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培養とトランスフェクション： 原虫の生態を理解するための2つの大きなボトルネック

哉百名


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MINI REVIEWの記事
Front. マイクロビオール、2023年4月4日
第2章 感染症と病気
第14巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1144453
この記事は、「研究テーマ」の一部です。
Neglected Tropical Infectious Diseasesのレビューです。
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培養とトランスフェクション： 原虫の生態を理解するための2つの大きなボトルネック

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1144453/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit


Sanju Kumari、Abhinav Sinha*。
ICMR-国立マラリア研究所、ニューデリー、インド
Plasmodiumの長期in vitro培養は、1976年にTragerとJensenによって成功したが、P. vivaxではほとんど達成されていない。しかし、Plasmodium vivaxの試験管内培養はまだほとんど達成されていません。Plasmodium vivaxの試験管内培養の大きな障害は、若い網状赤血球に侵入する傾向があり、侵入した網状赤血球の複雑なリモデリングを引き起こすことです。このような原虫の好みや、原虫と侵入した網状細胞との間の宿主-寄生虫相互作用については、多くの要因が検討されているところである。例えば、侵入後の網状細胞の浸透圧の安定性の低下、網状細胞中の鉄分の多さがP. vivaxの成長と増殖に有利であること、P. vivaxのin vitro成長における低酸素環境の役割など、寄生虫、宿主、環境に関する様々な要因がある。P. vivaxの血液ステージのトランスフェクションは、この寄生虫の複雑な生物学を理解するためのもう一つの大きなハードルである。この寄生虫を遺伝子組換えによって分子生物学的に研究するための努力は限られている。P. vivaxのユニークな生物学を理解するために、より長いin vitro培養を維持し、トランスフェクション技術を進歩させる新しいアプローチが緊急に必要である。
背景
Plasmodium vivaxは、Plasmodium falciparumに次いでマラリアによる死亡率および罹患率が高い、最も普及しているPlasmodium種である。世界保健機関（2021年）によると、世界における推定P.vivax症例の割合は2000年の8％から2020年には2％に減少したものの、WHO南東アジアおよび西太平洋地域ではP.vivaxが全マラリア症例のそれぞれ推定36％と30％に寄与しています。2020年のブータン、韓国、ミャンマー、ネパール、タイでは、依然として優勢な種（現地症例の50％以上）です（世界保健機関、2021）。P. vivaxに関連する重症マラリアや死亡例の報告により、Plasmodium vivaxが臨床的に注目を集めたのはここ10年来のことです（Kochar et al., 2005, 2009; Baird, 2007; Price et al., 2007; Anstey et al., 2009; Alexandre et al., 2010; Costa et al., 2011; Douglas et al. 2013, 2014; Patriani et al., 2019）。また、マラリア原虫vivaxは、そのほとんどが慢性的で再発する症状のため、マラリア撲滅・根絶の大きな障壁となると考えられています。臨床的・公衆衛生的に非常に重要であるにもかかわらず、P. vivaxが研究に値するほど注目されていないのは、主に、この寄生虫の臨床および基礎生物学の理解における2つの大きなボトルネック-血液段階の長期in vitro培養の欠如と遺伝子操作のためのトランスフェクション技術の最適化されていない開発-があるためである。そこで、本総説では、この2つの難関に関する最新情報に焦点を当て、難関を突破するための潜在的な方法を提案する。
原虫の生物学的背景
原虫のライフサイクルと生態は、他の原虫とは異なっている（図1）。その特徴は、(i)胞子虫は肝細胞内で下生子と呼ばれる休眠形態に発達する（Cogswell, 1992）、(ii)P．vivax merozoitesは他の原虫と異なり網状赤血球を好む（Field and Shute, 1956）ため、寄生率が著しく低いこと、（iii）臨床症状が現れる前に末梢血中に球形の配偶子が存在すること（Boyd and Kitchen, 1937）、（iv）末梢血中にすべての血液期の発生形態（リング、栄養体、シゾントおよび配偶子細胞）が存在する。ただし、成熟期であるトロフォゾイトとシゾントは、未成熟期よりも末梢血中に少ない（Rudolf and Ramsay, 1927; Field and Shute, 1956; Lopes et al., 2014）。


図1
図1. 原虫のライフサイクル。(a) Anopheles属の蚊が原虫の胞子虫をヒトの皮膚の真皮に接種し、血流に移行して最終的に肝臓に侵入する。肝臓では、原虫の胞子虫は分裂体か、数ヶ月から数年後に活性化して子虫を放出する低分子化体と呼ばれる休眠体に分化します。肝原虫は血流中の網状赤血球に侵入し、カベオラ様複合体の形成を開始し、血中分裂の完了に寄与する。無性寄生虫の一部は配偶子形成を受けて丸みを帯びた配偶子細胞を形成し（感染4日後）、別のAnopheles蚊によって血液食事とともに吸い上げられる（Bourgard et al.、2018）。Plasmodium vivaxのin vitro培養に関連する2つの主要な障害が、図に赤いマークで示されています。これらは以下の通りです： (A）網状赤血球の成熟： 網状細胞は、in vitro条件下で急速に成熟する（Malleretら、2015）。(B）浸潤の喪失： 原虫vivaxのメロゾイトは、数サイクル後にin vitroで未感染の網状赤血球に侵入する能力を失う（Bermudez et al.、2018年）。(b）蚊に取り込まれた雄性配偶子細胞と雌性配偶子細胞は、蚊の中腸で雄性配偶子と雌性配偶子に分化し融合して接合子を形成する。接合体は運動性のあるオキネートに分化し、中腸上皮を通過してさらに分裂してオーシストを形成する。オーシストは破裂して数百個の胞子虫を放出し、唾液腺を通過して、蚊に刺されたときに新しい宿主に感染します（Mueller et al., 2009）。
