高飼料効率ブロイラーからの初期生菌叢移植は産卵鶏の腸内菌叢を再形成することにより体重増加を改善した

2022年11月20日 09:06

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.1022783/full

Abdelmotaleb A. Elokil1,2†, Wei Chen3*, Khalid Mahrose4, Mahmoud M. Elattrouny2, Khaled F. M. Abouelezz5†, Hafiz Ishfaq Ahmad6, Hua-Zhen Liu1, Ahmed A. Elolimy7, Mahmoud I. Mandouh8, Alzahraa M. Abdelatty8 and Shijun Li1*.
1中国湖北省武漢市、華中農業大学動物科学獣医学院、教育部、農業動物遺伝育種繁殖学重点実験室
2エジプト、ベンハ大学モシュトホル校農学部動物生産学科
3広東省農業科学院動物科学研究所、中国農業部畜産・養鶏繁殖国家重点実験室、中国農業部華南動物栄養・飼料科学重点実験室、中国農業部広東省動物繁殖・栄養重点実験室、広州動物繁殖・栄養公開実験室、中国・広東省
4ザガジグ大学技術開発学部動物・家禽生産学科（エジプト、ザガジグ
5アシュート大学農学部家禽生産学科、エジプト、アシュート
6イスラミア大学バハワルプール校獣医学部動物育種・遺伝学科
7エジプト、ギザ国立研究センター、動物生産学部
8 エジプト、ギザ、カイロ大学獣医学部栄養学・臨床栄養学科
産卵期は飼育・生産ステージの基礎となる時期である。このため、糞便微生物移植（FMT）は腸内細菌の多様性を調節し、鳥の生産成績に影響を与える。本研究の目的は、飼料効率の高いブロイラー鶏からのFMTが、レシピエントである在来種の成長が遅い採卵鶏の腸内細菌叢の多様性と成長をプログラムすることができる効果を評価することである。このため、合計150羽（生後1日）のジンホンひよこを無作為に2群に割り当て、各群は5反復で構成した（n = 15羽/反復）。対照群（CON）とFMTレシピエント鳥（FMT）には基礎飼料を与え、FMT群にはCobb-500鶏から調製したFMTを毎日経口投与した。FMTは生後1dから28dまで実施し、実験期間を通じて、飼料摂取量と体重を毎週記録した。28日間の試験終了時に、枝肉形質を評価し、微生物群の多様性と機能を特徴付けるために、16S rRNAベースのメタゲノム解析によるマイクロバイオーム評価のためのセカルサンプルを採取した。データはRソフトウェアを用いて統計的に解析した。FMT群では、体重と体重増加率が増加し、FCRが減少した（p = 0.01）。FMT投与により、Firmicutesの相対存在量およびFirmicutes/Bacteroidetes（F/B）比が増加した（p = 0.01）。Lactobacillus、Lactococcus、Bifidobacteriumの相対存在量はFMT群で高かった。一方、Enterococcus、Helicobacter、BacteroidesはCON群でより多く存在した（p < 0.01）。アミノ酸代謝、二次代謝産物生合成、糖質代謝、エネルギー代謝、酵素ファミリー、補酵素、ビタミンに関する微生物機能のKyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）パスウェイはFMT群で有意にアノテーションされていた。全体として、飼料効率の高いブロイラーのドナーからのFMT投与は、明確な腸内マイクロバイオームを再形成することで体重増加を改善し、それはレシピエントの産卵雛の代謝と健康に関連していると考えられ、産卵鶏の早期ライフプログラミングへのFMT技術の応用について新たな知見を提供するものであった。

はじめに
産卵鶏の早期成熟と早期体重増加は、群れの均一性と卵生産効率を達成するための重要なステップであることが判明した（Underwoodら、2021）。宿主とその腸内細菌叢の密接な共生関係は、食事からのエネルギー収穫に影響を与え、宿主の健康を制御し、自然免疫と獲得免疫を促進する（Deweerdt, 2014）。さらに、腸内細菌叢は腸管粘膜の透過性を確保し、食物栄養素の発酵と吸収を調節しており、これはエネルギーと成長活動の調節における細菌叢の重要性を説明するものと考えられる（Sonnenburg and Bäckhed, 2016）。これまでの研究では、鶏の腸内細菌叢の発達に影響を与えるいくつかの要因として、パフォーマンスタイプ（Elokil et al., 2020a）、医学（Elokil et al., 2020b）、受胎率（Elokil et al., 2020a）、食事（Abuelezz et al., 2019）などを調査しました。プロバイオティクスや抗生物質のツールは通常、腸内の100兆個の常在微生物のうち3桁までしか変化させないのに対し、FMTは微生物群全体の変化に最も有効な方法として報告されています（Borody and Khoruts, 2012; Cammarota et al, 2014）。FMTは、便／糞便移植または糞便細菌療法としても知られ、治療または医療目的のために微生物群集を調節し（Zhangら、2012）、レシピエントの腸内細菌叢の耐久性のある変化を確立するために、ドナー個人からの便の液体濾液をレシピエント個人の腸に注入することである（Grehanら、2010）。

