無細胞生合成とディープラーニングの組み合わせが抗菌ペプチドの新規開発を加速する

2023年11月10日 00:15

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出版：2023年11月08日
無細胞生合成とディープラーニングの組み合わせが抗菌ペプチドの新規開発を加速する

https://www.nature.com/articles/s41467-023-42434-9

アミール・パンディ、デイヴィッド・アダム、...トビアス・J・アーブ著者一覧を見る
ネイチャー・コミュニケーションズ第14巻、論文番号：7197（2023）この記事を引用する

10 Altmetric

メトリクス詳細

要旨
生理活性ペプチドは、健康と医療における重要な分子である。ディープラーニングは、生理活性ペプチドの発見と設計に大きな可能性を秘めている。しかし、ハイスループットかつ低コストで候補を検証するためには、適切な実験的アプローチが必要である。ここでは、DNAテンプレートから直接抗菌ペプチド（AMP）を迅速かつ安価に製造するための無細胞タンパク質合成（CFPS）パイプラインを確立した。本プラットフォームを検証するため、ディープラーニングを用いて数千のAMPをde novoでデザインした。計算科学的手法を用いて、CFPSパイプラインで作製・スクリーニングした500の候補に優先順位をつけた。その結果、30個の機能的AMPが同定され、さらに分子動力学シミュレーション、抗菌活性、毒性などの特性評価を行った。特筆すべきは、6つのde novo-AMPが多剤耐性病原体に対して広域スペクトル活性を示し、耐性菌を作らないことである。我々の研究は、CFPSが24時間以内に生理活性ペプチドをハイスループットかつ低コストで製造・試験できる可能性を示している。

はじめに
世界保健機関（WHO）によると、抗菌薬耐性（AMR）は世界的な健康脅威のトップ10に入っている1。2019年だけでも、病原性大腸菌、ESKAPE病原体（Enterococcus faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Enterobacter spp.）、肺炎球菌、結核菌を含む多剤耐性菌が127万人の死亡をもたらした2。この数は、2050年までに毎年1,000万人に達すると予測されている2。このような脅威が迫っているにもかかわらず、新しい抗菌薬の開発は遅れている。2021年には4000を超える免疫腫瘍学的化合物が臨床試験中であったのに対し、臨床試験に供された抗菌薬はわずか40種類（うち多剤耐性グラム陰性菌に有効なものはない）であった3。

抗菌化合物の有望なクラスのひとつに、抗菌ペプチド（AMP）4,5,6,7,8がある。AMPの大きな分類は、12-50のカノニカルアミノ酸（AA）からなる直鎖ペプチドであり、細菌だけでなく、多細胞生物の自然免疫系における自然の抗菌兵器の一部として進化してきた4,6,8。古典的な抗生物質と比較すると、AMPは耐性化が少ない。その主な理由は、(i) ほとんどのAMPが細胞膜に直接作用すること、(ii) 殺菌率が比較的高いこと、(iii) AMPに対する耐性は、むしろ非特異的なメカニズムによって付与されるため、突然変異や遺伝子の水平転移が起こりにくいことである4。このことから、AMPは次世代抗菌薬の候補として注目されている。

現在までに約5000のAMPが明らかにされており、そのほとんどが天然由来である。しかし、これら5000のAMPは、自然界が探索しうる解空間のごく一部にすぎない（30AA AMPの場合、～2030）。さらに、ゲノムやメタゲノムからのAMPマイニングは、天然の（そしてまだ発見されていない）AMPが限られていることや、利用可能な計算的・実験的AMPマイニングツールによって妨げられている。したがって、この未知の領域から新しいAMPを発見する能力は限られている。ランダムに生成されたペプチドは抗菌特性を示す可能性が低いため9、AMPを無制限に開発する方法として、de novoタンパク質やペプチドの設計に採用されつつあるディープラーニングモデルを用いる方法がある10,11,12,13,14。生成的ディープラーニングとして知られるこのアプローチでは、モデルはラベル付けされていないデータのトレーニングセットで自然なタンパク質配列景観を学習し、新しい自然なタンパク質配列を提案する15。これらのモデルは、ラベル付けされたデータを使用して、配列からタンパク質の特定の特性（ラベル）を予測する予測モデルとは異なる16。生成的・予測的ディープラーニングは最近、新規AMP配列の発見に利用されており、その後、個々の候補の化学合成によって作成・検証されている6,17,18,19,20。このプルーフ・オブ・プリンシプルは、AMP探索におけるディープラーニングの可能性を示したが、より多くのAMP候補を中～高スループットで生産・スクリーニングする便利な方法がないため、このアプローチの広範な応用は制限されている。

AMP生産のスループットを向上させる一つの可能性は、化学合成からDNAベースの生物生産法に切り替えることである。しかし、大腸菌のような微生物におけるAMPの異種発現には、いくつかの欠点がある。(i)時間と労力がかかること、(ii)細胞培養からAMPのクローニング、生産、精製が必要であること、そして最も重要なことは、(iii)誘導時に生産菌株を死滅させる可能性があるため、多くの（強力な）AMP候補が利用できない可能性があることである。無細胞タンパク質合成（CFPS）は、これらの課題に対する有望な解決策を提供する。CFPSシステムは、タンパク質の生合成にDNAテンプレートを直接使用するin vitro転写翻訳（TX-TL）システムであり21,22,23、生きた細胞の外でペプチドを生産することができる。したがって、これらのシステムは、潜在的な細胞毒性効果を克服するのに役立ち、線状DNAから数百のペプチドを並行して迅速かつ小規模に生産する道を開くことができる。

ここでは、ディープラーニングとCFPSを組み合わせることで、AMPのde novoデザイン、迅速な生産、スクリーニングを24時間以内の小規模で、個々のAMP生産アッセイあたり10ドル未満で実現した（DNA断片のコストは除く）。500,000の理論配列を探索した後、500のAMP候補をスクリーニングし、30個の機能的AMPを同定した。注目すべきは、これらのAMPのうち6つが多剤耐性病原体に対して高い抗菌活性を示し、耐性菌が出現せず、ヒト細胞に対する毒性もわずかであったことである。

研究結果
ディープラーニングを用いたde novo AMPデザイン
AMPのde novo設計のために、先行研究20,24から、損失関数が異なる2つのバージョンの深層生成変分オートエンコーダ（VAE）を採用した（Methods）。生成VAEは教師なし学習モデルであり、AMP配列のみを入力とし、エンコーダー、潜在空間、デコーダーから構成される。モデル学習中、エンコーダーは入力配列を低次元空間（潜在空間）に圧縮し、デコーダーはこの潜在空間から配列を再構成することを目的とする（図1a）。我々はまず、汎用データセットとしてUniProtの約150万個のペプチド配列を用いてVAEの事前学習を行った。次に、de novo AMP生成に用いる潜在空間を設定するために、既知のAMP～5000個のデータセットを用いて、事前学習したVAEに対して転移学習を行った（Methods, Supplementary Table 1）。

図1：ディープラーニングと無細胞生合成によるAMPのde novo開発のワークフロー。
図1
a 既知のAMP配列でトレーニングした後、AMPのde novo設計のための生成的変分オートエンコーダ（VAE）。 b 既知のAMPとそのMICでトレーニングした後、MIC予測のためのリグレッサーとして予測的畳み込みニューラルネットワークまたはリカレントニューラルネットワーク。c 訓練された生成モデルと予測モデルは、それぞれ潜在空間からのサンプリング（AMPのde novoデザイン）とAMPの優先順位付け（そのMICの予測）に使用される。 d 合成DNA断片からデザインされたAMPの迅速な無細胞生合成と、無細胞ミックスで生成されたAMPの細菌培養への直接試験、それに続く一晩連続増殖アッセイのための実験パイプライン。BioRender.comで作成。

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実験的試験のためのAMPの数を減らすために、予測される生物活性、すなわち最小阻害濃度（MIC）に従って候補を選択する方法を設定した。この目的のために、先行研究を参考に、あるいは自社で構築した（Methods）、予測深層学習モデルを確立し、既知のAMP～5000種の配列とそれぞれの実験的MIC値（配列とMICの関係、図1b）を用いてトレーニングした。リグレッサーとして、畳み込みニューラルネットワーク（CNN）とリカレントニューラルネットワーク（RNN）を使用した（Methods、補足表1-3）。

興味深いAMP候補を同定するために、まず潜在空間から点をサンプリングして新しいAMPを生成し、それをデコーダーに入力した。これらのde novo AMPは、予測されるMICに従ってリグレッサーによって優先順位付けされた。異なるバージョンのモデルを用いて5回のラウンドを行い、潜在空間からサンプリングすることによって〜500,000の新しいペプチドを生成した。これらのペプチドを長さと生存率でフィルターにかけ、～50,000の候補に絞り、ウェットラボでの生物活性試験のために500のAMP候補に優先順位をつけた（図1cと補足表4）。

無細胞生合成により、機能性AMPの迅速なスクリーニングが可能
AMPのCFPSベースのスクリーニングを確立するために、384ウェルフォーマットでのAMPのハイスループット合成と試験のための実験パイプラインを設計した（図1d）。このシステムは、転写（TX）と翻訳（TL）を開始するT7プロモーターとリボソーム結合部位（RBS）、それに続くAMPコード領域、T7ターミネーターからなる直鎖DNAテンプレートに基づいている。DNA鋳型（10 nM）を無細胞TX-TLシステムの10 µLに直接添加すると、4時間以内にAMPが産生された（Methods）。in vitroで産生されたペプチドの抗菌活性を調べるため、4μLの無細胞ミックスを、大腸菌（グラム陰性）と枯草菌（グラム陽性）の最終培養量20μLに添加した。OD600を20時間測定することで、増殖を抑制して抗菌活性を示すペプチドを同定することができた。全体として、CFPSとそれに続く生物活性試験の全プロセスは、直鎖DNAで動作し、大規模なクローニングやペプチドの精製工程を必要としないため、24時間程度で完了する。

