乳牛の黄色ブドウ球菌臨床乳房炎感染と相関する生乳中の細菌群集の経時的センサス
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公開日：2022年11月24日
乳牛の黄色ブドウ球菌臨床乳房炎感染と相関する生乳中の細菌群集の経時的センサス
Soyoun Park, Dongyun Jung, ...Jennifer Ronholm 著者を表示する。
Animal Microbiome 4巻 記事番号：59（2022） この記事を引用する
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指標詳細
概要
背景
黄色ブドウ球菌は、乳牛における臨床的乳房炎（CM）の一般的な原因である。牛の乳腺微生物叢を最適化し、黄色ブドウ球菌のコロニー形成に抵抗させることは、現在研究が進んでいる分野である。しかし、感染に抵抗するようにマイクロバイオームを操作するために必要となる、黄色ブドウ球菌と常在菌の間の細菌間相互作用の詳細については、まだ知られていない。本研究では、S. aureus CM前、CM中、CM後のウシ乳の細菌群集の変化の特徴を明らかにし、感染した宿舎と健康な宿舎の乳中に存在する細菌群集を比較することを目的としている。
研究方法
ホルスタイン種の乳牛 698 頭から、泌乳期間全体にわたって四半期レベルの牛乳サンプルを採取した。10 頭からなる合計 11 の分房が S. aureus CM に感染し、健康状態に関わらずこれら 10 頭（n = 583）の牛乳サンプルを 16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンシングにより解析した。
結果
健康な牛舎の牛乳微生物相は、目視によりCM診断の2週間前にS. aureus CMの牛舎と区別可能であった。微生物ネットワーク解析の結果、11のOTUがOTU0001（Staphylococcus）と負の相関を有していた。多様性の低い、あるいはディスバイオティックなミルクマイクロバイオームは、必ずしも炎症の増加と相関していなかった。特に、Staphylococcus xylosus、Staphylococcus epidermidis、Aerococcus urinaeequiはそれぞれ、炎症レベルの低い宿舎のミルクに多く含まれていた。
結論
本研究の結果は、乳房マイクロバイオームは非常に動的であり、特定の細菌の存在量の変化が将来の黄色ブドウ球菌CMの潜在的な指標となり得ることを示している。本研究により、黄色ブドウ球菌のコロニー形成に対するバリアとして機能し、将来の黄色ブドウ球菌CMの発生を予防する可能性のある細菌種が特定された。
はじめに
牛の乳腺炎は、主に細菌感染によって引き起こされる乳腺の炎症であり、乳牛において最も一般的で費用のかかる疾患の1つで、酪農産業の収益性、動物福祉、抗菌剤の使用、公衆衛生に大きな影響を及ぼしている。牛の乳房炎は、酪農産業に毎年、米国で約 20 億ドル、カナダで約 794 百万カナダドル、英国で 168 百万ポンドの損害を与えています[1,2,3]。牛の乳房炎の最も一般的な原因である細菌は、環境および伝染性の病原体を幅広く含み、137以上の種を包含しています[4]。さらに、乳腺には粘膜層がないため、すべての常在菌に上皮が直接さらされることになります[5]。黄色ブドウ球菌は、伝染性牛乳房炎の一般的な病因であり、不顕性乳房炎（SCM）または臨床的乳房炎（CM）のいずれかを引き起こす可能性がありますが、知識のギャップが残っており、診断、治療、予防に影響を与えています[6,7,8]。酪農産業における抗菌剤の使用とともに、牛に特異的な病原適応性を持つ黄色ブドウ球菌のクローン株が出現・拡散し、これらの株における抗菌剤耐性の普及が進んでいます [9]。ウシ臨床乳房炎のマイクロバイオームのレジストームに関する最近の研究では、黄色ブドウ球菌がドキシサイクリン、アンピシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシンなどのいくつかの抗生物質に最も高い耐性を持つことが明らかになりました[10]。最近では、抗生物質耐性遺伝子のヒト病原体への拡散を減らすために、抗生物質、特に優先度の高いカテゴリーIとIIの抗生物質は、農業において禁止または高度に規制されています [9, 11, 12]。抗菌剤の使用中止は、農場の生産性や家畜の感染症流行など、他の懸念も引き起こします。そのため、持続可能な農業を支援するために、抗菌剤の代替品が求められています[13]。
マイクロバイオームは、難消化性栄養素の代謝、ビタミンの生合成、免疫系の教育、病原体の発育に対する微生物防御など、宿主の健康維持に基本的な役割を果たしています [14, 15]。現在では、宿主に生息する常在菌や共生菌が、外的な擾乱に対する回復力に潜在的な役割を持つことがよく受け入れられています。したがって、マイクロバイオームを標的とし、調節することは、乳房炎の予防と治療のための有望な選択肢として示唆されている [16, 17]。授乳中の女性へのプロバイオティクスの経口投与に関するいくつかの研究では、ヒトの乳腺炎予防および治療に対するプロバイオティクスの有効性が示されているが、ウシの乳腺炎に対する有効性はまだ不明である[18,19,20]。乳牛にプロバイオティクスを乳房内に投与したり、注入したりすることも、炎症促進作用があるため、依然として疑問視されています[21,22,23,24]。ウシ乳房炎の予防や治療にプロバイオティクスが有効であることを裏付ける証拠はないものの、プロバイオティクスとその活性生体分子の利用は、代替予防薬や治療薬の開発において依然として注目されている分野である [17, 25]。
ウシの乳房と生乳の微生物相を調べる研究は、多様で動的な微生物群の存在を示しています[15, 26, 27]。Gandaら（2016）は、40頭の牛で健康な宿舎のものと比較して、大腸菌CM感染の宿舎から採取した生乳の種の多様性が減少していることを示しました[28]。別の研究では、感染した宿舎（n = 28）は、単一の操作的分類単位（OTU）によって支配されていることが多いことが示された[27]。咀嚼後のミルクにおける微生物の変化については、研究間で違いが見られます。Falentinらは、前の泌乳期に臨床的乳房炎の既往がある宿舎で長期間にわたるマイクロバイオームの摂動を観察し、Gandaらは乳房炎の診断から14日後に微生物相が回復したことを報告している[29, 30]。しかし、微生物多様性の崩壊がCM感染によって起こるのか、あるいは感染前に微生物の変化が検出され、CMへの感受性に関与しているのかについては不明である。
