山火事後の初年度の細菌および菌類の急速な後継者育成の動き

2023年2月15日 13:42

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山火事後の初年度の細菌および菌類の急速な後継者育成の動き
M. ファビオラ・プリド＝チャベス、ジェームズ・W・J・ランドルフ、カサンドラ・ザルマン、ロラリー・ラリオス、ピーター・M・ホミアック、シドニー・I・グラスマン
初出：2022年12月29日
https://doi.org/10.1111/mec.16835
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概要
世界中で山火事の頻度と深刻さが増していることから、二次遷移への関心が高まっている。しかし、土壌微生物群集が生物地球化学循環を制御し、火災後の植生再生に果たす役割は大きいにもかかわらず、火災直後や高い時間分解能での測定がないため、微生物の二次遷移に関する理解は限定的である。この知識のギャップを埋めるため、我々は南カリフォルニアの山火事後17、25、34、67、95、131、187、286、376日の土壌を、火に適応したシャパラル低木林でサンプリングした。16Sと18SのqPCRによる細菌と真菌のバイオマス、および16SとITS2アンプリコンのIllumina MiSeqシーケンスによる豊かさと組成を評価した。火災により、細菌バイオマスは47％、細菌リッチネスが46％、真菌バイオマスは86％、真菌リッチネスが68％、それぞれ著しく減少した。焼失した細菌および菌類群集は、5-6回の組成変化期間を経て、急速なサクセッションを経験した。植物と同様に、「火を好む」親水性微生物が遷移を促進し、その多くは以前から世界中の森林で発見されており、時間の経過とともに存在量が顕著に変化した。菌類の二次遷移は担子菌酵母のGeminibasidiumによって開始され、糸状菌のPyronema, Aspergillus, Penicilliumとトレードオフした。バクテリアについては、プロテオバクテリアのマシリアが年間を通じて優勢であったが、ファーミキュートのバチルスとプロテオバクテリアのノビヘルバスピリルが時間と共に存在量を増やした。高分解能の時間サンプリングにより、火災後の微生物の二次遷移の動態を捉えることができ、支配的な親水性微生物間の耐熱性、コロニー形成、競争における推定上のトレードオフが、生態系機能に影響を与える可能性のある微生物遷移を制御していることが示唆された。

1 はじめに
米国西部（Riley & Loehman, 2016）および世界各地（Abatzoglou et al. 二次遷移、すなわち山火事などの撹乱の後に生態系が発展する軌跡は、植物については広く研究されているが（Derroire et al., 2016; Donato et al., 2012）、地下の微生物群集は比較的見落とされてきた。土壌微生物は火災後の有機物分解（Semenova-Nelsenら、2019）、栄養循環（Pérez-Valeraら、2020）、植物再生（Dove & Hart、2017）を駆動するので、山火事が土壌微生物の後継をどのように変えるかを理解することは、生態系の回復と機能に対する火災後の効果を予測するために必要かもしれません。

植物遷移は、生態系の健全性と機能に影響を与える主要なプロセスである。遷移の間、支配的な種は秩序ある予測可能な方法で変化することがある（Shugart, 2001）。例えば、初期のコロニー形成者（成長が早く、短命な種）は、後期のコロニー形成者（成長が遅く、長命な種）に取って代わられることが多い。しかし、山火事によって後継者時計がリセットされ、安定から軌道修正され（Reilly & Spies, 2016）、二次遷移が開始される可能性がある。植物の二次遷移は、多くの場合、火災後の不均質な景観に存在する残存植生と種子バンクに左右される（Jain et al.、2008）。初期の植物の定着は、競合が少なく栄養価の高い環境で起こることが多いが（Dalling, 2008）、遷移は、初期のコロニー形成者の量とアイデンティティ（すなわち、分散制限と優先効果；Kennedy et al.、2009）、空間と資源に関するトレードオフによって左右されることが多い（Tilman、1990）。実際、種の代替の軌跡を見ると、資源の利用が類似している（すなわち、ニッチの重複）初期入植者が空き地を支配するが、必然的に資源の利用に差異がある（すなわち、相補性）後期段階の種に置き換えられ、種の共存が可能になる（Pacala et al.1996; Turnbull et al.2013 ）ことが示されている。この後期群集は、群集組成の変動が小さいことを特徴とし、安定していると考えられがちである。しかし、植物遷移論で認識されているパターンが、地下の土壌微生物にも当てはまるかどうかは、まだ不明である。

火災後の土壌微生物に関する研究は、火災による死亡（Hart et al., 2005）、微生物の豊かさとバイオマスの変化（Dooley & Treseder, 2012; Pressler et al., 2019）、真菌の担子菌と共生菌根菌の子嚢菌や腐生菌への置き換え（Cairney & Bastias, 2007; Fox et al., 2022）により、火災が微生物の後継者軌道をリセットできることを示唆している。1世紀以上にわたって、火災後のきのこ調査において、親火性または「火を好む」菌類が一貫して見つかってきた（McMullan-Fisherら、2011；Saver、1909）。最近では、次世代シーケンサーにより、好火性子嚢菌のピロネマが規定火災後に100倍増加し（Reazinら、2016）、実験的パイロコスモスにおいて配列の60％以上を支配することが示されている（Brunsら、2020）。さらに、Proteobacteria Massiliaなどの好熱性細菌の証拠も増えている（Enrightら、2022年；Whitmanら、2019年）。この証拠は、野火とともに進化してきたシステムにおける好熱性微生物が、植物に類似した火適応を持ち（Rundel, 2018）、したがって、おそらく植物に類似した後継者動態を辿る可能性があることを示唆している（Dove et al. 親水性微生物は、火災（耐熱性胞子、硬化体など；Dayら、2020；Petersen、1970）や火災後の環境（耐乾性、窒素鉱物化親和性、芳香族炭化水素分解親和性など；Fischerら、2021；Nelsonら、2022；Steadorffら、2021）を生き残るための形質を持っています。さらに、火災による熱は土壌の上部数cmにしか浸透しないことが多いため（Neary et al., 1999; Pingree & Kobziar, 2019）、植物と同様に、胞子バンクを構成する生存した微生物によって二次継承が開始されることもある（Baar et al., 1999; Glassman et al., 2016）。現在、火災後のマイクロバイオームを評価する研究のほとんどは、1回のタイムポイントサンプリングに基づいており（Dove & Hart, 2017; Pressler et al., 2019）、したがって、親火性微生物の継承はほぼ不明である。しかし、2-3サンプリングタイムポイントからなる最近の研究では、細菌や真菌が火災後に急速な群集変化を起こすことが示唆されており（Ferrenberg et al., 2013; Qin & Liu, 2021; Whitman et al., 2022）、細菌および真菌の後継の軌道を理解するには、より高い時間分解能のサンプリングが必要であることが示されている。