まず、2つの既知のAMP、BP10025とCecropin B26でスクリーニングパイプラインを検証し、その後、5回のデザイン-予測-構築-テストサイクルで500のAMP候補（上記参照）をスクリーニングし、30の機能的de novo AMPを同定した（図2、補足表5）。この5回のラウンドの間、機能的AMP発見の成功率は、第1ラウンドから第5ラウンドまで、それぞれ0%から12.7%まで上昇した（補足表4）。翻訳開始率（TIR）はタンパク質の収量に強く影響するため27、我々のスクリーニングがTIRの低い候補に偏っていないかどうかを検証した。テストしたすべての配列についてTIRを計算したが28、テストした500の候補と同定された30個の機能的AMPとの間に有意な差は見つからなかった（補足注1、補足図3）。機能性AMPは、20 µL培養の最終容量に10 µLの無細胞ミックスを加え、生物学的3連複で再検証し（図2b、補足図1）、AMPの産生をSDS-PAGEで解析した（補足図2）。

図2: デノボで生成された優先順位付けされたAMPの無細胞生産と、枯草菌および大腸菌に対する活性スクリーニング。
図2
b. 枯草菌と大腸菌に対する機能性AMPのチャージとAlphaFoldで予測された構造、および関連する増殖の減速/停止曲線。全ての（コントロールを含む）AMPはCFPSを用いて生産され、活性試験の前にペプチドの精製は行われなかった。成長曲線（いずれも4-20時間のOD600 0-0.45）は、n = 3つの独立した実験の平均値である。c AMPのde novo-designに使用した2つの変分オートエンコーダ（VAE、KL-term annealingなしとあり、それぞれVAE_v1とVAE_v2、Methods参照）について、主成分分析（PCA）により50次元の潜在空間の2D-プロジェクションを得た。青色の強度は、潜在空間におけるトレーニングAMPの頻度を表す。機能的AMP（赤）、BP100およびセクロピンB（黒）は潜在空間にアノテーションされている。bのソースデータはSource Dataファイルとして提供される。BioRender.comで作成。

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機能性AMPはユニークであるが、天然のAMPと共通の性質を持っている。
次に、de novoで設計されたAMPをより詳細に分析した。AlphaFold29は、30個の配列のうち27個がらせん構造を形成していると予測した（図2b）。興味深いことに、VAE 1によって生成されたAMP#1-19は、VAE 2によって生成されたAMP#20-30と比較して、より構造的な多様性を示した。これは、2つのVAEが2つの異なる潜在空間を作り出し（図2c）、その結果、構造、物理化学的、および配列の特徴が異なるAMPをロバストに生成するという事実と一致している（補足図4）。AMPの主な特徴の一つは、AMPコアにカチオン性アミノ酸と疎水性アミノ酸が交互に存在することから生じる両親媒性である4,5。脂肪族アミノ酸を主成分とする天然のAMPとは対照的に、われわれのde novo AMPの疎水性コアはほとんどが芳香族であった（補足図5a）。特にフェニルアラニンが多く、ロイシンが少なかった（補足図5b、補足表6）。トレーニングAMPと生成ペプチドの間、また生成ペプチドと優先順位付けされたペプチドの間には有意な物理化学的差異があるが、500個のテストAMPと30個の機能性AMPにはそのような差異は見られなかった。おそらくサンプルサイズが小さいか、機能性候補とそれ以外を分ける差異が単純な物理化学的指標では示せないためであろう。さらに、BLAST検索は、我々のde novo AMPがその配列においてユニークであることを示した。約2億4,000万エントリーを網羅するUniProtデータベースに対しても、トレーニングデータセットのAMP配列に対しても、有意な類似性は見られなかった。(詳細なBLAST配列類似性解析については、補足表7-9と補足注2を参照）。これらの結果を総合すると、我々のde novo AMPは、天然のAMPと物理化学的な構築原理を共有しているが、アミノ酸配列においては異なっていることが示された。

デノボAMPはヒト膜よりも細菌膜を好む
構造と配列の解析から、われわれのde novo AMPは膜に挿入する両親媒性らせんとして働くことが示唆された。分子動力学（MD）シミュレーションを用いて、負に帯電したバクテリアの内膜（IM）とヒトの細胞膜（PM）のモデルとの相互作用を調べた（図3a、補足注3）。シミュレーションによると、すべてのAMPはPMよりもIM界面に強く結合した（図3b）。これは主に、このような陽イオンAMPが負に帯電した細菌膜と相互作用するためである。IMでのAMPの結合は急速に進行し、膜界面に完全に挿入されるまでに最大でも200ナノ秒かかった（補足図6a）。一度結合すると、シミュレーションの残りの時間、AMPはIMにしっかりと結合したままであった。いくつかのケースでは、数百ナノ秒後にAMPが浅く結合した状態から、膜の深いところに存在する結合モードへと再配向するのが観察された（例えば、AMP#29）。いくつかのAMPは部分的にPMとも結合する。しかし、ほとんどの場合、この結合は一過性で、頻繁に結合解除と再結合を繰り返し、IMで見られたようにPMの深部まで浸透することはなかった（補足図6b）。さらに、すべてのAMPは、PMとの相互作用よりもIMとの（主に静電的な）相互作用の方が多い（補足図6c）。我々のシミュレーションでは、ほとんどのAMPの予測された（主にらせん状の）構造はほぼ維持されているが、PM系でしばしば完全に溶媒和されたAMPと比較すると、IMへの膜結合の強さは、二次構造の安定性の増大と密接に関係している（補足図6d）。MDシミュレーションの結果、すべてのAMPがヒト細胞膜よりも細菌膜を標的としていることが示唆されたが、その程度は個々のAMPによって異なる。

図3：AMPと膜との相互作用の分子動力学（MD）シミュレーション。
図3
a シミュレーションのセットアップの概要と、IM上でのシミュレーション時間1μ秒後のAMP#5のスナップショット。ペプチドは赤いカートゥーン表現で、溶媒（水＋イオン）は透明な青い表面で、膜はグレーの甘草色表現で、脂質ヘッドグループのリン酸塩は球として示されている。 b 膜法線方向（y軸）に沿ったAMPの質量中心と膜正中面間の距離の分布。分布は、異なる横方向の膜張力（x軸）と異なる膜（青：PM、赤：IM）を用いて実行された、1μ秒のレプリケートの最後の940ナノ秒から計算された。細い点線はヘッドグループのリン酸位置を示す。AMP#2は、ジスルフィド結合の有無にかかわらずシミュレートした（Methods）。 c IM（上）とPM（下）上での強力なAMP（図4）のレンダリングシミュレーションスナップショット。作用機序の実験については図5c, dを参照。膜の相互作用するリーフレットは、灰色の脂質の尾とオレンジ色（リン酸塩）と緑色（コレステロール酸素）の球で描かれている。BioRender.comで作成。

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デノボAMPは良好なMIC/毒性比を示す
CFPS中のペプチドの濃度は定義されていないため、細胞アッセイには純粋なペプチドが必要であった。純粋な化合物を得るために、機能性AMPを化学合成し、その生物活性、特に最小阻害濃度（MIC）30、溶血（HC50）と細胞毒性（CC50）を評価した。候補30種のうち、22種のペプチドが化学合成により製造された。20のAMPは枯草菌に対して6μM以下のMICを示し、15のAMPは大腸菌に対して25μM以下のMICを示した（図4a、補足表10、11）。HC50とCC50はほとんどの場合で有意に高く、新鮮ヒト赤血球に対して15種のAMPがHC50 > 100 µM（13種 > 250 µM）を示し、HCT116ヒト結腸細胞に対して13種のAMPがCC50 > 100 µM（6種 > 250 µM）を示した（図4a、補足表10、11）。このことは、いくつかのde novo AMPについて、生理活性と毒性の関係が非常に良好であったことを示している。我々は、良好な生物活性対毒性比を示した16種のAMPを継続することにし、MICが高い、あるいはHC50/CC50値が低いという理由で6種のAMPを除外した（AMP #1 、#7、#10、#18、#23、#26）。

図4：化学的に合成された機能性AMPの生物活性特性。
図4
a AMPの枯草菌（灰色）および大腸菌（黒色）に対する最小発育阻止濃度（MIC）。HCT116ヒト結腸細胞およびヒト赤血球に対するAMPのCC50（50%細胞毒性、青）およびHC50（50%溶血、赤）値（それぞれn=2独立実験の平均）。矢印は測定限界以上の値を示し、黒はMIC > 100 µM、青はCC50 > 250 µM、赤はHC50 > 250 µMをそれぞれ示す。MIC、HC50およびCC50の値は補足表10に示す。 b. ESKAPE病原体（E. faecium、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、肺炎桿菌、A. baumannii、緑膿菌、腸内細菌科細菌（P. aeruginosa）を含む）に対して試験したAMPのMIC値。緑膿菌、エンテロバクター属菌は二重測定（n = 2独立実験）、Y. pestisおよびB. anthracis、S. pneumoniaeに対する6種類の強力な広帯域AMPのMICは三重測定（n = 3独立実験）の平均値。BioRender.comで作成。