微生物Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比は、体細胞成長の正の相関を持つ重要なものであり、これらの分類群には、宿主に余分なエネルギー源を提供する難消化性炭水化物を発酵させる細菌が含まれ、最終的に骨格筋と脂肪組織に貯蔵され、体細胞成長に使用されるからである（Cornejo-Parejaら、2019年）。体重選択により、腸内細菌叢に量的な遺伝的相関のある反応が見られ、F/B比の遺伝率に有意差があることが示され、高体重鶏と低体重鶏の遺伝的相関が推定された（Meng et al.，2014）。さらに、ヒト（Karvonen et al., 2019）、マウス（Vadder de and Mithieux, 2018）、ウサギ（Zeng et al., 2015）では、腸内細菌叢のF/B比が高いことが体重過多に関連しているとされています。F/B比が高いブロイラー雛の腸内細菌叢は、産卵雛に比べて飼料成分を発酵させて揮発性脂肪酸を生産する能力が高いことが明らかになった（Walugembe et al.、2015）。このことから、腸内微生物の多様性及び／又は豊富性における高いF/B比は、体重増加に関連することが示唆された。一方、糞便微生物移植（FMT）、プロバイオティクス、および抗生物質による腸内細菌叢の意図的な変化は、鳥の成長性能の改善などいくつかの目的で使用されている。

景洪鶏は、中国でも有数の在来種であり、卵生産の経済価値が高い重要な卵品種の一つとして湖北省に広く分布していることから、本研究の対象として選定された。風土病に対する高い抵抗性、粗飼料条件、広範な飼育環境などを備えている。したがって、本研究の目的は、FMTをツールとして、産卵鶏の腸内細菌叢の調節を介して初期ライフプログラミングを誘導し、早期の体重成熟につなげることである。これにより、腸内細菌叢の意図的なプログラミングが産卵期のヒナの成長性能にどのような影響を与えるかを理解するための実験的証拠を提供する。

材料と方法
実験デザイン、飼料、および鳥の管理
28日間の試験で Jing Hong産卵系統の孵化したばかりの未生雛の合計150羽を、以下の2つの処理群（n = 75/群）に無作為に割り付けた。(1) 基本飼料を与えた群 (CON) と (2) 基本飼料を与え、糞便微生物叢移植を行った群 (FMT) である。各食餌療法は5反復（15羽/反復）で構成された。ヒナは、試験期間中、華中農業大学の閉鎖型養鶏場の成長金属ケージに収容し、各ケージには動物の栄養所要量を確保するための手動給餌器および飲水器を1つずつ設置した。糞便サンプル採取のため、各ケージの下にパーチメント紙を敷いたトレイを設置した。飼料は、中国の飼料データベース（Beijing, 2004）を用いて、中国飼料標準のガイドラインに従って調合し、飼料成分および栄養組成は表1に示した。すべての鳥に同じ等窒素・等カロリー食を与え、水はアドリブで提供した。

表 1
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表1. 実験用飼料の組成および栄養レベル (給餌ベースとして%)。

FMT材料の調製と植え付け
便ドナーとして、孵化したばかりの Cobb-500 ブロイラー雛を毎日 75 羽使用した。FMTは、方法（Matsuoka et al., 2014）に従って調製した。簡単に説明すると、毎日午前中に新鮮な糞便サンプル10gを滅菌チューブ（50ml）に採取した。排泄物の白い部分は主に尿酸からなるため直ちに除去し、糞便部分を0.75％食塩水と1：6の割合で混合し（糞便1gに対して0.75％食塩水を6ml）、低速（800×g）で4℃、3分間スパンして未消化飼料および粒子状物質と微生物画分に分けた。沈殿物が完全に沈殿するまで氷上に保ち、上清を回収し、滅菌ガーゼで濾過して糞便懸濁液を得た。

産卵鶏におけるFMTの実施
ドナーであるCobb-500と同程度の年齢（1日齢）のレシピアントであるJing Hongの雌鶏150羽を無作為に2群（FMT群とCON群）に分け、各群75羽を5反復（n = 15羽/反復）で構成されるようにした。FMT群の各産卵ヒナには、生後1日目から28日目まで、毎日早朝、飼料と水にアクセスする前に、FMT溶液1mlを経口新鮮投与した。移植は1mlの経口投与で、先端が柔らかい柔軟性のあるオーラルシリンジを雛の舌の裏側に装着して行った。その後、雛が材料を飲み込んだことを確認するために監視し、投与後60分間は餌を与えないようにした。