感染した雌のAnopheles蚊に刺されると、胞子虫は30分以内に皮膚から肝臓に移動し、肝細胞に感染して成熟し、活発に分裂する肝内分裂体または不活性な下生子（図1、Krotoski、1985）を形成する。この次亜細亜菌は数ヶ月から数年間静止状態にあり、血流に乗った後、臨床的な再発を引き起こす。下生子の活性化の原因は解明されていないが、寄生虫や細菌の感染が考えられる（Shanks and White, 2013）。P. vivaxとP. falciparumの両方が存在する共蔓延地域では、P. falciparum治療後にP. vivax寄生虫血症の高いリスクが観察された（Douglas et al., 2011; Commons et al., 2019）。Commonsらが行ったメタ分析では、P. falciparum感染症の治療63日後、P. vivax再発のリスクは24％であり、寄生虫学的再発のほぼ70％を占めることが示されました。しかし、P. falciparum感染症の治療後にP. vivaxの寄生リスクが高まるメカニズムはまだ不明で、P. vivaxの低ノゾイトが再発する可能性があると仮定されています（Hossain et al., 2020）。
P. vivaxのもう一つのユニークな特徴は、宿主細胞として網状細胞を好むことである（Kitchen, 1938）。網状赤血球は全赤血球の1〜2％を占め、これがP. vivax感染者における寄生虫血症の低さの原因であると考えられる。網状赤血球は赤血球よりも大きいため（Riley et al., 2001）、P. vivax感染細胞は、末梢血塗抹標本に存在する未感染/P. falciparum感染赤血球と比較して大きく見える。P.vivaxは宿主細胞内で発生期に特異的なタンパク質を産生し、宿主細胞膜に裂け目のような構造を作り、カベオレ-小胞複合体がギムザ染色で小さな点のように見えることから、シュフナー点と呼ばれています（Aikawa et al, 1975; Mueller et al, 2009; Akinyi et al, 2012; Gunalan et al, 2020）．これらの点の生物学的な役割はまだほとんど解明されていないが、これらの点はP. vivaxの培養中に目立たない（Gunalan et al.、2020）。
P. vivaxの特徴として、この寄生虫に感染した赤血球のアメーバ状（細胞質に指のような突起がある）が挙げられる（Suwanarusk et al.、2004）。Suwanaruskら（2004）は、P. vivaxに感染した赤血球（Pv-iRBC）が変形性を増し、脾臓の類洞を容易に通過できることを実験的に示しました。Pv-iRBCの変形能の増加は、脾臓からのクリアランスを回避する方法であると考えられる（Suwanarusk et al., 2004; Handayani et al., 2009）。さらに、このことは、末梢血中のすべての寄生虫ステージの通過につながるかもしれない（Suwanarusk et al.、2004）。末梢血中に全ステージが存在し、P. vivaxに接着ノブがないことから、細胞接着がなく、深い毛細血管に封じ込められると考えられた。しかし、脾臓（del Portillo et al., 2004）や肺（Anstey et al., 2007）への細胞接着を示唆する報告は少なく、P. vivaxにおける隔離や細胞接着の有無は、依然としてドグマである。Fieldら（1963）は、P. vivax感染者の末梢血から分裂片が消失したことから、P. vivaxの隔離を提案した（Fieldら, 1963）。また、最近の報告では、末梢血中のシゾントが存在しないか、非常に少ないことが報告されている（Lopes et al.） さらに、骨髄におけるシゾントと配偶子の蓄積も観察された（Baro et al.、2017）。P. vivax感染者の血漿中に存在する細胞外小胞（EV）は、感染網状赤血球のヒト脾臓線維芽細胞（hSF）への接着を促進する寄生虫タンパク質を含んでいます。ヒト脾臓線維芽細胞は、P.vivax感染EVを取り込むと、転写因子NF-kBが結合してICAM1の発現を誘導する（NF-kBは細胞質から核に移行する）。hSFs膜上のICAM-1の発現が増加すると、脾臓微小血管系で寄生虫が細胞接着し増殖する網状細胞の隔離が容易になる（戸田ら、2020）。この報告は、P. vivaxの細胞接着と隔離の仮説をさらに支持するものである。
しかし、この原虫は、細長い配偶子を持つPlasmodium falciparumとPlasmodium reichenowi (Mueller et al., 2009)を除くほとんどの原虫属と同様に、円形の配偶子を含んでいます。また、P.vivaxの配偶子は感染後4日目以降に出現し、臨床症状発現前に末梢血で観察できることも臨床的に重要な特徴である（Mueller et al.、2009年）。この報告から、配偶子の生成は第一世代のメロゾイトから始まる可能性が示唆されている（McKenzie et al.、2002）。しかし、いつ性行為が始まるかはまだ不明である。
熱帯熱マラリア原虫のin vitro培養
連続的な長期in vitro培養（Plasmodium falciparum, Plasmodium knowlesi, and Plasmodium cynomolgi）は、寄生虫のライフサイクルや侵入プロセスを詳細に理解するための重要なツールであることが証明されています（Trager and Jensen, 1976; Kocken et al., 2002; Grüring et al., 2014; Chua et al., 2019）．しかし、このような長期間のin vitro培養のためのシステムは、Plasmodium vivaxには存在しない。Plasmodium vivaxの継続的な増殖と成長を可能にする方法を開発すれば、Plasmodium vivaxマラリアの分子的詳細を探求する新たな研究機会を私たちに提供することができます。ここでは、P. vivax血液期培養の限界と研究上の問題点を詳しく説明しました。さらに、vivaxマラリア研究者が開発・探求している別の研究手段についても触れています。
P. vivaxの試験管内培養に初めて成功したのは1912年である（Bass and Johns, 1912）。しかし、この寄生虫を増殖させるための詳細なプロトコルが確立されたのは1970年代半ばになってからである（Trager and Jensen, 1976）。それ以来、培養液、寄生虫由来、網状赤血球由来を変更することにより、培養条件を改善するためにいくつかの改良が試みられ、最近、他の人々によって詳細にレビューされている（Bermudezら、2018；Thomson-Luqueら、2019）。P. vivax培養の最適化に向けた主要な開発を表す年表を図2に示しました。主要な開発では、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、L-グルタミン、HEPES（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid）およびヒポキサンチンとともに新世界サル（Saimiri boliviensis）血液を用いて、P. vivax培養が233日間継続的に維持されています（寄生率 0.1%）（Mehlotra et al, 2017）．この研究は、P. vivax培養の長期培養はもう不可能ではないという信念につながる。しかし、ヒト末梢血を用いたさらなる検証が必要である。

図2
図2. P. vivaxのin vitro培養に向けた主な開発状況を表した年表。[14]: Bass and Jones (1912) [108]： Siddiqui (1979) [68]： Larrouyら（1981） [12]： バーンウェルら(1989) [82]： モンス(1990) [67]： ランナーズ(1992) [120]： ウドムサンペッチら（2007）［102］： Russell et al. (2011) [16]： Borlon et al. (2012) [41]： フェルナンデス＝ベセラら（2013）［100］： Roobsoongら(2015) [109]： シンら（2015）[107]： Shaw-Salibaら（2016）［78］： Mehlotraら(2017)。
