欧米食は腸内細菌叢のリモデリングと2-オレオイルグリセロールの産生増加を介してオスマウスの非アルコール性脂肪肝炎の発症に寄与する

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発行：2023年1月16日
欧米食は腸内細菌叢のリモデリングと2-オレオイルグリセロールの産生増加を介してオスマウスの非アルコール性脂肪肝炎の発症に寄与する

https://www.nature.com/articles/s41467-023-35861-1

Western diet contributes to the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis in male mice via remodeling gut microbiota and increasing production of 2-oleoylglycerol - Nature Communications

ミン・ヤン
チー・シャオキアン
...
李光復
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Nature Communications 14巻、記事番号：228（2023） この記事を引用する
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アブストラクト
欧米型の食生活と腸内細菌叢の相互作用は、非アルコール性脂肪肝疾患の発症と非アルコール性脂肪肝炎への進行を促進する。しかし、非アルコール性脂肪肝炎に寄与する特定の微生物および代謝メディエーターは、依然として同定されていない。そこで、西洋の典型的な食事であるコリン低含有高脂肪高糖質食をCL-HFSと名付け、雄マウスに肝炎、脂肪症、線維化などのヒト疾患の特徴を持つ非アルコール性脂肪肝炎を誘導することに成功しました。メタ分類学的およびメタボローム研究により、Blautia productaと2-オレオイルグリセロールがCL-HFS誘発非アルコール性脂肪肝炎に寄与する臨床的に関連する細菌および代謝メディエーターであることが判明しました。In vivo研究では、Blautia productaと2-オレオイルグリセロールの両方が、普通食またはCL-HFSを与えたマウスにおいて肝臓の炎症と肝繊維化を促進することを検証しました。細胞および分子生物学的研究により、GPR119/TAK1/NF-κB/TGF-β1シグナル経路が2-オレオイルグリセロールによるマクロファージプライミングとその後の肝星細胞活性化を仲介していることが明らかになりました。これらの知見は、非アルコール性脂肪肝炎の病態の理解を深めるとともに、微生物やメタボライトを用いた非アルコール性脂肪肝炎の治療法開発のためのターゲットを提供するものです。
はじめに
非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）は、新たな世界的な健康脅威であり、急速に慢性肝疾患の主要な原因となりつつあり、世界中の人口の25％が罹患しています1. NAFLDの発症は、単純な脂肪症から、肝細胞の損傷やバルーン化、肝炎、肝線維化を特徴とする進行型の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）まで様々です2。NASHの進行は、その後の肝硬変や末期の肝細胞がん（HCC）3へとつながります。 近年、西洋型食生活（WD）と腸内細菌叢が相互に作用して、NAFLDの発症やさらなる病気の進行に寄与する代謝物を生成することを示す証拠が増えています4。しかし、NAFLDを促進する特定の細菌と代謝産物、およびその基礎となるメカニズムは十分に理解されていません。このような知識のギャップを解決することで、進化し続ける医療の危機に対する治療標的を特定することができます。
腸と肝臓は、門脈を介することで解剖学的・機能的に密接に連絡しています。この腸-肝軸は、食事や微生物の成分、および腸から肝臓への結果物の輸送を可能にし5、肝臓は腸のホメオスタシスに影響を与える第一胆汁酸のような因子を分泌する6。不健康なライフスタイルとそれに伴う腸内細菌叢の変化は、肝臓の免疫とホメオスタシスに大きな影響を与える多くの病原性因子の産生をもたらし、NAFLD発症の一因となる7。フルクトース、スクロース、飽和脂肪酸を多く含む典型的なWDは、NAFLD発症の主な要因として浮上している8。WDのモデルとして高脂肪食（HFD）を与えたマウスは、肥満、メタボリックシンドローム、肝脂肪症を再現性よく発症するが、肝線維化を伴うNASHは発症しない9。NAFLDにおける腸内細菌叢の重要な役割は、数多くのヒトおよび動物実験によって証明されています。腸内細菌組成の変化は、肝の糖質および脂質代謝、ならびに炎症性エフェクターと抗炎症性エフェクターのバランスに大きく影響し、NAFLDの発症に影響を及ぼす可能性があります10。さらに、食事と腸内細菌叢の相互作用は代謝を形成し、NASHの病態に大きな影響を与える多数の生理活性代謝物を産生する11。ある研究では、腸内グラム陰性菌の過剰増殖がインスリン抵抗性と内因性エタノール産生を促進し、コリン欠乏を誘発することが示され、これらはすべてNASHに関与する因子である12。さらに、遊離脂肪酸、トリメチルアミン、二次胆汁酸、エタノールなどの微生物由来の代謝産物は、肝細胞のストレス、傷害、死を誘発することが報告されています。その結果、肝硬変や肝細胞癌の素因となる線維形成やゲノムの不安定性が引き起こされる13。このような知見の進歩にもかかわらず、WD誘発NAFLDに寄与する未認識の細菌および代謝物を同定し、NAFLDの病因を完全に理解するための基礎的メカニズムを解き明かすためには、さらなる研究が必要である。
本研究では、コリン欠乏性HFD（CD-HFD）よりも典型的なWDを再現するCL-HFSを野生型（WT）マウスに与えることにより、臨床的に適切なNASHのマウスモデルを確立することに成功しました。このモデルを用いて、肝炎と線維化を引き起こす特定の微生物、Blautia producta (B. producta) とその成果代謝物である2-オレオイルグリセロール (2-OG) を特定しました。特にヒトのNASHに関連し、ヒトのNASH患者の肝臓で2-OGの蓄積の増加が検出されました。細胞機構研究では、2-OGが微生物の代謝産物であり、マクロファージ（MΦ）依存的に肝星細胞（HSC）を活性化して細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を産生することが示されました。分子生物学的研究により、2-OGはGタンパク質共役型受容体GPR119アゴニストであり、TAK1/NF-κB/TGF-β1シグナル伝達経路を介してMΦを刺激することが示されました。これらの知見は、NASHの病態の理解を深めるとともに、治療標的の可能性を示すものである。
研究成果
代表的なWDであるCL-HFSを用いた臨床に適したマウスNASHモデルの開発
我々は、典型的なWDに近似したCL-HFSを用いた臨床的なNASHのマウスモデルの開発に成功した。NAFLDの誘発には、メチオニン/コリン欠乏食（MCD）14や、コリンを含まない60kcalの脂肪と0.1%のメチオニンからなるCD-HFD15が広く適用されていますが、この食事は、ヒト疾患には存在しない肝萎縮や重度の体重減少を引き起こすこともよくあります15のことです。全米健康栄養調査（NHANES）2009-2014のデータによると、年齢や性別に関係なく、成人の90％以上が、米国国立医学アカデミー食品栄養委員会が推奨する適切な量のコリンを摂取していない16。そこで、WT C57BL/6 Jマウスに、CD-HFD（コリンなし）よりも典型的なWDを表現しやすいCL-HFSを摂取させることにしました。その結果、CL-HFSの摂取（図1a）によって、12週目に肝臓の大きさが増加し、肝臓の色が目に見えて明るくなり（図1b）、36週目に体重が有意に増加した（補足図1a）。血液生化学検査では、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、コレステロールの有意な増加が見られた（補足図1b）。H&E染色では、炎症細胞の浸潤、脂質滴の蓄積、肝細胞のバルーン化が顕著に増加し、NAFLD Activity Score（NAS）が上昇した（図1cおよび補足図1c、d）。シリウスレッド染色では、コラーゲンの産生が有意に増加し、細胞周囲および橋渡し型の肝線維症が形成された（図1c、補足図1d）。IHCでは、活性化造血幹細胞のマーカーであるα-SMAの発現が有意に増加した（図1cおよび補足図1d）。qPCRでは、Col1a1、Col4a1、Acta2などの細胞外マトリックス（ECM）遺伝子（図1d）とIL1b、Tgfb1、Tnfaなどの炎症性サイトカイン遺伝子（図1e）のmRNA発現が有意に増加した（図）。これらの変化は、ヒトのNASHと一致していた（図1f-hおよび補足図1e）13。さらに、qPCRにより、IL6、Ccl2、Myd88、Nfkbの発現が有意に増加した（補足図1f）。また、CL-HFSは内臓脂肪を有意に増加させたが、皮下脂肪は増加させなかった（補足図2b-d）。内臓脂肪における炎症性サイトカインやアディポカインの発現は、CL-HFS飼育マウスとND飼育マウスの間で統計的に有意なものは検出されなかった（補足図2e）。これらの結果は、CL-HFSによって誘導された脂肪組織は、これらのマウスにおけるNASHの発症および進行の主要な要因ではない可能性を示唆している。これらの組織学的、免疫組織化学的、生化学的、および分子生物学的解析から、CL-HFSの摂取は、脂肪肝、肝障害、自然肝炎反応、ECM遺伝子アップレギュレーション、および肝繊維化、さらに肥満を誘導し、ヒト疾患における典型的NASHの特徴を反映することが示唆されました。したがって、このモデルは臨床的に適切であり、NASHの病態とその基礎的なメカニズムを研究するためのプラットフォームとなる。
図1：マウスNASHモデルの樹立と特性評価