本研究では、生乳の細菌群集に見られる多様性の構成とレベルが、どの宿舎で黄色ブドウ球菌CMを発症するかを予測するものであり、特定の細菌の存在は黄色ブドウ球菌の存在と負の相関があるのではないかと仮定している。我々は、S. aureus CMの発生前、発生中、発生後の健康な宿舎と病気の宿舎における細菌群集組成の経時的変化を理解し、S. aureusによるコロニー形成と負の相関を示す特定の細菌分類群、したがって、この重要な病原体と拮抗関係を持つ可能性のある細菌分類群を特定することを目的としている。
材料と方法
牛乳サンプルの収集
モントリオール大学獣医学部（Saint-Hyacinthe）に近接するケベック州のカナダの乳牛群から、合計698頭のホルスタイン乳牛がプロジェクトに登録された。2018年12月から2020年2月にかけて、5つの異なる乳牛群から、募集した牛の乾乳前、分娩後、および泌乳中の4分の1レベルの乳サンプルを隔週で採取した。すべてのミルクサンプルは、乳房炎ネットワーク（http://www.reseaumammite.org/tactic/fr/echantillonnage/）が推奨する指示に従い、無菌的に採取されました。この研究期間中に27,000以上の個々のミルクサンプルが研究スタッフによって収集され、限られた冷蔵スペースにより-10℃から-20℃の間で保管された；ただし、-80℃での急速冷凍が理想的であったであろう[31]。生産者（毎日）と研究スタッフ（隔週サンプリング訪問時）は、牛乳と乳房の目視検査によりCMを同定した。体細胞数（SCC）はほとんどの非臨床生乳サンプルで測定された。すべての生乳サンプルの微生物学的培養は、10 µLの生乳を5%ヒツジ血液寒天培地に広げて行った[32]。35 ℃で 24 ～ 48 時間培養した後、寒天培地上で観察されたさまざまな細菌表現型の数を数え上げました。血液寒天培地上に 3 種類以上の異なるコロニーを保有する牛乳サンプルは、全国乳房炎協議会の勧告 [33] に従って汚染されていると見なされました。非汚染試料では、コロニーを列挙し、各表現型（1または2表現型）の代表コロニーをマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（MALDI-TOF）質量分析で分析し、病因を同定した[34]。CMが認められ，純粋培養または混合培養でS. aureusが分離された乳房分画は，血液寒天培地で＞3種類のコロニー形態を生じた試料を含めて，S. aureusに感染していたものとした．本研究期間中にCMと診断された135頭166分画のうち，10頭11分画がS. aureus CMと診断された．この10頭から、S. aureus CMの前後2週間とCM診断日に40の宿舎（感染、非感染）すべてから合計599の乳サンプルを採取した（追加ファイル1：図S1）。使用した命名規則、例えばH1C120は、聞き取り番号（H）と牛の番号（C）を示すものである。各ミルクサンプルの命名規則には、採取日（YYMMDD）、割り当てられた牛の番号（C）、四半期（Q）が含まれている。
DNA 抽出
ミルクサンプルは氷上で解凍し、チューブを反転させて十分に混合した。DNA 抽出には、1.0 mL の牛乳のアリコートが使用された。各ミルクサンプルは16,000×gで10分間遠心分離した後、上清を廃棄した。16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンシングのため，残りのパレットから，DNeasy® PowerFood® Microbial Kit (QIAGEN, Germany) と QIACube instrument (QIAGEN, Germany) を組み合わせ，製造者の指示に従ってビーズビートで細菌 DNA を抽出した．配列決定後に Good's coverage < 99.0% となったミルクサンプルの細菌 DNA を再抽出し、再度配列決定を行った。抽出キットに含まれる各試薬を用いてDNA/RNAフリー水からDNAを抽出することを含む独立した陰性抽出対照を、本研究で使用した各キットについて実施した。また、本試験で使用した各 DNA 抽出キットを用いて、寛大なドナー（GD）牛のルーメン試料から抽出した全 DNA を含む陽性抽出対照を行い、各キットからの結果を比較し、本試験の一貫性を検証した。ショットガンメタゲノムシークエンスでは、1.0～6.0 mL の牛乳を用いて同じキットで細菌 DNA を抽出し、抽出した DNA を DNeasy® PowerClean® Pro Cleanup Kit (QIAGEN, Germany) でクリーンアップを行った。DNAの濃度と純度は、Invitrogen™ Quant-iT™ dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) と Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA) を使って評価した。
PCR増幅、ライブラリー調製、ハイスループット16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス
ミルクサンプル（n = 593）を16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスで解析した（Additional file 2: Table S1）。Illumina MiSeq ペアエンド（2 × 250 bp）シーケンシングを使用して、各ミルクサンプルの細菌群集を決定した。細菌16S rRNA遺伝子のV4超可変領域は、F548とR806のプライマーペアを用いて増幅した[35]。PCR は、HotStartTaq® Plus Master Mix Kit（QIAGEN、ドイツ）を用いて、95 ℃で 5 分間の変性、35 サイクルの増幅（95 ℃ 30 秒、50 ℃ 30 秒、72 ℃ 1 分）、72 ℃ 10 分間の最終延長サイクルで実施した。DNA/RNA free waterの増幅を試みたものからなる独立したネガティブPCRコントロールは、この研究の一部として行われた各96ウェルPCR反応に含まれ、シークエンスに供された。アンプリコンはAgencourt AMPure® XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) を用いて精製し、Invitrogen™ Quant-iT™ dsDNA Assay Kitで定量した。シークエンス前にDNAを等モル濃度でプールし、プールしたライブラリーをMiSeqとMiSeq reagent kit V2 (Illumina Inc., USA) を用いて500サイクル（251×2）シークエンスした。