P. vivaxを培養するための継続的な努力にもかかわらず、主に、寄生虫の侵入効率、すなわち網状赤血球に侵入して感染を確立できる感染性メロゾイトの割合が徐々に失われるため、依然として困難です（Thomson-Luqueら、2017；Bermudezら、2018；Gunalanら、2020）。しかし、寄生虫の侵入効率が低下する生物学的根拠は、まだ明らかではありません。宿主、寄生虫、環境因子を考慮した徹底的な解析が必要である。ここでは、これら3つの要因について詳しく理解することを試みた。
宿主要因
Plasmodium vivaxは、その成長と増殖に宿主の網状赤血球を必要とする（Bass and Johns, 1912; Mons, 1990）。網状赤血球は、成熟赤血球（6-8mm）よりやや大きい（10-15mm）前駆体赤血球で、残存RNAの網目状ネットワークを有している。HeilmeyerとWesthauserは、supravital染色した血液塗抹標本で網状赤血球の多様な性質を観察し、4つのクラス（I-IV）に分類した。核を持たない非常に若い網状赤血球は、他の小器官とともにRNAの密集したまとまった塊を持ち、ハイルマイヤーのクラスI（HCI）網状赤血球と呼ばれています。さらに成熟した網状細胞は、元の密な塊の代わりにRNAの網目状のネットワークを持ち、HCII網状細胞と呼ばれます。HCIII網状体では、分散したRNAの量が少なくなります。RNAの残骸が分散した最も成熟した網状体はHCIV網状体と呼ばれる（Heilmeyer and Westhäuser, 1932）。HCIとHCIIの初期網状赤血球が骨髄に存在するのに対し、HCIII網状赤血球は主に骨髄に存在し、HCIVは末梢血に存在する最も一般的な網状赤血球の形態である（Seip、1953）。初期の網状赤血球は大きく、硬く、不規則な形をしていますが、成熟した網状赤血球は小さくなり、両凹の形になります（Malleret et al.、2013）。網状赤血球は循環するヒト赤血球のわずか1～2％を占め、寿命は～4日：骨髄で3日、循環で24時間と短い（Kaufman、2017）。
網状赤血球の成熟は、トランスフェリン受容体（CD71）の発現低下によって示されます（Kono et al., 2009; Malleret et al., 2013）。未熟なCD71+網状赤血球（HC0、I、II、III）の大部分は骨髄に限定され、末梢血に存在するCD71-細胞（HCIV網状赤血球または赤血球）およびCD71+網状赤血球の少数集団と比較してP. vivaxに対してより侵襲性を維持します（Malleret et al., 2015）. CD71は、P. vivax Duffy-binding protein/Duffy antigen receptor for chemokines channel（Kanjeeら、2021）とともに、寄生虫リガンド、PvRBP2b（Gruszczykら、2018）を介してP. vivaxによる侵入に重要な網状赤血球受容体となることが示されてきた。CD71+網状赤血球における優先的な侵入は、未熟な網状赤血球が、寄生虫の成熟に必要な鉄やその他の代謝物（Thomson-Luque and Bautista, 2021）を豊富に含んでいるからかもしれない。未熟な網状赤血球はヘモグロビンを合成し、全ヘモグロビンの～20％～30％がこの段階の赤血球で合成される（Riley et al., 2001）。しかし、Malleretらは、P. vivaxが生体外で網状赤血球の急速な成熟を誘導することを明らかにし、未熟な網状赤血球の連続的な変形から身を守るためと考えられる（Malleretら, 2015）。その後、Limらは、初期段階の寄生虫が網状赤血球に常に存在することを確認し、赤血球の成熟が生体内でそれほど急速に起こらないことを確認した（Lim et al., 2016）。しかし、成熟したP. vivaxと成熟した網状赤血球の間の特異的なクロストークを理解することは、P. vivaxの長期のin vitro培養に影響を与える可能性がある。
CD71（トランスフェリン受容体1）は鉄輸入タンパク質であり、トランスフェリンと結合した鉄を網状赤血球の内部に取り込む（Jandl et al.、1959）。興味深いことに、血色素症患者から分離された網状赤血球は、全赤血球の14％～17％を占め、臍帯網状赤血球の6.9％～7.9％と比較しています（Udomsangpetch et al.、2007）。ヘモクロマトーシスは、組織や器官への過剰な鉄の蓄積を特徴とする遺伝性疾患であり（Andrews et al.、1999）、瀉血は血液中の過剰な鉄を除去するため、ヘモクロマトーシスの有効な治療法である。瀉血後は、ヘモグロビン濃度や血清鉄濃度が低下し、骨髄が非常に活性化するため、赤血球の損失を補うために網状赤血球が増加し、網状赤血球の成熟速度が遅くなります（Conrad et al., 1962; Gildersleeve et al., 1985; Feeney et al., 2005）。さらに、寄生虫の負担が少ないにもかかわらず、P.vivax感染の場合、重度の貧血を示す報告もある（Mohapatra et al., 2002; Collins et al., 2003; Kenangalem et al., 2016; Punnath et al., 2020）。その理由の1つは、P. vivaxがその成長と生存のために多くの鉄を必要とし、その結果、宿主の鉄不足と最終的な貧血を引き起こす可能性があることである。現在までにP. vivaxの培養に最も成功した試みの1つであるGolendaらは、ヘモクロマトーシス患者の網状赤血球を用い、各サイクル後に寄生率が約2倍増加し、他の方法と比較して高いことが確認されています（Panicakulら、2007；Noulinら、2012、2014）。Shaw-Salibaらによる最近の報告によると、P. vivaxは新鮮な血色素症患者の血液から分離した網状赤血球に対して著しい選好性を示した。彼らは、キャンドルジャー（～18％の酸素；Shaw-Salibaら、2016）において、20％のAB+熱不活性化血清、6％のヘマトクリットを補充したMcCoyの5A培地を使用して、最大1.8％の寄生虫症を達成しました。注目すべきは、Golendaらは遠心分離ステップ後に網状赤血球数の5倍増を達成したのに対し、Shaw-Salibaらは出発血色素症血液から最大3倍増の網状赤血球を得ることができた。これは、ヘモクロマトーシス患者の治療手順の違い、出血回数の違い、瀉血の違いによる網状赤血球数の違いのためかもしれません」（Shaw-Saliba et al.、2016）。総じて、ヘモクロマトーシス患者の血液から分離された網状赤血球は、他の血液源と比較してP. vivax感染に対する侵襲性が高いままであると思われるが、これはおそらくヘモクロマトーシス血液中の豊富な鉄と多くのCD71+網状赤血球の数が原因である（Conrad et al, 1962; Gildersleeve et al, 1985; Feeney et al., 2005）.