土壌微生物の遷移の予測は、直接的および間接的な山火事の影響によって複雑になることがある（Neary et al.、1999）。土壌の燃焼度合いが直接的な火災の影響を制御するのに対し（Reazin et al., 2016; Whitman et al., 2019）、土壌水分の変化は間接的に火災後の微生物に影響を与え（Placella et al., 2012; Yang et al., 2021）、特に降水量が限られている乾燥環境において、後継を推進する可能性がある。これまでの研究で、細菌は土壌の湿潤化に迅速に反応すること（Barnardら、2013；Placellaら、2012）、一方、真菌は土壌の水分変化に対する反応が鈍いこと（Barnardら、2013；Evans & Wallenstein、2012）が立証されています。さらに、微生物の生活戦略は、火災に対する微生物の反応を決定することができます。研究によると、火災は外菌根菌（EMF; Cowan et al., 2016; Glassman et al., 2016; Pulido-Chavez et al., 2021）とアーバスキュラー菌（AMF; Xiang et al., 2015）の豊かさを減少させるが、一時的に樹上植物の豊かさを増やすことができる（Enright et al., 2022; Semenova-Nelsen et al., 2019）。しかし、火災が複数の微生物ギルドにどのように影響するかに関する限られた研究（Certini et al., 2021）では、火災後の生態系の回復に不可欠な疑問である、山火事の直接的な影響と、山火事後に菌根菌が生き残る時間の長さを特定する分解能が欠けている。

我々は、カリフォルニアのチャパラルに注目することで、微生物による生態系遷移理論を構築し、自然界で検証することを提案する。シャパラルは、厳しさの高い火災に適応した低木林であり、世界中の地中海性気候に分布する生物多様性のホットスポットである（Barro & Conard, 1991; Rundel, 2018）。シャパラル植物の二次遷移は比較的よく理解されており、一般的に火災によって開始される（Keeley et al.）しかし、支配的なチャパラル植生は、その定着と生存に必要な菌根のアソシエーションを形成するが（Allen et al.、2005）、チャパラル微生物のサクセッションについてはほとんど知られていない。実際、火災後のマイクロバイオーム研究の13％しか低木地で行われていない（Pressler et al.、2019）。乾燥地は地球の地表の41％近くを占め、気候変動に伴って拡大しており（Feng & Fu, 2013）、チャパラルなどの乾燥地システムにおける二次遷移ダイナミクスを理解することは重要です（Osborne et al.、2022年）。我々は、シャパラルに焦点を当て、シャパラルが火とともに進化してきた歴史から火に適応した微生物を持っていると考えられるが（Hans, 1971）、親火性細菌と真菌は系統的に保存されていると思われるので、後継パターンは他のバイオマスにも広く一般化できるだろうと予想している（Enright et al.）実際、火で攪乱されたスペインの低木地帯では、子嚢菌科ピロネマタ属と少数の担子菌属内の真菌分類群が地球規模で分布しているようだ（Pérez-Valera et al, 2018）、マツ科（Reazin et al., 2016; Whitman et al., 2019; Xiang et al., 2014）、ユーカリ（Ammitzboll et al., 2022; McMullan-Fisher et al., 2011）、レッドウッドタノキ林（Enright et al., 2022）などに分布しているという。

ここでは、火災後のマイクロバイオームについて、これまでで最も高解像度の時間サンプリングを実施した。我々は、シャパラル（Chaparral）の山火事後1年間にわたり、9つのタイムポイントで土壌をサンプリングし、微生物の後継者動態に対する山火事の即時および時間的影響を特定し、以下の仮説を検証することが可能となった。(H1) 山火事によって細菌と真菌のバイオマスと濃度が低下し、火事後 1 年で群集組成が変化する (H2) 山火事は真菌ギルドに明確な影響を与え、共生菌根菌は最も大きな減少を示す。(H3）土壌焼失の程度が高いほど、バクテリアと菌類はより減少し、降水は菌類よりもバクテリアの遷移に大きな影響を与える。（H4）遷移は親火性微生物によって開始され、植物と同様に、成長や栄養獲得などの生態生理学的形質の差異に基づいて、時間とともに存在量が変化すると考えられる。

2 材料と方法
2.1 調査地域、プロットデザイン、および土壌の採取
Holy Fire は、2018 年 8 月 6 日から 9 月 13 日まで、南カリフォルニアのクリーブランド国有林で 94km2 を焼失した。2018 年 9 月 30 日、9 つのプロット（焼失 6、未焼失 3、図 1a）を選択した。プロットは、外菌根の宿主であるマンザニータ（Arctostaphylos glandulosa）とアーバスキュラーで外菌根の宿主であるシャミセ（Adenostoma fasciculatum）によるアスペクト、傾斜、標高、火災前の植生支配が類似しているものを選んだ（Allenら、2005年）。プロットはエッジ効果を避けるため、林道から平均25m（10-40m）離れた場所に設置され、それぞれ中心から5m離れた場所に4つの1m2のサブプロットが含まれている（図1b）。この調査地は、夏は暑く乾燥し、冬は涼しく湿潤な地中海性気候で、年平均気温は17℃、総降水量は668 mm（冬・春平均100.63 mm、夏9.18 mm）である。降水量は、El Cariso気象台（raws.dri.edu）から収集した月別サマリーによるデータである。土壌は、Cieneba と Friant シリーズに分類され、Typic Xerorthents と Lithic Haploxerolls に分類される。土壌は砂質および礫質のロームで、平均pHは焼畑プロットで6.8、非焼畑プロットで6.2だった（表S1に追加プロット情報あり）。土壌の種類は異なるが、土壌の種類は細菌や真菌のバイオマスや豊富さには影響しなかった（glmer; p > 0.05）。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図1
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パワーポイント
キャプション
火災封じ込め後7日以内に作成されたBAER土壌燃焼度マップ（https://burnseverity.cr.usgs.gov）を用いて、中程度の燃焼度内にあるプロットを特定した（図1a）。注目すべきは、BAER の粗いスケールの測定値（30 m）は、土壌微生物群の空間分布や回転速度とはあまり一致しないことです（Bahram et al.）灰の深さは土壌の加熱 (Parson et al., 2010) と火災の深刻度 (Bodí et al., 2014) に応じて増加するため、各 1 m2 のサブプロットごとに灰の深さ (cm) を 3 回測定して平均化し、土壌火災深刻度の代理として使用しました (図 1c)。灰は火災後の風雨によって急速に再分布されるため（Bodí et al.、2014）、降水イベント（最初の雨は 10 月 3 日に発生）または強風イベント（9 月 3～17 日の平均風速は 2.7m/s）の前に灰を測定しました。したがって、土壌の燃焼の深刻さの測定は、初期の灰の深さを参照している。