ショットガン・メタゲノムライブラリー調製とハイスループットシーケンス
牛乳サンプル（n = 3）は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスの結果に基づいて、低SCC（< 200,000 cells/mL）で単一の分類群に高度に支配された微生物相のため、追加解析の対象として同定された。これらのサンプルは、さらにショットガン・メタゲノミクスによって解析された。シーケンスライブラリーは、Nextera XT DNA Flex Library Preparation Kit (Illumina Inc., USA) およびNextera XT Index Kit (Illumina Inc., USA) を用いて、メーカーの説明書に従って作製した。ペアエンドシーケンス（2×150 bp）は、Genome Quebec（カナダ、モントリオール）のNovaSeq 6000マシン（Illumina Inc.、米国）で実施した。
16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータ解析
MiSeqシーケンサーから得られたFASTQファイルをMothur (v. 1.42.3) [36]を用いて解析した。OTUピッキングは、SILVA v138.1データベースを用いて行った[37]。GoodのカバレッジはMicrobiomeAnalyst[38]を用いて計算し、実行した。配列は、vegan R パッケージ (v. 2.6-2) [39,40,41] を用いて平均希薄化 OTU テーブルを得るために、最小限の配列数 (n = 3068) に 1000 回繰り返し希薄化 (vegan::rarefy.perm) し、さらなる解析に使用した。α-diversity（Chao1、Shannon、Simpson）を算出し、Mann-Whitney検定（ペアなし）をvegan Rパッケージで実施した。ベータダイバーシティ（Bray-Curtis指数）は計算し（vegan::vegdist）、順列多変量分散分析（PERMANOVA）を行い（vegan::adonis2）、非計量多次元尺度（NMDS）順序付けを用いてvegan Rパッケージでデータを描きました（vegan:: metaMDS）。線形判別分析効果量（LEfSe）は、Mothur [42]を用いて行った。相対的存在量（%）だけでなく、α-diversity（Shannon index）もlog10(SCC)との相関を調べた。スピアマン相関と標準回帰モデルをRソフトウェアで計算した[43]。
微生物変化解析
本研究では、新しい泌乳サイクルにおける各牛の最初の黄色ブドウ球菌 CM イベントに注目した。黄色ブドウ球菌のCMが発生した分房と健康な分房の乳汁微生物の変化を比較するために、同じ牛の4つの分房すべてで全体的にSCCが高かったため、H4C88の1分房（Q3）を除き、泌乳期間全体を通してSCCが低い（< 200,000 cells/mL） 各牛から1つだけ健康分房を対照として選んだ（追加ファイル2：Table S1）。1頭の牛（H2C7）は、S. aureus CMの最初の週（Week 0）にシークエンス結果が出なかったため、この特定の分析では除外された。次に、黄色ブドウ球菌のCMを経験した乳房（n = 10）のミルクを、健康な（コントロール）乳房（n = 9）のミルクと比較した。そして、黄色ブドウ球菌CMの6週間前と2週間後までの5つの時点（Week-6, Week-4, Week-2, Week 0, Week 2）の微生物変化を、健康な宿舎と黄色ブドウ球菌CM宿舎の乳汁微生物組成を比較することによって解析した。個々の乳房をα-diversity、β-diversity、LEfSeの解析に用いる実験単位とした。S. aureus CM症例を、S. aureus CMの最初の週における病気の宿舎のStaphylococcus属の相対的存在量（16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンス）に基づいて2群（グループIおよびII）に分けた（追加ファイル1：図S2）。グループ I（7 頭 14 クォーター）では、各週に健常乳と乳房糜爛乳を同数ずつ使用した。6週目と4週目に6検体、2週目に12検体、0週目に14検体、2週目に8検体を使用した。グループ II（3 頭から 6 クォーター）では、Week2（4 サンプル）を除く各週で 6 サンプルを使用した。
微生物ネットワーク解析
全ミルクサンプル（n = 583）の平均希薄OTU表を用いて、Rソフトウェアで微生物ネットワーク解析を行った[43]。ネットワークの複雑さを軽減するために、ミルクサンプルの少なくとも10%で検出された293のOTUのみを解析に含めた。微生物ネットワークは、OTU間のスピアマン相関による共起度を計算し、2つのOTU線形モデル（GLM）、1つは環境の独立変数のみを含むGLM、1つは独立変数と他のOTUの相対存在度を含むGLMで裏付けされた[44]。GLM 分析には、各 OTU-OTU の組み合わせの 16S rRNA 存在量データの準ポアソン分布が用いられた。サンプルソース（牛とクオーター）を独立変数とした。2つの OTU 間の相関は、両方の分析で p 値 (< 0.01) によってフィルタリングされた [44, 45]。Spearman 分析と GLM 分析の結果が一致しない場合、偽陽性または偽陰性の相互作用の可能性があるため、さらなる分析では除外された。Spearmanのρが0.2以上または≦-0.2である相互作用が含まれ、これはCytoscape (v. 3.8.2) を用いてβで可視化された[46]。
ショットガン・メタゲノムシーケンスデータ解析