Gunalanらによる最近の報告では、様々な培養条件/ステップにおいて、骨髄と比較して高い周囲酸素による酸化ストレスが、P. vivaxの増殖に悪影響を及ぼす可能性が示唆された。さらに、網状赤血球の高いグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）含有量（赤血球の成熟に伴い減少）は、この酸化ストレスを打ち消し、したがってP. vivaxの増殖に適した微環境を提供します（Luzzatto、2006； Wilson他、2016； Gunalan他、2020）。しかし、グルタチオン、アスコルビン酸、セレン、ピルビン酸、リポ酸などの抗酸化物質の補充は、P. vivaxの増殖を改善しない。さらに、低酸素を模倣した条件での培養や、より膜透過性の高い抗酸化物質の使用など、他の培養条件の変更とともに抗酸化物質を組み合わせることで、網状赤血球の内部に存在する酸化ストレスを緩和できる可能性が示唆されている（Gunalan et al.） 鉄（Fe+2）もプロオキシダントとして作用し、細胞の酸化ストレスを誘発することが注目される（Puntarulo, 2005; Colpo et al., 2008）。鉄（Fe+2）により誘発された細胞の酸化ストレスを緩和するために鉄キレーターを使用できるかどうかを調べるのは興味深いことです。Gunalanらによって記述された抗酸化物質のリストに加え、deferoxamine、deferiprone、deferasiroxも検討されるかもしれない。
Clarkらは、網状赤血球の浸透圧安定性を測定するフローサイトメトリーベースのアッセイを用いて、Plasmodium vivax感染網状赤血球の構造的完全性を調査した。その結果、未熟なCD71+網状赤血球は、他の成熟段階のCD71-網状赤血球や正常細胞の中で、最も浸透圧的に安定していることが観察された。P.vivax感染網状赤血球は、未感染のCD71+網状赤血球に比べて安定性が低く、P.vivax感染が網状赤血球の安定性を損なうことが示唆された。さらに、P. vivax感染網状赤血球は、P. falciparum感染正常細胞と比較して、より不安定であることが観察された。興味深いことに、幹細胞をin vitroで分化させて得た網状赤血球は、ex vivoの網状赤血球と比較して安定性が低いことが示されている（Clark et al.、2021）。これは、P. vivaxがex vivo培養でよりよく増殖するという観測の背後にある理由の1つであると思われる。したがって、in vitroでの網状赤血球の浸透圧安定性を高めることができる試薬は、Plasmodium vivaxの長期培養に影響を与えるであろうことが示唆され、例を挙げると、コレステロールは、in vitro培養に存在する網状赤血球の浸透圧安定性を高めることが示されている（Clark et al.、2021).