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デノボAMPはin vitroで広帯域活性を示す
以下では、臨床に関連する菌株、特に多剤耐性ESKAPE病原体（すなわち、Enterococcus faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Enterobacter spp.；図4b）に対して、残りの16種類のde novo AMPを試験した。我々のAMPはE. faeciumとA. baumanniiに対して最も強力で、それぞれMIC≦25 µMのAMPが15種類（13種類≦6.3 µM）、MIC≦25 µMのAMPが13種類（10種類≦6.3 µM）であった（図4b）。残りのESKAPE病原体である肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、エンテロバクター属に対しては、それぞれ10種、9種、8種、3種のAMPがMIC≦25μMを示した（図4b）。いくつかのAMPは個々の菌株に対して明確な活性プロフィールを示したが、6つのAMPは広域抗菌薬に分類され、良好な治療域、すなわち溶血および細胞毒性が関連的に低い抗菌活性を示した（AMP #3 、#5、#13、#15、#16、#27）。注目すべきことに、これらのAMPは、悪名高い生物脅威物質であるYersinia pestisとBacillus anthracisに対しても活性を示した（図4b）。

試験管内でde novo AMPに耐性は生じなかった
次に、本研究で同定された6種類の広帯域AMP（AMP#3、#5、#13、#15、#16、#27）に対する耐性の出現を試験した。そのために、ペプチドを用いた大腸菌連続継代実験を行った。コントロールとして、一般に多剤耐性病原体に対する最後の手段と考えられている広域抗生物質であるイミペネムを加えた31。イミペネムのMICは最大8倍まで徐々に上昇し、EUCASTで定義された臨床的耐性のブレイクポイントを超えた（図5a、補足図7）。耐性が観察されなかったという事実は、我々のAMPが特定の細胞標的に作用するのではなく、むしろグローバルに（すなわち膜で、図3c）作用し、耐性発現を引き起こしにくいという事実と一致している。この作用様式は、ヨウ化プロピジウム染色と顕微鏡検査（図5c, d）によりさらに確認され、AMP処理による膜破壊が明確に示された。

図5：大腸菌に対するAMPの耐性試験と作用機序試験。
図5
a 1/2-MIC濃度のAMPで培養した細胞から毎日継代培養した21日間のMIC測定値。MIC値は、各AMPの21日平均値の最小値で正規化した。棒グラフはn = 3つの独立した実験の平均値である。未処理の大腸菌（コントロール）、（AMP）溶媒、および6種類の強力なAMP、ポリミキシンBについて、1/4 MIC濃度の異なるAMPが大腸菌外膜小胞（OMV）の数に及ぼす影響を示す。棒グラフは、コントロールはn = 8、AMP#3はn = 6、その他はn = 3の独立実験の平均値。統計：通常の一元配置分散分析 p < 0.0001 (4.86×10-6)、ポリミキシンBを唯一の有意差グループとした。 c プレートリーダーは、未処理（コントロール）またはAMPで処理した大腸菌細胞を用いて、ヨウ化プロピジウムの蛍光（任意単位）を測定した。棒グラフはn = 3つの独立した実験の平均値。d 大腸菌細胞を未処理または6種類の強力なAMPとセクロピンB（膜破壊性AMP）で処理し、ヨウ化プロピジウム（赤）で染色した位相差顕微鏡。a-cのソースデータおよびdの生画像（さらにそれぞれ6回取得し、n = 3生物学的反復の2つの画像で同様の結果）は、Source Dataファイルとして提供される。BioRender.comで作成。

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最後に、大腸菌の外膜小胞（OMV）の放出に対するAMP処理の効果も調べた。OMVはグラム陰性菌が自然に放出するもので、膜を標的とする抗生物質の効果を中和する表面攻撃剤に対する反応となりうる32,33,34。注目すべきは、グラム陰性菌の外膜に作用する抗生物質であるポリミキシンBとは異なり、6種類の広帯域AMPのいずれも、未処理の大腸菌と比較してOMVの放出を有意に増加させなかったことである（図5b）。これらの実験を総合すると、我々が開発した6種類の広帯域AMPは、細菌の耐性発現や自己防御反応から逃れることができることが示唆された。

考察
本研究では、30種類のde novo AMPの設計と検証を行い、そのうち6種類がin vitroで広帯域活性を示した。最近の研究で、新規AMPの発見や開発におけるディープラーニング手法の威力が印象的に示された6,20。しかし、これらの研究は、合成して試験できるペプチドの数が限られていることや、設計から検証までに比較的長い時間がかかるという問題を抱えている。ここでは、CFPSを用いて、AMP開発におけるデザイン-ビルド-テストのサイクルを劇的に前進させた。

この研究では、天然アミノ酸を含む直鎖ペプチドにCFPSパイプラインを採用したが、将来的に活用できるCFPSのユニークな利点は、サイクルや非カノニカルアミノ酸を含むペプチドを合成できる可能性である。AMP30種のうち8種が化学合成に成功しなかった経験など、限界がある化学合成と同様に、CFPSは合成が困難なモチーフを持つペプチドの発現に困難に直面する可能性がある。さらに、ペプチドの発現性や構造、PUREコンポーネントとの相互作用の可能性により、偽陰性の結果が出ることもある。幸い、CFPSのスループットは、多数の候補をスクリーニングすることで、このようなケースをカバーしている。なお、ペプチド配列が長いほど（抗菌特異性が高いほど）、化学合成の難易度は高くなり、CFPSの作業の難易度は低くなります。さらに、我々のCFPSパイプラインは大きなタンパク質にも適用できる。

最近のアプローチと比較すると、機能性AMPを見つける成功率は同じ範囲にあり、テストしたすべての候補で6%（我々の最良のジェネレーターとレグレッサーの組み合わせでは12.6%、補足表4）であるのに対し、Dasらの報告では10%である20。しかし、発見された機能的AMPの総数は、桁外れに多く（30個のAMPに対して2個）、しかも大量に増加した速度（24時間に対して28日）で、コストもそれなりに低い（DNA合成やPCRプライマーを使用する代わりに、減少し続けるコストを除けば、2つの菌株を並行してスクリーニングするための1個のAMPの生産に10ドル未満）。最先端のディープラーニング・モデルは、将来的にはヒット率を向上させることができるが、我々のような高スループット・アプローチにより、より高いヒット数を達成することができる。さらに、CFPSシステムを社内で調製することで、ペプチド生産のコストを～1$35,36まで下げることができる。

ユニークで多様である一方で、我々のde novo AMPは既知のAMPと共通の性質を持っている。それらはカチオン性アミノ酸と疎水性アミノ酸に富むα-ヘリカルペプチドがほとんどで、負電荷を持つIMに作用することが好ましいと予測されており、われわれのパイプラインが、AMPの一般的な構築原理に従った、自然界に存在しない新しい配列をデザインできたことを示している。得られたAMPは、（in vivoでの検証を経て）治療への応用を成功させるために貢献しうるいくつかの特徴を有しており、これには、広域スペクトル活性、耐性菌の発生傾向の低さ、局所的または全身的使用の可能性、既存の治療法との相乗効果の可能性などが含まれる。

私たちは主に広域スペクトル活性を持つAMPに焦点を当てたが、様々な機械学習技術を組み合わせた私たちのパイプラインは、より特異的な特徴を持つAMPの開発と反復最適化にも適していることに留意する。これらの特性には、選択性と特異性、安定性、in vivoバイオアベイラビリティ、免疫調節特性、既存薬との相乗効果、耐性などが含まれる。これらの特徴を改良することにより、我々のパイプラインは、様々な臨床応用に向けたAMPの設計を前進させる可能性を秘めている。

全体として、我々の研究は、CFPSが将来的に機械学習アプローチの可能性を最大限に活用するためにどのように利用できるかを示す原理実証を提供するものである。特に、DNA合成コストが減少し続けていることを考慮すると、ディープラーニングとCFPSを組み合わせた我々のアプローチは、ペプチドの生産とスクリーニングにおいて、時間、コスト、労力の面で効率的なアプローチを提供する。このように、我々の研究は、AMPのデザイン-機能空間を、より速く、より深く探索する可能性を持っている。これにより、将来的にペプチドベースの医薬品候補の発見と開発が促進されることが期待される。

方法
プレトレーニングデータセットとトレーニングデータセット
プレトレーニングデータ。一般的なタンパク質文法を表すタンパク質配列の大規模なコーパスを収集するため、UniProt37（2021年7月現在）から49アミノ酸より短い全てのタンパク質配列をダウンロードした。重複配列やアミノ酸文字が不明なエントリーを削除した後、3,104,952のユニークな配列が残り、そのうちの半分のランダムなサブセットをプレトレーニングに使用した。

AMPデータ。実験的に検証されたAMP配列については、APD39、DADP40、DBAASP41、DRAMP42、YADAMP43のいくつかの公開AMPデータベースから配列と活性データを統合したGiant Repository of AMP Activities (GRAMPA)38を使用した。このデータベースは、6,760のユニークな配列と51,345のMIC測定値から構成され、いくつかの細菌および非細菌の標的種にまたがっている。我々は、MIC測定値を10種の最も豊富な細菌種（大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌、肺炎桿菌、バウマンニ、黄色ブドウ球菌、枯草菌、表皮菌、Micrococcus luteus、E. faecalis）に絞り込み、実験室内での発現が可能なように、C末端アミド化以外の化学修飾を含むペプチドをすべて除外した。重複配列と48アミノ酸以上のエントリーを除去した後、5319のユニークなAMP配列が残った。