メタゲノムDNAは、1サンプルあたり平均5060万リードを生成した。得られたFASTQファイルは、metaWRAP (v. 1.2.1) のReadQCモジュールを用いて、カットオフ値20で低品質塩基をトリミングし、アダプターや宿主特異的リードを除去する処理を行った[47]。参照ゲノムとして Bos taurus 3.1 (UMD 3.1, https://bovinegenome.elsiklab.missouri.edu/downloads/UMD_3.1)を用い、宿主特異的なリードを除去した。その結果、717,369 (190507C7Q2), 166,400 (190923C74Q1), 649,838 (649,838) というリードが得られた。クリーンアップしたリードをアセンブルし、Kraken2 with miniKrakenデータベース[48]を用いて微生物群集を種で解析した。また、クリーンアップしたリードを metaSPAdes (v. 3.15.2) でアセンブルし、CONCOCT (v.1.0.0), MaxBIN2 (v. 2.2.6), metaBAT2 (v. 2.2.15) で分類ビンにクラス分けした [49,50,51,52]．分類されたビンは RefineM (v. 0.1.2) でコンタミネーションを減らし、精製されたビンは CheckM (v. 1.1.3) で評価しました [53, 54]．ビンの精製後、メタゲノム集合ゲノム（MAG）を Prokka (v. 1.14.5) で処理し、コードされている遺伝子をアノテーションしました[55]。Virulence 遺伝子と抗菌剤耐性遺伝子は、VFDB データベースを通じて ABRicate (https://github.com/tseemann/abricate) を使って解析した。バクテリオシン、二次代謝産物、代謝経路の検索には BAGEL4, AntiSMASH, KEGG を用いた[56,57,58]。
結果
本研究では，乳牛の19.3%（135/698頭）がCMに感染し，そのうちS. aureusによる感染は7.4%（10/135頭）のみで，その他はNAS，Escherichia coli，Klebsiella pneumoniaeなど様々な病因による感染症であった．各牛の最初のS. aureus CM症例は、生後8日から203日（DIM）の間に発生した。移行期（1-21 DIM）に3例、泌乳前期（22-100 DIM）に2例、泌乳中期（101-200 DIM）に4例、泌乳後期（> 201 DIM）に1例であった。15ヶ月の研究期間中にS. aureus CMと診断された10頭のホルスタイン乳牛から、4つの四半期すべてから合計599のミルクサンプルが採取された。このうち、6サンプルは細菌のDNA濃度が低かったため、シークエンスは失敗した。ミルクサンプル（n = 593）とコントロール（n = 25）を含め、合計 13,854,684 のシーケンスリードがフィルターを通過し、サンプルあたり平均 22,418 のシーケンスリードがカウントされました。希釈中に、ライブラリーサイズが小さいために10個のミルクサンプルが削除され、さらなる解析のために583個のミルクサンプルが残された。PCR反応に含まれる陰性コントロールはいずれもゲル電気泳動で目に見えるPCRバンドを生じず、陰性コントロールと陽性コントロールのクロスコンタミネーションは認識されなかった。従って、コントロールに由来するOTUはサンプルデータセットから削除されなかった。
サンプリング期間中の牛の全体的な微生物叢
全ミルクサンプルの分類学的プロファイル解析の結果、異なる相対的存在量の細菌群が5つの牛群に共有されていることが示された。Firmicutesが優勢で、平均相対量は65.7％、次いでBacteroidota、Proteobacteria、Actinobacteriotaであった（図1A）。Firmicutesは、サンプリング期間中、すべての牛で非常に多く見られた。特に、H4C88とH4C419ではStaphylococcusよりもAerococcusの平均相対量が多く、H2C7とH2C42ではGlutamicibacterを中心とするActinobacteriotaが多かった（Fig. 1B）。H4C88とH4C419では、Aerococcusの相対的な存在量に四半期レベルの差が見られ、1～2四半期でより多く存在した（Fig. 1D）。同様に、H2C7とH2C42では、Glutamicibacterは隣接する四半期と比較して1つの四半期でより多く存在した。各牛における主要な植物群および属の相対的な存在量のばらつきは、牛／四半期固有の微生物群集に寄与していることが明らかになった。
図1
図1
黄色ブドウ球菌による臨床的乳房炎に罹患した 10 頭の牛の生乳微生物相の相対存在量。A 生乳試料中の各門の相対存在量は、4つの門が多数を占めた。Firmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria、Actinobacteriotaの4つの門が存在することがわかった。B FirmicutesとActinobacteriotaの相対的存在比は10頭で異なっていた。C 属レベルでは、10頭すべてでStaphylococcus属が最も多く存在した。他の牛では、H4C88とH4C419でAerococcusの分布が多く、H2C7とH2C42でGlutamicibacterが多くなっていた。D AerococcusとGlutamicibacterの相対的な存在量は、四半期レベルで異なっていた。各牛の名前の識別子は、牛群を表す'H'と牛の番号を表す'C'
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黄色ブドウ球菌CM前、CM中、CM後の微生物変化
CM開始1週目（Week 0）に宿舎から採取した牛乳から黄色ブドウ球菌を分離したS. aureus CM事例では、ブドウ球菌属の相対量に差異が見られた。このことから、S. aureus CM症例を2つのグループに分けることにした。グループIは感染0週目にブドウ球菌が比較的多かった7頭（63.6％、7/11）であった。グループIIは感染診断時にStaphylococcusの相対量が極めて少ない（10％未満）3頭から構成された。
グループ I（n = 7）では、黄色ブドウ球菌CMの4週間前（Week-4）までは、健常区とCM区でα-diversity、β-diversityともに有意差はなかった（Fig. 2）。LEfSe解析でも、Week-6とWeek-4において、健常者の宿舎と将来のCM宿舎のいずれにも相関のある特定のOTUを特定することができなかった。微生物プロファイルの違いは、S. aureus CMの2週間前（Week-2）から観察された。Chao1およびSimpson指標は有意差を示さなかったが、Week-2における将来のCM区画のα多様性は健常者と将来のCM区画で有意差を示した（Shannon p < 0.05; Mann-Whitney statistic 32）（追加ファイル3：表 S2）。Bray-Curtis非類似度のPERMANOVA解析により、Week-2におけるβ多様性は健常者と将来のCM区間で大きく非類似であることがわかった（PERMANOVA p < 0.05, F = 2.32）．LEfSeは、Week-2において健全な宿舎と高い関連性を持つ4つのOTUを同定した。