされました。免疫蛍光染色切片の画像は、Leica MC170 HD デジタルカメラを使用して 20 倍の対物レンズで取得されました。

4.6. 血清生化学的パラメータ

血清中のLDH、CK、BUNは自動生化学分析装置（2110、日立、日本）で測定した。

4.7. リアルタイム定量PCR

総RNAは、RNAiso Plus試薬（タカラバイオ、草津、日本）を使用して、製造元の指示に従って腓腹筋ホモゲネートから抽出されました。RNAの濃度と純度は、NanoDropTM 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で評価しました。総RNAは、製造元の指示に従って、PrimeScript RT Master Mixキット（タカラバイオ、滋賀、日本）を使用してcDNAに逆転写されました。qRT-PCRは、SYBR Premix Ex Taq II（タカラバイオ、日本）を使用して、qTower 2.2リアルタイムPCRシステム（アナキティックイエナ、テューリンゲン、ドイツ）で実行されました。標的遺伝子のプライマーは、Sangon Biotech（上海、中国）によって合成されました。遺伝子発現解析に使用したプライマー配列は、表1に示されています。 PCR プロトコルは、95 °C で 30 秒間の変性、続いて 95 °C で 5 秒間、60 °C で 30 秒間の 40 サイクルで構成されました。増幅の最後に融解曲線プロトコルが実行されました。遺伝子発現の相対的な倍数変化は、GAPDH を内部コントロール遺伝子として使用して 2 −ΔΔCt法で分析されました。

表 1. RT-qPCR 解析で使用したプライマーの配列。

4.8. ウエスタンブロッティング

筋肉サンプルをRIPA溶解緩衝液でホモジェナイズし、10,000× g（10分、4℃）で遠心分離して総タンパク質を得た。次に、BCAタンパク質アッセイキット（Aidlab Biotechnologies Co., Ltd.、北京、中国）を使用して、抽出物中の上清タンパク質濃度を定量した。次に、等量のタンパク質（レーンあたり50μg）を10％SDSポリアクリルアミドゲルで分離し、続いてポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（Millipore、米国マサチューセッツ州マールボロ）に電気転写した。次に、膜をブロッキングバッファー（1× TBS、0.1% Tween 20、5% スキムミルク）で室温で 3 時間インキュベートし、次に一次抗体（PBST で 1:1000 希釈）で 4 °C で一晩インキュベートしました：抗 IL-1β（1:1000、26048-1-AP、Proteintech、Rosemont、IL、USA）、抗 TNF-α（1:1000、17590-1-AP、Proteintech、USA）、抗 MuRF1（1:1000、55456-1-AP、Proteintech、USA）、抗 MAFbx（1:1000、67172-1-Ig、Proteintech、USA）、抗 GAPDH（1:10,000、60004-1-Ig、Proteintech、USA）。翌日、膜は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) と結合した二次抗体に室温で 1 時間さらされました (PBST で 1:1000 に希釈)。ブロットは、強化化学発光検出システム (ChemiDoc MP、BIO-RAD、米国カリフォルニア州ヘラクレス) を使用して検出されました。

4.9. 酸化ストレスバイオマーカーの測定

合計 1 mL の抽出溶媒を 100 mg の腓腹筋サンプルに加え、均質化しました。次に、均質化物を 14,000× gで 10 分間遠心分離し、上清を収集して測定しました。上清は、市販のキット (それぞれ BC0025、BC1275、Solarbio Science & Technology、北京、中国) を使用して、マロンジアルデヒド (MDA) およびタンパク質カルボニル (PC) 含有量を分光光度計で分析しました。すべての手順は、製造元の指示に従って実行されました。

4.10. 糞便マイクロバイオーム分析

糞便サンプルからのゲノム微生物DNAは、DNAスツールキット（PF Mag-BindスツールDNAキット、米国ジョージア州ノークロス）を使用して抽出されました。16SリボソームRNAのV3-V4高可変領域は、ABI GeneAmp ® 9700 PCRサーモサイクラー（Thermo Fisher Scientific、米国カリフォルニア州）によってPCR増幅領域として選択されました。細菌のフォワードプライマーは338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）、リバースプライマーは806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）でした。遺伝子はIllumina MiSeqプラットフォーム（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）で配列決定されました。元の配列はfastpソフトウェア[ 68 ]を使用して定性的に管理され、FLASHソフトウェア[ 69 ]を使用してスプライシングされました。 97%の類似性カットオフを持つ操作的分類単位（OTU）は、 UPARSE（v.11）[ 70、71 ]を使用してクラスタリングされ、キメラ配列が識別され、除去されました。ASV情報に基づいて、観測されたASV、Chao1の豊富さ、シャノン指数、グッドの被覆率を含む希薄化曲線とアルファ多様性指数が、Mothur v1.30.2 [ 72 ]を使用して計算されました。Bray-Curtisの類似度に基づく主座標分析（PCoA）は、Vegan v2.4.3パッケージを使用して完了しました。生のリードは、NCBl Sequence Read Archive（SRA）データベース（アクセッション番号：SRP509306）に保存されました。

我々はRとSTAMP（v.2.0.0）を使用して、異なるグループの腸内細菌叢プロファイルの特徴的な分類群を特定した[ 73 ]。我々は線形判別分析効果サイズ（LEfSe）法を使用して微生物叢ベースのバイオマーカーを特定した。この方法は、線形判別分析（LDA）スコアが2.0超（偽発見率（FDR）<0.5）であることが、対応する集団の独自性に寄与することを示す。

4.11. 糞便中のSCFAの測定

凍結した糞便サンプルを氷上で解凍した。各サンプル合計 50 mg とメタノール 1 mL を 2 mL ポリプロピレン遠心管に加え、5 分間ボルテックスで混合して SCFA を抽出した。次に、混合物を 14,000× gで 10 分間遠心分離し、上清を収集して測定した。SCFA の定量は、PBS で再構成した上清を用いて高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) で実施した。簡単に説明すると、上清溶液 1 mL を 1/10 量の H 2 SO 4 (0.01 M) で酸性化し、コンデンサーに通してサンプル内の揮発性化合物を分離した。0.45 μm の膜でろ過した後、等量のサンプルを HPLC (Thermo Fisher U3000 液体クロマトグラフ) にロードした。クロマトグラフィーカラム：C18 AQ（4.6×250mm）。移動相には硫酸（0.01M）を使用し、SCFAのレベルは外部標準較正法で測定した。

4.12. 統計分析

データは平均±標準偏差として表される。統計解析はGraphPad Prism 8.0.2(263) (Insightful Science、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実施した。2つのグループの比較にはスチューデントのt検定を使用し、複数グループ間の差はBonferroniの事後検定を用いたANOVAによって決定した。相関分析はRソフトウェア(v.3.6.2)を用いたピアソン法を使用して実施した。統計的有意性の閾値として0.05未満のp値に設定した。アスタリスクは有意水準を示す: (ns、有意性なし、* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001、**** p < 0.0001)。