網状赤血球の急速な成熟は、アッセイのエンドポイントに到達するのに長い時間を要するアッセイにこれらの細胞を使用する場合の制限要因であることも判明した。Borlonらは、臍帯血から得た網状赤血球を冷凍保存する確率を分析した。網状赤血球は、以前に確立されたプロトコル（Russell et al.、2011年）に従って分離されました。その後、細胞を20％グリセロールでホモジナイズし、液体窒素で保存した。液体窒素保存は網状赤血球の安定性と生存率に影響を与えず、正常に成熟して寄生虫の侵入をサポートすることが示された（Borlon et al.、2012年）。さらに、Noulinらは、造血幹細胞から得た赤血球は、細胞膜に存在する受容体を乱すことなく、1年間凍結保存できることを示しました。網状赤血球の凍結保存には、異なる保存剤を含む2種類の培地を使用し、どちらも成功した。1つは28%のグリセロール、3%のソルビトール、0.9%の塩化ナトリウムからなり、もう1つは10%のジメチルスルホキシド（DMSO）と40%のウシ胎児血清からなります（Noulin et al., 2012）。
寄生虫の要因
新鮮な網状細胞の継続的な供給にもかかわらず、P. vivaxの培養は、無性赤血球内サイクルの数ラウンド後の非効率的な侵入、成熟および脱出の欠如など、様々な寄生虫関連の変数のために困難なままである。in vitro条件下での網状赤血球への非効率的な寄生虫侵入は、依然として最大のハードルの1つです（Thomson-Luque et al.、2017）。Thomson-Luqueは、P. vivaxのin vitro培養中に観察された問題のいくつかを列挙している：ピクノティックリング、シュフナドットの欠如、栄養虫の形成遅延、血液段階の代わりに配偶子細胞の存在、危機形態の寄生体の出現（壊れた寄生体の断片または栄養不足の不健康寄生体； Thomson-Luque et al., 2017）。それにもかかわらず、寄生虫血症の減少は、主にトロフォゾイトからシゾントへの移行状態で観察された。この謎の背後にある理由は、依然として未解明である。しかし、好ましい環境の欠如が要因の1つである可能性がある。
Plasmodium vivaxの分離株は遺伝的に多様であり、それぞれの分離株は異なるレベルの網状赤血球嗜好性を持っている。インドのP.vivax分離株を用いたLimらの研究によると、P.vivaxの一部の株は、一般的にこの種が網状赤血球を制限する性質とは対照的に、網状赤血球への嗜好性が低いことが示されました。網状赤血球を好む菌株では、配偶細胞よりも分裂細胞の数が多く、若い網状赤血球への侵入が分裂細胞の発達に役立つことが示唆された（Lim et al.、2016）。別の研究では、Russellらがタイとミャンマーの国境から分離された85のP. vivaxの臨床分離株を用いて、寄生虫の侵入効率を調査しました。すべてのP. vivax臨床分離株の間で、侵入効率に高いレベルのばらつきが観察された。しかし、特定の分離株を異なるABO血液型ドナーから分離した網状赤血球とインキュベートした場合、浸潤効率は一定であった。その結果、侵入効率のばらつきの約86％が寄生虫の種類に依存していることが明らかになった。宿主の血液型は、侵入効率の総変動の0.17％を占めるに過ぎなかった（Russell et al.、2011）。
上記の2つの研究は、P. vivaxヒト分離株はそれぞれ独自の特徴を持ち、それが侵襲のばらつきを生み出していることを示しています。さらに、各分離株のユニークな特性は、これまで知られていなかった遺伝的要因に起因している可能性がある。これらの遺伝的要因は、転写、ゲノム、エピゲノムレベルで個々の寄生虫の分離を制御している可能性がある。将来的には、網状赤血球の侵入を制御する決定因子が、P. vivaxの長期血液期培養に影響を与えることが予想される。
通常の寄生虫を用いた侵襲試験法では、寄生虫群の平均寄生量を測定し、その平均寄生量が各寄生虫の侵襲を代表すると仮定している。しかし、この方法では、他の寄生虫とは異なる行動をとる特定の寄生虫の亜集団がカウントされない可能性があります。そのため、他の研究者が標準的に行っているように、単一寄生虫の培養を行い（Miao and Cui, 2011）、その成長パターンを監視する必要があります。また、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて複雑な寄生虫集団から単一寄生虫を分離することにより、寄生虫個体レベルでの遺伝的変異を明らかにすることができる。
環境要因
P. vivaxのin vitro培養に関わる3番目に重要な要因は、培養液（寄生虫の周囲に存在する環境）である。P. vivax in vitro培養のための培養液の処方に関する詳細は、すでに他の人が詳しくレビューしています（Bermudez et al., 2018; Thomson-Luque et al., 2019）。したがって、ここでは論じていない。さらに、ヒト血清を含むMcCoy's 5A培地は、in vitro条件でのP. vivax増殖のために最も一般的に使用される製剤である。しかし、McCoy's 5A培地は、赤血球内サイクルの48時間後にP. vivaxの生存率を低下させることが報告されている（Borlon et al.、2012）。Rengelらによる最近の観察では、Iscove's modified Dulbecco's medium（IMDM）は、他の製剤と比較して寄生虫の赤血球内増殖をよりよくサポートすることが示されている（Rangelら、2018年）。しかし、IMDMで増殖した寄生虫を他の培地と区別するトランスクリプトームシグネチャーに有意差は観察されなかった。それにもかかわらず、Plasmodium vivaxの寄生虫の密度はIMDMを使用しても時間の経過とともに低下し、この寄生虫の持続的なin vitro培養の大きな障害となる。
P.vivax感染網状赤血球のFACSによる単細胞培養は、ある寄生虫が隣接する寄生虫の成長と生存を阻害する効果を調べ、その後寄生虫の侵入、成熟、脱出をモニターすることができる。さらに、P. vivaxの各分離株はin vitro条件下で独自の挙動を示すことが、いくつかの報告で示唆されています。分離株固有のメタボロミクス研究は、in vitro条件下で動作する代謝経路の違いを理解するのに役立つと考えられます。また、メタボローム解析は、各分離株に必要な培地や成長因子の最適化に役立つと思われます。しかし、Rengelらは、凍結保存した患者分離株からFACSで精製した1000匹の寄生虫を異なる培地で培養し、寄生虫の様々な発生段階でトランスクリプトーム解析を行うという同様の研究を試みている。さらに、培養液は寄生虫の転写プロファイルにあまり影響を与えないことが確認された（Rangel et al.、2020）。培養液の違いによる寄生虫の転写反応の欠如は、宿主細胞（赤血球）自体の役割が変化していることを示唆しているのかもしれない。しかし、異なる培地が寄生虫の生存に果たす役割を探るには、さらなる研究が必要である。さらに、シングルセル・トランスクリプトミクスは、1つの分離株内の寄生虫間の変異を特徴付けるのに役立つと思われます。