S. aureus CMの最初の週（Week 0）では、病気の宿舎のα多様性とβ多様性の両方が、健康な宿舎と有意に区別された（Shannon p < 0.05; Mann-Whitney statistic 47; PERMANOVA p < 0.05, F = 7.07）. LEfSeは12個の異なるOTUを同定したが、Week-2で見つかったOTUと重複しているものはなかった。OTU0002 (LDA score = - 4.47, p = 0.03) と OTU0001 (LDA score = 5.58, p = 0.002) はそれぞれ健康な宿舎と乳腺症宿舎に高い相関があった。S. aureus CMの2週間後（Week 2）には、感染宿舎のαおよびβ多様性はいずれも健常宿舎と区別できないことから、微生物叢が再確立したことが示唆された。しかし、5つのOTUは依然として健常区でより多く存在し、Ruminococcaceae unclassifiedに相当するOTU0009は0週目（LDA score = - 3.93, p = 0.008 ）と2週目（LDA score = - 4.17, p = 0.04 ）で連続的に健常区で見出された。
図2
図2
グループ I は、CM 診断時（0 週目）に CM 区域でブドウ球菌が検出された病気の牛（n = 7）で構成された。週6日および週4日の時点で、α-diversity（A）およびβ-diversity（B）は、健常牛舎と乳房炎牛舎でほぼ同じであった。健康な宿舎のαダイバーシティは診断の2週間前（Week-2）には病気の宿舎と有意な差があった。0週目にはα-、β-多様性ともに健康な宿舎と病気の宿舎で有意な差があり、その後、乳房炎がさらに数週間続く間、その状態が維持された。黄色ブドウ球菌のCMが消失した2週間後（Week2）には、α-、β-多様性は回復し、健康な宿舎と同程度になった。C LEfSe解析の結果、診断時にはOTU0002（Aerococcus）およびOTU0001（Staphylococcus）がそれぞれ健康な宿舎および乳腺炎宿舎と高い関連性を持っていた。Ruminococcaceae unclassified (OTU0009)は、0週目および2週目に健康な宿舎と高い関連性を示した
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グループIIは、0週目のCMミルクサンプル（191119C120Q2、190805C419Q4、191118C184Q4）でブドウ球菌がほとんど検出されなかった牛（n = 3）で構成されている。これらの乳検体は，微生物培養により乳汁から黄色ブドウ球菌が分離されたため，当初は黄色ブドウ球菌CMと診断された。これらのグループIIのCM乳試料からは、S. aureusと同時に他の細菌が分離されることがあった（Additional file 4: Table S3）。191119C120Q2からは，血液寒天培地上で溶血活性を示さない表現型の異なるコロニーが，S. aureus（1 CFU/0.01 mL of milk）とともにさらに2つ分離された。190805C419Q4からはCorynebacterium bovis（4 CFU/0.01 mL of milk）とS. aureus（1 CFU/0.01 mL of milk）が分離されたが，190805C419Q4からはCorynebacteriumの多量性は検出されなかった．191118C184Q4からはAerococcus viridans（10 CFU/0.01 mL of milk）とS. aureus（10 CFU/0.01 mL of milk）が分離され，191118C184Q4ではAerococcusの相対量が34％以上であることが確認された．なお、H4C419およびH5C184の病巣は、Week-2に他の病因によるCMを経験していた。興味深いことに、グループIIの3頭のαおよびβ多様性は、Week-6からWeek-2までのすべての時点において、健康な宿舎と病気の宿舎の間で有意な非類似は認められなかった（追加ファイル3: 表S2）。LEfSeは、黄色ブドウ球菌のCM前とCM中に、14のOTUが健康な宿舎または乳房炎宿舎に強く関連していることを確認した。その中で、OTU0001（Staphylococcus）は健康な宿舎と有意に関連していた（LDA score = - 5.28, p = 0.05） (Additional file 3: Table S2)。
微生物群集のネットワーク解析
85,837の可能な種間相互作用（2932 - 12、自己相互作用を除く）のうち、フィルタリング後に残ったのは278 OTUを含む5561相互作用のみであった（追加ファイル5: 表S4）。その中で、Staphylococcusに対応する2つのOTU（OTU0001とOTU0012）は、14のOTUと25の相互作用に関与していた（図3A）。OTU0001と他のOTUとの相互作用は、OTU0021を除いて全て双方向であり、OTU0012と他の2つのOTUとの相互作用は一方向であった。GLM解析のβは、11のOTUすべてがOTU0001（ブドウ球菌）に対して、相互作用よりも強い負の影響を与えることを示した。しかし、OTU0001と11のOTUの関係は無視できるものであった（Spearmanのρ > - 0.2）。UCG-005とAerococcusに対応する2つのOTUのみが、それぞれOTU0001と中程度の相互作用（Spearmanのρ > - 0.4）および弱い相互作用（Spearmanのρ > - 0.3）をしていた。より厳密な解析のために、血液寒天培地上で3つ以上の表現型を持つコロニーが分離されたすべてのサンプル（n = 45）を除外した。この解析でも、OTU0001にマイナスの影響を与えるOTUが同定されたが、最初の解析で同定されたものの、2回目のより厳しい解析では同定されなかったOTU0022（Ruminobacter）を除いて、同じOTUがOTU0001にマイナスの影響を与えることが確認された。さらに、11個のOTUをまとめてOTU0001と相対的な存在比を比較した（図3B）。健康な宿舎の11のOTUは、黄色ブドウ球菌のCMの前、中、後にOTU0001よりも一貫して高い相対量を示し、CMの宿舎で劇的に変化した。11属の相対現存量は、6週目と4週目にはOTU0002より高く、2週目と0週目にはOTU0001より低くなった。この11属とOTU0001の相対量の差は、黄色ブドウ球菌のCMが数週間続く間（Week0_during）、連続した週でより顕著になり、Week2では黄色ブドウ球菌のCM前と同様に減少した。
図3.