非AMPデータ。UniProtKB37,44から、"not antimicrobial, antibiotic, antiviral or antifungal"（2021年7月現在ダウンロード）と表示されたタンパク質を検索し、曖昧なアミノ酸を含むエントリーを削除し、49アミノ酸より短いユニークな配列のみを残した。その結果、10,612個のユニークな非AMP配列を含むデータセットが得られた。

Generator variational autoencoder (VAE)
VAEは以前de novo AMPデザインに使用されたことがあるため、VAEを使用した17,18,20,45。生成VAEは、エンコーダー、潜在ベクトル、デコーダーで構成される。エンコーダーは、入力データ（ペプチドのアミノ酸文字をワンショットでエンコードしたもの）を情報ボトルネックとなる潜在ベクトルに送り込み、デコーダーは潜在ベクトルから入力データを再構成することを目的とする。VAEを訓練し、入力データと再構成されたデータとの差を最小化することで、2つの働きをする。エンコーダーは訓練データセットを低次元空間にマッピングすることを学習し、デコーダーは潜在空間内の任意のベクトルから訓練データに類似したサンプルを生成することを学習する。従って、トレーニングデータセットの各ペプチドは、多次元潜在空間の点上に位置する。この空間の空の領域からベクトルを選び、デコーダーに入力すると、同じ文法を共有するが、トレーニングデータセットでは見られない新規のペプチド配列が得られる。事前学習とトレーニング（転移学習）の後、潜在空間から新しいAMPをサンプリングし、特にコントロール機能AMPの近傍探索、勾配降下、ランダムサンプリングなど、さまざまな戦略を用いて生成した（補足表1、4）。

VAEモデルの生成。CNN-RNNハイブリッドVAEモデルのニューラルネットワークアーキテクチャをHawkins-Hookerら24から採用した。エンコーダは5つの連続した1次元畳み込み層からなり、潜在ベクトルであるサイズ50の密な層に供給される。デコーダは、潜在ベクトルをサンプリングする4つのデコンボリューション層と、入力と同じ次元のシーケンスを出力する512セルのGRU層からなる。モデル損失は再構成損失とカルバック・ライブナー（KL）損失の加重和である。KL項アニーリング46 では、言語などの離散データを扱う際の標準的なプラクティスとして、全損失関数を学習過程で動的に変更することができる。最終的な2つのモデルは、KL項アニーリングなしとKL項アニーリングありで学習された（それぞれVAE_v1とVAE_v2）。モデルはAdamオプティマイザーを使ってコンパイルした。

プレトレーニングとトレーニング AMP配列の学習データセット(~5000)は、タンパク質配列とランダムなアミノ酸文字列との違いや、タンパク質配列をAMPとするものを学習するには十分ではありません。このような場合、モデルの性能を向上させるために、より大きな一般的なデータセットによる事前学習が必要である。我々は、UniProtKBの～150万個のタンパク質配列を使って、600エポックの事前学習を行った。その後、AMPデータで400エポック学習させた。モデルの学習指標は補足表1に示す。

リグレッサー畳み込みニューラルネットワークとリカレントニューラルネットワーク
リグレッサーニューラルネットワーク。我々は以前に報告されたリグレッサー・モデルを採用した38。まず、2つの連続した1次元畳み込み層、最大プーリング層、平坦化層、ドロップアウト層（0.5）、および3つの密な層でCNNリグレッサーを構築した。次に、LSTM層と2つの密な層を持つ単純なRNN回帰器を構築した。モデルは平均二乗誤差損失とAdamオプティマイザを用いてコンパイルした。

グラム特異的回帰器細胞膜の構造の違いから、グラム陽性菌とグラム陰性菌ではAMPに対する反応に違いがあると仮定した。これらの違いを捉えるために、グラム特異的リグレッサーモデルをトレーニングした。グラム陰性モデルは、4619 個のユニークな AMP 配列とそれに対応する大腸菌の MIC 測定値で、グラム陽性モデルは、4089 個の AMP 配列とそれに対応する枯草菌の MIC 測定値でトレーニングしました。このアプローチにより、リグレッサーモデルの精度と効率が向上した（補足表1、2、4）。

トレーニング AMP配列とそれに対応するMIC測定値（log 10）を含むデータのペアで、これらのモデルをトレーニングした。3.5未満をAMP、3.5～3.9を潜在的AMP、3.9以上を非AMPと解釈した。リグレッサーモデルは、プールされたAMPと非AMPのデータで200エポック学習させた。モデルの学習指標は補足表1に示す。

AMPのサンプリングと優先順位付け
ペプチド合成の各ラウンドにおいて、VAEの潜在空間から数千のランダムな点を選択し、それぞれからペプチド配列を再構築した。生存不可能な配列は除外し、36-48アミノ酸のAMPを残した。その結果、生存可能なペプチド配列が残った（補足表4）。次に、これらの配列をリグレッサーに入力し、MIC予測に基づいて優先順位をつけた。AMPとして予測されたものの中からランダムに、あるいは上位にランクされたソートされたAMPの中から、50-150のAMPを選び（補足表2、5）、5回に分けてウェットラボ実験を行い、この研究でテストした500以上のAMPのリストを作成した（補足表2）。

分子動力学（MD）シミュレーション
すべてのMDシミュレーションは、Gromacs 2020.347とCHARMM36m力場48を用い、積分時間ステップ2fs（膜平衡化では一部1fs、補足表12参照）で行った。水素を含む結合はLINCSアルゴリズム49 を用いて拘束した。静電相互作用は、Particle-Mesh Ewald (PME)アルゴリズム50を用い、1.2 nmより離れたペアについては実空間カットオフで計算した。Lennard-Jones相互作用は、force-switchアルゴリズムを用いて、1～1.2 nmの間で滑らかにゼロに切り替えた。

タンパク質、膜、溶媒（水とイオン）は、v-rescaleアルゴリズム51を用いて、37℃（310.15K）に設定したサーマルバスに、時定数1psで個別に結合させた。平衡化運転の間、圧力カップリングはBerendsenバロスタット52によって処理され、すべての生産運転ではParrinello-Rahmanバロスタット53に切り替えられた。バロスタットの時定数と圧縮率は、それぞれ一貫して5 psと4.5 × 10-5 bar-1に設定された。圧力カップリングは、膜のある系では半等方的に（xとyの次元を一緒にカップリングして）適用し、それ以外では等方的に適用した。基準圧力は1 barとした。有限サイズ効果による膜へのペプチド挿入のエネルギー的ペナルティを打ち消すために、3つの異なる横方向の膜張力（0、9、17.1bar）で各膜系をシミュレートした。したがって、圧力テンソルの対角要素(PXX, PYY, PZZ)は次のように設定した。

$$,{P}{{XX}}={P}{{YY}}=P-\frac{\varDelta P}{3}$$
(1)
$${P}_{{ZZ}}=P+2\frac{\varDelta P}{3}$$
(2)
ここでPは基準圧力（1bar）、∆Pは望ましい横方向の膜張力です。異なる張力に対して無相関なシミュレーションを行うために、原子の開始速度はマックスウェル・ボルツマン分布に従ってランダムに初期化した。膜上のAMPのMDシミュレーションはそれぞれ1µsで行った。

視覚的解析とレンダリングには、VMD54、PyMOL55、ChimeraX56ソフトウェアを使用した。

膜のセットアップ。以前の研究とリピドミクス実験の結果に従い、ヒト細胞膜（PM）57,58と大腸菌内膜（IM）59の外葉に似た膜をモデル化した。詳細な組成は、補足表13, 14にまとめてある。

CHARMM-GUI membrane builder60,61を用いて、これらのモデル膜の12.5 ×12.5 nm2パッチを作成し、最急降下アルゴリズムを用いて、どの原子にも作用する最大の力が1000 kJ mol-1を下回るまでエネルギー最小化を行い、その後CHARMM-GUIの平衡化スキームに従って平衡化を行った（補足表12に要約）。

AMPシステムのセットアップ。一方、短いBP100は、VMD54のMolefacture Protein Builderプラグインを用いて、初期角度φ=-60°とψ=30°のコイルとしてモデル化した。いくつかのAMP（AMP#2, #4 , #6 , #8 , #10 , #11 , #12 , #14 , #18 , #19 ）は複数のシステインを持つため、次に、水とイオン（150 mM NaClと全体的な中和のための対イオン）のみで囲まれ、ジスルフィド結合がない状態で、1-2 μsのMDシミュレーションを行った。これらのシミュレーションでそれぞれの構造の2つのシステインが相互作用する頻度と距離に基づいて、AMP#2（Cys11, Cys47）にはジスルフィド結合を、AMP#8（Cys29, Cys35）とAMP#14（Cys10, Cys32）には予測されたβシート間をつなぐジスルフィド結合を割り当てた。AMP#2ではシステインが特に多く、1つの特定のジスルフィド結合を課すことで構造に偏りが生じる可能性があるため、さらにジスルフィド結合を課さずにシミュレーションを行った。

これらの構造は、第一主軸がz軸に直交するように配向され、平衡化されたPMとIMにまだ結合していないが、近接して配置された。続いて、このボックスをTIP3P水62で溶かし、NaClイオンを150mMの濃度になるように加え、系に対イオンを追加して全体的な中性性を確保した。系は純粋な膜系と同じ方法でエネルギー最小化され、その後5ナノ秒間平衡化された。最小化と平衡化の間、1000 kJ mol-1 nm-2の力定数でペプチド重原子の位置拘束をかけた。