17、25、34、67、95、131、187、286、376日目に土壌を採取した。これは、火災後約2週間と3週間、1、2、3、4、6、9、12ヶ月目に相当する。9つの時点それぞれで、各燃焼サブプロットから灰層の下にある上部10 cmの鉱物質土壌（A層）を採取した。山火事によって有機物層が燃焼するため、サンプリングの均質性と非焼成プロットでの処理間の直接比較を保証するために、A 地層のサンプリング前にリター層を除去した（Pulido-Chavez ら、2021 年）。土壌は，二次汚染を防ぐために使用後にエタノールで洗浄した～250mlの放出可能な球根プランターで採取し，その結果，サンプリング時点ごとに36個の土壌サンプル（9区画×4小区画）が得られた。土壌は、サンプリング後数時間以内に個々のWhirl-Pakに入れてクーラーでカリフォルニア大学リバーサイド校（UCR）に輸送し、4℃で一晩保管した後、微生物群の回転を最小限に抑えるためにサンプリング後24時間以内にエタノール洗浄したふるい（2mm）で室温でふるい分けした（Phillips、2021年）。サブサンプルは、将来のDNA抽出のために-80℃で凍結した。DNA 抽出を行う前に、土壌を 1 ヶ月から 1 年間 -80°C で保存したが、-80°C での保存期間の違いは、DNA 量と完全性に影響しない (Lauber et al., 2010; Pavlovska et al., 2021)。

2.2 DNA 抽出、増幅、塩基配列決定
9 つのタイムポイントすべてに対する DNA 抽出は、2019 年の夏に実施した。土壌はエタノール洗浄したスパチュラを用いて秤量（0.25g）し、Qiagen DNeasy PowerSoil Kitsを用いてメーカーのプロトコルに従って処理し、溶液中に多量の沈殿物が残っているためC3溶液（有機物と無機物を沈殿させるための溶液）添加後に遠心分離時間を1.5分に増加し、-20℃で保管した。抽出したDNAは、真菌のITS2領域を増幅するITS4-funと5.8Sのプライマーペア（Taylor et al., 2016）、古細菌とバクテリアの16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅する515F-806Rプライマーペア（Caporaso et al., 2011）を用いてデュアルインデックス配列戦略（DIP）（Kozich et al., 2013）で増幅させた。我々の16Sプライマーは古細菌とバクテリアを増幅するが、古細菌はシーケンシングリードの1%未満しか寄与しないため、簡略化のため、16S法と結果を単にバクテリアと呼ぶことにした。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は2段階で行った。最初のPCRで遺伝子特異的プライマーを増幅し、2回目のPCRでイルミナシーケンス用のDIPバーコードとアダプターをライゲーションした。細菌については、1:10に希釈したDNA 1μl、Ultra-Pure Sterile Molecular Biology Grade water (Genesee Scientific) 10.5μl, AccuStart ToughMix (2× concentration; Quantabio) 12.5μl, 10μM 515Fと806Rプライマーを各0.5μlとした。PCR1のサーモサイクラーの条件は以下の通りである。94℃ 2分，94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 1分，68℃ 2分伸長を29サイクル行った。真菌については、原液DNA 5 μl、超純水 6.5 μl、AccuStart ToughMix 12.5 μl、10μM ITS4-fun と 5.8S primers 各 0.5 μlを組み合わせた。PCR1のサーモサイクラーの条件は以下の通りである。94℃ 2分、94℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 2分を30サイクル、68℃で10分延長した。PCR1産物はAMPure XP magnetic beads (Beckman Coulter Inc.) を用いて、製造元のプロトコルにしたがって洗浄した。イルミナシーケンス用のバーコードとアダプターを含むDIP PCR2プライマーは、10μMのDIP PCR2プライマー2.5μl、超純水6.5μl、Accustart ToughMix 12.5 μl、PCR1産物1 μlを含む25 μl反応中の第2PCRステップでアンプリコンにライゲーションされました。細菌と真菌のPCR2のサーモサイクラーの条件は以下の通りである。94℃ 2分、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを10回繰り返した。324サンプル（9プロット×4サブプロット×9タイムポイント）の細菌および真菌PCR産物は、次に、ゲル電気泳動バンド強度に基づいて別々にプールされ、確立された方法に従ってAMPureで洗浄された（Glassman et al.、2018）。各プールは、焼かれたプロットと焼かれていないプロットからの2-3タイムポイントを含み、2：3の比率で細菌と真菌を組み合わせる前に、Agilent Bioanalyser 2100で品質と量をチェックした（細菌は0.4単位、真菌は0.6単位）。各ライブラリーは細菌と真菌の両方について2-3個のタイムポイントにしか適合しないため、UCR統合ゲノム生物学研究所でIllumina MiSeq 2 x 300 bpを用いて4つのライブラリーにわたる9個のタイムポイントの配列を決定しました。324の実験サンプルに加え、各タイムポイントからの陰性DNA抽出物とPCRコントロール、モックコミュニティ（ZymoBIOMICS微生物コミュニティ標準、Zymo）を各ライブラリーに加え、さらなる品質管理および推論を実施した。

2.3 細菌・真菌のバイオマス量
細菌については Eub338/Eub518 プライマー (Fierer et al., 2005) を、真菌については FungiQuant-F/FungiQuant-R プライマー (Liu et al., 2012) を用いて、バイオマスの代理として定量 (q) PCR により細菌と真菌の遺伝子コピー数を推定した。真菌類については、種同定に適したITS2領域（Mayerら、2021）よりも、保存性が高く、長さの変異が少ないため、qPCRに適したsmall subunitを使用した（Schochら、2012）。菌類Saccharomyces cerevisiaeの18S領域または細菌Escherichia coliの16S領域をGenewiz, Inc.が構築したpuc57プラスミドベクターに既定の方法でクローニングし、10倍連続希釈による標準曲線を作成した（Averill & Hawkes, 2016）。10 μl qPCR反応は3連で行った。反応には、1μlの未希釈DNA、1μlの0.05 M Tris-HCl ph 8.3、1μlの2.5 mM MgCl2（New England BioLabs）、0.5 μlの0.5 mg/mL BSA、0.5 μlの0. 25 mM dNTP（NEB）、0.4 μMの両プライマー、0.5 μlの20x Evagreen Dye（VWR International）、0.1 μlのTaq DNA polymerase（NEB）および4.6 μlの超純水であった。CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System を採用し、以下の条件で行った。遺伝子コピー数は、Cq/閾値サイクルにおける既知/計算コピー数に対するサンプルあたりの平均Cq値として算出される定量サイクル（Cq）、CFX Maestroソフトウェアで生成されるy切片（b）および傾き（m）を用いて、10（（Cq-b）/m）式で生成された。R2 > 0.994の値を許容範囲とした。遺伝子コピー数は、乾燥土壌1グラムあたりで正規化した（Tatti et al.、2016）。注目すべきは、qPCRを含む、微生物のバイオマスを推定するすべての方法には、ターゲットコピー数のばらつきによる限界（Gaoら、2022）があることです（Lofgrenら、2019; Songら、2014）。しかし、選択したマーカー遺伝子を定量するqPCRの高い感度（Tellenbach et al., 2010）は、種の特異性ではなく、総微生物バイオマスの推定に関心がある場合、環境試料からの微生物バイオマスの推定に理想的である（Smith & Osborn, 2009）。さらに、真菌の一般的なバイオマス定量法は相関がある（Cheeke et al.、2017）。