全体として、寄生虫、環境、宿主の各要因が、単独または複合的に、Plasmodium vivax in vitro培養の決定要因となっているようです。これには、インビトロ培養中の寄生虫の侵入と寄生虫バイオマスの維持における寄生虫遺伝子と遺伝子発現の役割も含まれる。さらに、Plasmodium vivaxの寄生虫は、薬剤の選択やバイオマーカーの同定に必要な分子および遺伝子決定因子を欠いている。原虫のトランスジェニック開発は、in vitro培養システムの欠如、トランスフェクション効率の低さ、選択マーカーの欠如という難点がある。しかし、このような課題にもかかわらず、この寄生虫を分子レベルで編集する試みはほとんど行われていない。
原虫vivax血液期トランスフェクション
ゲノム編集のための新しい方法論が開発されたにもかかわらず、Plasmodium vivaxの遺伝子操作はまだ十分に試みられていません。この寄生虫の遺伝子操作の取り組みが進まないのは、長期間のin vitro培養ができないことと、寄生虫の遺伝子操作を行うための分子ツールが乏しいことに起因しています。これは、安定した遺伝子操作を行うには、一般的に3〜4週間の無性繁殖を継続的に維持する必要があり、その間にP. vivaxが上記の理由によりin vitroの条件に耐えられなくなる可能性があるためである。安定なトランスフェクションの場合、プラスミドDNAは最初に細胞質でエピソーム的に複製し、その後、薬剤選択の間（2〜3週間）、シングルまたはダブルクロスオーバーの相同組換えによってゲノムに統合し、そのような成功した形質転換体はさらにサザンブロッティングによって確認される（Crabbら、1997）。一方、P. vivaxでは、トランスフェクション後48〜96時間のin vitro維持で済むため、一過性のトランスフェクションを容易に行うことができる（Crabb et al.、2004）。しかし、P. vivaxのトランスジェニック系統の開発やノックアウト研究による遺伝子機能解析には、安定したトランスフェクションが必要です。
また、Plasmodium vivaxのトランスフェクションに関連するもう一つの重要な要因は、P. vivax特異的プラスミド構築に必要な遺伝子制御エレメントがないことである。マラリア原虫のヒスチジンリッチプロテイン3プロモーターとカルモジュリンプロモーターは、マラリア原虫で機能することが示されている（Pfahler et al.、2006）。Moraes Barrosらは、P. vivaxのcalmodulinプロモーターを使用して、P. vivaxにおけるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）発現に成功した（Moraes Barrosら, 2015）。しかし、Plasmodium falciparumの血液期培養でP. vivaxプロモーターを特徴付けるいくつかの試みは、依然として成功していない（Azevedo and del Portillo, 2007）。しかしながら、初めてP. yoeliiにおいて、11番染色体のP. vivaxセントロメア（PvCEN）と熱ショックタンパク質70のプロモーター（pvhsp70）が活性であることが示されました（Thawnashom et al.、2019）。これらの制御配列は、今後、P. vivax特異的なプラスミド構築や遺伝子操作に活用することができます。
原虫vivaxのトランスフェクションは、寄生虫を分子探索に適合させるための重要なステップとなるであろう。現在までに、P. vivaxの栄養体をトランスフェクションするための独立した試みは2回しか行われていない。Pfahlerらは、ルシフェラーゼ構築物を用いてP. vivax血液期寄生虫を一過性にトランスフェクトした（Pfahler et al., 2006）。トランスフェクションにはP. vivax SalvadorI株を用い、寄生虫は感染した脾臓摘出Saimiri boliviensisサルから分離した。精製したP. vivax感染栄養体をルシフェラーゼ含有プラスミドと混合し、Gene Pulser Xcell™ electroporation system（BioRad）を用いてエレクトロポレーションした。トランスフェクトされたレポーター遺伝子は、P. falciparumの5′および3′調節エレメントの制御下にあるにもかかわらず、発現した。このことは、制御領域が両種間で保存されていることを示すものであった。トランスフェクション技術のもう一つの大きな発展として、Morales Barrosらは、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてP. vivax Chesson株を安定的にトランスフェクションしました。P. vivaxのジヒドロ葉酸還元酵素（pvdhfr）をコードする遺伝子に特定の変異（4重変異体）を導入し、Saimiri boliviensisの薬剤ピリメタミンを用いて選択した。P. vivax Chesson感染脾臓摘出Saimiri boliviensisサルから血液サンプルを採取し、変異pvdhfr配列を含むZFNプラスミドを用いて感染赤血球を生体外でエレクトロポレーションした（Moraes Barros et al., 2015）。カスタマイズされたZFNをP. vivaxの遺伝子操作に使用できるようになった。さらに、変異pvdhfrまたはヒトdhfrまたは他の選択可能なマーカーを、P. vivaxにおける選択のために使用することができる。P. vivaxの連続的なin vitro培養システムがない場合、トランスフェクションおよび選択は高価な非ヒト霊長類で行われてきた。
トランスフェクションに関連する変数、例えばエレクトロポレーション条件やトランスフェクションするP.vivaxの発育段階は、P.vivax感染赤血球の入手が限られているため、最適化されていない（Pfahler et al., 2006）。しかし、上記の2つのトランスフェクション研究から、特定のステージを好む他の原虫種（表1）とは異なり、すべての発育ステージを含むP. vivax感染血液をトランスフェクションに使用することができるようです。いずれにせよ、P. vivaxの各発育段階におけるトランスフェクション効率を調べるためには、段階を特定したトランスフェクションを行う必要がある。
表1
表1. 異なる原虫種におけるトランスフェクションのための好ましい血液ステージ。
原虫の生態を研究するためのオプション
網状赤血球産生細胞系（Reticulocyte producing cell lineage
P. vivaxのin vitro培養を成功させるためには、網状赤血球の利用可能性が制限要因になる。従って、網状赤血球の連続的で均質な集団を供給できる網状赤血球産生細胞系列が必要である。これまで、造血幹細胞/前駆細胞（Kurita et al., 2013; Huang et al., 2014）、胚性幹細胞（Hirose et al., 2013）または人工多能性幹（iPS）細胞（Kurita et al., 2013）からヒト赤血球の不死化ラインを作製する試みはほとんど行われていない。しかし、iPS細胞は胚性幹細胞に比べ、核出率が低い。また、胚性幹細胞から生産される網状赤血球は胎児ヘモグロビンを含んでおり、in vitroでの培養に悪影響を及ぼす可能性がある。骨髄や末梢血から分離された造血幹細胞は、網状赤血球の作製に適した代替品である。しかし、骨髄由来幹細胞の分離は侵襲的であるのに対し、末梢血由来幹細胞は容易に入手できる。