a CL-HFSによるNASHの誘発を示す概要図。6週齢のWT C57BL/6 Jマウスに、CL-HFSまたは普通食（ND）を12週間与えた。18週目に各マウスを安楽死させ、以下の研究を行った。 b CL-HFSおよびNDを与えたマウスの肝臓の代表的な巨視的画像。 c 肝臓組織の代表的な組織学的画像。CL-HFS飼育マウスでは、ND飼育マウスと比較して、NASHの典型的な肝機能が検出された：H&E染色では、脂質の沈着（L）、肝細胞の膨張（黒矢印）、炎症細胞の肝浸潤（赤矢印）、シリウスレッド染色ではコラーゲンの産生の増加（黄矢印）、IHCではα-SMAの産生の増加（緑矢印）。d 細胞外マトリックス（ECM）遺伝子Col1a1、Col4a1、Acta2のmRNA発現のqPCR測定；e 炎症性サイトカイン遺伝子IL1b、Tgfb1、TnfaのmRNA発現のqPCR測定（ND飼育マウスおよびCL-HFS飼育マウスの肝臓における表示時点において）。dおよびeについては、n = 5、データは平均±SDで示される。 f 健常者およびNASH患者の肝組織の代表的な組織学的画像。健常者と比較して、NASHは、H&E染色で評価した脂質沈着（L）、肝細胞のバルーン化（黒矢印）、炎症細胞の肝浸潤（赤矢印）、シリウスレッド染色で評価したコラーゲンの産生増加（黄矢印）、IHCで評価したα-SMA（緑矢印）の産生促進をもたらした。g ヒト肝臓におけるECM遺伝子のmRNA発現。qPCRにより、健常人と比較してNASH患者の肝臓におけるCol1a1、Col4a1、Acta2の遺伝子発現の増加が検出された。 h ヒト肝臓における炎症性サイトカインのmRNA発現。qPCRにより、健常人と比較してNASH患者の肝臓におけるIL1b、Tgfb1、Tnfaの遺伝子発現が増加した。gおよびhについては、n＝7、データは平均値±SDで示される。データの統計解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いて、Tukeyの多重比較検定（≧3群）またはMann-Whitney検定（両側）付き一元配置分散分析により行った。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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ABX治療はCL-HFS誘発NASHの発症を予防的・治療的に抑制する
腸内細菌叢の異常は、NAFLDの進行・発症に大きく寄与する環境リスクファクターである10,17。これまでの研究で、抗生物質のカクテル（ABX）は、有意な肝毒性を伴わずにマウスの腸内細菌叢の相対的存在量に変化をもたらすことが示されている18,19。これらの変化がNASHの発症を予防できるかどうかを検証するため、CL-HFS飼育マウスに飲料水を介してABXを投与しました（図2a）。他の文献報告18,19と一致して、ABX投与は有意な肝毒性を引き起こさず、肝炎や線維化を促進しなかった（補足図3）。また、ABXはマウスの体重および食物消費量に影響を与えなかった（補足図3）。体重および肝臓重量の測定、H&E染色、浸潤炎症細胞のカウント、Sirius red染色、Oil red O染色、IHC、qPCRを実施した結果、ABX投与によりCL-HFSによる肝臓対体重比の上昇が抑制されたこと（図．2b）、肝常在炎細胞の頻度が減少し（図2c、d）、肝コラーゲン、α-SMAの産生および脂質の蓄積が減少し（図2c、e）、結果としてNASが減少することが示された（図2f）。これらの変化は、ABXによるCol1a1、Col4a1、Acta2などのECM遺伝子の肝発現抑制（図2g）、IL1b、Tnfa、Tgfb1、Ccl2、Myd88、Nfkbなどの炎症性サイトカイン、ケモカイン、シグナル伝達遺伝子の発現の著しい低下によって示される炎症反応の抑制（図2h）を伴っていることが明らかとなっています。造血幹細胞は、中毒性肝疾患モデルや脂肪性肝疾患モデルにおいて肝筋線維芽細胞の約82％〜96％に寄与していることから20、次にABX投与が造血幹細胞の活性化を抑制するかどうかを検討した。活性化した造血幹細胞は、筋線維芽細胞の特徴であるα-SMAとCol1α21を発現しています。CL-HFSの摂取により、α-SMAとCol1αを発現する造血幹細胞の頻度と細胞数はNDと比較して3倍以上増加したが、この増加はABX処理により有意に抑制された（図2i、j）。しかし、ABXは造血幹細胞の活性化抑制に直接的な効果を示さなかった（補足図3、4）。これらの結果は、ABXを介した腸内細菌叢の変化が、炎症反応、肝線維化、造血幹細胞活性化を抑制することにより、CL-HFS誘発NASHに極めて重要な役割を果たすことを示唆している。
図2：ABX投与はCL-HFS誘発性NASHの発症を遅らせる。
a ABXの治療デザインを示す概要。6週齢のWT C57BL/6 JマウスにCL-HFSを12週間摂取させ、ABXを同時に投与した後、安楽死させ、以下の試験を行った。対照としてND飼育マウスを用いた。 b CL-HFSによる肝臓/体重比の増加に対するABXの影響。NDと比較して、CL-HFSは肝臓と体重の比率の増加を引き起こしたが、ABX処理によって抑制された。 c CL-HFS誘発NASHに対するABXの影響。無処置マウスと比較して、ABX処理によりCL-HFS飼育マウスの炎症細胞（赤矢印）の肝臓浸潤（H&E染色）、コラーゲン（シリウスレッド染色）、α-SMA（IHC検出）および脂質の蓄積（オイルレッドO染色）が明らかに低下した。バー：100μm。 d 肝臓に浸潤する炎症細胞の半定量；e cに示した3群のマウスの肝臓におけるコラーゲン産生、α-SMAタンパク質発現、脂質蓄積の半定量。 f NAFLD活動スコア（NAS）。ABX投与により、CL-HFS飼育マウスのNASは減少した。 g ABX投与の有無にかかわらず、CL-HFS飼育マウスのECM遺伝子の肝mRNA発現。qPCRにより、ABX投与マウスの肝では、無処置マウスと比較してCol1a1、Col4a1およびActa2のmRNA発現が減少した。h 肝臓における炎症性サイトカイン、異化性サイトカイン、ケモカインのmRNA発現量。qPCRにより、ABX投与マウスの肝臓におけるIL1b、Tgfb1、Tnfa、Myd88、Nfkb、Ccl2のmRNA発現量が未処置マウスと比較して減少した。ABXは造血幹細胞の活性化を抑制した。フローサイトメトリーアッセイの代表的な結果（i）および累積結果（j）は、ABX処理により、CL-HFS飼育マウスにおいてCol1aおよびα-SMAを発現する活性化造血幹細胞の頻度が減少することを示した。n = 5、データは平均±SDとして示される。データの統計解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いて、Tukeyの多重比較試験による一元配置分散分析（ANOVA）により行った。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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次に、CL-HFS誘発NASHを抑制するABXの治療可能性を検討した。WTマウスにCL-HFSを12週間与えてNASHを誘導した後、6週間飲水でABX処理を行い、腸内細菌叢の選択的抑制を誘導した（補足図5a）。ABX治療投与では肝脂質蓄積の有意な減少は認められなかったが（p = 0. 31）ものの、肝重量比、肝コラーゲンおよびα-SMA産生量、NAS、ECM遺伝子Col4a1およびActa2ならびに炎症性サイトカインTgfb1、Ccl2およびIL1bのmRNA発現、ならびにCol1αおよびα-SMAを発現する活性化造血幹細胞の平均頻度と細胞数は有意に減少した（補足図5b-i）。これらの結果は、ABXがNASHを抑制する重要な可能性を示唆しています。
ABX投与はCL-HFSによる腸内細菌叢と肝代謝物の変化を調節する
CL-HFSによるNASHの予防・抑制を経験したマウスの腸内細菌叢に対するABXの影響を調べるため、上記実験のマウスから糞便サンプルを採取しました（図2）。16 S rRNA遺伝子配列決定とoperational taxonomic units（OTU）に基づく相対存在量プロットから、CL-HFSによって引き起こされた腸内細菌叢組成の顕著な変化がABX処理によって抑制され、ND飼料マウスで見られた細菌ファミリーの相対存在量となることが示されました（図3a）。この変化はβダイバーシティ解析でも支持された（図3b）。3群のマウスの中で最も変化が顕著な腸内細菌叢の4属の相対存在量を図3cに示した。その結果、CL-HFSの摂取により、Blautia（門、Firmicutes）とAkkermansia（門、Verrucomicrobia）の存在量が相対的に増加し、Alistipes（門、Bacteroidetes）とMuribaculaceae（門、Bacteroidetes）が減少することが示されました。ABX投与により、このCL-HFSによる腸内細菌叢の変化が抑制され、AlistipesとMuribaculaceaeの頻度が増加し、BlautiaとAkkermansiaの頻度が減少しました。(図3c)。これらの結果は、ABXが腸内細菌叢の操作と関連して、CL-HFSを原因とするNASHの発症を抑制することを示唆している。
図3：ABX投与は腸内細菌叢と肝臓の代謝物のプロファイルを変化させる。