生育成績および枝肉形質
体重は毎週記録し、1週間の体重増加量を決定するために使用した。飼料摂取量は毎週記録し、FCRを算出した。生後28日目に、群平均BWの健康なヒヨコ11羽を選び、安楽死させた。ヒナの胸部（大胸筋）および大腿部（太鼓腹）の筋肉を剥いで除骨し、重量を測定した。肝臓の重量、および十二指腸、空腸、回腸、噴門の長さ（cm）をAbdelattyら（2021）と同様に測定した。

微生物DNAの抽出
微生物遺伝子解析のためのサンプルを得るために、盲腸からの新鮮なサンプル（n＝11／群）を嫌気条件下で屠殺後5〜10分後に無菌的に採取し、滅菌2mlクライオチューブ（Sarstedt、Nümbrecht、ドイツ）に入れた後、サンプルを全微生物DNA抽出まで直ちに-80℃で保管した。その後、すべてのサンプルチューブを液体窒素中で瞬間凍結し、その後、全微生物DNAの抽出のために-80℃で保存した。

DNA stool mini kit（QIAmp DNA Stool mini Kit; QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて、300μlの盲腸試料から製造者の指示に従って微生物DNAを抽出した。DNA 濃度の定量には，Qubit dsDNA HS assay kit (Life Technologies) を用いた Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., Shanghai, China) を使用した．

PCR 増幅と 16S rRNA 配列決定
抽出した各DNAサンプルのアリコートをPCR増幅の鋳型として使用した。さらに、16SリボソームRNA、ライブラリ調製、およびDNA配列決定は、商業プロバイダー（Personalbio Co.Ltd.、中国、上海）によって実施された。およそ570bpのアンプリコンサイズを生成するために、V3-V4領域アンプリコンを標的とするプライマー（フォワード5′CCTAYGGRBGCASCAG GNG 3′、リバース5′GGACTACNNGGTATCTAAT 3′ ）を増幅に用い、PCR生成物を精製した（Busatoら、2022; Tawfikら、2022). PCR条件は、初期変性、アニーリング、伸長を行い、94℃4分、94℃30秒、50℃45秒、72℃30秒のサイクルを25回繰り返した。

配列の品質管理および操作型分類単位（OTU）の算出
各ライブラリーについて、V3-V4領域の増幅ライブラリーをプールし、Illumina Miseq 2000プラットフォームシーケンサーを用いて、7サイクルのインデックスリードで生成した250bpペアエンドリード（ミスマッチのない10bp以上のオーバーラップを持つ配列が組み立てられる）を含む配列を決定した。得られたオーバーラップペアエンドリードをスティッチし、バーコードとプライマー配列を除去した後、Microsynthを用いて品質フィルタリングを行った。配列の品質管理を行うため、事前にフィルターをかけ、ステッチしたリードをQIIMEソフトウェア（Quantitative Insights into Microbial Ecology, v1.8.0）により処理した1。次に、生タグを前処理してキメラ配列を除去し、有効なタグを生成することでクリーンタグを作成した。最後に、QIIMEソフトウェアで配列の定量解析を行い、USEARCHソフトウェア（v5.2.236）を用いてキメラ配列を除去した2。

バイオインフォマティクス解析
各サンプルについて、キメラ配列（160 bpより短い）を除去した後の品質配列を数え、各サンプルに含まれる配列の長さ分布を特徴付けるために、Rソフトウェアを用いて配列長分布の統計的推定を作成した。その後、オープンリファレンスOTUピッキングとUCLUST (Edgar, 2010)を用いて、類似度97%のOTUに配列がクラスタリングされた。さらに、Specaccum解析を適用し、すべてのサンプルサイズとOTU存在量マトリックスが群集の豊かさを推定するのに十分であるかどうかを確認した（補足図S1）。最後に、QIIMEのGreengenesデフォルトデータベースを用いてOTUの分類を決定した（DeSantis et al.、2006）。その後、グループ間（CONとFMT）で最も豊富なOTUを、16S rRNAマーカーをターゲットに、分類学的分類のためにBLASTNを使用してNCBI核酸データベースに対して分類した。細菌と古細菌の解析には、16S rRNA遺伝子のデータベースであるGreengenes (Release 13.8)3 とRDP (Ribosomal Database Project, Release 11.1)4 をデフォルトで使用し、サンプル間およびグループ間のOTU多様性を特定した。サンプル（＝グループ）ごとのOTUの総数を計算するために、Rソフトウェアを用いてベン図を作成した。