AMPの無細胞生産と活性試験
AMPをコードするDNA断片は、AMPコード領域の上流にT7プロモーター（GAATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA）、RBS（TCTAGAGATTAAAGAGGAGAATACTAG）配列、下流にT7ターミネーター（TACTCGAACCCCTAGCCCGCTCTTATCGGGCGCTAGGGGTTTTGT）を持つように設計した。500のDNA断片はTwist Bioscience社から購入した。PUREfrex®2.0キット（GeneFrontier #PF201 -0.25-5-EX、Hölzel, Germanyより購入）を用いて、各フラグメントの最終濃度10 nMをAMPの無細胞転写および翻訳に使用した。384ウェルプレート（BRAND, #781687 ）で、各AMPに対して30 µL容量の無細胞反応を作り、37℃で4時間インキュベートした。無細胞ミックスは、大腸菌と枯草菌の活性試験、または機能性AMPのSDS-PAGElに直接使用した。

グラム陰性菌とグラム陽性菌の代表として、大腸菌MG1655と枯草菌PY79を用いた。LB寒天平板からLB培地へ、各菌株について3つの異なるコロニーから一晩培養し、37℃で振盪しながら増殖させた。翌日、それぞれをLB培地（1:1000）で再培養し、37℃で振とうしながらOD≈1まで増殖させた。細胞をLBで104 cfu mL-1に希釈し、希釈細胞16 µLを、あらかじめ4 µLの無細胞反応ミックス（AMP産生）を添加した384ウェルプレート（Greiner Bio-One、#781185）のウェルに添加した。培養液を混合し、プレートをガス透過性フィルム（Carl Roth, #T093 .1）で密閉した。37℃で20時間振とうしたプレートリーダー（Tecan Infinite® 200 PRO）で10分ごとにOD600を測定し、細菌の増殖を阻害するAMPについて増殖曲線を分析した。20時間後のマイクロプレートを目視で調査し、また増殖曲線を目視で分析し、コントロールと比較して、時間とともにOD600をプロットし、増殖の停止または鈍化を調べた。

無細胞系で産生されたAMPのSDS-PAGE
無細胞反応で産生された機能性AMPを検出するために、SDS-PAGEを用いた23。簡単に説明すると、無細胞反応を2x Tricineバッファー（Bio-Rad、#1610739）で3分間煮沸し、16.5% Mini-PROTEAN ポリアクリルアミドTris/Tricineゲル（Bio-Rad、#4563065）にロードし、ランニングバッファー（10 mM Tris、10 mM Tricine、0.01% SDS）中、200 mAで5時間反応させた。その後、ゲルを12％トリクロロ酢酸で1時間、40％EtOH、10％酢酸で1時間固定し、QC Colloidal Coomassie（Bio-Rad, #161 -0803）で一晩染色した後、水で24時間脱染し、Intas GelStick Touch Imagerで画像化した。

最小発育阻止濃度（MIC）の測定と耐性試験
MIC測定に使用した菌株は、大腸菌MG1655、枯草菌PY79、E. faecium（牛の腸からの分離株）、黄色ブドウ球菌DSM 11729、K. pneumoniae DSM 30104、A. baumannii（ヒト腹壁からの分離株）、緑膿菌DSM 1117、エンテロバクター属、Y. pestis EV76、B. anthracis Sterne、およびS. pneumoniae D39である。抗菌薬のMIC測定には、一般的に使用されている標準プロトコルを用い、そのプロトコール中のカチオン性AMPに関するすべての示唆を考慮して、AMPのMICを測定した30。化学合成したペプチドをBSA（0.2% w/v）酢酸（0.01% v/v）溶液に溶解し、試験する最高濃度の10倍とした。96ウェルPCRプレート(Axygen, #PCR -96-SG-C)に、各ペプチドに指定された各行のカラム1～10から2倍連続希釈液を作り、BSA(0.2% w/v)酢酸(0.01% v/v)溶液をカラム11と12にピペッティングした。各希釈液7.5 µLの3連ピペットをポリプロピレン96ウェルプレート（Corning、#3359）にピペッティングした。Mueller-Hinton broth 2（MHB 2、Sigma-Aldrich、#90922）中の3連の細菌一晩培養液を、前日に3つの異なるコロニーから調製し、37℃で振盪培養した後、朝、37℃で振盪培養したMHB 2で1000倍に希釈してOD≈1になるまで継代培養した。次に、細菌培養物を105 cfu mL-1になるようにMHB 2で希釈し、96ウェルプレートのカラム1-11のペプチド上に各3連の67.5 µLを添加した。MHB 2をカラム12に添加した。プレートは粘着フィルム（VWR, #391 -1262）で密封し、37℃で20時間培養した。S. pneumoniaeについては、MHB 2の代わりにTHY培地を用いた。

2日目以降、最高AMP濃度（MICの半分）で増殖させた3連細胞のそれぞれをMHB 2で10,000倍に希釈し、新たに調製したペプチド希釈液に加えた以外は、耐性試験にも同じ手順を用いた。

細胞毒性（CC50）の測定
細胞毒性測定は、HCT116ヒト結腸細胞（ATCC、#CCL-247™）を用い、MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium）に基づく比色法であるCellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega, #G3580 ）を用いて細胞生存率を測定した。MTSテトラゾリウム化合物（オーウェン試薬）は、代謝活性の高い細胞内でデヒドロゲナーゼ酵素によって産生されるNADPHまたはNADHによって還元され、着色したホルマザン生成物となる。

1日目、細胞が表面の50-80％の密度に達した時点で、10mLのDPBS（ギブコ、#14190367）を用いて穏やかに2回洗浄した。1mLのトリプシン（Capricorn、#TRY-1B）を加え、37℃で5分間インキュベートした後、DMEM高グルコース（Capricorn、#DMEM-HPA）、10% v/vウシ胎児血清（FBS、Capricorn、#FBS-11A）、細胞培養用抗生物質ミックス（Capricorn、#PS-B）を含む9mLの培地を加えた。培養液を15mLのファルコンに移し、1000rpmで3分間スピンダウンした。上清を吸引し、10mLの新しい培地を加えて移した。細胞を培地で希釈し、36 µL中に5000個の細胞を入れた。36µLの細胞培養液を384ウェルプレート（Greiner, #781185 ）の各ウェルにピペッティングした。最後のウェルには培地のみを入れた。細胞を37℃、5％CO2で24時間培養した。2日目に、最終濃度250μMから始まる2倍連続希釈でペプチドを調製した。カラム11と12には水のみを加えた。3日目に、CellTiter 96® AQueous One Solution 8 µLとSDS 10% 10 µLを各ウェルに加え、37℃で90分間インキュベートした後、490 nmの吸光度を測定し、培地のみのウェルの値で補正した。CC50値（細胞の50%を死滅させる各AMPの濃度）は、Graphpad Prism 9を用いて算出した。

溶血活性（HC50）の測定
ヒト血液をPBSで3回洗浄し、2V PBSに再懸濁した。初期濃度250μMのAMPを96ウェルポリプロピレンプレート（Vボトム、Greiner Bio-One GmbH）で滴定した。5μLのAMP希釈液に45μLの洗浄濃縮ヒト赤血球を重層し、プレートを密封して37℃で1時間インキュベートした。上清40μLを1000×g、5分間、室温で最終遠心後、ELISAプレートに移し、405nmで吸光度を測定した。Triton X 100で処理した赤血球を陽性対照とした。HC50値（赤血球を50％溶解する各AMPの濃度）は、GraphPad Prismを用いて算出した。

作用機序アッセイとヨウ化プロピジウム（PI）を用いた顕微鏡検査
プレートリーダーアッセイ。大腸菌MG1655細胞をLB中、37℃で指数期まで培養し、3つのコロニーを摘出した。細胞を4000 x gで遠心分離して回収し、10 mM PBS（pH = 7.0）で3回洗浄し、10 mM PBSでOD600 = 1に調整した。PBS中の細胞10μLを最終濃度4×MICになるようにAMP10μLと混合し、37℃で1時間インキュベートした。最終濃度20μMのPI63をAMP処理サンプルと未処理サンプルのそれぞれに添加し、暗所で37℃で30分間インキュベートした。Tecan Infinite® 200 PROプレートリーダーを用い、励起波長535 nm、発光波長615 nmで蛍光を測定した。

顕微鏡用サンプル調製。大腸菌をLB中、37℃で指数期まで増殖させ、新鮮なLBで108 cfu mL-1に希釈した。50μLの希釈細胞を1.5mLチューブにピペッティングし、50μLのAMPを20μMのPIとともに最終濃度4×MICで添加した。混合液を37℃で1時間、振盪しながらインキュベートした。1μLのサンプルをアガロースパッド（PBS中2％アガロース）にロードし、100倍のNeoFluor位相差対物レンズとFluoArc HBOランプを装備したZeiss AxioPlan 2正立広視野顕微鏡を用いて画像化した。PIの蛍光はTxRed HC Filter set (AHF, F36-504)を用いて記録した。

画像処理。位相差画像と蛍光画像を重ね合わせた。蛍光チャネルのダイナミックレンジは、バックグラウンド蛍光を除去するために最小125 AUに設定され、一方、位相差チャネルのコントラストは、より良好な可視化のために手動で調整された。異なる表現型を比較するため、232ピクセル×232ピクセルの関心領域を切り取った。生画像ファイルは本研究で提供される。