近年、正常ヒト赤血球が不死化成体赤血球株の作製に使用されています（Trakarnsanga et al.、2017）。Bristol Erythroid line Adult (BEL-A)は、成人骨髄CD34+細胞に由来する初のヒト不死化成人赤血球系で、核形成後に成熟網状赤血球を生成する。形態的・機能的にBEL-Aはin vitro培養網状赤血球に似ています（Trakarnsanga et al.、2017）。さらに、BEL-CおよびBEL-P赤血球系は、臍帯血や末梢血CD34+細胞から作製されています（Daniels et al.、2021）。BEL-CとBEL-Pはいずれも、グローバルな発現、分化プロファイル、全体的なプロテオームプロファイルの観点から、親細胞の特性を再現することが示されています。さらに、BEL-A、BEL-C、BEL-Pの作出は、宿主と寄生虫の相互作用とその後遺症を研究するための扉を開くものである。次に、これらの系統のP. vivax感染およびin vitro培養への適合性を検討することができる。
ヒト化マウスモデル
CD71産生ヒト赤血球は、P. vivaxのin vitro培養の制限因子である。Luiza-Batistaら（2022）は、ヒト造血幹細胞および前駆細胞の生着後、ヒト赤血球を有するマウスモデルの開発を試みました。このモデルマウスは、3週間の感染後、de novo P. vivaxの増殖と成長をサポートした。HIS-HEry（ヒト免疫系-ヒト赤血球）と呼ばれるマウス株は1年間生存し、寄生虫の性期の骨髄への局在、ゲメト球の形成、低寄生虫血症にもかかわらずAnopheles蚊への感染などP. vivax感染者のいくつかの主要特徴を模倣した。現在のモデルは、Plasmodium vivaxの生物学を理解する上で新たな道を開いたが、循環するヒト赤血球の数が少なく、配偶子細胞感染後のスポロゾイト生成数が少ないため、さらなる改善が必要である（Luiza-Batista et al., 2022）．特に、末梢のヒト赤血球の数が少ないのは、ネズミのマクロファージによって除去されるためである（Hu et al., 2011）。さらに、末梢赤血球の数が少ないと、蚊に感染する配偶子細胞の数が制限されるため、現在のマウスモデルはさらなる最適化が必要である。
霊長類マラリアモデル - cynomolgi原虫
Plasmodium cynomolgiは霊長類のマラリア原虫で、現在P. vivaxのモデル系として使用されている。系統学的にも表現型的にも、P. cynomolgiとP. vivaxは非常に近い関係にあります（Tachibana et al., 2012）。P. cynomolgiの改良されたゲノム配列アセンブリは、P. cynomolgiとP. vivaxの間に282の類似した遺伝子クラスターを明らかにし、これはそれらが近縁であることをさらに強化する（Pasini et al., 2017） Berok株由来のP. cynomolgi株の血液期培養は、最近Chuaら（2019）により開発されました。P. cynomolgiのin vitro培養が可能になれば、P. vivaxではまだ達成されていないハイスループットの薬剤スクリーニングや遺伝子操作に活用できるため、P. vivax研究に新しい道を開くことになる。P. cynomolgi Berok K4株のin vitro増殖は、6つの独立した研究室で成功した。感染後46-48時間で8-16個の子虫が形成され、6日目以降に配偶子が観察されたが、配偶子血症は0.01％と低い。注目すべきは、P. cynomolgiのM株とB株は、in vitroでの培養を何度か試みたが失敗したことである（Chua et al.、2019）。
Plasmodium knowlesiを介したPlasmodium vivaxの遺伝子操作。
Plasmodium vivaxは、下糸球の形成と網状細胞を好むという点で、P. knowlesiとは依然として異なる。しかし、この2つの寄生虫は系統的に近縁であり、宿主細胞への侵入をDuffy結合タンパク質に依存している（Adamsら、1990；Kingら、2011）。長期的なin vitro培養ができないため、P. vivaxの研究は、ほとんどが組み換えタンパク質アッセイ、ex vivo研究、霊長類感染、ヒトマラリアのコントロール感染に限定されています（Russellら、2011；Shakriら、2012；Payneら、2017年）。P. knowlesiの長期培養への適応（Butcher, 1979）は、P. vivaxの基本的な生物学を探求するためのユニークなプラットフォームを提供します。さらに、P. knowlesiは、アカゲザルのRBCと血清を必要とせず、ヒトの血清で培養することができます（Moon et al.、2013）。このヒトに適応したP. cynomolgi株で達成されたトランスフェクション効率は30％～40％で、P. falciparumの10万倍であり、P. bergheiで得られたものを凌駕する。トランスフェクション効率が高いため、トランスフェクション後、第一世代でトランスジェニック寄生虫を観察することができる。さらに、Mohringらは、P. knowlesiにおいて、CRISPR-Cas9を介したゲノム編集を行った。CRISPR-Cas9を介したゲノム編集に関わる主要なパラメータを調べたところ、トランスフェクションに100％成功する非常に堅牢なプロセスであることが判明しました（Mohring et al.、2019）。これにより、ヒトに感染する原虫において、ゲノムワイドな系統的ノックアウトや遺伝子タグ付けが可能になります。
網状赤血球における受動的なメロゾイトの "侵入"
様々な面で標準化が進んでいるにもかかわらず、P. vivaxの試験管内培養を継続的に維持することは困難である。継続的なin vitro培養の欠如は、主にP. vivaxのメロゾイトが新しい網状赤血球に侵入できないことに起因する（Russell et al.） 網状赤血球への積極的な侵入を成功させるハードルを克服するために、エレクトロポレーション（通常のトランスフェクション手順と同様）または細胞質内メロゾイト注入（細胞質内精子注入の手順と同様）により網状赤血球にメロゾイトを受動導入してその後遺症を調査することが考えられる。メロゾイトの大きさは1〜1.5μm、赤血球の直径は6〜8μmの範囲にあり、少なくとも理論的には実現可能である。P.vivaxのin vitro培養の成功に大きな影響を与えることができる、遊離したメロゾイトを網状赤血球に直接投与することを考えるのは興味深いことであろう。しかし、このような赤血球内への遊離メロゾイトの導入の成功は、寄生虫空胞膜（PVM）を持たない注入されたメロゾイトの生存に完全に依存するであろう。生存メロゾイトの単離は、Plasmodium knowlesi（Dennisら、1975；Bannister and Mitchell、1989；Lythら、2018）およびPlasmodium falciparum（Boyleら、2010）において十分に確立されているが、P. vivaxでは依然として未試行である。精製されたメロゾイトは無傷のままであり、侵入能力を保持している。確立されたメロゾイト分離プロトコルは、P. vivaxのメロゾイト分離と網状赤血球浸潤アッセイ、または網状赤血球への直接導入に利用できる。