微生物組成のアノテーション
12,000配列の希薄化深度を用いて、サンプル間のα-およびβ-多様性解析を行った。α-多様性は、重み付けなしのUniFrac距離および重み付けしたUniFrac距離（Lozupone et al.、2007）を用いて決定した。α-多様性の解析（Shannon、Simpson、Chao1、ACE 指数）は、試料中の微生物群集構造の変動の要因を見つけるために適用された（Shannon, 1948; Simpson, 1949; Chao and Shen, 2004）。また、最大希薄化深度12,000配列と観測されたOTU指標を用いて、試料中のβ多様性の希薄化曲線（PCA、PCoA、NMDS、UPGMAクラスタ分析）を算出した（Ramett, 2007）。系統樹構築のオーダー（MEGANとKRONA）は、微生物のインタラクティブな可視化に使用し、OTUタグに基づくグループ間の種アノテーションの結果を視覚的に表示した。そして、上位50位の存在量の分布とサンプル間の類似度によってヒートマップを構築した。PLS-DA、LDA、PERMANOVA、ANOSIMの順序分析を行い、重要種のスクリーニングのためのグループ間の群集構造のばらつきを明らかにした。

微生物機能予測のためのアノテーション
16S rRNA遺伝子から全ゲノム配列に基づいて細菌の代謝機能を予測するため、Tax4Funに基づいて配列のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）機能アノテーションを実施し、その後、統計解析メタゲノムプロファイル（STAMP）ソフトウェアパッケージを使って可視化しました（Langille et al.、2013年）。KEGGオーソロジー（KO）は、非微生物パスウェイを削除したKEGGレベル2パスウェイに分類した。分類された遺伝子は、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理、細胞プロセス、生物システム、ヒト疾患の6つに分類され、それぞれはさらに複数のレベルに分類された。NSTI（Nearest Sequenced Taxon Index）は、サンプル中の各OTUについて、配列決定された参照ゲノムの利用可能性を示す指標として使用されました。これは、OUT abundanceを考慮し、Greengenes reference phylogenyに基づいて、OTUと最も近い配列決定済み参照ゲノム間の各サンプルの平均枝長を計算する。最後に、Rソフトウェアを用いて、各サンプルにおける最も豊富な機能予測上位50のクラスター分析を行い、ヒートマップで表示した（Langille et al.）

統計解析
β多様性の解析には、PCAとPCoAが含まれ、これらは重み付きUniFracと重みなしUniFracを用いて計算された。CON群とFMT群における異なる細菌分類群を推定するために、Rソフトウェアバージョン3.2.2、R Coreの一元配置分散分析とLM手順を適用した（R Development Core Team、2015）。各ヒナ個体は実験単位とみなし、FMTは統計モデルにおける固定効果として含まれた。すべての差はp < 0.05で有意とみなし、p < 0.10で傾向とみなした。一対比較はT検定を用いて行った。

結果
生育成績および枝肉形質
産卵鶏のCON群とFMT群との間の体重、日増体重、内臓重量および消化管切片の長さの差を表2に示す。FMTは最終体重を2.5％増加させ（p＜0.01）、1日平均増体重を2.3％増加させた（p＜0.01）。飼料要求率はCON群に比べFMT群で低く（p=0.01）、FMT鶏は対照群に比べ胸筋重量が9.7％、大腿筋重量が17.63％増加した（p=0.01）。肝臓重量は8.5%増加した（p = 0.01）。一方、十二指腸、腸骨および盲腸の長さは、MFT群ではCON群に比べ短かった（p＜0.05）。

表2
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表2. ドナーである商業用ブロイラー鶏からレシピエントである在来種景洪産卵鶏への経口糞便微生物叢移植が体重およびいくつかの枝肉形質に及ぼす影響1.

16S rRNA配列の測定基準と品質
22羽の鶏（n = 11/食餌処理）から得られたハイスループットシーケンスでは、合計775,945リード（サンプルあたり平均35,270リード、範囲32,836-38,767リード；補足図S2）を得た。平均リード長は160 bpで、OTUに示される配列長の分布は、QIIME（Quantitative insights into microbial ecology）を用いてgreengeneデータベースに基づいて作成し、ドメイン、門、クラス、目、ファミリー、属などの異なる分類レベルについて特徴づけを行った。サンプルによく含まれると考えられる分類群がさらなる解析に使用された。対照群および抗生物質曝露群における各分類レベルのOTUの統計的数をSupplement Table S1に示す。これらのサンプルからは、12 phyla、23 classes、35 orders、60 families、77 genera、31 speciesが同定されたSupplementary Table S2.