ABXの非存在下または存在下でNDまたはCL-HFSを12週間摂取させたFig.2マウスから糞便および肝臓サンプルを採取した。 a CL-HFS摂取マウスにおける運用分類単位（OUT）の相対存在量に対するABXの影響。糞便サンプルの16 S rRNA遺伝子配列決定により、3群のマウスの腸内細菌叢のプロファイルを同定した。 b ABX処理により腸内細菌叢の類似性が変化した。PERMANOVA有意差検定は、Jaccard類似性指数を定義するためにPrincipal-coordinate analysis（PCA）を用いて行った。 c ABXは代表的な細菌種に著しい変化をもたらした。ABX投与により、CL-HFS飼育マウスの糞便サンプルにおいて、BlautiaとAkkermansiaの相対量が有意に減少し、AlistipesとMuribaculaceaeの相対量が増加した。 n = 5、データは平均±SDで示される。 d ABXは肝代謝物プロファイルを変えた。3群のマウスの肝代謝物をノンターゲットGas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）で分析した。ヒートマップでは、ND飼育マウス10匹、CL-HFS飼育マウス10匹、ABX投与CL-HFS飼育マウス10匹の肝臓組織30個における5代謝物のZスコアが示されました。ABX処理により、CL-HFS飼育マウスの以下の代謝物生成は著しく減少した。L-フェニルアラニン（Phe）、ピログルタミン酸（PCA）、2-オレオイルグリセロール（2-OG）、システイン（Cys）、L-バリン（Val）n = 10、データは平均±SDとして示される。データの統計解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いて、Tukeyの多重比較テストを伴う一元配置ANOVAにより行った。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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腸内細菌叢は、全身の代謝に強く関連している。したがって、ABXによる腸内細菌叢のリモデリングは、CL-HFS飼育マウスの肝代謝を変化させると考えられる。ABXまたはコントロールを投与したND-およびCL-HFS飼育マウスの肝臓を採取し（図2）、ノンターゲットガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）による肝代謝の解析に使用しました。結果は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）試験後にTukeyの多重比較試験で補正して解析し、3群間で検出された309代謝物のうち、50代謝物に有意な変化が見られた（補足図6）。赤い点で示したND飼育マウスとCL-HFS飼育マウスの間で有意差のある代謝物のうち、L-フェニルアラニン（Phe）、ピログルタミン酸（PCA）、2-OG、システイン（Cys）、L-バリン（Val）の5つはCL-HFS摂取に反応して明らかに増加し、これはABX処理によって抑制された（図3d）。その他の変化した代謝物は不明であるか、ABX処理に有意な反応を示さなかった（補足図6および補足表1、2）。これらの結果から、CL-HFSとABXの両方が腸内細菌叢を再形成し、肝代謝物に大きな影響を与えることが示唆されました。
ヒトのNASH患者では、糞便中のBlautiaと肝内2-OGの増加も検出される
今回の知見の臨床的関連性をさらに確立するために、HFS摂取に伴うマウスとヒトの腸内細菌叢組成の共通点と相違点を調査しました。BioProject PRJNA540738（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/540738）から公開されているNAFLD患者のヒトマイクロバイオームデータベースを用いて、健常者とヒトNAFLD患者の腸内細菌叢の比較解析を実施しました。マウスとヒトに存在する上位2つの細菌門であるFirmicutesとBacteriodetesに着目し22、NAFLD患者ではBacteriodetesが有意に減少し（補足図7a）、Firmicutesが有意でなくわずかに増加している（補足図7b）ことが判明した。しかし、Firmicutes門の1科であるLachnospiraceaeは有意に増加した（補足図7c）。Lachnospiraceaeの一属であるBlautiaは、健常者と比較してNAFLDのヒト患者で非常に濃縮されていた23。また、最近の研究では、Lachnospiraceae科は、同じHCC患者の非腫瘍領域と比較して腫瘍領域で有意に増加する原発性HCCのシグネチャー分類群であることが確認されている24。この知見は、我々のCL-HFS飼育マウスモデルにおけるBlautiaの豊富さと一致し、NASHの病態やHCCへの寄与において、ヒトとマウスでBlautiaが共通の役割を果たすことが示唆された。
次に、ヒトのNASH患者における肝代謝物の変化を調査しました。具体的には、NASHマウスにおいて、CL-HFSとABXの両治療に反応して最も顕著に変化することが確認された5つの代謝物に注目した。我々は、代謝測定用に、組織学的にNASHが確認された、または確認されていない肥満患者8名から肝生検体を採取しました（図4a）。ノンターゲットGC-MSでは、肥満とNASHの患者では、NASHでない患者に比べて2-OGが有意に増加した（図4b）が、他の4つの代謝物（Phe、PCA、Cys、Val）にはそのような相関は見られなかった。また、4-ヒドロキシブタン酸が有意に増加していることが確認されました（図4b）。結論として、我々の前臨床試験と臨床試験は、マウスとヒトのNASH患者の両方でBlautiaと2-OGの両方が増加することを一貫して示し、NASHを促進する細菌と代謝物として機能すると考えられる。
図4：肥満患者とNASHの有無における肝臓代謝物の不一致。
a 肥満患者およびNASHの有無にかかわらず、NASが存在する。NASに従って、8人の肥満患者を、肥満でNASが4以上（高）と肥満でNASが4未満（低）の2群に分けた。 b 肥満でNASが高い患者では、肝2-OGと4-ヒドロキシブタン酸の生産が肥満でNASが低い患者と比較して有意に増加した。n = 4、データは平均±SDで表示。データの統計解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いたMann-Whitney検定（片側）で実施した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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代謝産物は、代謝メディエーターとしてNAFLD/NASHの病態生理に影響を与えることはよく知られている25。細菌性リパーゼがトリアシルグリセロールを消化し、2-OGを生成することが研究で証明されている26。Blautia属の1種であるB. productaは、CL-HFS飼育マウスで増加していたが、低脂肪食飼育マウスでは増加していなかった（補足図8）。B. productaを嫌気的条件下で培養し、2-OG濃度をGC-MSで分析したところ、培養液中の2-OGの生産量が有意に増加していることが検出された（補足図9a）。また、CL-HFS飼育マウスでは、血清中の2-OGがND処理マウスやABX処理CL-HFS飼育マウスのそれと比較して増加した（補足図9b）。さらに、ABX5滅菌したマウスにB. productaを再増殖させると、2-OGの肝蓄積が増加することがin vivo試験で示された（補足図9c）。これらの結果から、2-OGはNASH発症に関連するCL-HFSとリパーゼ産生菌の相互作用から生成される代謝物であることが示されました。
B. productaはCL-HFS飼育マウスにおいて肝臓常在菌MΦと造血幹細胞の活性化を促進する。
マウスおよびヒトの NASH と Blautia および 2-OG の正の相関、およびリパーゼ産生種である B. producta が 2-OG を産生することがわかったため、この種の NASH 病態への寄与をさらに検討した。ABX5は、マウスの腸内細菌叢を広範囲に枯渇させるのに使用されているが、罹患率や死亡率への影響はほとんどない27。WTマウスをABX5で処理しても肝臓の炎症と線維化に有意な影響を誘導しないことを示した（補足図3）後、ABX5で2週間マウスを処理し、CL-HFSを与えながらB. productaをマウスに経口投与した（図5a）。CL-HFS の摂取と ABX 処理に反応して Alistipes putredinis (A. putredinis) が Blautia と反比例して変化することから、コントロールとして Alistipes を選択した。12週間後、各マウスの肝非実質細胞（NPC）をフローサイトメトリーアッセイのために単離した。その結果、A. putredinisではなくB. productaによる再増殖は、CL-HFS摂取マウスにおいて、CD11bとF4/80を発現する肝臓常在MΦの頻度と細胞数を著しく増加させた（図5c、d）。この変化は、CD3+T細胞、CD4+CD3+T細胞、CD8+CD3+T細胞、NK1.1+CD3+ナチュラルキラーT（NKT）細胞、CD3-B220+B細胞、またはCD49b+CD3-ナチュラルキラー（NK）細胞などの他のタイプの免疫細胞では見られなかった（図5B）。また、B. productaの再増殖により、α-SMAとCol1αを発現する活性化造血幹細胞の頻度と細胞数が有意に増加した（図5e、f）。組織学的解析、シリウスレッド染色、IHC染色により、B. producta再増殖により、炎症細胞の肝浸潤、コラーゲンおよびα-SMAの産生が増加した（図5g、h）。さらに、qPCRによりECM遺伝子Col1α1、Col4a1、Acta2の発現増加が検出された（図5i）。これらの結果は、B. productaがCL-HFS誘発NASHにおいて、MΦと造血幹細胞を活性化し、肝線維化を促進することを示唆している。CL-HFS誘発NASHを確立したマウスの内蔵を滅菌した後、B. productaを再増殖させると（補足図10a）、B. productaがCL-HFS誘発のMΦおよび造血幹細胞の活性化をさらに増強することが明らかになった（補足図10b-e）。さらに、B. productaの補充は、ND飼育マウスの肝線維化を促進し、肝常在MΦを増加させた（補足図11）。これらの結果から、B. productaは、NDおよびCL-HFS飼育マウスの両方において、NASHの開始と進行の間にMΦと造血幹細胞を活性化し、NASH促進細菌として機能することが確認された。
図5：B. productaの再増殖は、肝臓に常駐するMΦの変調と関連して、CL-HFS誘発の肝線維化を促進する。