2.4 バイオインフォマティクス
イルミナデータは、Qiime2バージョン2020.8（Bolyenら、2019）で処理した。4つのイルミナシーケンスランからの脱多重化fastQファイルは、プライマーを除去するためにcutadapt（Martin、2011）を使用して個別に処理され、キメラ配列および低品質領域をフィルタリングして除去し、Amplicon Sequence Variants（ASV）を生成するためにデフォルトパラメータでDADA2 version 2020.8 にかけられました（Callahan et al.，2017）。リードは、次世代イルミナシーケンスのベンチマークであるグローバル品質管理閾値（Q30）にトリミングした（Illumina, 2011）。細菌のフォワードリードは170 bp、リバースは163 bpにトリミングされ、真菌のフォワードリードは209 bp、リバースリードが201 bpにトリミングされた。平均して、バクテリアでは72%、菌類では61%の順方向および逆方向の配列がマージされた。各ライブラリーのDADA2出力は1つのライブラリーにまとめられ、シングルトンの除去や分類の割り当てなどの下流処理が行われた。Qiime2 Naïve Bayes Blast+分類器を用いて、細菌にはSILVA version 132 (Yilmaz et al., 2014)、真菌にはUNITE version 8.2 (Abarenkov et al., 2020)の分類学的割り当てを行いました。ミトコンドリアと葉緑体に割り当てられた細菌配列とKingdom Fungiに割り当てられなかった真菌配列は削除された。真菌ASVテーブルをエクスポートし、FUNGuild（Nguyen et al., 2016）を通して解析し、AMF、EMF、saprotrophs、および病原体に対する高確信度ランキングのみを含む機能生態学ギルドを割り当てた。さらに、ネガティブコントロールとモックコントロールを検査し、ネガティブコントロールの配列および/またはASVが無視できるものであること、およびモックの分類学が既知のコミュニティと相関していることを確認した。配列は、National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive に BioProject Accession Number PRJNA761539 として提出した。

2.5 統計解析
4回のIllumina MiSeqランにより、9.8M細菌および24.6M真菌配列が得られ、ダウンストリーム解析では平均31,052細菌および78,202真菌配列/試料となった。ネガティブコントロールの配列リードが少なく、ASVの数も少ないことから（Table S2）、バクテリアは7115、真菌は11,058の配列/サンプル深度になるようレアファクションを行い、データセット内で最も多くのサンプル数と配列深度を保持する保守的なステップを踏みました。レアファクションにより、すべてのネガティブサンプル/コントロールが除去された。真菌と細菌のアルファ多様性は、BiodiversityR version 2.14-2 (Kindt & Coe, 2005) を用いて、観察された種の豊かさ、シンプソン、シャノン、チャオ1、ACE、シンプソンの均一性、逆シャノンという指標で見積もられた。多様な土壌群集から豊かさを推定することには限界があるが（Willis et al., 2017）、山火事の影響を受けた土壌は多様性の低い群集を構成しており、種の豊かさのパターンはメトリクス間で類似していた（図S1）。したがって、すべての下流分析において、希釈後に観察されたASVの数として推定される豊かさに焦点を当てた。また、バイオマスおよびリッチネスが減少したかどうか、また、バイオマスおよびリッチネスが火災後の時間と共に増加したかどうか（H1）、山火事が菌類ギルドに明確な影響を与えるかどうか（H2）、バイオマスおよびリッチネスの変化が降水および土壌焼損度（H3）と関連するかどうかを調べるため、細菌と菌類の両方について、後方モデル選択を行い、処理（焼失 vs. 焼失）および時間（測定）により9種類の統計モデルを適合させた。H3）バクテリアと菌類ともに、後方モデル選択を行い、処理（焼失 vs. 未焼失）、時間（火災からの日数で測定）、灰深さ（cm）、月降水量（mm）、2次交互作用を予測因子として、9つの統計モデルを当てはめた。データの過分散と条件付き分散が条件付き平均より大きいことを考慮し、MASSパッケージバージョン7.3-57 (Venables & Ripley, 2002) の負の二項分布による一般化混合効果モデル (glmer) を使用した (Bliss, 1953; Ross & Preece, 1985)。火災発生からの時間と降水量はスケーリングされ、中心化された。すべてのモデルについて、異なる入れ子レベル（プロット、サブプロット、火災からの時間）と予測変数のないヌルモデルを実行して、入れ子レベルをテストした。モデルの選択はMuMINパッケージバージョン1.46.0 (Barton, 2020)のAICc (Akaike Information Criterion)を用いて行われた。すべてのリッチネスモデルにはランダム効果としてプロット、サブプロット、火災発生からの時間が含まれ、すべてのバイオマスモデルにはランダム効果としてプロットと火災発生からの時間が含まれた。サブプロットは最適なモデルであると判断されなかったため、バイオマス解析には含まれなかった（AIC選択）。擬似R2、つまりすべてのモデルで説明される分散（周辺および条件付き）は、MuMInパッケージのr.squaredGLMM関数を用いて計算された。

ベータ多様性の比較は、vegan Avgdist関数で距離行列を生成し、100回の反復ごとに平方根変換したブレイ・カーティス非類似度中央値を計算することで行った。我々は、veganバージョン2.6-2（Oksanenら、2018）のadonis関数で実装された並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA；Anderson、2017）を使用して、細菌および真菌コミュニティ組成全体に対する、山火事、火事からの時間、降水、土壌燃焼の重大度、および2次相互作用の著しい影響を検定した。さらに、独立した各時点で野焼きの有意性を検証した（H1）。結果は、非計量的多次元尺度法（NMDS）序列を用いて可視化した。