アルファおよびベータ多様性
観測された全OTU数、α指数（ACE、Chao1）、グループ間の多様性指標（Simpson、Shannon）を表3にまとめた。観察された総OTU数は、FMT群でCON群より有意に増加した（p < 0.01）。一方、ACEとChao1の平均値は、FMT群でCON群よりも有意に減少した（p < 0.01）。同様に、Simpson指数とShannon指数も、FMT群ではCON群よりも有意に減少した。さらに、β-多様性指標、主成分分析（PCA）、非計量多次元尺度法（NMDS）、主座標分析（PCoA）が得られ、CON群とFMT群の群間距離と群間距離を測定した。

表3
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表3. 対照群と糞便微生物移植（FMT）群のヒナ間の細菌群集の観察された操作的分類単位（OTU）およびα-多様性測定値。

非加重UniFrac距離に基づくPCAを図1に示す。PCAプロットにより、CON群のサンプル間の距離はFMT群のそれよりも小さく、FMTの方がより多様な腸内細菌叢を有していることが示された。類似性分析のR値（ANOSIM；0.38）は、CON群とFMT群内のサンプル間で相関があった（p＜0.01）。同様に、NMDSの加重値および非加重値から、CON群のサンプルはFMT群のサンプルよりも緊密なクラスタを形成していることが示された。変異型多変量分散分析（PERMANOVA）から得られたR値については、CON群とFMT群のサンプル間およびグループ間のUniFrac距離の重み付け（R = 0.25; p < 0.05）および重み付けなし（R = 0.19; p < 0.01）で有意な相関が見られた。また、比較解析のボックスプロットでは、グループ内で最も低いグループ距離が有意に推定された（p < 0.05）。

図1
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図1. 非加重UniFrac距離に基づくPCA（主成分分析）。(A) PCA、(B) UniFrac距離の加重および非加重の非計量多次元尺度法（NMDS）、および (C) 対照群とFMT群のUnifrac距離の群間/群間差の比較分析用boxplot。2つの独立したクラスターは、ANOSIM (R = 0.38***) およびPERMANOVAにより、対照群とFMT群のunifrac距離の重み付け (R = 0.25**) および非重み付け (R = 0.19***) に有意な相関を示した。

微生物の構造と組成
図 2 は、FMT が景洪鶏の腸内細菌叢構造に及ぼす影響を示している。CON群と比較して、FMT群ではOTU数が有意に増加し（p < 0.01）、ユニークなOTUが多く存在することがわかった。さらに、マイクロバイオームコミュニティにおける最も豊富な上位50属のヒートマップとクラスター分析を組み合わせると、CON群とFMT群のサンプル間で類似したマイクロバイオーム組成があることが明らかになりました。マイクロバイオームの各門・科の分類群の相対的存在量（総配列数に対する割合）に関するCON群とFMT群の違いを図2および表4に示す。

図2
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図2. FMTがニワトリの腸内細菌叢の構造に与える影響。(A）共通ユニットとユニークユニットのグループ間（ControlとFMT）のOUT数を示すベン図。(B) グループ間で相対量に有意差のある属を示すヒートマップ。(C）門・科のControl群とFMT群の各分類レベルにおける群間の分類学的構成分析。

表4
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表4. メタゲノム解析を用いて推定した対照群と糞便微生物移植（FMT）群のヒナの糞便微生物叢における分類群の相対存在量（総配列数に対する割合）1。

門レベルでは、FMT群ではFirmicutesの相対量が増加し、Bacteroidetesの相対量が減少し（p < 0.01）、FMT群ではCON群よりFirmicutes/Bacteroidetes比（F/B比）が増加した（p < 0.01; 表4）。マイクロバイオームの各門および科の分類群の相対的存在量（総配列数に対する割合）に関するCON群とFMT群の違いを図2および表4に示す。門レベルでは、FMT群でFirmicutesの相対量が増加し（FMT vs. CON, 89.05 vs. 75.39%）、Bacteroidetesの相対量が減少した（FMT vs. CON, 2.51 vs. 5.80%）（p < 0.05）。その結果、Firmicutes/Bacteroidetes比（F/B比）はCON群よりもFMT群で増加した（FMT vs. CON, 35.45 vs. 12.99%; p < 0.01; Table 4）。一方、Proteobacteria（FMT vs. CON, 3.52 vs. 7.98%）とCampilobacterota（FMT vs. CON, 0.164 vs. 0.811%）の相対存在量はFMTグループの鶏で減少した（p < 0.01; Table 4）。同様に、図2および表4に示したように、Verrucomicrobia（FMT vs. CON, 0.740 vs. 1.36%）およびTM7（FMT vs. CON, 0.005 vs. 0.042%）の相対存在量は、FMT群においてCON群より減少した（p＜0.05）。