a 腸内細菌叢の滅菌と細菌の再増殖を示す概要。6週齢のWT C57BL/6 Jマウスは、ABX5を飲料水に2週間経口投与して腸内細菌を枯渇させた後、CL-HFSと同時にBlautia producta（ATCC 27340）またはAlistipes putredinis（ATCC 29800）の再増殖を、200μlのPBS中に3×108CFU/マウスという用量で週2回の経口ガベーションにより受けた。12週間後、すべてのマウスを安楽死させ、肝臓を採取し、以下の研究のために肝NPCを分離した。 b 明確な肝免疫細胞の頻度 肝NPCはフローサイトメトリーにより、肝臓に常在するCD3（CD3+）、CD4（CD3+CD4+）、CD8（CD3+CD8+）、NK（CD3-CD49b+）、NKT（CD3+NK1.1+）、DC（CD11b+CD11c+）およびB細胞（CD3-B220+）の頻度を定義した。 c NPC中の肝臓常在MΦの代表頻度。d cの肝MΦの平均頻度（左）と絶対数（右）。データは、A. putredinisではなくB. productaによる再増殖が、CL-HFS飼育マウスの肝MΦの頻度を高めることを示している。e 活性化造血幹細胞の代表的な頻度 f eの活性化造血幹細胞の平均頻度（左）および絶対数（右） A. putredinisではなくB. productaによる再増殖が、CL-HFS飼育マウスにおいてCol1αおよびα-SMAを発現する活性化造血幹細胞の頻度を増加させることを示す。 g 炎症細胞（H&E染色）、コラーゲン生成（シリウスレッド染色）およびα-SMA生成（IHC染色）による肝臓浸潤。赤矢印は炎症細胞を指す。シリウスレッド染色とIHC染色により、B. producta再増殖マウスとA. putredinis再増殖の有無にかかわらず対照マウスでコラーゲンとα-SMAの産生の増加を検出した。h Sirius redおよびα-SMA染色が陽性であった領域の半定量（平均％）。 i ECM遺伝子の発現。qPCRにより、A. putredinisの再増殖がある、またはない対照マウスに対して、B. productaの再増殖があるマウスではCol1a1、Col4a1および Acta2のmRNA発現が増加していた。n = 5、データは平均±SDとして提示されています。データの統計解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いて、Tukeyの多重比較テストを伴う一元配置ANOVAにより行った。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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2-OGは単一代謝物として、MΦプライミング時に造血幹細胞を活性化する。
次に、2-OGが肝炎や造血幹細胞の活性化を誘導する代謝メディエーターとして機能するかどうかを検討した。この仮説を検証するために、ND飼育マウスに、0.2mLのPBSに20μg/マウスの用量の2-OGを週3回、6週間にわたってi.v.投与した（図6a）。この用量の2-OGは、細胞毒性を示さず、肥満やNASHの患者と同等の肝2-OG濃度になることから選択された（補足図12）。その結果、2-OG投与により、肝の炎症性細胞の浸潤、コラーゲンやα-SMAの産生が増加した（図6b、c）。さらに、各マウスから肝NPCを単離し、フローサイトメトリーアッセイで解析した。2-OG投与は、他のリンパ球の頻度に検出可能な変化を誘導しなかったが（図6d）、CD11b＋F4／80＋MΦ（図6e、f）およびα-SMA＋Col1α＋HSCsの頻度（Fig．qPCRでは、Acta2、Col1a1、Col4a1およびGpr119の発現が2倍以上増加した（図6i）。Cnr1ではなく、Gpr119とCd68の肝発現の増加（補足図13a、b）は、CL-HFS誘発NASHマウスと肥満とNASHのヒト患者でも検出されました。2-OGは、脂質作用を媒介するGPR119のアゴニストとして認識されている28,29。さらに、NASHを発症した肝臓では、GPR119が肝細胞ではなく、主に肝臓に常駐するMΦで発現していることが明らかになった（補足図14）。これらの結果は、2-OGがGPR119シグナルを介してMΦに作用する可能性を示唆している。
図6：2-OGは、肝臓常在菌MΦの変調と関連して、ND飼育マウスに肝線維化を引き起こす。
a 2-OG処理の実験計画を示す概要である。NDを与えた8週齢のWT C57BL/6 Jマウスに、0.2mL PBS中20μg/マウスの用量で、週3回、6週間、2-OGのi.v.注射をした。コントロールにはPBS注射を使用した。その後、すべてのマウスに肝灌流を行い、以下の研究のために肝NPCを単離した。 b 炎症細胞の肝浸潤（H&E染色）、コラーゲン産生（シリウスレッド染色）、およびα-SMA産生（IHC染色）。赤矢印は炎症細胞を指す。c シリウスレッド染色とα-SMA IHC染色が陽性であった部位の半定量化。半定量化により、コントロールマウスに対して2-OG処理マウスでシリウスレッド染色面積とα-SMA IHC染色面積が増加した。 d 肝臓における異なるタイプの免疫細胞の出現頻度。肝臓NPCは、CD3（CD3＋）、CD4（CD3＋CD4＋）、CD8（CD3＋CD8＋）、NK（CD3-CD49b＋）、NKT（CD3＋NK1・1＋）、DC（CD11b＋CD11c＋）およびB細胞（CD3-B220＋）等の異なるタイプの免疫細胞の平均頻度を定義するためにフローサイトメトリを受けた。 e NPCの肝臓残留MΦsの典型頻度。f eに示したコントロールおよび2-OG処理マウスのNPCにおけるMΦの平均頻度（左）および絶対数（右）。 g 肝NPCにおけるCol1αおよびα-SMAを発現する活性化造血幹細胞の代表頻度（左）：2-OG注射により肝に存在するMΦの頻度が増加した。h gに示すように、コントロールおよび2-OG処理マウスのNPCにおけるCol1αおよびα-SMAを発現する活性化造血幹細胞の平均頻度（左）および絶対数（右）である。i肝臓のGpr119とActa2のmRNA発現。qPCRにより、2-OG注射により肝臓のGpr119、Acta2、Col1a1、Col4a1のmRNA発現が増加した。n = 5、データは平均±SDで示される。データの統計解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いたマン・ホイットニー試験（両側）により実施した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されています。
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細胞基盤としてのMΦと造血幹細胞が2-OGによるNASHの病態を媒介するかどうかを調べるために、単一または共培養したマウス不死化造血幹細胞とRAW264.7細胞を2-OGで24時間刺激した。qPCRで測定したActa2、Col1a1、Col4a1の発現は単一造血幹細胞およびRAW264. 7細胞では変化しなかったが（補足図15a、b）、共培養細胞では増加した（補足図15c）。この変化は、Gpr119、IL1b、Tgfb1の著しい増加を伴っていた（補足図15d）。フローサイトメトリーアッセイにより、α-SMAとCol1αは主に造血幹細胞から、GPR119は主にRAW264.7細胞から産生されることがわかった（補足図15e-h）。また、2-OGはWTマウスの肝NPCおよび脾臓細胞におけるMΦの頻度を有意に増加させた（補足図16a-d）。しかし、これらの効果は、他の4つの変化代謝物（Cys、PCA、Phe、Val）、およびCL-HFSに関連する対照代謝物セリンには見られなかった（補足図16e-f）。さらに、2-OGはTGF-β1による造血幹細胞の活性化を増強せず、TGF-β1単独よりもCol1a1、Col4a1、Acta2のさらなる増加を刺激することが示された（補足図17）。これらの結果は、代謝メディエーターとしての2-OGが、MΦ依存的に造血幹細胞を活性化することを示唆している。
GPR119アゴニストとしての2-OGは、TAK1/NF-κB/TGF-β1シグナル経路を介してMΦを活性化する。
これらの結果から、GPR119が分子基盤として2-OGによるMΦのプライミングを仲介しているかどうかを調べることにした。そこで、マウスGPR119に対する3種類のsiRNAを用いて、その発現を抑制する能力を評価した（補足図18a、b）。機能的に検証されたsiRNAを用い、RAW264.7細胞のGPR119をsiRNAでノックダウンすると、共培養造血幹細胞におけるActa2、Col1a1、Col4a1などのECM遺伝子の2-OG誘導性の上昇を阻害することが示され（図7a）、GPR119が2-OGによるMΦ活性化に必要であると考えられた。qPCRアッセイにより、2-OG刺激は、RAW264.7細胞（図7b）および腹膜MΦ（補足図18c）におけるIL1b、Tnfa、Tgfb1、NfkbおよびGpr119の発現を著しく増強し、 siRNAによるGpr119ノックダウンによりRAW264.7細胞の2-OGによる活性化（補足図18d）は阻害された。In vivoでは、肝臓に常駐するMΦの枯渇（補足図19）またはMΦのGpr119のノックダウン（補足図20）により、2-OGを介した造血幹細胞の活性化が阻害されることが示された。さらに、IL-1やTNF-αではなく、TGF-β1の抗体による遮断は、造血幹細胞とRAW264.7細胞の共培養におけるECM遺伝子の2-OGによる産生促進を抑制した（図7c）。分子解析の結果、CL-HFSの摂取により、肝MΦの遺伝子発現は、Gpr119、Tak1、Nfkb、Tgfb1が有意に上昇したが、Erk1、Ampk、Jnk、Mapk14などの他の下流標的は上昇していなかった（補足図21）。TAK1のアップレギュレーションは、RAW264.7細胞および共培養造血幹細胞の2-OGによる活性化にも関連していた（補足図22）。In vitroの研究では、RAW264.7でTAK1をノックダウンすると、Tgfb1およびNfkbの2-OGによる上昇を抑制できたが、Grp119は抑制できなかった（図7d、e）ことから、NF-κBおよびTGF-β1がTAK1の下流標的であると考えられた。これらの結果から、GPR119/TAK1/NF-κB/TGF-β1シグナル経路がHFS誘発NASH肝における2-OG誘発MΦ活性化を仲介し、その結果TGF-β1が広く認識されているマスターレギュレーターとして作用して造血幹細胞を活性化していることが示唆された（図8）。
図7：2-OGはGPR119-knockdown MΦとその共培養造血幹細胞を活性化することができない。