しかし、網状赤血球細胞質へのメロゾイトの直接導入は、PVMを形成せず、その後、寄生虫が生存しない可能性がある。PVMは、寄生虫細胞質から宿主細胞質へのタンパク質の輸送、栄養素の取り込み、老廃物の排泄を助けることが知られているが（Goldberg and Zimmerberg, 2020）、TheileriaやBabesia属に属する寄生虫の一部は宿主細胞質内にPVMがなくても生存できる（Lingelbach and Joiner, 1998; Shaw, 2003; Repnik et al, 2015）ことから、細胞内アピカンプレックスに必須ではないことも示されている。さらに、Pasmodium寄生虫におけるPVMの意義は依然として不明である（Goldberg and Zimmerberg, 2020）。網状細胞におけるメロゾイトの細胞質内注入は、Plasmodium PVMの生物学をも理解するための扉を開くかもしれません。
結論
過去10年間、P. vivaxの試験管内培養を確立するためにいくつかの試みがなされましたが、その成果はわずかなものでした。しかし、霊長類に適応したP. vivaxの試験管内培養に向けて、大きな進歩がありました。しかし、P. vivaxの試験管内培養を長期にわたって維持し、高寄生虫血症を維持することは、まだ達成されておらず、十分な注意が必要である。P. vivaxの試験管内培養に関連する最も謎めいた要因は、公表されたプロトコルの再現性がないことである。Golendaら（1997）は、ヘモクロマトーシス患者の血液を使用して、これらの寄生虫を6-8世代にわたって培養する最も成功したプロトコルを開発しました。Shaw-Salibaらは、Aotus lemurinus lemurinusから得たP. vivax霊長類適応株Sal-1を用いて、Golendaのプロトコルを最適化することを再度試みました。しかし、Golendaの研究結果は再現されなかった。その理由は、若い網状赤血球の含有量や鉄レベルの違い、あるいは使用したP. vivaxの菌株の違いによるものであると思われる。ヒトP. vivaxの各株はin vitroシステムにおいて独自の成長動態を示し、それは各株のユニークな遺伝子構成に起因している可能性がある。Golendasと他の研究者の研究に関連する変数に対処するために、さらなる調査が必要である。さらに、ヘモクロマトーシス患者の網状赤血球がP. vivaxのin vitroでの増殖を支持するのは、網状赤血球に豊富な鉄分が含まれているためと考えられるが、網状赤血球の浸透圧安定性はP. vivax感染において重要な役割を果たし、長期的なin vitroでのP. vivax培養に影響を与えるかもしれない。また、赤血球前駆細胞から不死化網状赤血球株を作る可能性や、網状赤血球/赤血球にP.vivaxメロゾイトを受動的に導入する青空研究にも取り組む必要があります。
トランスフェクションの成功例としては、P. vivaxで一過性のトランスフェクションが達成されましたが、ヒト分離株を用いてさらに最適化する必要があります。P. vivaxの遺伝子操作は、まだ成功していない。連続培養システムの欠如がP. vivaxのトランスフェクション技術の進歩における大きな制限となっているため、理想的なP. vivaxの長期培養システムが確立されるまで、P. vivaxの生物学の一部を模倣する代替原虫（P. cynomolgiおよび P. knowlesi）の使用を、一時的アプローチとして奨励できるかもしれない。
著者寄稿
SKは原稿を起草し、執筆した。ASは、コンセプト立案、デザイン、編集、原稿のレビューを行った。すべての著者がこの論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
本研究は、インド医学研究評議会（ICMR）（ニューデリー）より、Sanju Kumariへの博士研究員奨励金（ICMR-PDF）の形で資金提供された。
利益相反
著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または保証されるものではありません。
略称
CD71, Cluster of differentiation 71; CRISPR/Cas9, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Crispr associated protein9; DMEM, Dulbecco's medium eagle medium; DMSO, Dimethylsulfoxide; FACS, Flourescence activated cell sorting; G6PD, Glucose 6-phosphate dehydrogenase； HC, Heilmeyer's class; HEPES, 4-(2-hydroxylethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid; PV, Parasitophorous vacuole; Pv-IRBCs, Plasmodium vivax-infected red blood cells; PVM, Parasitophorous vacuolar membrane; Pvdhfr, Plasmodium vivax dihydrofolate reductase; RBC, Red blood cell; ZFN: Zinc finger nuclease.
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キーワード Plasmodium vivax、網状赤血球、in vitro培養、トランスフェクション、マラリア
引用します： Kumari S and Sinha A (2023) Culture and transfection： 原虫の生物学を理解するための2つの大きなボトルネック。Front. Microbiol. 14:1144453. doi: 10.3389/fmicb.2023.1144453
受理された： 2023年1月14日、受理：2023年2月28日；
発行：2023年04月04日
編集者
スヴァンカー・ゴライ（ライガンジ大学、インド
レビューした人
Katy Shaw-Saliba, 米国国立アレルギー・感染症研究所（NIH）, 米国
著作権 © 2023 Kumari and Sinha. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣行に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： Abhinav Sinha, abhinavsinha@icmr.gov.in
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