AMP処理後の大腸菌の外膜小胞（OMV）放出
大腸菌MG1655をMacConkey寒天培地（Carl Roth, Karlsruhe, Germany）プレート上で一晩培養した。一晩培養では、1コロニーを2mLのLB培地に接種し、37℃、160rpmで培養した（MaxQ 6000、Thermo Fisher Scientific、Karlsruhe、ドイツ）。菌培養液を10mLの新鮮なLB培地に移し、培養した（1時間、37℃、160rpm）。必要量の細菌を、1/4 MICのAMP#3、#5、#10、#13、#15、#16、#27で処理するか、コントロールのために未処理のままにするか、溶媒コントロールとして酢酸とBSAで処理した（90分、37℃、160rpm）。サンプルを遠心分離（4,500 x g、15分、4℃；Multifuge X3R、Thermo Fisher Scientific）し、上清を滅菌ろ過（0.22 µm）した後、100 kDa分子量カットオフフィルター（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を用いて20倍に濃縮した。放出された小胞の数を測定するために、サンプルは NanoAnalyzer (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK)64を用いたナノフローサイトメトリー(nFCM)で測定した。

AMPの化学的ペプチド合成
材料市販の試薬はすべて以下の会社から購入し、精製せずに使用した：Sigma Aldrich（米国）からチオアニソール（#T28002）、1,2-エタンジチオール（EDT、#8.00795）、N-メチル-2-ピロリドン（NMP、#M79603）；ピペリジン（#T6146）、プランジャー付き2mLポリプロピレンリアクター、フリットポアサイズ25μm（#7926. 1）（Carl Roth社製、ドイツ）；2,6-ルチジン（#10731354）、酢酸パラジウム（#441390010）、フェニルシラン、トリフルオロ酢酸（TFA、#293812500）（Acros社製、米国）；マイクロスケールカラム（#35.091）（Intavis社製、ドイツ）；Fmoc-Gly-OH（#FAA1050. 0100）、Fmoc-L-Asn（Trt）-OH（#FAA1015.0100）、Fmoc-L-Asp（tBu）-OH（#FAA1356.0100）、Fmoc-L-His（Trt）-OH（#FAA1090. 0100）、Fmoc-L-Ile-OH（#FAA1110.0100）、Fmoc-L-Met-OH（#FAA1150.0100）、Fmoc-L-Phe-OH（#FAA1175-0100）、Fmoc-L-Pro-OH*H20（#FAA1185. 0100）、Fmoc-L-Thr（tBu）-OH（#FAA1210.0100）、Fmoc-L-Tyr（tBu）-OH（#FAA1230.0100）、Fmoc-L-Val-OH（#FAA1245. 0100）、Iris Biotech社（ドイツ）のTentaGel S RAM樹脂（#S-30023）； Fmoc-L-Ala-OH-OH（＃05001）、Fmoc-L-Arg（Pbf）-OH（＃CC05005）、Fmoc-L-Cys（Trt）-OH（＃CC05009）、Fmoc-L-Gln（Trt）-OH（＃CC05012）、Fmoc-L-Glu（OtBu）-OH（＃CC05013）、Fmoc-L-Leu-OH（＃CC05017）、 Fmoc-L-Lys（Boc）-OH（＃CC05018）、Fmoc-L-Ser（tBu）-OH（＃CC05023）、Fmoc-L-Trp（Boc）-OH（＃CC05076）、Carbolution（Germany）からのN，N′-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、＃CC01002）、およびOxyma（＃CC01024）； Grüssing GmbH（ドイツ）からの無水酢酸（Ac2O）；ペプチドグレードのジメチルホルムアミド（DMF、＃1003976025）およびHPLCグレードのアセトニトリル（MeCN）（＃34851-2. 5 L）はMerck（ドイツ）から；タイプ1の超純水はTKA（ドイツ）のMicroPure Water Purification Systemで得た。

固相ペプチド合成。すべてのペプチドはFmoc-固相戦略で合成した。合成はINTAVIS ResPep SLi装置を用いた自動ペプチド合成機で5μmolスケールで行った。より多量のペプチドは、複数の5μmol合成を並行して行うことで達成した。全てのペプチドには、TentaGel S RAM (0.22 mmol/g)樹脂を使用した。

自動固相ペプチド合成（INTAVIS ResPep SLi）：

この合成プロトコルの条件、試薬、対応する容量は、5 µmolスケールの合成に対応する。インキュベーションや反応時間中に混合は行わなかった。カップリングステップでは、温度を40℃に設定した。

膨潤：適量の樹脂（23 mg）を200 µL DMF中で30分間膨潤させた。

時間Fmoc保護基の脱保護：ピペリジン（150μL、DMF中20%）を樹脂に添加し、5分間インキュベートした。このステップを繰り返し、樹脂を濾過し、DMF（1×300μL、3×225μL）で洗浄した。

アミノ酸のカップリング：混合バイアルに、対応するFmoc-アミノ酸（4 eq、0.5 M）を53 µL、Oxyma（4 eq、2 M）を15 µL、DIC（4 eq、2 M）をそれぞれDMF中13 µL、NMPを29 µL、装置が自動的に加えた。得られた溶液は、樹脂に添加する前に1分間待って活性化した。この懸濁液を15分間インキュベートした。次に樹脂を濾過し、カップリングを繰り返した。カップリング後の洗浄は行わなかった。

キャッピング： 150μLのルチジン/Ac2O/DMF 6:5:89溶液を樹脂に加え、8分間インキュベートした。樹脂を濾過し、DMFで洗浄した（3×225 µL）。

最後のカップリング後、樹脂をDMF（1×300 µL、3×225 µL）、エタノール（4×150 µL）およびCH2Cl2（5×150 µL）で洗浄した。最後に、樹脂を連続気流下で5分間乾燥させた。

最終的な切断、精製および特性評価：

アミノ酸側鎖の切断と脱保護：すべてのペプチドは、合成プロトコルの最後のステップに従って、あらかじめ5x DMFと10x CH2Cl2で洗浄した乾燥樹脂から切断した。Cys、Met、Trpの総数に応じて、補足表15の切断カクテルのいずれかを利用した。切断カクテルAは、完全合成後の最初のテスト切断として使用した65。切断後に酸化が観察された場合には、カクテルBを適用した66,67。5μmolの樹脂に対して、2mLの開裂カクテルを調製した。アルギニン残基を8個以上含むペプチドでは、総量を1.5倍に増やした。乾燥した樹脂をプランジャーで2mLの反応器に装填し、フリットを対応する混合物で処理し、2.5時間振とうして濾過した。樹脂を1mLのTFAで洗浄し、濾液を合わせた。濾液のTFA含量を緩やかな窒素流で減少させた。次に、氷冷ジエチルエーテル（DEE）（100μLのカクテルに対して1.00mLのDEE）を加え、最終ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離し（8000rpm、4℃、5分間）、上清を捨て、ペレットをもう一度洗浄した；すなわち再溶解し、冷DEEで沈殿させた。その後、ペプチドペレットを0.1％のTFAを含む超純水／MeCN（70：30）に溶解し（不溶性の場合はさらにMeCNを加え、1：1を超えない）、精製した。

精製：ペプチドは、分取Agilent 1260 Infinity II Series HPLC-system (Agilent Technologies)のカラム1を用いた逆相(RP)-HPLCで精製した（補足表16）。最初の5分間はカラムの平衡化のためにアイソクラティックな操作を行い、その後、25分間でそれぞれ指定されたリニアグラジエントを行った（グラジエントはそれぞれのペプチドで指定されている）。検出は、波長220nmと260nmの吸収を測定することで行った。溶離液には超純水（A）とMeCN（B）を用い、両溶媒に0.1％のTFAを添加した。

特性評価：凍結乾燥品は、Agilent 1260 Infinity II Series HPLC-system（Agilent Technologies社製）を用い、カラム2を用いた分析HPLC-MSにより同定した（補足表16）。検出は、波長 220 nm および 260 nm での吸収を測定することにより行った。溶離液には、0.05%のTFAを添加した超純水（A）および0.03%のTFAを添加したMeCN（B）を用いた。同定にはLTQ-FT Ultra装置（Thermo Fischer Scientific）を用いてHR-ESI-MSを行った。精製ペプチドのHPLCクロマトグラムを補足図8-34に示す。

データ収集/解析ツール
細菌増殖データ、PI蛍光、吸光度値は、Tecan Infinite 200 Proプレートリーダー、Magellan™標準ソフトウェアで収集した。外膜小胞はNanoAnalyzer (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK)とNanoFCMソフトウェア(NF Profession V1.08)を用いて収集した。画像はZeiss AxioPlan 2正立広視野顕微鏡とMetaMorphバージョン6.2r6ソフトウェアを用いて収集した。データはPython 3スクリプト、MS Excel 2021、GraphPad Prism v9、FiJi version 1.54 fを用いて解析した。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの入手可能性
本論文の研究を解釈、検証、拡張するために必要なデータは、読者に提供されている。本研究で使用されたトレーニングデータ、500のテストされたAMPの配列、本研究で作成された補足図4と5のデータは、https://github.com/amirpandi/Deep_AMP。本研究で作成した30個の機能的AMPの配列と図4aの元データは、補足情報（それぞれ補足表5と10）に記載されている。本研究で作成した図2b、図5a-d、補足図1、補足図2、補足図7の元データは、Source Dataファイルとして提供する。ソースデータは本論文とともに提供される。

コードの利用可能性
すべてのディープラーニングモデルは、Google Colab pro環境でPython 3.9を使用し、Keras 1.0とTensorFlow 2.0バックエンドを使用して構築、学習、テストされた。本研究で開発された深層学習コードとモデルは、https://github.com/amirpandi/Deep_AMP。MDシミュレーションのセットアップはhttps://doi.org/10.5281/zenodo.7327525。

参考文献
世界保健機関（WHO）. 10 Global Health Issues to Track in 2021. https://www.who.int/news-room/spotlight/10-global-health-issues-to-track-in-2021 (2020).