属レベルでは、Lactobacillus (FMT vs. CON, 17.87 vs. 9.12%), Lactococcus (FMT vs. CON, 2.51 vs. 5.80%), Bifidobacterium (FMT vs. CON, 0.064 vs. 0.051%) などいくつかの共生分類群の相対存在比が CON 群と比較して FMT 群で有意に増加した (p < 0.01; Figure 2; Table 4)。一方、Enterococcus (FMT vs. CON, 0.55 vs. 0.86%), Helicobacter (FMT vs. CON, 1.027 vs. 1.589%), Bacteroides (FMT vs. CON, 0.054 vs. 1.30%) などいくつかの病原性分類群の相対存在量はCON群と比較してFMT群で有意に減少した (p < 0.01; Figure 2; Table 4)．

産卵鶏のFMTによる腸内細菌群集の再形成
FMTと関連する特定の細菌分類群を線形判別分析（LDA）に基づきLEfSe分析した結果を補足図S3に示す。宿主-微生物相軸の構造を代表するLEfSeクラドグラムは、CON群とFMT群の間で有意に異なる計64の細菌分類群を含み、FMT群では7分類群（Lactobacillallus、Lactobacillaceae、Lactobacillales、Bacilli、 Dietzia、 DietziaceaeおよびAeriscardovia）だけと、群間の微生物相の著しいシフトを示している。LDAスコアプロットは、2つのグループ間で有意なグループ濃縮分類群を示した（p < 0.05）。

図3は、Metastats解析を用いて、門と属のレベルでグループ間の存在量の比較を行ったもので、FMTグループでFirmicutesとAcidobacteriaの門、DietziaとRuminococcusの属が増加していることが示された。サンプル間の類似性を算術平均による重み付けしないペアグループ法（UPGMA）分析で評価したところ、CON群とFMT群のサンプルはほぼ類似しており、階層ツリーの異なるクラスターに分布していた（補足図S4）。

図3
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図3. コントロールとFMTのヒナのグループ間の分類群存在度の有意差に関するメタスタッツ比較統計検定。(A) 6つの門 (B) 20の属で、F/B比がコントロール群に比べ高い。

微生物機能予測
KEGGパスウェイ解析の第2レベルに基づくCON群とFMT群の相対的存在量比較をTable 5およびFigure 4に示す。CON群とFMT群の間で、細胞プロセス、環境情報処理、遺伝情報処理、免疫情報処理、代謝情報処理、生体システム処理の計6つのカテゴリーが明らかになった。

表5
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表5. メタゲノムプロファイルの統計解析を用いて推定した、CON群とFMT群のヒナ間のKEGG第2レベルパスウェイによって予測される機能性マイクロバイオームの相対的存在量。

図4
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図4. KEGGセカンドレベル解析の機能予測に対するFMTの影響。(A) KEGG オーソログ遺伝子クラスター存在量ヒートマップとサンプル間の機能群存在量分布の類似性に基づくクラスター分析を組み合わせたもの（赤は対応するサンプルで存在量の多い機能群、緑は存在量の少ない機能群を表す）、共通機能群と固有機能群のベン図、(B) PLS-DA 識別分析プロットは同じ群に属するサンプル同士が近く、異なる群の点間の距離は遠く離れていることを示している。

細胞プロセスのカテゴリーでは、細胞の増殖と死、輸送と異化のレベルは、FMTグループの方がCONグループよりも相対量が多かった（p < 0.01）。また、環境情報処理カテゴリーの膜輸送経路のレベルは、FMT群でCON群より有意に増加した（p < 0.01）（表5）。遺伝情報処理のカテゴリーにおける機能的マイクロバイオームの予測では、DNAの複製と修復、転写、翻訳の3つのパスウェイのレベルがFMT群で有意に増加した（p < 0.01）。免疫情報処理カテゴリーにおける感染症パスウェイの1レベルが、FMT群ではCON群と比較して増加した（p < 0.05）。代謝処理のカテゴリーについては、アミノ酸代謝（p＜0.01）、二次代謝物生合成（p＜0.01）、糖質代謝（p＜0.01）、エネルギー代謝（p＜0.05）、酵素ファミリー（p＜0.05）、補酵素とビタミン（p＜0.05）についての経路レベルの群間（FMTとCON）差はFMT群がCON群より高いことが明らかにされました。内分泌系のパスウェイレベルは、CON群と比較してFMT群で有意に上昇した（p < 0.01）。

CON群とFMT群の間の解析と組み合わせたヒートマップでは、最も多いKEGGオーソログ遺伝子の上位50個がクラスター化した。コントロール群のサンプルは、類似の微生物組成に基づいてクラスターを形成していた。共通機能群と固有機能群のベン図では、FMT群がCON群より多くの機能群を持つことが明らかになった。PLS判別分析（PLS-DA）プロットから、同じグループに属するサンプルは、異なるグループのサンプルよりも互いに類似していることが示された。