a MΦのGpr119-knockdownは、2-OGによる共培養造血幹細胞の活性化を阻害した。qPCRでは、Gpr119-knockdown RAW264.7細胞と共培養した造血幹細胞における2-OGによる遺伝子Acta2、Col1a1、Col4a1のアップレギュレーションは検出されず。 7細胞をsiRNAで誘導した。 b 2-OG刺激は、RAW264.7細胞においてGPR119および炎症性サイトカインの産生増加を誘導する。 7細胞。qPCRは、2-OG刺激RAW264.7細胞において、24時間のGpr119、Nfkb、Tnfa、IL1b、Tgfb1のmRNA発現増加を検出した。TGF-β1（10 ng/mL）はポジティブコントロールとして用いた。c 抗TGF-β1は、RAW264.7細胞と共培養した2-OG誘導造血幹細胞の活性化を阻害した。qPCR解析により、RAW264.7細胞と共培養した造血幹細胞において、2-OG刺激によりActa2、Col1a1、Col4a1が上昇することが示された。これは、TGF-β1（1μg/ml）に対する抗体により阻害されたが、IL-1（1μg/ml）、TNF-α（1μg/ml）に対する抗体では認められなかった。 d Tak1ノックダウン用siRNAについての検証qPCRにより、RAW264.7細胞にtak1の発現が著しく低下したことが認められた。 e 2-OG刺激は、Tak1ノックダウンしたMΦにおけるNfkbおよびTgfb1の発現を促進できない。qPCR検出により、2-OG刺激は、Tak1ノックダウンRAW264.7細胞において、NfkbおよびTgfb1ではなく、Gpr119の発現を著しく増加させた。a、d、eについてはn=6、b、cについてはn=3。データは、平均値±SDで示した。アッセイは2回繰り返した。データの統計解析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを用いて、Tukeyの多重比較検定付き一元配置分散分析（≧3群）またはMann-Whitney検定（両側）により行った。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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図8】2-OGを介したMΦ依存的な造血幹細胞活性化の模式図である。
CL-HFSとBlautiaの相互作用により2-OGが生成され、GPR119-TAK1-NF-κBシグナルを介してTGF-β1のMΦ発現を刺激する。その結果、TGF-β1は静止造血幹細胞（qHSCs）から活性化造血幹細胞（aHSCs）を活性化し、Acta2、Col1a1、Col4a1などのECM遺伝子の発現を増加させる。この図は、Biorender（https://biorender.com）を用いて作成したものです。
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ディスカッション
NAFLDとNASHは、その有病率と公衆衛生への影響から、最近、関心が飛躍的に高まっています13。しかし、食事、腸内細菌、宿主代謝の相互依存性に関する理解はまだ不十分であり、NASH治療のための微生物および代謝ターゲットの同定を著しく妨げています30,31。我々は、西洋型CL-HFSを摂取させることにより、ヒト疾患の典型的な特徴を再現したマウスNASHモデルを確立しました。このモデルとヒト患者の生体試料を用いて、B. productaとその代謝物である2-OGが、NAFLD/NASHの発症・進展を促進する病原細菌および代謝メディエーターであることを突き止めた。2-OGは、GPR119/TAK1/NF-κB/TGF-β1シグナル経路を通じてMΦを調節することにより、造血幹細胞を活性化し、肝線維化を誘導することがメカニズム研究で示唆されています。
臨床および前臨床研究では、NAFLD/NASHにおける微生物関連メカニズムが強調されている32,33,34。しかし、NAFLDおよびNASH35を治療するために微生物を標的とした治療法は開発されていない。有益な細菌と病原性細菌を同定し、このますます蔓延する疾患の基礎となる細胞および分子メカニズムを解明するために、さらなる努力が必要である。私たちの研究は、B. productaを臨床的に関連性のあるNASH促進細菌として特定しました。BlautiaはLachnospiraceae科の属で36、NAFLDのヒト患者23で増加し、ネズミのNAFLD治療後に減少することが報告されています37。一方、他の研究では、Blautiaと内臓脂肪38や炎症性疾患39との間には負の相関があり、Blautia lutiの枯渇は肥満の子供におけるインスリン抵抗性の悪化に関係することが示された40。ここで、NASH発症時のマウスにおけるBlautiaの豊富さ（図3a、c）、ヒトにおけるその科Lachnospiraceaeの増加（補足図7）を明らかにしました。我々は、Blautiaの減少が抗生物質を介したNASH発症の抑制と関連していることを示した（図3cおよび図2）。特に、Blautiaの再増殖は、WTマウスでは肝炎や線維化を、CL-HFS飼育マウスではNASHのさらなる進行を有意に促進する（図5および補足図10）。同様に、B. productaの補充はND飼育マウスにおいて肝線維化を促進する（補足図11）。しかし、Blautia属を含むLachnospiraceaeが宿主の生理機能に与える影響は、異なる研究間で一貫性がないことが多い41。これらの結果は、ヒトNASH患者における微生物群集をプロファイリングし、その有益な効果や病原性を種レベルで明らかにする必要性を示唆しています。
微生物の代謝産物は、宿主の代謝と人間の健康に重要な役割を果たします42。短鎖脂肪酸、トリメチルアミン-N-オキシド、胆汁酸、内因性エタノール、インドールなどは、NAFLD/NASHの発症に大きく影響する重要な制御因子であると報告されている43。我々の知見に関連することとして、B. productaがフルクトースやスクロースを消化し、酢酸、エタノール、乳酸、コハク酸を生成することがNASH発症に関連することを示す研究がある36,44。一方、Blautia faecisが産生する酪酸は、肥満の子どもで減少していた40,45。今回、CL-HFS飼育マウスでは、Blautiaの存在量と並行して、エタノールと乳酸の平均的な増加が検出されたが、酢酸、酪酸、コハク酸の増加はなく、これらの増加は統計的に有意ではなかった（補足図6）。興味深いことに、我々は2-OGをCL-HFS誘発性ではなく、CCl4誘発性（補足図23）マウスの肝線維化を引き起こす、これまで認識されていなかった代謝メディエーターとして同定した。特に臨床的に重要なのは、マウスとヒトのNASHの両方で2-OGの増加が検出されることである（図3dおよび図4b）。さらに、2-OGの減少は、ABXを介した腸内細菌叢の抑制と関連しており、NASHの発症を予防的に遅らせることができる（図2）。我々のin vitroおよびin vivo研究は、B. productaが2-OGを産生するリパーゼ産生菌の一種であり、B. productaの再増殖が肝臓での2-OG蓄積につながることを示している（補足図9）。
我々の知見と一致して、アラキドン酸（AA）などのいくつかの生理活性脂質は、炎症反応を誘発することが示されている46,47。AAから生成されるプロスタグランジン（PG）は、免疫細胞（MΦsやTヘルパー細胞など）の活性化、病原体や損傷関連分子パターン（PAMPsやDAMPs）を介した炎症反応の増幅など、異なる細胞・分子メカニズムでいくつかの疾患において慢性炎症を引き起こすことがある48。一方、N-オレオイルエタノールアミン（OEA）やN-パルミトイルエタノールアミン（PEA）、N-リノレイルエタノールアミン（LEA）などのN-アシルエタノールアミン（NAE）などの生理活性脂質には、抗炎症作用があると報告されている49、50がある。Leafortらは、肝細胞におけるN-アシルホスファチジルエタノールアミン選択的ホスホリパーゼD（NAPE-PLD）の遺伝子ノックアウトにより、NAEや2-OGの産生が減少し、肝脂肪症の誘導に関連するAAsの産生が増加することを報告している49。Chenらは、NAPEを過剰発現させた大腸菌を経口投与したマウスは、肝トリグリセリド蓄積と肝炎を抑制したと報告しています50。また、2-OGは、腸L細胞などのヒト腸内細胞においてGPR119のアゴニストとしてグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）およびインクレチンの放出を刺激し、インスリン分泌を増加させ、耐糖能を改善することが報告されている29、51、52. これらの研究を総合すると、異なる生理活性脂質が炎症反応に与える影響は、特定の細胞タイプや環境に関連していることが示唆されます。
重要な知見として、MΦ/造血幹細胞のクロストークがCL-HFS誘発NASHを媒介する細胞メカニズムであることが挙げられます。本研究ではさらに、2-OGがMΦ依存的に造血幹細胞を活性化し（補足図15および19）、マウスの肝線維化を誘導する（図6）代謝制御因子であることを明らかにした。MΦでは、2-OGは造血幹細胞の活性化とECMタンパク質の生産を仲介するマスターレギュレーターであるTGF-β1の生産を制御する（図7b、c）。造血幹細胞を静止状態から増殖性・線維化性の筋線維芽細胞へと活性化することは、動物モデルおよびヒト患者の両方において、肝線維化の必須細胞イベントである53,54。MΦは肝炎と線維化に寄与し55,56、2-OGは重要な制御因子として機能する。これらの結果は、NASHにおける肝MΦと造血幹細胞との間のメカニズム的なつながりを立証するものである。