図3
牛乳中の微生物相とその相対的存在量の微生物ネットワーク解析。A ネットワークは、古典的なスピアマン相関に基づくネットワーク解析とGLMアプローチの組み合わせによるものである。各ノードはOTUレベルの分類群を表す。矢印は、GLM解析によるβの計算に基づいて、関係の方向（ソースからターゲットへ）を示している。緑と赤の接続は、それぞれ正と負の関係の相対的な強さを示しています。スタフィロコッカスに対応する2つのOTUを含む16のOTUが関与する1242の相互作用のみを表示した。B 健常乳房（n = 10）と臨床的乳房炎（n = 11）を対象に、CM前、CM中、CM後を含む8週間における2つのグループ（11 OTUとOTU0001）の相対量を比較した結果、黄色ブドウ球菌は、CM前、CM中、CM後を含む8週間で、11 OTUが最も多く存在することがわかった。
フルサイズ画像
SCCと乳汁微生物叢の関係
本研究におけるSCCの範囲は、非CM乳（n = 385）において4000 cells/mL から 35,891,000 cells/mL までであった。各OTUの相対量（n = 5068）とlog10(SCC)の相関は、無視できるほど小さいか、弱いものであった。興味深いことに、OTU0001（Staphylococcus）とOTU0002（Aerococcus）は、SCCが低い（< 200,000 cells/mL）いくつかのミルクサンプルで比較的高い存在度で観察された（図4A）。例えば、単一のOTUが高い頻度で存在することが牛乳試料で確認された。例えば、190507C7Q2 (OTU0001, 100%), 190923C74Q1 (OTU0001, 86.5%), 190204C88Q3 (OTU0002, 37%)のように、単一のOTUが高い頻度で存在した。これら2つのOTUとlog10(SCC)の相関は弱く、方向も逆であった。さらに、細菌の多様性と炎症の関係を調べるために、Shannon indexとlog10(SCC)の相関を分析した。Shannon indexはlog10(SCC)と負の相関を示したが、弱い相関だった（Spearmanのρ＞-0.3）（Fig. 4B）。この相関は、血液寒天培地上で3種類以上のコロニー形態を示した牛乳試料を除外した解析（n = 45）でも観察された。
図4
図4
ミルク微生物叢の相対的存在量。A SCCの低いミルクサンプルでは、OTU0001とOTU0002が優勢であった。B シャノンインデックスはlog10(SCC)と負の相関があった（スピアマンのρ＞-0.3）。C ショットガンメタゲノムシークエンスにより、健康なミルクサンプルの細菌種を同定し、相対存在量(%)を明らかにした。
フルサイズ画像
健康な牛乳に含まれるブドウ球菌とアエロコッカス属の菌種
健康なミルクサンプルに存在するOTU0001 (Staphylococcus) とOTU0002 (Aerococcus) のどのような菌種をさらに調べるために、3つのミルクサンプルについてショットガンメタゲノムシーケンスを実施しました。190507C7Q2 (SCC = 59,000 cells/mL), 190923C74Q1 (SCC = 143,000 cells/mL), 190204C88Q3 (SCC = 43,000 cells/mL)の3つの牛乳サンプルについて、ショットガンメタゲノムシークエンシングを行った。このうち、試料190204C88Q3は血液寒天培地上で3種類以上の表現型を示した。宿主DNAが大量に混入していたため、細菌コンティグは543,451 (190507C7Q2), 9747 (190923C74Q1), 107,032 (190204C88Q3)であった。Kraken2解析の結果、これらのミルクサンプル中の細菌種の大部分は、S. xylosus（95%, 190507C7Q2）、S. epidermidis（62%, 190923C74Q1）、A. urinaeequi（55%, 190204C88Q3）だった（図4C、追加ファイル6: 表S5）。これらのうち、分類学的ビンから2つのMAGを良質（完全性85%以上、汚染度2%未満）に再構築できた。これらのMAGはS. xylosusとA. urinaeequiであり、ゲノムサイズはそれぞれ2.3 Mb (CDS 2234) と1.5 Mb (CDS 1373)であると同定された。S. xylosus MAGとA. urinaeequi MAGのいずれからも既知の病原性遺伝子は見いだせなかった。S. xylosus MAGからは、アミノグリコシド系抗生物質耐性に関連する抗菌性遺伝子（K19299）のみが検出された。S. xylosus MAGのAntiSMASHでは、staphyloferrin A (K23447, K23446, K21898), staphyloxanthin (K10208, K10209, K10210, K10211), squalene (K00801) など二次代謝物に関連する5つの遺伝子クラスタが検出された。しかし、A. urinaeequi MAGでは、最終ビンには予測される遺伝子クラスターは見られなかった。ただし、精製前のビンにはリコペン生合成の遺伝子クラスター（K02291とK10027）が見られた。
考察
本研究では、15ヶ月の研究期間中に黄色ブドウ球菌性乳房炎を発症した乳牛10頭を対象に、4つの分房すべての健康状態を追跡し、黄色ブドウ球菌性CM前、中、後のミルク微生物叢を調査した。全サンプルについて16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを行い、健康な対照区からの3サンプルについてはショットガンメタゲノミクスを行った。このミルク微生物叢の縦断的コホート研究により、人工チャレンジモデルで感染した牛ではなく、自然な黄色ブドウ球菌CMを経験した牛に関連する微生物の変化を研究することができるようになりました。
宿主のマイクロバイオーム構成は、体の部位、時間、健康状態によって異なります。乳牛の場合、これまでの微生物相研究では、異なるニッチの微生物プロファイル、同じ時点における CM 区域と健常区域の違い、乳房炎治療に対する微生物変化などが注目されてきました [27, 28, 59]。しかし、微生物組成の農場ごとのばらつきが、ミルクマイクロバイオーム研究間の不一致を引き起こす可能性がある。いくつかの研究では、各農場は独自の持続的な微生物相を持つ特定のニッチであることが示されている[60, 61]。本研究では、ミルク微生物叢の組成が四半期レベルだけでなく牛のレベルでも変化していることが観察された。これらの変動は、環境や感染症によるものと考えられるが、本研究に含まれる各牛群の牛の数が限られており、偏りがあるため、牛群特異性を証明することはできなかった。牛群特異的な微生物相とその変動は、乳質管理および微生物指標を用いたウシ乳房炎の早期発見法の開発に課題を投げかけている。実際、LEfSe分析によって同定された本研究のすべてのバイオマーカー（OTU）の相対存在量は研究期間中一貫しておらず、ウシの乳腺内における微生物の健康状態を表すことができる単一の分類子は存在しないことが示唆された。しかし、11のOTUのグループとしての相対的な存在量は、泌乳期間にわたって検出可能であった（追加ファイル1：図S3）。