抗菌薬耐性協力者。2019年における細菌性抗菌薬耐性の世界的負担：系統的分析。Lancet 399, 629-655 (2022).

記事

Google Scholar

Miethke, M. et al. 新しい抗生物質の持続可能な発見と開発に向けて。Nat. Rev. Chem. 5, 726-749 (2021).

論文

パブメドセントラル

Google Scholar

抗菌ペプチド：進化に基づく応用。Science 368, eaau5480 (2020).

合成生物学の時代、抗菌ペプチドは次世代の抗生物質となるか？Antibiotics (Basel) 9, 484 (2020).

Ma, Y. et al. ディープラーニングを用いたヒト腸内細菌叢からの抗菌ペプチドの同定。Nat. Biotechnol. 40, 921-931 (2022).

論文

パブコメ

Google Scholar

Fjell, C. D., Hiss, J. A., Hancock, R. E. W. & Schneider, G. Designing Antimicrobial Peptides: Form follows Function. Nat. Drug Discov. 11, 37-51 (2011).

論文

PubMed

Google Scholar

Dijksteel, G. S., Ulrich, M. M. W., Middelkoop, E. & Boekema, B. K. H. L. Review：抗菌ペプチド（AMP）を用いた臨床試験から得られた教訓。Front. Microbiol. 12, 616979 (2021).

論文

PubMed

パブメッドセントラル

Google Scholar

Szymczak, P. et al. 深層生成モデルHydrAMPを用いた高活性抗菌ペプチドの発見。Nat. Commun. 14, 1453 (2023).

論文

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CAS

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パブメドセントラル

Google Scholar

Huang, P.-S., Boyken, S. E. & Baker, D. The coming of age of de novo protein design. Nature 537, 320-327 (2016).

論文

ADS

CAS

PubMed

Google Scholar

タンパク質設計における最近の進歩：原理、方法、応用。J. Biol. Chem. 296, 100558 (2021).

論文

パブメドセントラル

Google Scholar

Dauparas, J. et al. ProteinMPNNを用いたロバストな深層学習ベースのタンパク質配列設計。Science 378, 49-56 (2022).

ProtGPT2はタンパク質設計のための教師なし深層言語モデルである。Nat. Commun. 13, 4348 (2022).

論文

ADS

CAS

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パブメドセントラル

Google Scholar

タンパク質言語モデルの境界を探る：タンパク質言語モデルの境界を探る。

Strokach, A. & Kim, P. M. Deep Generative Modeling for protein design. Curr. Opin. Struct. Biol. 72, 226-236 (2022).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Li, F. et al. ディープラーニングに基づくkcat予測により、酵素制約モデルの再構築が可能になった。Nat. Catal. 5, 662-672 (2022).

論文

CAS

Google Scholar

抗菌ペプチド生成のための変分オートエンコーダ。ACS Omega 5, 20746-20754 (2020).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

抗菌性エプタイドの生成と活性予測のための変分オートエンコーダーフレームワーク。Front. Microbiol. 12, 725727 (2021).

論文

パブメドセントラル

Google Scholar

Wang、C., Garlick、S. & Zloh、M. 新規抗菌ペプチド設計のためのディープラーニング。Biomolecules 11, 471 (2021).

Das,P.ら、深層生成モデルと分子動力学シミュレーションによる抗菌薬探索の高速化。Nat. Biomed. Eng. 5, 613-623 (2021).

論文

CAS

パブコメ

グーグル奨学生

Garenne, D. et al. 無細胞遺伝子発現。Nat Rev Methods Primers 1, 49 (2021).

Silverman, A. D., Karim, A. S. & Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat. Rev. Genet. 21, 151-170 (2020).

論文

CAS

Google Scholar

ポータブルなオンデマンド生体分子製造。Cell 167, 248-259.e12 (2016).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

ホーキンス-フッカー（Hawkins-Hooker）ら、変分オートエンコーダによる機能的タンパク質変異体の生成。PLoS Comput. Biol. 17, e1008736 (2021).

論文

パブメドセントラル

グーグル奨学生

植物病原性細菌に対する殺菌活性を有する直鎖状ウンデカペプチドのライブラリー。Peptides 28, 2276-2285 (2007).

論文

PubMed

Google Scholar

Jarvis, D. L., Summers, M. D., Garcia, A. Jr & Bohlmeyer, D. A. バキュロウイルス系におけるヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの発現および分泌における異なるシグナルペプチドおよびプロシーケンスの影響。J. Biol. Chem. 268, 16754-16762 (1993).

論文

パブコメ

Google Scholar

翻訳開始はリボソームドラフト機構を介してRNAフォールディング動態によって制御される。J. Am. Chem. Soc. 138, 7016-7023 (2016).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

タンパク質の発現を制御するための合成リボソーム結合部位の自動設計。Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Jumper, J. et al. AlphaFoldによる高精度タンパク質構造予測。Nature 596, 583-589 (2021).

論文

ADS

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Konur、O. Algal Science, Technology and Medicineハンドブック（Academic Press、2020年）。

Rodloff, A. C., Goldstein, E. J. C. & Torres, A. イミペネム療法の20年。J. Antimicrob. Chemother. 58, 916-929 (2006).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

分泌細菌外膜小胞の生物学的機能と生合成。Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Bauwens, A., Kunsmann, L., Karch, H., Mellmann, A. & Bielaszewska, M. 腸管出血性大腸菌O104:H4およびO157:H7における外膜小胞の抗生物質による修飾。Antimicrob. Agents Chemother. 61, e00937-17 (2017).

Manning, A. J. & Kuehn, M. J. Contribution of bacterial outer membrane vesicles to innate bacterial defense. BMC Microbiol. 11, 258 (2011).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Lavickova, B. & Maerkl, S. J. PURE無細胞系を製造するためのシンプルで頑健かつ低コストな方法。ACS Synth. Biol. 8, 455-462 (2019).

論文

CAS

グーグル・スカラー

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C. & Maerkl, S. J. OnePot PURE無細胞システム。J. Vis. Exp. 172, e62625 (2021).

Google Scholar

UniProt Consortium. UniProt：2021年の普遍的タンパク質知識ベース。Nucleic Acids Res. 49, D480-D489 (2021).

論文

Google Scholar

Witten, J. & Witten, Z. Deep learning regression model for antimicrobial peptide design. bioRxv 692681 (2019).

Wang, G., Li, X. & Wang, Z. APD3: the antimicrobial peptide database as a tool for research and education. Nucleic Acids Res. 44, D1087-D1093 (2016).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

DADP: the database of anuran defense peptides. Bioinformatics 28, 1406-1407 (2012).

論文

PubMed

Google Scholar

DBAASP v.2: A enhanced database of structure and antimicrobial/cytotoxic activity of natural and synthetic peptides. Nucleic Acids Res. 44, 6503 (2016).

論文

PubMed

PubMedセントラル

Google Scholar

DRAMP: a comprehensive data repository of antimicrobial peptides. Sci. Rep. 6, 1-7 (2016).

Google Scholar

YADAMP：抗菌ペプチドのデータベース。Int. J. Antimicrob. Agents 39, 346-351 (2012).

論文

パブコメ

Google Scholar

UniProt. https://www.uniprot.org/help/uniprotkb.

Ghorbani, M., Prasad, S., Brooks, B. R. & Klauda, J. B. Deep attention based variational autoencoder for antimicrobial peptide discovery. bioRxiv 2022.07.08.499340 (2022).

Bowman, S. R. et al. 連続空間からの文の生成. arXiv 1511.06349 (2015).

Abraham, M. J. et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX 1-2, 19-25 (2015).

論文

ADS

グーグル・スカラー

Huang, J. et al. CHARMM36m：折りたたみタンパク質および本質的に無秩序なタンパク質のための改良された力場。Nat. Methods 14, 71-73 (2017).

論文

PubMed

Google Scholar

Hess, B., Bekker, H., Berendsen, H. J. C. & Fraaije, J. G. E. M. LINCS：分子シミュレーションのための線形制約ソルバー。J. Comput. Chem. 18, 1463-1472 (1997).

論文

CAS

Google Scholar

Essmann、U.ら、平滑粒子メッシュEwald法。J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).

論文

ADS

CAS

Google Scholar

Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. 速度再スケーリングによる正準サンプリング。J. Chem. Phys. 126, 014101 (2007).

論文

ADS

PubMed

Google Scholar

Berendsen, H. J. C., Postma, J. P. M., van Gunsteren, W. F., DiNola, A. & Haak, J. R. 外部浴との結合を用いた分子動力学。J. Chem. Phys. 81, 3684 (1984).

論文

ADS

CAS

Google Scholar

Parrinello, M. & Rahman, A. Polymorphic Transitions in Single Crystals: a new molecular dynamics method. J. Appl. Phys. 52, 7182 (1998).

論文

ADS

Google Scholar

VMD: visual molecular dynamics. J. Mol. Graph. 14, 33-38 (1996).

論文

パブコメ

Google Scholar

Schrödinger, L., & DeLano, W. PyMOL. http://www.pymol.org/pymol (2020).

UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30, 70-82 (2021).