分子レベルでは、2-OGがGPR119アゴニスト29として機能し、MΦを活性化することを明らかにした。in vivoおよびin vitroの研究により、2-OG刺激によりマウス肝臓のGPR119産生が増加し（図6i）、MΦのGPR119発現が増加する（図7b）ことが示された。また、MΦのGPR119をin vivoでノックダウンすると、2-OGによる造血幹細胞の活性化が抑制された（補足図20）。さらに、Nfkb、Erk1、Ampk、Jun、Mapk14、Tak1などの炎症性サイトカイン遺伝子の産生を担う正規のシグナル伝達経路を網羅的に探索した結果、CL-HFS摂取により肝MΦにおけるTak1の発現が選択的に増加することが示され（補足図21）、CL-HFS誘発肝炎にTAK1が関与していることが示唆された。さらに、Tak1のノックダウンは、MΦにおける2-OG誘発GPR119発現には影響を与えなかったが、2-OG刺激によるTGF-β1およびNF-κB発現をブロックした（図7）。これらの結果から、2-OGはGRP119/TAK1/NF-κB/TGF-β1シグナル経路を介してMΦを活性化することが示唆された。TAK1は、マウス胚線維芽細胞やT細胞などでは自然免疫シグナルやアポトーシスに影響を与える必須かつ正の制御因子であるが、好中球では細胞の発達や炎症性シグナル経路の活性化に影響を与える負の制御因子であることが他の研究者によって示されている57，58，59．TAK1が生体内で2-OGまたはCL-HFS誘発性NASHを媒介するのに必要であるかどうか、および肝細胞の異なるサブセットにおけるTAK1の役割について調べるには、さらなる努力が必要である。
NAFLDの有病率は全年齢において女性よりも男性で高いことから60、本研究ではまず男性マウスを選択し、女性マウスは選択しなかった。したがって、本研究結果の女性マウスへの一般化可能性は不明である。
結論として、我々は、典型的な西洋型食餌を用いた臨床的に適切なマウスNASHモデルを開発し、NASHの病態を研究することを可能にした。B. productaと2-OGは、NASH関連細菌であり、GPR119シグナルを通じてMΦを調節する代謝調節因子であることが明らかになった。これらの細胞および分子メカニズムに関する知見は、NASH発症における食事/腸/肝臓/免疫の軸に関する理解を大きく前進させ、ひいてはこの世界的な健康脅威に対する食事および微生物による介入法の開発を促進することになる。
研究方法
研究の承認
肝メタボロミクスアッセイのために、ミズーリ大学病院で肥満のヒト患者8名から非識別情報を持つ肝臓検体を採取し、-80℃で凍結しました。患者のうち4人は組織学的にNASHが確認され、4人はNASHなしであった。詳細は補足表3に記載されている。本研究は、ミズーリ大学の施設審査委員会（IRB）により承認されている（IRB#2008258）。研究参加者全員から、書面によるインフォームドコンセントを得た。ヒトNASHの特徴を明らかにするために、関連するRNAサンプルを含む14枚のスライド状のホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ヒト肝生検が、カンザス大学医療センター施設審査委員会（IRB#11378）による倫理的承認と患者からの書面によるインフォームドコンセントを得てカンザス大学肝臓センターバイオレポジトリから提供された。検体のうち7検体は健康なドナーから、他の7検体は組織学的にNASHが確認された患者からのものである。
動物プロトコール（番号24640）は、ミズーリ大学コロンビア校動物ケア・使用委員会の承認を得た。動物実験は、脊椎動物の研究に関するすべての関連する倫理規定に準拠した。
動物、飼料、およびマウスNASHモデル
野生型雄性C57BL/6 Jマウス（Strain #000664）はJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）より購入した。すべてのマウスは、特定病原体を含まない施設内で、12時間の明暗サイクル、温度65-75°F（〜18-23℃）、湿度40-60％で維持した。マウスは1ケージあたり最大5匹まで収容され、適切な寝具と餌および水への自由なアクセスがある。マウスは、施設に到着後、実験前に少なくとも1週間はモニターした。
6週齢のC57BL/6 Jマウスをランダムにグループ分けし、指示された時間および実験においてND、CL-HFS、またはLFDを、1グループあたり5匹のマウスに与えた。Research Diets, Inc. (D19061310i, New Brunswick, NJ)から購入した脂肪40kcal%、果糖20kcal%、コレステロール2%、コリン0.05%のCL-HFSをマウスNASHモデルの誘発に使用した。Lab Supply, Inc.から購入した脂肪13kcal%、炭水化物62.14kcal%、コレステロール0.014%、コリン0.2%の普通食（ND）（LabDiet 5053, Fort Worth, TX）は対照食とした。Research Diets, Inc.から購入した（D07042710i, New Brunswick, NJ）5kcal%の脂肪を含む低脂肪食（LFD）を4週間与え、腸内細菌叢プロファイルを変調させた。
細胞株、細菌株、および培地
マウス肝星状細胞株mHSC61は、マウントサイナイ医科大学（米国ニューヨーク州）のScott L. Friedman博士からの寛大な贈り物であり、Prigrow III培地（Applied Biological Materials Inc.、Richmond, BC）中で培養されました。マウスMΦ細胞株RAW264.7（カタログ番号TIB-71、ATCC、Manassas、VA、USA）は、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で培養された。両系統の細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加した培地で、37℃、5％のCO2を含む加湿雰囲気下で培養された。DMEM、FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質溶液は、Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)から購入した。
細菌株であるブラウティアプロテラ（B. producta）（ATCC 27340）およびアリスティペスプトレディニス（A. putredinis）（ATCC 29800）は、ATCC（Manassas、VA）より購入した。両菌は、コロンビア血液寒天培地プレート（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）上で37℃の嫌気条件下で培養した。
16 SリボソームRNA（rRNA）遺伝子ライブラリーの調製とシークエンス
マウスから直腸遠位部の便サンプルを無菌的に採取し、直ちに-80 ℃で凍結した。DNA は PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Labs, Carlsbad, CA) を用いて、製造者の指示に従い単離した。16 S rRNA 遺伝子ライブラリーの調製、配列決定、および情報解析は、ミズーリ大学の DNA コア施設およびメタゲノミクスセンターで実施した。
簡単に説明すると、細菌の16 S rRNA遺伝子アンプリコンは、proBaseで入手できるユニバーサルプライマー（U515F/806 R）を用いて16 S rRNA遺伝子のV4領域を増幅して構築した。プライマーは、イルミナ標準アダプター配列で挟まれています。デュアルインデックスのフォワードプライマーとリバースプライマーをすべての反応に使用した。PCRは、100 ngメタゲノムDNA、プライマー（各0.2 µM）、dNTPs（各200 µM）、およびPhusion high-fidelity DNA polymerase（1U, Thermo Fisher）を含む50 µL反応中で行った。増幅パラメーターは、98℃（3分）＋［98℃（15秒）＋50℃（30秒）＋72℃（30秒）］×25サイクル＋72℃（7分）。アンプリコンプール（5 µL/反応）を合わせて十分に混合し、等量の50 µLのアンプリコンにAxygen Axyprep MagPCR clean-up beadsを加えて精製し、室温で15分間インキュベートした。その後、生成物を80%エタノールで複数回洗浄し、乾燥したペレットを32.5 µLのEBバッファー（Qiagen）に再懸濁し、室温で2分間インキュベートし、磁気スタンドに5分間設置しました。最終アンプリコンプールは、Advanced Analytical Fragment Analyzer自動電気泳動システムで評価し、Quant-iT HS dsDNA試薬キットで定量し、MiSeq装置でのシーケンスのためにイルミナの標準プロトコルにしたがって希釈した。
DNA配列はMU Informatics Research Core Facilityで組み立て、注釈を付けた。プライマーは、フォワードリードとリバースリードの5'末端に一致するように設計した。Cutadapt（バージョン2.6; https://github.com/marcelm/cutadapt）を使用して、フォワードリードとリバースリードの5'末端からプライマーを除去した。どちらかのリードが5'プライマーと一致しない場合、リードペアは拒絶され、許容されるエラーレートは0.1であった。第2プライマーを確実に除去するために、各リードに対して2回のパスが行われた。プライマー配列の3'末端と3bpの最小限のオーバーラップが除去に必要であった。
QIIME2 DADA2プラグイン（バージョン1.10.0）を使用して、以下のパラメータを組み込んだASV（amplicon sequence variants）のノイズ除去、複製除去、およびカウントを行った。1) フォワードリードとリバースリードを150塩基に切断、2) 予想エラー数が2.0以上のフォワードリードとリバースリードを破棄、3) キメラをコンセンサス法で検出し、除去した。QIIME2では、Rバージョン3.5.1とBiomバージョン2.1.7を使用しました。Silva.v132データベースを用いて、classify-sklearn手順で最終配列に分類子を付与した。
マウスの抗生物質カクテル処理
ABXは、バンコマイシン（0.5g/L）、ネオマイシン（0.5g/L）、イミペネム（0.5g/L）からなる抗生物質カクテルで、肝毒性は認められていない18、19。マウスは、腸内細菌叢の比較的選択的な抑制を誘導するためにABX処理を受けた。アンピシリン（100 mg/kg）、バンコマイシン（50 mg/kg）、メトロニダゾール（100 mg/kg）、ネオマイシン（100 mg/kg）および抗真菌剤アンフォテリシンB（1 mg/kg）からなる抗生物質カクテルABX5は、マウスの罹患率と死亡率にほとんど影響しない27。ABX5は、微生物相の広範な枯渇を誘導してマウスの腸を滅菌し、その後、NASHに対する効果を調べるために指示された個々の細菌種で再増殖させるために使用される。