本研究では、新しい泌乳サイクルにおける各四半期の最初のS. aureus CMのみを考慮し、S. aureus CMの前、中、後の微生物変化を調査した。Andrewsらは以前，感染した28の分房から採取した牛乳のうち，感染した分房の牛乳マイクロバイオームが単一のOTUによって支配されていることが多いことを報告した[27]．S. aureus CMの最初の週では、5つのミルクサンプルでOTU0001が80%以上の相対量で優勢であった。また、生産者または研究スタッフが目視で指摘した黄色ブドウ球菌CMの2週間前に、3つのミルクサンプルでOTU0001の相対存在度が高い（80％以上）ことが観察された。また、CMと診断される2週間前の生乳サンプルのSCCは57,000個/mLから12,107,000個/mLであり、乳房内感染のステージが大きく異なることが示された。この違いは、黄色ブドウ球菌の病原性、黄色ブドウ球菌に対する常在細菌叢の抵抗性/耐性、または特定の動物が行う免疫反応に起因する可能性がある[62,63,64]。また、黄色ブドウ球菌のコロニー形成とその後の乳腺の炎症との間の時間差が異なるため、単に黄色ブドウ球菌のコロニー形成が原因である可能性もある[65]。しかし、S. aureus CMの正確な開始日に関するデータがないため、CMの2週間前から実際の発症までのタイムギャップを決定することはできなかった。また、CM後2週間以内に病人宿舎の微生物相が回復し、健常宿舎の微生物相に類似していることが確認された。この結果は、自然感染およびグラム陰性病原体の実験的感染により、14日以内にCM宿舎の乳汁微生物相が再確立することを示したGandaらの先行研究[28, 30]と一致する。
また、意外なことに、同じ牛乳から黄色ブドウ球菌が分離されたにもかかわらず、0週目にブドウ球菌がほとんど検出されなかったCM例も見いだされた。このような不一致は、おそらく微生物叢のまれなメンバーを検出することができない不十分な配列深度によるものであり、過去にほとんど報告されていない[66,67,68]。これは、私たちが検出できなかった他の内在的要因や外因的要因に起因する可能性がある。また、グループIIでは、黄色ブドウ球菌のCMの直前に、同じ四半期に別のCM感染があり、ブドウ球菌の影が薄くなっている可能性があることを強調しておく必要がある。さらに興味深いことに、II群のWeek0では、Staphylococcus（OTU0001）が健常者の宿舎と有意に関連していた（Additional file 3: Table S2）。SCCが低い（15,000個/mLから282,000個/mL）ことを考慮すると、これらの健康な宿舎のブドウ球菌はNASである可能性が高い。このことは、α-diversityの高さは、病原性細菌に対する微生物の回復力を示すものでも、感受性を示すものでもなく、ウシ乳腺内における健康な転帰と関連するものでもないことを示唆するものである。
ネットワーク解析の結果、11のOTUがOTU0001（Staphylococcus）の相対的存在量と負の相互作用を持つことが確認された。この相関は、黄色ブドウ球菌が感染時にマイクロバイオームの支配的なメンバーとなり、これらのOTUの多くを置き去りにするために観察されたものと思われる。これらの11のOTUは、それぞれ異なる時点でマイナーな集団を構成しているが、我々が分析したミルクサンプルにはそれぞれ共通して検出された（32％〜91％）。これらの11のOTUはOTU0001との相互作用の他に、互いに、また他の多くのOTU（n = 202）にも良い影響を及ぼしていることがわかった。このように相互に絡み合った微生物叢は、集団で病原体のコロニー形成に対する微生物的な回復力を提供し、乳房内の個々のグループの変動を可能にしている可能性がある。この結果は、ウシ乳腺の細菌が協調して健康な微生物叢として機能し、乳房炎病原体に対して直接的、間接的に異なる様式で交差防御を提供する可能性を示唆している。
また、SCCと細菌量の関係についても検討した。本研究では、log10(SCC)と強く相関する特定の分類群は存在しなかったが、SCCが低い（<200,000 cells/mL）健康な宿舎の牛乳サンプルでは、StaphylococcusまたはAerococcusのどちらかのOTUが非常に優勢であることが判明した。これは、これらのOTUが特定の牛乳サンプルに存在しても炎症促進活性がないことを示している。一般に、微生物の多様性が著しく低下すると、微生物相のバランスが崩れ、侵入してくる細菌や病原性細菌に対してより脆弱になる傾向があるため、この発見は興味深いものである [69, 70]。しかし、本研究では、宿主の免疫反応を引き起こすことなく、単一の分類群が優勢であることが観察された。この特定の細菌群が乳房炎病原体に対する拮抗能力も備えていれば、牛の乳房内プロバイオティクスとして有望な候補となる可能性がある。ショットガンメタゲノム解析により、S. xylosus、S. epidermidis、A. urinaeequiが3種類の健康な牛乳試料で非常に優勢であり、各試料の細菌数の95％、62％、55％を占めていることが明らかになった。不顕性乳房炎や乳臨床乳房炎は、S. xylosus や S. epidermidis などの NAS によって引き起こされることがあり、これらは SCC が高いだけでなく低い宿舎からもしばしば分離される [71, 72]。S. xylosusは、S. aureus agrのクオラムセンシングシステムを妨害し、S. aureusのバイオフィルム形成能力を阻害することが知られている[73, 74]。S. epidermidisは、バイオフィルム形成、成長、クォーラムセンシングにおいて、S. aureusに対してよく知られた拮抗菌である[75,76,77]。したがって、190507C7Q2や190923C74Q1のように強い乳房内炎症を伴わないNASは、抗S. aureusプロバイオティクスとして開発できる可能性を持っている。A. urinaeequi は NAS と異なり、これまでほとんど研究されておらず、その抗菌活性はグラム陰性菌のみに対して確認されている[78]。しかし、我々のグループは、乳製品から分離した A. urinaeequi 株が乳腺内感染関連黄色ブドウ球菌を共培養条件下で抑制することを以前に報告しており[79]、本属も抗黄色ブドウ球菌プロバイオティクス開発において注目される存在である。