考察
ニワトリの健康状態やパフォーマンスを向上させるために、早期のライフプログラミングに関心が高まっている。最近の報告では、腸内細菌叢を調節するために鳥の初期生活におけるFMTの適用について有望な結果が示されている（Siegerstetterら、2018年；Yanら、2021年）。そこで、ブロイラードナー雛からFMTを毎日投与した場合の安全性と、成績の悪い在来種産卵雛の幼生期における腸内細菌叢の組成、構造、機能を変化させ代謝を改善する能力について検討しました。コブ500ブロイラー（ドナー）の腸内細菌叢は、飼料効率および体重増加の改善に関する明確な微生物群集を含むいくつかの研究において以前に特徴付けられた（Siegerstetterら、2018年；Richardsら、2019年）。

本研究では、支配的な門は、FirmicutesおよびProteobacteriaであり、Bacteroidetes、Cyanobacteria、およびActinobacteriaが続くが、各門の割合は変動し、FMT処理に影響されることが示された。また、FMT群では、FirmicutesとF/B比が増加しており、これはヒナの体重増加とも一致していた。したがって、これまでの研究により、ヒト（Karvonenら、2019）、マウス（Everardら、2014）、ウサギ（Zengら、2015）などの異なる種において、F/B比が哺乳類の体重増加に関連することが示されているので、盲腸微生物叢のFirmicutesおよび高いF/B比が飼料エネルギーをより効率的に使用できるためではないかと推測された。さらに、対照群とFMT群の差は、後者が、消化管内の微生物が豊富なブロイラー雛から豊富な微生物相を得たため、より多くの栄養素を摂取できることに起因していると考えられる。

また、ほとんどのα-diversity index（Ace、Chao、Shannon、Simpson）はFMT群よりも対照群で高く、Firmicutesの過剰発現やF/B比から均一性が高いと思われるFMT群よりも対照群の腸内細菌叢がより多様であることが示唆された。さらに、本研究では、FMTを受けたヒナでは、Lactobacillus、Lactococcus、Bifidobacteriumがより豊富に存在した。Lactobacillusは、糖質（Goh and Klaenhammer, 2014）および脂質代謝（Falcinelli et al, 2015）、免疫系代謝（Xin et al, 2014）に関与することが知られています。乳酸菌は、栄養吸収を促進し、宿主免疫を強化し、腸の炎症反応を防ぐため、最も重要な細菌属である（Wang et al.、2018）。合わせて、乳酸菌とビフィズス菌は、腸の生理学と体重増加に有益であるとされています。

腸内細菌叢組成は、宿主-マイクロバイオーム相互作用を通じて宿主の生理反応に影響を与える最も内的な要因の1つであり、正常な腸内細菌叢は腸管透過性、栄養消化性、および抗炎症反応を可能にします（Elokilら、2020c）。今回の結果から、FMTによる微生物分布のシフトが体重増加の改善に成功したことが示唆された。したがって、FMT群の腸内細菌叢は、対照群と比較して、宿主が体重を増やすために、複雑・単純な炭水化物を消化し、揮発性脂肪酸、微生物タンパク質、ビタミンなどの栄養素をより多く生産することができるのである。

原核生物の免疫系から発展したCRISPR-Cas技術により、近年、科学者は比類ない容易さと効果で生物を調べ、改変できるようになりました（Vercoeら、2013；Ahmedら、2018）。CRISPR-Casシステムの細菌集団への送達は、もう1つの選択肢です。これらのシステムは、特定のマイクロバイオーム構成要素を標的にして破壊するように設計することができます（Ramachandran and Bikard, 2019）。これらの技術を合わせると、マイクロバイオームの構成部分と人体の間に存在する複雑な関係を探求する魅力的な機会が得られます。また、マイクロバイオームを特異的に標的とする薬剤の創製に向けた新たな可能性を開くものでもあります（Stout et al.）ほとんどの細菌はCRISPR-Casシステムを持っており、その40%に存在する。特定の状況では、内因性のCRISPR-Casシステムを使用することが可能かもしれませんし、他のケースでは、設計されたCRISPR-Casシステムを標的細菌に導入することが可能かもしれません（Hullahalli et al.、2017）。プロバイオティックまたはマイクロバイオーム関連酵母、細菌、バクテリオファージのゲノムは、いずれもこれらの方法を用いて改変することが可能である。さらに、その配列に基づいて、残りのマイクロバイオームに影響を与えることなく、特定の株を根絶するために採用することができます（Jiang et al.、2013）。