ABXおよびABX5処置のために、マウスは、飲料水中のABXまたはABX5を指示された濃度で与えられた。抗生物質水は1日おきに交換した。Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)の抗真菌剤アムホテリシンBを除き、抗生物質はGold Biotechnology (St. Louis, MO)のものを使用した。
血液生化学検査
血液生化学プロファイル分析は、ミズーリ大学の獣医医療診断研究所において、Olympus 400AUe Chemistry Analyzer (Olympus Corporation, PA) を用いてアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、コレステロール、トリグリセリドの濃度を測定するために使用した。その結果をもとに、肝機能と脂質代謝を評価した。
腸内細菌叢の滅菌と細菌の再増殖
マウスは、上記のようにABX5処理をして腸を殺菌した後、B. productaまたはA. putredinisを、200μLのPBS中に3×108CFU/マウスの用量で、週2回6週間経口投与して再増殖した。
トータルRNA抽出とリアルタイムPCR（qPCR)
Total RNAは、RNeasy@ Micro Kit (Qiagen, Germantown, MD)を用いて、製造者の指示に従い抽出した。高容量cDNA逆転写キット（Applied Biosystems、Foster、CA）を用いて、全RNAのcDNAへの逆転写を行った。 qPCRは、SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）を含む20μL反応混合物で、QuantStudio 3 Detection System（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いて行った。反応は三重で行った。異なる遺伝子の発現をハウスキーピング遺伝子18 S RNAの幾何平均に正規化し、発現レベルのばらつきをコントロールした。データは、2-ΔΔCT法を用いて解析した。すべてのプライマーはIntegrated DNA Technologies, Inc. (Skokie, Illinois)によって合成され、それらの配列は補足表4に示されている。
肝臓非実質細胞（NPC）の単離
肝非実質細胞（NPC）または白血球の分離は、我々の以前の発表に記載されている62。簡単に説明すると、麻酔をかけたマウスの肝臓を、Ca2+フリーPBS中0.05%コラゲナーゼ（Gibco, Gaithersburg, MD）で門脈からポンプ速度4mL/minで灌流した。その後、肝組織を採取し、小片に切断し、GBSS（Sigma, St.Louis, MO）中の0.04%コラゲナーゼ中で室温、240rpmで連続振とうしながら20分間インキュベートした。得られた懸濁液を250μmメッシュでろ過し、350gで10分間、室温で遠心分離して細胞をペレット化した。細胞ペレットを懸濁し、GBSS(Sigma, St. Louis, MO)で洗浄した。遠心分離後、収穫した細胞をGBSS 15 mLに懸濁し、30% Nycodenz solution (Accurate Chemical & Scientific Inc., Westbury, NY) 18.45 mLと混合した。この細胞懸濁液は、1400gで20分間、室温でブレーキをかけずに勾配遠心分離を受けた。最上層の濃縮肝NPCを採取し、PBSで洗浄した後、培養液またはフローサイトメトリーバッファーに懸濁し、以下の実験に用いた。
フローサイトメトリー
フルオロクロム標識抗体によるリンパ球の生体外染色は、記載されているように単細胞懸濁液で行った62。細胞内染色のために、細胞を固定し、緩衝液（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で透過させ、フルオロクロム標識抗体で染色した。染色した細胞をFACScan Flow Cytometer（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて分析した。データはFlowJoソフトウェアバージョン10.7.1（Tree Star, Ashland, OR）を用いて解析した。この実験で使用したすべての抗体の出典は、補足表5に記載されている。
H&E染色
FFPE肝臓ブロックから4μmの組織切片を切り出した。切片は、ミズーリ大学の獣医医療診断研究所によってヘマトキシリンとエオシン（H&E）で染色された。画像は、光学顕微鏡（Keyence BZ-X810, Itasca, IL）を用いて撮影した。各組織切片のリンパ球、単球、MΦなどの炎症性細胞は、病理学者によってカウントされた。
肝臓コラーゲン染色および半定量化
シリウスレッドキット（カタログ番号9046、Chondrex、Redmond、WA）を用いたコラーゲン染色は、メーカーの指示に従い実施した。赤く染色された部分は、コラーゲンの沈着を示す。コラーゲン産生の半定量化は、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health/NIH, Bethesda, MD）を用いて各スライドの赤色染色領域の割合を計算することにより測定した。簡単に説明すると、画像解析時に画像をスケーリングしてグレースケールに変換し、その後、赤色染色領域のパーセンテージを検出した。詳細な手順はNIHのウェブサイト(https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/stained-sections/index.html)に記載されている。各組織切片について5フィールド（200×）を無作為に選択し、各サンプルの赤色染色領域の平均パーセンテージを算出した。各群の異なるマウスからの5つの肝臓組織切片を、コラーゲン産生の半定量化のために適用した。
脂質の染色と半定量化
凍結した肝臓ブロックを用いて、10μmの組織切片を作製した。Oil Red O Stain Kit (Catalog #ab150678, Abcam, Waltham, MA)による脂質染色は、製造者の説明書に従って実施した。その後、組織切片をヘマトキシリンで2分間染色して核を表示し、蒸留水ですすぎ、水性マウントメディウムでマウントした。画像は顕微鏡（Keyence BZ-X810, Itasca, IL）で撮影し、ImageJソフトウェアで評価した。
免疫組織化学染色（IHC）および半定量化
コラーゲン染色について記述したように調製した4μmの組織切片をIHCに使用した。簡単に説明すると、組織切片をキシレンで脱パラフィンし、様々なグレードのエタノール（100％、95％、80％、70％）で再水和し、溶液（Vector Laboratories Inc.、Burlingame、CA）で抗原除去を行い、0.2％ Triton X-100で透過処理を行い、血清でブロッキングし、BLOXALL試薬（Vector Laboratories Inc. その後、切片を最適な濃度の一次抗体（補足表5）、二次抗体、DAB基質と順次インキュベートして発色させた。シリウスレッド染色と同様の方法で半定量化を行い、ImageJソフトウェアでα-SMA染色面積の割合を測定した。
透過型電子顕微鏡(TEM)
新鮮な肝臓組織を直ちにカルノフスキー試薬（2％パラホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒド、 0.1M カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4）63で固定し、ミズーリ大学EMコア施設で処理した。観察は、JEOL JEM-1400 透過型電子顕微鏡（日本）の下で行われた。
NAFLD活性スコア（NAS）算出
NAS64は、0～8までの脂肪症、小葉の炎症、バルーニングの評点として広く使われている指標で、各サンプルについて算出しました。簡単に説明すると、NASは、脂肪症（0：5％未満、1：5～33％、2：34～66％、3：66％以上の脂肪蓄積）、小葉炎症（0：×200フィールドで炎症巣なし、1：2巣未満、2：2～4巣、3：4巣以上）、肝細胞バルーン（0：なし、1：少数のバルーン細胞、2：目立つバルーン）の非加重合計スコアである。NAS > 4はNASHと診断され、NAS < 3はnon-NASHと診断された。
siRNAトランスフェクション
siRNAおよびネガティブコントロール（NC）は、IDTから購入した（カタログ番号SR411245、OriGene Technologies, Inc.、Rockville, MD）。マウスRAW264.7細胞においてGPR119およびTAK1のsiRNA媒介ノックダウンを実施するために、細胞を6ウェルプレートで50％コンフルエンスまで増殖させた後、siTran 2.0 siRNA transfection reagent (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) で20nM siRNAトランスフェクションを受けていた。8時間後、培地を10％FBSを含む完全DMEM培地に交換した。その後のアッセイのために、細胞をさらに48時間培養した。
MΦにおけるGPR119のshRNAによるノックダウン
マウスGpr119 shRNAレンチウイルス粒子およびスクランブルshRNAレンチウイルス粒子は、OriGene Technologies, Inc.から購入した（カタログ番号TL507165V, Rockville, MD）レンチウイルス粒子を、80%コンフルエンスまで増殖させたRAW264.7細胞または骨髄由来のMΦにトランスフェクトした。感染後12時間目に、細胞培地を通常の培養液に変更した。3日目に、GPR119ノックダウンMΦと名付けたトランスフェクト細胞におけるGPR119mRNAレベルを測定し、GPR119ノックダウンを確認した。骨髄由来MΦは、以前行ったようにM-CSF（100 ng/mL, macrophage colony-stimulating factor）を用いて誘導した65.