今回のマイクロバイオーム研究では、乳牛の黄色ブドウ球菌CM前、CM中、CM後の微生物群集とその変化を明らかにし、乳房の健康に重要な役割を果たす可能性のある細菌間相互作用を同定した。また、11個以上のOTUがStaphylococcus（OTU0001）と負の相関を持ち、S. aureus CMに対する感受性と関連している可能性のある細菌間相互作用を同定した。また、特定の細菌群による乳汁微生物のアンバランスは、必ずしも疾患や炎症と関連しないことを示す証拠となった。我々の発見は、病原体に拮抗するが強い炎症を誘発しない細菌群を用いて、将来のウシ乳房炎の発生を予防するために、ウシの乳房における微生物調節と摂動の応用の可能性を示唆するものである。しかし、S. aureus CMの症例数および牛群数が限られているため、本研究では生物学的および地理的なバイアスがかかっている可能性がある。さらに、限られた数の牛乳サンプルから豊富な細菌種を同定することは、潜在的な抗S. aureusプロバイオティクスを誤って解釈することにつながる可能性がある。したがって、今後、S. aureusと潜在的なプロバイオティクスとの間の拮抗的相互作用、およびin vivoおよびin vitroにおける炎症促進効果に焦点を当てた研究が必要である。
データおよび資料の利用可能性
すべての配列データは、NCBI Sequence Read Archive (SRA) のBioProject ID PRJNA752361で入手可能である。
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資金提供
このプロジェクトは、Dairy Farmers of Canada, Dairy Research Cluster 3 "The Mastitis Network "から資金提供を受けました。Continuing the Advancement of Milk Quality in Canada」（SDとJRに授与）。SP、DJ、DKはNSERC CREATE in Milk QualityおよびOp + Lait Regroupmentからの資金提供を受けたことを認める。
著者情報
著者および所属
カナダ、QC州、モントリオール、McGill大学、Macdonaldキャンパス、農業・環境科学部
Soyoun Park, Dongyun Jung, Ianina Altshuler & Jennifer Ronholm（朴昭允、鄭東雲、イアニナ・アルトシュラー、ジェニファー・ロンホルム
モントリオール大学医学部、カナダ、QC州、セント・ヒアシント
Daryna KrubanおよびSimon Dufour
乳房炎ネットワーク、カナダ、QC州、セント・ヒアシント
Soyoun Park、Dongyun Jung、Daryna Kruban、Simon Dufour & Jennifer Ronholm
Regroupement FRQNT Op+Lait（カナダ、QC州、Saint-Hyacinthe)
Soyoun Park、Dongyun Jung、Daryna Kruban、Simon Dufour、Jennifer Ronholm。
貢献
JRとSDが研究の構想を練った。DKは牛乳サンプルとメタデータを収集し提供した。SPとDJはミルクサンプルの整理、保管、追跡を行った。SPはDNA抽出、ライブラリ作成、配列決定、データ解析を行い、原稿を執筆した。IA は微生物ネットワーク解析に貢献した。最終原稿は全著者が読み、承認した。
共著者
Jennifer Ronholmに連絡する。
倫理的宣言
利害関係
著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立的な立場をとっています。
補足情報
追加ファイル1: 図S1.
S. aureus臨床乳房炎を発症したホルスタイン種乳牛。この図は、カナダのケベック州にある 5 つの酪農場で、黄色ブドウ球菌による臨床的乳房炎と診断された 10 頭の乳牛の図である。すべての乳房炎は自然感染で発生した。牛乳サンプル（n = 599）は 4 区画すべてから隔週で採取されました。各牛の名前の識別記号は、牛群を表す「H」と割り当てられた牛の番号を表す「C」です。赤と青の四角い箱は、それぞれ黄色ブドウ球菌とその他の乳房炎病原体に感染した、目に見える症状のある臨床的な乳房炎を表しています。黒い四角い箱は非乳房炎を表しています。色に関係なく開いている四角い箱は、ミルクサンプルの欠落（n = 16）、低い細菌DNA（n = 6）、低いライブラリリードサイズ（n = 10）のために16S rRNAデータが利用できないミルクサンプルを示している。図 S2 乳牛のグループ。黄色ブドウ球菌による臨床的乳房炎に罹患した乳牛 10 頭（11 クォーター）を、第 0 週のブドウ球菌の相対存在量に基づきグループ分けした。健康なクォーターとCMクォーターの2つを選択し、各牛の名前の下に表示した。0週目の乳房炎乳サンプルでは、グループIではStaphylococcusが単独で優勢であったが、グループIIでは相対存在量が10％未満でほとんど検出されなかった。Fig. S3 健常児および乳腺症児の泌乳期間中の11のOTUおよびOTU0001（Staphylococcus）の相対存在量。線グラフは、各牛の2つの四半期（健康な四半期と乳房炎四半期）における11 OTUとOTU0001の相対存在量の研究期間中の変化を示している。縦の点線は、黄色ブドウ球菌のCMの開始または終了を示す。
追加ファイル2：表S1.
黄色ブドウ球菌による臨床的乳房炎と診断された牛から採取された全乳検体（n = 583）のメタデータ
追加ファイル3：表S2.
グループ I とグループ II の黄色ブドウ球菌臨床性乳房炎の前、最中、後の微生物学的変化
追加ファイル4：表S3.
臨床的乳房炎乳試料から分離された病因物質
追加ファイル5: 表S4.
牛乳サンプル（n = 583）の微生物ネットワーク解析
追加ファイル6: 表S5.
ショットガンメタゲノム解析で得られた3つの乳サンプルから検出された細菌種/菌株とその相対的存在量（%）。
権利と許可
この記事は、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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この記事の引用
Park, S., Jung, D., Altshuler, I. et al. A longitudinal census of the bacterial community in raw milk correlated with Staphylococcus aureus clinical mastitis infections in dairy cattle. Anim microbiome 4, 59 (2022). https://doi.org/10.1186/s42523-022-00211-x（英語）。
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受領日
2022年3月7日
受理済
2022年11月09日
公開日
2022年11月24日
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