我々の知見は、FMT処理が景洪鶏の早期体重増加を促進することを明らかにし、FMT群の鶏は対照群よりも身体的成長が早期に完了し、産卵期間の長さが増加することを推測した（Choi and Cho, 2016）。予想通り、FMT群のコックは、櫛の高さと色、ワトル長、耳たぶ幅、翼幅、胴回り、太鼓腹長、精巣重量などの身体・外部形態形質が良好となる（Metsler-Zebeli et al.、2016）。産卵鶏の体重-年齢関係は、産卵鶏の卵重量および生産卵数に直接関連しているため（Di Massoら、1998）、卵重量は、産卵性能の成功のための重要な基準である適切な群れの均一性を達成する（Lacinら、2008）。本研究では、腸内細菌叢の均一性を制御し、増加させるFMTによって達成された。

結論
結論として、本研究の結果から、飼料効率の高いブロイラーのドナーから産卵期のヒナへの FMT 投与により、腸内に異なる微生物群集がコロニー形成され、対照群と比較して腸内機能および抗菌病原性が改善されることが示された。さらに、FMTを適用した低成長ヒナ（Jing Hong）の初期生活プログラミングは、Firmicutes、Lactobacillus、Lactococcus、Bifidobacteriumの食道内存在量の増加を介して成功し、これは産卵ヒナの糖質代謝および健康増進に関連していると考えられた。FMTは動物の成長パフォーマンスを向上させるための潜在的な戦略である可能性がある。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表されたデータは、中国科学院生物情報センター／北京ゲノム研究所リポジトリのゲノム配列アーカイブ（Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021）（Nucleic Acids Res 2022）に寄託され、アクセッション番号GSA: CRA007995。https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa で一般に公開されている。

倫理に関する声明
動物実験については、The experimental procedures used to the Care and Use of Laboratory Animals of the Standing Committee of Hubei People's Congress (No. 5) のガイドラインを満たし、中国湖北省の生物学研究動物管理委員会および中国華中農業大学の倫理委員会（承認番号 HZAUCH-19006）から承認されている。本研究では、動物の苦痛を最小限にするためにあらゆる努力を払い、ARRIVEガイドラインに準拠して実施した。

著者の貢献
AbE、H-ZL、SL は本研究の構想・設計に貢献し、実験を実施した。WC、KA、ME、KMはデータベースの整理を行った。H-ZI、AhE、MM、AAが統計解析を行った。SLとWCはこのプロジェクトの一部資金協力者である。すべての著者が等しく原稿を書き、修正し、論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。

資金提供
本研究は、中国自然科学基金（No.32072707）、湖北省科学技術重大プロジェクト（2020ABA016）、中国国家重点研究開発計画（SQ2021YFD1300002）、ハイレベル農業科学アカデミー科学革新戦略建設特別基金（R2020PY-JX008および202106TD）、エジプト科学研究省科学技術革新基金機関（39382）により支援されています。資金提供者は、原稿のデザイン、分析、解釈、執筆に関与していない。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.1022783/full#supplementary-material に掲載されています。

脚注

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キーワード：微生物移植、初期生活プログラミング、16S rRNA遺伝子、体重増加、産卵鶏

引用元 Elokil AA, Chen W, Mahrose K, Elattrouny MM, Abouelezz KFM, Ahmad HI, Liu H-Z, Elolimy AA, Mandouh MI, Abdelatty AM and Li S (2022) Early life microbiota transplantation from highly feed-efficient broiler was improved weight gain by reshaping the gut microbiota in laying chicken.（飼料効率の高いブロイラーからの早期生命微生物移植は産肉鶏の腸内微生物相を再構築することで体重増加率を向上させた）。Front. Microbiol. 13:1022783。doi: 10.3389/fmicb.2022.1022783

Received: 2022年8月18日; Accepted: 2022年10月10日
公開：2022年11月18日

編集者

中国亜熱帯農業研究所（CAS）周西宏
査読者：Waqas Ahmed, The University of the Univ:

Waqas Ahmed, The University of Tennessee, United States（テネシー大学、米国
Aqeel Ahmad, フロリダ大学, 米国
Copyright © 2022 Elokil, Chen, Mahrose, Elattrouny, Abouelezz, Ahmad, Liu, Elolimy, Mandouh, Abdelatty and Li. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用，配布，複製は認めない．

*Correspondence: Wei Chen, cwei010230@163.com; Shijun Li, lishijun@mail.hzau.edu.cn

†ORCID: Abdelmotaleb A. Elokil https://orcid.org/0000-0001-7175-1408
Khaled F. M. Abouelezz https://orcid.org/0000-0002-6141-1095

免責事項：本記事で述べられているすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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