2-オレオイルグリセロール処理
2-OGはCayman Chemical Companyから購入した（カタログ番号16537、Ann Arbor、MI）。肝線維化を誘導するために、マウスは、20μg/マウスの用量で2-OGのI.V.投与を週3回、6週間受けた。細胞刺激のために、マウスマクロファージ（MΦ）細胞株RAW264.7細胞、造血幹細胞、またはそれらの共培養に、50μg/mLの用量の2-OGを24時間投与した。
四塩化炭素(CCl4)の腹腔内投与
コーン油（Thermo Scientific, Waltham, MA）中のCCl4溶液（10%（v/v））を、WT C57BL/6 Jマウスに8mL/kg体重で週2回、6週間I.P注入して肝線維化を誘発した。
GC-MSによるサンプル調製と非標的代謝物分析
各マウスから肝生検を採取し、直ちに液体窒素で凍結した。メタボロームアッセイ用の肝臓サンプルは、以前に公開されたプロトコル66に若干の修正を加えたものとして準備した。詳細には、各肝臓サンプル50 mgを秤量し、0.1%ギ酸（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）を含む0.25 mLの予冷メタノールに添加した。リビトールは、動物の内因性代謝物ではないため、分析の妨げにならないことから、他者の先行研究67,68および我々の今回の研究で内部標準物質として選択されました。今回の分析では、リビトール（Sigma-Aldrich、St.Louis、MO）を32.79 µg/mLの濃度で各サンプルにスパイクし、その後20秒間ボルテックスし、その後ビーズビーターで室温でホモジナイズしました。ホモジナイズしたスラリーサンプルを、室温で13,000g、15分間遠心分離した。遠心分離後、各サンプルの上清200μLを、室温で窒素（N2、エアガス社、コロンビア、ミズーリ州）ガスの穏やかな流れの下で乾燥させ、誘導体化のために-80℃で保存した。代謝物の誘導体化は、GC-MS分析の直前に実施した。各乾燥抽出物を、50μLのピリジン中の新鮮なメトキシアミン塩酸塩（Sigma-Aldrich、セントルイス）を用いて、15mg/mLの濃度で50℃で1時間メトキシム化し、最後に、50μLのMSTFA (N-methyl-N-(trimethyl-silyl) trifluoroacetamide) +1% TMCS (chlorotrimethylsilane) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) で50℃、1時間に渡って誘導体化を行った。
GC／MS分析は、ミズーリ大学のメタボリックセンターのAgilent 5973質量選択検出器（MSD）と結合したAgilent 6890ガスクロマトグラフで実施した。GCカラムはAgilent J&W DB-5MS（長さ：60m、内径：0.25mm、膜厚：0.25μm）を使用しました。キャリアガスにはヘリウムを用い、1.0 mL/minの定流量で使用した。各サンプル（1 µL）は、スプリットレスモードで注入した。オーブン温度は、最初80 ℃で2分間保持した後、5 ℃/分で315 ℃にランプし、315 ℃で12分間保持した。トランスファーラインの温度は280 °Cであった。MSスペクトルは、スキャンモードで2.42スペクトル/秒の周波数で取得した。質量範囲は50〜650m/zとした。
GC-MSの生データをデコンボリューションし、自動質量スペクトルデコンボリューションおよび同定システムソフトウェア（AMDIS、バージョン2.73）を使用して処理した。代謝物の同定は、社内スペクトルライブラリ、GOLM Metabolome Databaseライブラリ、および米国国立標準技術研究所（NIST17）マススペクトルライブラリを用いたスペクトルマッチングにより行った。スペクトルマッチングの閾値は>75に設定した。Metabolomics Ion-based Data Extraction Algorithm (MET-IDEA, version 2.06) は、AMDIS 出力ファイル (.ELU) から代表イオン強度値を抽出し、その存在量を内部標準69の存在量に正規化することによって各代謝物の相対定量に用いられた。代表的なイオンとは、.ELUファイルに記載されている「モデル」イオンを指します。多変量解析は、オンラインソフトウェアMetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca)を用いて実施した。生データは、NIH共通基金のNational Metabolomics Data Repository（NMDR）70に寄託した。
B. producta培養液中およびマウスでの2-OG処理後の2-OG濃度の定量化については、真正標準2-OGを用いて検量線を作成した。0.01-1.25μg/mLの範囲でR2=0.9995の直線検量線が構築されました。
統計解析
グループ間の統計的有意性は、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン8.3.0、GraphPad Software, La Jolla, CA）を用いて、一元配置ANOVA（≧3グループ）に続いてTukeyの多重比較テストによる推奨補正または片側または両側マン・ホイットニーテスト（2グループ）を使用して決定した。データは、平均値±標準偏差（SD）で表される。p値0.05未満を有意差とみなした。
報告書の要約
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご確認いただけます。
データの入手方法
図を作成するためのすべての生データは、Source Dataファイルに記載されています。本研究で作成したマウス糞便サンプルの16 S rRNA遺伝子シーケンス生データは、NCBI BioProject IDでNCBI Sequence Read Archive (SRA) に寄託されました。PRJNA719798とフリーアクセスリンクがあります。マウス肝臓代謝物の生データは、NIH Common FundのNational Metabolomics Data Repository (NMDR)にstudy ID: ST002156で寄託されました。データはプロジェクトのデジタルオブジェクト識別子（DOI）: https://doi.org/10.21228/M8RQ67 から直接アクセスでき、アクセスコードなしで直接ダウンロードすることができます。ソースデータは本論文に添付されています。
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謝辞
このプロジェクトは、NIH R01DK130340（G.L., K.S.O., R.S.R. ）、NIH R01CA208396（G.L., M.K.., K.S.O.）、NIH R01CA250536（G.L. and K.S.O.）、一部VA Merit Award I01 BX004065-1（E.T.K. and K.S.O. ）、Ellis Fischel Cancer Center Pilot Project Grant（G.L. ）の支援を受けています。また、Scott L. Friedman博士の研究室には造血幹細胞株を提供していただき、電子顕微鏡コアファシリティとミズーリ大学メタゲノミクスセンターの技術サポートに感謝する。Nancy Walker (MU Department of Surgery)の原稿に対する批判的なレビューに感謝する。本研究で使用した検体は、ミズーリ大学病院と同様に、カンザス大学肝臓センターバイオリポジトリから提供されたものである。研究のために検体を提供してくださった患者さん、検体を調達してくださった医師、看護師、研究者の方々の貢献に感謝します。
著者情報
著者ノート
これらの著者は均等に貢献した。Ming Yang, Xiaoqiang Qi, Nan Li.
これらの著者は、この仕事を共同で監督した。Kevin F. Staveley-O'Carroll, Guangfu Li.
著者と所属
ミズーリ大学外科、コロンビア、ミズーリ州、65212、米国
Ming Yang, Xiaoqiang Qi, Nan Li, Jussuf T. Kaifi, Shiyou Chen, Andrew A. Wheeler, Eric T. Kimchi, Kevin F. Staveley-O'Carroll & Guangfu Li
中国医科大学第一付属病院放射線腫瘍科（中国遼寧省瀋陽市、110001番地
ナン・リー
ミズーリ大学エリス・フィッシェルがんセンター（ミズーリ州コロンビア、65212、米国
Jussuf T. Kaifi, Eric T. Kimchi, Kevin F. Staveley-O'Carroll & Guangfu Li
ハリー・S・トルーマン記念VA病院（ミズーリ州コロンビア、65201、米国
Jussuf T. Kaifi, Eric T. Kimchi, Kevin F. Staveley-O'Carroll & Guangfu Li
ミズーリ大学獣医学部獣医病理学教室（ミズーリ州コロンビア、65212、米国
アーロン・C・エリクソン
ミズーリ大学栄養・運動生理学教室（ミズーリ州コロンビア市、65212、米国
R. スコット・レクター
ミズーリ大学医学部消化器・肝臓学科（ミズーリ州コロンビア、65212、米国
R. スコット・レクター
ミズーリ大学分子微生物学・免疫学教室、コロンビア、ミズーリ州、65212、米国
李光復
貢献度
概念化。方法論：M.Y.、K.S.O.、G.L.。検証：M.Y., X.Q., N.L., A.E., and G.L: 形式分析：M.Y., X.Q., N.L., J.K., S.C., A.W., S.R., A.E., E.T.K., K.S.O., and G.L.,。調査：M.Y.、X.Q.、N.L.、A.E.、G.L.。M.Y.、X.Q.、N.L.、リソース。A.E., E.T.K., K.S.O., G.L. Writing-Original Draft: M.Y.執筆-レビューと編集。M.Y.、X.Q.、N.L.、J.K.、S.C.、A.W.、S.R.、A.E., E.T.K., K.S.O., and G.L. 資金獲得。E.T.K.、K.S.O.、G.L. 監修。E.T.K.、K.S.O.、G.L.
対応する著者
Kevin F. Staveley-O'CarrollまたはGuangfu Liに対応する。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者らは競合する利害関係はないことを宣言している。
査読
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Nature Communicationsは、Amandine Everardとその他の匿名の査読者の方々に感謝します。
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Yang, M., Qi, X., Li, N. et al. Western diet contributes to the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis in male mice via remodeling gut microbiota and increase production of 2-oleoylglycerol. Nat Commun 14, 228 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35861-1
引用元：ダウンロード
2021年9月14日受理
2023年1月4日受理
2023年1月16日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-35861-1
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ネイチャーコミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723(オンライン)
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