また、遷移を定量化するために、いくつかの方法を採用した（H4）。まず、phyloseq version 1.38.0 (McMurdie & Holmes, 2013) を用いて群集組成パターンを属レベルで特徴づけ、焼失群集と未焼失群集の各時点における優勢なASVの相対存在度（プロットの判読に使用した3%以上の配列存在度）を独立してグループ化し、遷移を可視化した。第二に、ソルガムの微生物遷移を調べた研究（Gao et al., 2020）と同様に、時間距離と群集組成の相関を調べるために、vegan mantel関数を使用し、火災の有無でターンオーバーがどのように変化するかを明らかにした。第三に、空間的な種のターンオーバーを可視化するために（Baselga, 2010）、初期遷移期には大きな変動が見られるという事実を利用した（Collins, 1990; Pandolfi, 2008）。そこで、veganのbetadisper関数を使ってBray-Curtis非類似度の多変量分散を計算し、主座標分析（PCoA）を使って結果を可視化し、後継期の細菌・菌類群集の均質性を検証した。最後に、codynパッケージバージョン2.0.5（Hallett et al., 2016）を採用し、方向性変化率、安定性、同期性など、後継時間にわたる群集力学のパターンを明らかにした（Collins et al., 2000）。後継には、初期後継種から後期後継種への入れ替えを介した方向性の変化が含まれる（Clements, 1916; Platt & Connell, 2003）ため、各微生物群集のユークリッド距離を用いて方向性の変化率を算出した。次に、種の出現や消失が遷移を促進するかどうかを判断するために、種の回転を測定した。多様性が増すと安定性が増すので（多様性安定仮説）、焼畑プロットと非焼畑プロットの群集安定性を、各時刻点での平均存在量を標準偏差で割った値で独立に測定した（Lehman & Tilman, 2000）。しかし、群集の安定性は時間的な種の共分散に依存するため、完全な種の同期性を1、0を非同期性とする同期性 (Loreau & de Mazancourt, 2008) を測定した (Valencia et al., 2020)。非同期性は種個体群の共分散をもたらし、種間のトレードオフが全体的な群集の安定性に寄与する可能性がある。

すべての統計解析はR 4.1.1 (R Core Team, 2021)で行い、プロットはggplot2 version 3.3.6 (Wickham, 2016)を用いて作成した。すべての統計コードはGitHub https://github.com/pulidofabs/SecondarySuccession-Chaparral で入手可能である。

3 結果
3.1 シーケンスデータ
4回のIllumina MiSeqの実行により、細菌33,078個、真菌11,480個のASVが得られた。実験サンプルと比較して、細菌陰性対照は平均して10個のASVを有し、真菌陰性対照は8個のASVを有していた（表S2）。希釈の結果、細菌性ASVは24874個、真菌性ASVは7445個となり、すべての対照試料が除去された。希薄化した真菌ASV表から真菌ギルドを抽出した結果、EMF208種、樹上性70種、AMF65種、病原性26種の真菌ASVが検出された。

3.2 細菌および真菌のバイオマスおよびリッチネスに対する山火事の影響
火災は、火災後1年目の細菌および真菌のバイオマス量と富栄養度を有意に減少させた（表S3）。火災は、細菌と真菌の両方において、豊富さよりもバイオマスに大きな影響を与え、全体として細菌よりも真菌に大きな影響を与えた（図2）。年間を通して平均すると、火災によってバクテリアのリッチネスが46%（図S1A）、バイオマスが47%（図S2A）減少し、真菌のリッチネスが68%（図S1A）、バイオマスが86%（図S2B）減少していることがわかった。火入れ後17日目における野火の直接的な即効性は、豊富さよりもバイオマスで強く、細菌バイオマスは84％（図2A）、真菌バイオマスは97％（図2B、表S3）減少していた。一方、焼失後17日目では、菌類リッチネスは45%減少したが（図2d）、細菌リッチネスは一時的に31%増加したが、焼失後25日目には29%減少した（図2c; 表S3)。焼失プロットと非焼失プロットのバイオマスおよびリッチネスの差は、火災後時間が経つにつれて小さくなったが、細菌および真菌のバイオマスまたはリッチネスが非焼失レベルまで回復するには1年では不十分だった（図2）。火災の影響は、バクテリアよりも菌類で大きく、火災後1年の時点で、菌類バイオマスは80%、リッチネスが61%低く、バクテリアバイオマスは43%、リッチネスが23%低かった（図2; 表S3)。

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図2
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3.3 火災は直接および間接的にバイオマスおよび生物量に影響を与える
火災は、バクテリアと真菌のバイオマスおよび富栄養度に直接的かつ負の影響を与えた。これらの直接的な影響は、真菌のバイオマスについては火災との正の相互作用によって、真菌の豊かさと細菌のバイオマスについては土壌の燃焼度との正の相互作用によって、時間とともに変化した（図3；表S4）。火災発生からの経過時間も真菌類の豊富さに直接正の影響を与えた（表S4）。土壌焼失の程度は、バクテリアと真菌の豊富さには有意な悪影響を及ぼしたが、バイオマスには有意な直接効果を示さなかった。つまり、バイオマスはその程度に関わらず、火災によって同様に減少した（図3c、d；表S4）。降水量には有意な直接効果が見られなかったが、降水量は火災と相互作用して、バクテリアのバイオマスおよび菌類の豊富さには正の影響を与えたが（図2a、d）、バクテリアの豊富さには負の影響を与えた（図2c、表S4）。

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図3
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3.4 異なる菌類群集の豊かさに対する山火事の影響
山火事の影響で、すべての菌類群集の種の豊富さが大幅に減少し（図 S3、表 S5）、特に AMF の減少が最大となった。焼失したプロットでは、焼失していないプロットに比べて、各時点の平均で、EMFは68％、病原菌は71％、樹液菌は86％、AMFは98％減少し（図S3）、どの菌群も焼失前の水準に戻るには1年では不十分であった（図S4）。実際、376日目には、EMFは平均91%、AMFは89%、病原菌は69%、サプロブは61%減少していた（図S4）。外生菌根の豊かさは土壌焼失の深刻さによって、また火災と時間の相互作用によって減少したが、火災からの時間は樹液の豊かさに直接的かつ負の影響を与え、時間とともに減少した（表S5）。最後に、火災と降水量の相互作用は、EMFと病原体の豊かさの両方にマイナスの影響を与えた（表S5）。

3.5 山火事による微生物群集組成の変化
火災は細菌および真菌の群集構造に有意な影響を与え、細菌で13％、真菌で10％の組成変動を説明した（表S6）。火災発生からの時間は、群集組成への影響は小さく、バクテリアで4%、菌類で1%の変動を説明した。土壌の焼け具合はバクテリアと菌類に等しく影響し、両者の分散の2%を説明した。一方、降水量は菌類よりもバクテリアにやや大きな影響を与え、バクテリアの分散の3%、菌類の分散の1%を説明した（表S6）。また、細菌と真菌の両方で、小さいながらも有意な交互作用が見られた（表S6）。さらに、焼失圃場と未焼失圃場間の群集組成は、バクテリア（図S5）および菌類（図S6）ともに9時点すべてで有意に変化し、群集組成の差は、焼失後17日目から376日目にかけてバクテリア（図S5）で12%から21%、菌類（図S6）で9%から13%と経時的に増加した。焼失した細菌（図4a）および真菌（図4c）組成の全体的な変化は、以前は希少だった分類群によってもたらされ、時間とともにその存在量が増加した（図4b,d）。真菌類とは異なり、焼失細菌群集は、単一の属であるProteobacteria Massiliaによって経時的に一貫して支配されていた（平均配列存在比57％）（図4b）。しかし、3つのファーミキューテス属が急速に優勢になり、バチルス属（13%）、未分化のクロストリジアル属（26%）、パエニバチルス属（4%）が火災後34日および67日で優勢になった。しかし、これらのファーミキューテス類は、プロテオバクテリアのノビヘルバスピリラムが時間とともに増加し、34日目の1%から年末には24%まで急速に減少した（図4b）。焼失菌類では、焼失後17日目に優勢であった担子菌類の酵母Geminibasidium（45%）とEMF Inocybe（16%）が急速に減少し、糸状菌類の子嚢菌類が時間の経過とともに増加した（図4d）。ピロネマ属は、ジェミニバシジウムの減少に伴って増加し、火災後25日から95日まで優勢で、火災後67日に配列量の67%でピークに達した。また、子嚢菌類Aspergillusは火災後17日から376日まで2%から22%に、Penicilliumは36%から49%に増加した（図4d）。