論文

PubMed

Google Scholar

Schaefer, S. L., Jung, H. & Hummer, G. SARS-CoV-2融合ペプチドの宿主エンドソームおよび細胞膜への結合。J. Phys. B 125, 7732-7741 (2021).

論文

PubMedセントラル

Google Scholar

細胞膜は、脂質の不飽和度、パッキング、タンパク質の形状において非対称である。Nat. Chem. Biol. 16, 644-652 (2020).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

大腸菌の両膜と抗菌ペプチドポリミキシンB1の相互作用：分子動力学法による研究。PLoS Comput. Biol. 11, e1004180 (2015).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

CHARMM-GUI: a web-based graphical user interface for CHARMM. J. Comput. Chem. 29, 1859-1865 (2008).

論文

パブコメ

Google Scholar

分子動力学シミュレーションのためのタンパク質・膜複合体の自動ビルダーとデータベース。PLoS One 2, e880 (2007).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W. & Klein, M. L. 液体水のシミュレーションのための単純なポテンシャル関数の比較。J. Chem. Phys. 79, 926 (1983).

論文

ADS

CAS

グーグル奨学生

Blaskovich, M. A. T. et al. バンコマイシン耐性菌およびダプトマイシン耐性菌に対して活性を示す、タンパク質にヒントを得た抗生物質。Nat. Commun. 9, 22 (2018).

論文

ADS

パブコメ

Google Scholar

Ponath, V. et al. NK細胞受容体NKp30の分泌リガンド：B7-H6は、BAG6とは対照的に、細胞外小胞を介してわずかに放出されるのみである。Int. J. Mol. Sci. 22, 2189 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Fmoc固相ペプチド合成後の副反応を最小化する切断法。Int. J. Pept. Protein Res. 36, 255-266 (1990).

論文

PubMed

Google Scholar

ペプチドの研究．CLV. ペプチド合成におけるトリメチルシリルブロマイドの硬酸脱保護試薬としての評価. Chem. Pharm. Bull. 35, 3880-3883 (1987).

論文

CAS

Google Scholar

Pearson, D. A., Blanchette, M., Baker, M. L. & Guindon, C. A. Trialkylsilanes as scavengers for the trifluoroacetic acid deblocking of protecting groups in peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 30, 2739-2742 (1989).

論文

CAS

Google Scholar

Yin, Y. W. & Steitz, T. A. T7 RNAポリメラーゼにおける開始転写から伸長転写への移行の構造基盤。Science https://doi.org/10.2210/pdb1msw/pdb (2002).

大腸菌リボソームの高分解能構造。Nat. Struct. Mol. Biol. https://doi.org/10.2210/pdb5it8/pdb (2016)。

参考文献のダウンロード

謝辞
本研究は、A.P.への欧州分子生物学機構（EMBO）長期博士研究員奨学金（ALTG 165-2020）、T.J.E.へのマックス・プランク協会およびゴードン・アンド・ベティ・ムーア財団（https://doi.org/10.37807/GBMF10652）、F.A.へのドイツ研究評議会DFG; AB 792/1-1 (423428279)の支援を受けている、ドイツ研究評議会TRR81：「分化および悪性腫瘍におけるクロマチン変化」TRR81/3, Z04 (109546710)からV.T.T.およびO.V.、連邦教育研究省（Bundesministerium für Bildung und Forschung）からPermedCOPD - FKZ 01EK2203A; ERACoSysMed2-SysMed-COPD-FKZ031L0140、ドイツ研究振興財団（Deutsche Forschungsgemeinschaft）からSFB/TR-84 TP C01からB.S、 S.L.S.とG.H.は、ヘッセン州科学芸術省の資金援助によるClusterprojekt ENABLE、ドイツ研究財団（DFG）の資金援助による共同研究センター1507による財政的支援を受け、計算資源についてはMax Planck Computing and Data Facility (MPCDF)に感謝する。M.K.は、INRAeのMICA部門、Université Paris-Saclay、Ile-de-France（IdF）地域のDIM-RFSI、ANR DREAMY（ANR-21-CE48-003, ANR iCFree grant (ANR-20-BiopNSE)）からの資金援助に感謝する。R. Weiss、P. Wichmann、A.M. Küffner、S. Scholz、R. Inckemann、C. Diehl、A. Yazdizadeh Kharrazi、J. Zarzycki、H. Heには、技術的および実験的なサポートと有意義な議論に感謝する。図1dでは、PDB構造1MSW68と5IT869を使用し、Biorender.comで編集した。図はBiorender.comで作成した。

資金提供
Projekt DEALによるオープンアクセス資金提供。

著者情報
著者および所属
ドイツ、マールブルグ、マックス・プランク陸上微生物学研究所、生化学・合成代謝学科

アミール・パンディ、デヴィッド・アダム、アミール・ザレ、エリザヴェータ・ボブコヴァ、イェガネ・フォロギジャバリ、トビアス・J・エルブ

ドイツ連邦微生物学研究所（ドイツ・ミュンヘン

デイヴィッド・アダム、ペーター・ブラウン、ハイナー・フォン・ブットラー

ドイツ・マールブルク・フィリップス大学化学部

ヴァン・トゥアン・トリン、フランク・アベンドロス、オララ・バスケス

マックス・プランク生物物理学研究所理論生物物理学部門、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ

シュテファン・L・シェーファー＆ゲルハルト・フンマー

ギーセン大学肺研究所、マールブルグ肺センター、マールブルグフィリップス大学、ドイツ肺研究センター（DZL）、ドイツ・マールブルグ

Marie Burt、Björn Klabunde、Wilhelm Bertrams、Anna Lena Jung & Bernd Schmeck

パリ・サクレー大学、INRAe、アグロパリテック、ミカリス研究所（フランス、ジュイ＝アン＝ジョザス

マニッシュ・クシュワハ

ドイツ感染研究センター（DZIF）、ミュンヘン、ドイツ

ペーター・ブラウン＆ハイナー・フォン・ブットラー

フラウンホーファーITMP免疫・感染・パンデミック研究所（ドイツ・ミュンヘン

ペーター・ブラウン

マックス・プランク陸上微生物学研究所、生物間相互作用における天然物部門、ドイツ・マールブルク

クリストフ・スパーン＆ヘルゲ・B・ボーデ

腫瘍免疫学研究所、腫瘍生物学・免疫学センター、マールブルグ・フィリップス大学、ドイツ・マールブルグ

クリスティアン・プレウザー & エルケ・ポッゲ・フォン・シュトランドマン

細胞外小胞コア・ファシリティ、マールブルグ大学腫瘍生物学・免疫学センター、マールブルグ、ドイツ

クリスティアン・プレウザー＆エルケ・ポッゲ・フォン・シュトラントマン

ゲーテ大学フランクフルト校バイオサイエンス学部分子バイオテクノロジー学科（ドイツ・フランクフルト・アム・マイン

ヘルゲ・B・ボーデ

ドイツ・マールブルグフィリップス大学化学・生物学科

ヘルゲ・ボーデ

ドイツ、フランクフルト、ゼンケンベルク自然研究センター

ヘルゲ・B・ボーデ

SYNMIKRO合成微生物学センター（ドイツ・マールブルク

ヘルゲ・ボーデ、ベルント・シュメック、オララ・バスケス、トビアス・J・エルブ

フローサイトメトリー-バクテリアベシクルコアファシリティー、マールブルグ大学、マールブルグ、ドイツ

アンナ・レナ・ユング & ベルント・シュメック

ドイツ・マールブルク・フィリップス大学・マールブルク大学医療センター・呼吸器・クリティカルケア医学科

ベルント・シュメック

肺衛生研究所（ILH）、ギーセン、ドイツ

ベルント・シュメック

ドイツ感染症研究センター（DZIF）メンバー、ドイツ・マールブルク

ベルント・シュメック

ゲーテ大学生物物理学研究所（ドイツ、フランクフルト・アム・マイン

ゲルハルト・フンマー

貢献
T.J.E.とA.P.が本研究を考案し、原稿を執筆した。A.Z.はディープラーニングコードとシミュレーションを開発し、対応するメソッドセクションを執筆し、BLAST解析を行った。A.P.とY.F.は無細胞タンパク質合成と初期生理活性試験を行った。M.K.はRBS計算とkinfold計算を行った。S.L.S.は分子動力学シミュレーションを行い、G.H.とともに解析し、対応する方法と結果のセクションを執筆した。A.P.、D.A.、B.K.、P.B.およびH.v.B.は、MIC試験、溶血試験および細胞毒性試験の実施と解析を行った。V.T.T.は、自動固相による化学的ペプチド合成と分析を行い、対応する方法のセクションを執筆した。A.P.、E.B.、C.S.は作用機序アッセイを実施し解析した。M.B.は外膜小胞実験の実施と解析を行い、対応する結果と方法のセクションを執筆した。C.P.はOMV定量法を確立し、細胞外小胞コア施設でOMV定量を行った。E.P.v.S.、H.B.B.、H.v.B.、W.B.、A.L.J.、F.A.、B.S.、G.H.、O.V.、T.J.E.が監修した。すべての著者が原稿に意見を寄せ、最終原稿を確認した。

対応著者
Amir PandiまたはTobias J. Erbまで。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、Marnix Medema氏と他の匿名の査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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この記事の引用
Pandi, A., Adam, D., Zare, A. et al. Cell-free biosynthesis combined with deep learning accelerates de novo-development of antimicrobial peptides. Nat Commun 14, 7197 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42434-9

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受領
2023年7月21日

受理
2023年10月10日

掲載
2023年11月08日

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https://doi.org/10.1038/s41467-023-42434-9

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