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図4
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3.6 バクテリアの遷移ダイナミクス
焼失した細菌群集は、菌類群集の約2倍の速度で急速かつ明確な遷移軌道（図5a）を経験し（図5c）、25、34、95、131、187、286日の6つの主要組成転換点によって駆動されていた（図5e）。一方、未焼成の細菌群集は、優占率が低く、経時的に安定した状態を保ち（図6a）、遷移（図6c）や組成の入れ替わり（図6e）は見られなかった。これらのパターンは、後継者ダイナミクスの測定値にも反映されている（表S7）。例えば、焼失した細菌群集は、種組成の時間変化が方向性を持ち、非焼失群集（0.12；表S7）よりも高かった（0.16；表S7）。また、焼失した細菌群集は、焼失していない細菌群集（5.36；表S7）よりも低い同期性を示した（0.03）。

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図5
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図6
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3.7 菌類群集の遷移ダイナミクス
焼失した菌類群集は、焼失後25、34、67、95、131日の5つの主要な組成転換点（図5f）により、急速かつ明確な後継者追跡（図5b、d）が行われた。一方、未燃焼の菌類群集では、優占率は低く（図6b）、遷移もなく（図6d）、組成の変化もなく（図6f）、経時的に安定した状態が維持された。バクテリアと同様に、これらのパターンは後継者ダイナミクスの指標（表S7）にも反映され、焼失菌類群集は未焼失群集（0.08）よりも高い方向転換を示し、焼失系に多くの種が導入されたことにより後継者のパターンが強くなったことを反映している。また、焼失菌類群集は、非焼失菌類群集（0.05）よりも同期性（0.04）がやや低く、群集安定性（6.42）は非焼失菌類群集（8.58）よりもはるかに低く、焼失菌類群集の変化に対する感受性がより高いことが示された（表 S7）。

3.8 微生物遷移を促進する分類群
細菌および真菌の遷移は、耐熱性や迅速なコロニー形成などの生理的形質に基づいて存在量がトレードオフされる分類群によって推進された（表1）。焼畑プロットにおけるバクテリア（図5a）と真菌（図5b）の初期交代現象は、分類群の消失によって引き起こされ、バクテリア（17-95日目）の方が真菌（17-25日目、表S7）よりも顕著であった。実際、火災後25日目のファーミキューテス・バシルス、34-67日目のパエニバチルスとドミバチルス、95日目のプロテオバクテリア・ノビヘルバスピリルムを含む少数の分類群による支配が増加し、マシリアの一定の支配（火災後34-286日）が、時間とともにRB41、Conexibacter、キャンディデータ・ウダエバクター、バシルスなど初期の細菌種の消滅をもたらした（図5a; 表S7）。一方、真菌の遷移は、担子菌門のInocybe、Cortinarius、Tomentella、子嚢菌門のBalsamia、およびこれまで稀だった担子菌EMF属（Inocybeの亜属）の1種Mallocybeなど、未焼却群集を支配したGeminibasidiumとEMF属が急速に優勢となったことによって始まった（図5bおよび図6b）。興味深いことに、火災後25日目にはEMFのほとんどの種が群集から急速に消失し、Pyronema、Penicillium、Aspergillusが常に優勢であった（図5b）。しかし、遷移が進むにつれて、種の出現により、細菌類では後期遷移（187-376日；図5a）、真菌類では中期遷移（67-187日；図5b；表S7）が促進された。細菌類では、ペドバクターとアドヘリバクターという2つのバクテロイデット類とブラストコッカスという放線菌の出現が晩年（187-376日目）の細菌類の遷移を形成していた（図5a）。菌類では、中期（95-187日目）に糸状菌のPyronemataceaeとSordariaceaeのGelasinospora属、および担子菌類のキノコ形成性分類群の出現によって遷移が促進された（図5b）。例えば、以前は優占していたEMFのInocybe属は群集に残っていたが、その存在量はかなり低く、火災からの経過時間とともに17日目の16%から376日目の0.1%まで減少していた（図4d）。一方、非火災時の群集では稀であった（配列数0.01%未満）親水性の担子菌類CoprinellusとTephrocybeは、その年の後半に群集に現れた（図5b）。後期（286-376日目）の真菌の遷移は、担子菌のTephrocybeと子嚢菌のAspergillusとRasamsoniaの優位性が高まり、Pyronemaの存在量が減少した（図5b）。

表1. Grimeの競争-ストレス耐性-ルデラル（CSR）継承説における親水性細菌・菌類の位置づけの仮説（属レベルでの形質ごと、現在の文献に基づく）。
kingdom Phylum Genus Grime's traits (CSR) 特性の説明 References
Bacteria Firmicute (Bacillota) Bacillus S 好気性、従属栄養、抗生物質産生、耐熱性、内胞子、窒素還元、リン酸可溶化 Grady et al. (2016); Kaur et al. (2018); Mandic-Mulec et al. (2015); Espinosa-de-los-Monteros et al. (2001); Kalayu (2019); Slepecky & Hemphill (2006); Espinosa-de-los-Monteros et al. (2001)
Bacteria Firmicute (Bacillota) Clostridiales S,R 耐熱性、内胞子、ストレスに反応して胞子形成を誘発、窒素を削減 Grady et al. (2016); Kaur et al. (2018); Mandic-Mulec et al. (2015); Paredes-Sabja et al. (2011); Kalayu (2019).
Bacteria Firmicute (Bacillota) Paenibacillus S 好気性、従属栄養、抗生物質生産（バクテリオシン）、耐熱性、エンドスポア、窒素固定 Grady et al. (2016; Kaur et al. (2018); Mandic-Mulec et al. (2015); Monciardini et al. (2003); Slepecky & Hemphill (2006))
細菌類 Actinobacteria (Actinomycetota) Conexibacter C 好気性、従属栄養、抗生物質産生、窒素を還元 Espinosa-de-los-Monteros et al. (2001); Kalayu (2019).
細菌類 Proteobacteria (Pseudomonadota) Massilia C,R 好気性、高速繁殖、多様な生態、資源を利用 Li et al. (2014); Toljander et al. (2005)
細菌類 Proteobacteria (Pseudomonadota) Novihersparillium C,R 速い繁殖、資源を利用、おそらく PyOM 分解菌 Baldani et al.
菌類

担子菌門 Geminibasidium S 温度・氷点下耐性酵母 Alexopoulous & Mims (1952)
菌類子嚢菌類 Pyronema S, R 耐熱性強角膜；おそらくPyOM分解菌、糸状菌 Moore (1962); Fischer et al. (2021)
発芽に熱や化学処理を必要とし、色素を持つ菌糸体 Alexopoulous & Mims (1952)
R 無性分生子が多く、成長が早い、糸状菌 Dix & Webster (1995); McGee et al. (2006); Crow (1992)
真菌類子嚢菌科 Aspergillus R 無性分生子、速い成長、糸状菌性
Dix & Webster (1995); McGee et al. (2006); Crow (1992)

担子菌門Coprinellus C おそらくPyOM分解菌、糸状菌 Steindorffら(2021)
菌類担子菌門
Tephrocybe anthrocophila テフロシベ・アントロコフィラ

C アンモニウムや窒素に親和性がある、糸状菌 (Suzuki, 2017;Legg, 1992)
4 ディスカション
本研究では、これまでで最も高解像度な火災後のマイクロバイオームの時間サンプリングを行い、バクテリアと菌類が、時間の経過とともに存在量がトレードオフする親油性分類群の優位性によって急速な後継を経験していることを初めて示すことができた（H4）。我々の研究はカリフォルニアのシャパラルで行われたが、ここで同定された支配的な親水性分類群の多くは、スペインの低木林（Pérez-Valeraら、2018）や松（Brunsら、2020；Reazinら、, 2016）、トウヒ（Whitman et al., 2019）、ユーカリ（Ammitzboll et al., 2022; McMullan-Fisher et al., 2011）、レッドウッド-タノキ林（Enright et al., 2022）であり、我々の結果が山火事の影響を受けた生態系について一般性を示すことができる。山火事によって細菌および真菌のバイオマス量と富栄養度が減少し、群集組成のシフトが年間を通じて継続することがわかった（H1）。真菌群は火災と時間によって異なる影響を受け、AMFとsaprobesは火災直後の影響が最も大きかったが、時間経過とともにEMFが最も減少した（H2）。さらに、微生物の豊富さとバイオマスの変化は、火災からの時間、降水量、土壌の燃焼度合いの相互作用を含む、複数の生物学的相互作用によって引き起こされた（H3）。

4.1 森林火災によるバクテリアおよび真菌のバイオマスおよびリッチネスの減少
火災は、地中海低木地帯（Pérez-Valera et al., 2018）および森林（Dooley & Treseder, 2012）における過去の火災後の研究を裏付けるように、土壌細菌および真菌のバイオマスおよびリッチネスを減少させた。我々は、細菌よりも真菌のバイオマスおよびリッチネスに対してより大きな火災の影響を指摘し、細菌が真菌よりも火災に強いことを示す先行研究と一致した（Certini et al.、2021; Glassman et al.、2021; Pourreza et al.、2014; Pressler et al.、2019）。どちらの微生物群もリッチネスとバイオマスは時間とともに増加したが、どちらの群も未焼失のレベルまで回復するには1年では不十分で、低木林では微生物のバイオマスおよびリッチネスの回復には20年以上かかる可能性があると示した先行研究（Pérez-Valera et al, 2018）と一貫していた。興味深いことに、我々は、火災後に直接、細菌の豊かさの一過性の増加を観察したが、これは、アクチノバクテリア属のソリルブロバクターやコネキシバクター（Albuquerque & da Costa, 2014）などの分類群に起因すると考えられ、ここ（表S1）や他の研究（Neary et al., 1999）で観察した土壌pHの上昇によって、あるいは火災後の窒素とリンの利用可能量の増加によって、好まれる可能性がある（Certini et al., 2021）。

4.2 真菌群に対する野火の影響
火災による死滅は、AMF と樹液菌類で急速であった。しかし、EMFは時間の経過とともに火災の影響を最も受け、主に宿主の死亡によって菌根の豊かさに火災が負の影響を与えることを指摘する生態系全体の研究を裏付けた（Dove & Hart, 2017; Pulido-Chavezら, 2021）。実際、火災後、すべてのサブプロットには植生がなかった（生きた植生被覆0％）のに対し、未焼成プロットでは97％の植生被覆があった。しかし、ITS2プライマーはすべてのAMF分類群を適切に検出しないため、AMFの急激な減少はプライマーの偏りに起因する可能性があることに留意する（Lekberg et al.、2018）。さらに、焼失した温帯松林（Owen et al., 2019; Pulidoo-Chavez et al., 2021）や松が支配する地中海システム（Gassibe et al., 2011; Hernández-Rodríguez et al., 2013）で以前発見された外生菌根菌のCortinarius、Inocybe、Tomentellaも初期のチャパラルの菌類継承を支配し、コミュニティで1～2カ月間残存することを示す。EMFは2ヶ月後にはほとんど消滅してしまったので、これは宿主の死後、菌根菌がどれくらいの期間で消滅するのかという疑問に対する答えになる可能性がある。検出されたEMFシグナルが遺存DNAである可能性もあるが（Carini et al., 2016）、火災後のシステムに典型的な高い土壌温度（Amacher et al., 2001; Neary et al., 1999）は遺存DNAを劣化させていると考えられ（Sirois & Buckley, 2019; Torti et al., 2015）、これらのEMFが火災を生き残り少なくとも2か月間は死にゆく宿主にしがみついた可能性を示唆している。あるEMF属が他の属より生き残るのは、探索の種類と現在の光合成物質と貯蔵された光合成物質に対する特異性に起因する可能性がある（Gray & Kernaghan, 2020; Pena et al.）例えば、Cortinariusは中長期の探索タイプで、維持のために多くの炭素を必要とするが、火災後17日しか生存しなかった。一方、短距離接触型であるInocybeは（Agerer, 2001; Koide et al., 2014）、炭素要求量が少ないか温暖化に適応したためか、年間を通して非常に低い個体数で生存した（Fernandez et al., 2017）。我々の結果は、初期のEMFは宿主の貯蔵光合成物や、生存し再萌芽したマンザニータやシャミセの低木が提供する低資源で生存できたが、大多数のEMFは火災による死亡を経験したことを示している。

4.3 焼失群集を支配する好気性菌類
カリフォルニア州では、これまでいくつかの生態系で検出されてきた親水性菌類が群集を支配しており、親水性微生物が生物に特異的でないことを示している。このことは、親水性微生物が生物に特有なものではなく、チャパラルや一部のマツ科の森林でよく見られる、強度の高い火災の際に到達する温度閾値によって、これらの菌類が活性化する可能性があることを示している (Agee, 1993; Keeley & Zedler, 2009; Neary et al., 1999)。特に、我々の焼畑群集はPyronema属、Penicillium属、Aspergillus属の子嚢菌類に支配されており、地中海低木林（Livne-Luzonら、2021）、北方トウヒ林（Witmanら、2019）、山地松林（Brunsら、2020；Pulido-Chavezら、2021）で優勢な火災後の真菌種と同様のものであることがわかった。ピロネマ（P. omphalodes）とアスペルギルス（A. fumigatus）はともにカリフォルニアのシャパラルに生息する好熱菌として知られており（Dunn et al., 1982）、さらにP. domesticum, A. udagawae, A. elsenburgensisなどの種も確認された。これらの菌類は山火事に適応し、熱で活性化する休眠胞子、硬化体、分生子などの耐火構造を作り出す(Gottlieb, 1950; Moore, 1962; Rhodes, 2006; Warcup & Baker, 1963)。アスペルギルス（A. udagawaeを含むFumigati亜属）は高温によって迅速かつ効率的に発芽し（Rhodes, 2006）、アンモニウムや硝酸塩など様々な炭素・窒素源を利用できるため（Krappmann & Braus, 2005）、火災後にアスペルギルスが急速に優勢になると思われる。さらに、Pyronema domesticumは、火災後の環境において豊富な基質である発熱性有機物を無機化できる（Fischerら、2021年）。さらに、最近報告された耐熱性担子菌酵母であるGeminibasidium（Nguyen et al.、2013）は、火災後17日目に優勢となった。ほとんどの好熱菌はキノコから記載されているためか、一般的に好熱菌とは記載されていないが（McMullan-Fisher et al., 2011）、他の2つの研究では、松林の火災後にGeminibasidiumが増加することが分かっており（Pulido-Chavez et al., 2021; Yang et al., 2020）、Geminibasidiumが十分に代表される好熱菌であると示唆されている。これらの結果を合わせると、優占する好気性菌は予想以上に広く分布しており、火災に対する反応は火災適応形質や温度閾値によるものであると思われる。

4.4 親水性菌類は菌類の二次遷移を促進する
親水性菌類は生態系に広く分布しているが、これらの親水性菌類がどの程度で出現し、その回転率がどの程度か、また、その存在量が時間とともに変化するかについては、理解が不足している（Fox et al.、2022）。後継者理論では、初期の後継段階は、ストレス耐性（S）と競争的（C）な生命史戦略の間で時間の経過とともにトレードオフする、成長の早い生物またはルデラル（R）生物によって支配されている（Kinzig & Pacala, 2002）（Grime、1977；Zhang et al.、2018）と述べている。GrimeのC-S-Rを微生物に適応させた最近の研究は、親火性微生物が火災後の資源獲得（C）、耐熱構造（S）、高速成長（R）など植物に類似した形質で火災後に生き残り繁栄することを示唆している（Enrightら、2022; Whitmanら、2019). 我々のデータは、チャパラル親水性微生物がこれらの形質カテゴリーに当てはまり（表1）、これらの形質間のトレードオフが微生物継承を駆動する可能性があることを示唆している。

火災後の初期の遷移は、生き残った耐熱性菌類（すなわち、GeminibasidiumとPyronema）が牽引し、高速コロニー形成菌（すなわち、PenicilliumとAspergillus）が続き、火災後の資源を利用できる競合菌に追い越された。(また、GeminibasidusとTephrocybeの2つの菌類が、火災後の資源を利用する競争力のある菌類に追い越された。） Geminibasidiumが耐熱性および耐キセロ性を有するのに対し（Nguyen et al.、2013）、Pyronemaは耐熱性硬化体を生産し（Moore、1962）、山火事での生存を可能にする。両種とも耐熱性があるが、酵母のGeminibasidiumと糸状菌のPyronemaの形態的な成長特性の違いが、優劣のトレードオフを説明する可能性がある。例えば、単細胞の増殖によってGeminibasidiumは瞬時に優勢になったが、栄養分を採食し、表面のコロニー形成を急速に増やす能力によって、糸状のPyronemaは空き地をよりよく支配することができるかもしれない。興味深いことに、熱活性化型Neurospora crassaに近縁で（Dettman et al., 2001; Emerson, 1948）、色素性菌糸を生産し、発芽に熱または化学処理を必要とすることが知られているGelasinospora heterosporaが火災後25、34、95日で非常に多く、これも好熱性であると示唆される。この菌は無性分生子を大量に生産し（Crow, 1992）、オープンニッチへの迅速なコロニー形成を可能にしており、同じく無性分生子が多い火災後の初期優勢植物（James, 1984）と類似している。最後に、植物と同様に、競争が後期の後継者動態を駆動するようであり（Tilman, 1990; Zhang et al., 2018）、9-12ヶ月でCoprinellusやTephrocybeなどの親油性真菌分解者の出現が示唆されており、ユーカリ林の知見を裏付ける（Ammitzboll et al., 2022; McMullan-Fisher et al., 2011）。コプリネルスは芳香族炭化水素を分解できることを示す証拠があり（Steindorffら、2021）、この豊富で複雑な炭素源をめぐって初期の真菌類分類群に勝っているという考えを裏付ける。さらに、Tephrocybe anthracophilaはアンモニウム-窒素に対して高い親和性を持ち（Legg, 1992; Suzuki, 2017）、この豊富な火災後の資源にアクセスすることが可能である。以上より、植物と同様の火災適応形質間のトレードオフが、火災後の微生物遷移を促進する可能性があることが示された。

4.5 親水性細菌が優勢で、細菌の二次遷移が開始される
好気性従属栄養細菌は、胞子形成や抗生物質の生産を行い、火災後の環境における競争力を向上させる可能性があるため、細菌は急速な遷移と群集の入れ替わりを経験していることが明らかになった。さらに、これまでに検出されたカナダ（Whitman et al., 2019）、中国北方（Xiang et al., 2014）、カリフォルニア州レッドウッド-タノキ林（Enright et al., 2022）およびスペイン低木林からの推定好気性細菌もカリフォルニア州シャパラルを支配していることを示し、これらの好気性細菌が広く分布する可能性を示唆するものであった。特に、我々の焼畑群集は、先行研究（Ammitzboll et al., 2022; Enright et al., 2022; Sáenz de Miera et al., 2020; Whitman et al., 2019; Xiang et al., 2014）と同様に Actinobacteria, Acidobacteria, Firmicutes, Proteobacteria 系のタクサを好んで生息していた。

細菌の後継ダイナミクスは真菌類とは異なり、最初の数週間は高い多様性と優位性の欠如が特徴で、未焼成の群落で観察された分布を模倣していた。山火事のような複雑な資源環境では、多様な生物群集が資源をよりよく利用できるため、競争よりもニッチ補完性が重要であり（Eisenhauer et al.、2013）、さらに群集の安定性に貢献する。本研究の結果はこの考えを支持するものであり、本研究で優占する分類群は異なる資源を利用していると考えられる。例えば、Paenibacillus属のメンバーは窒素を固定でき（Monciardini et al., 2003; Slepecky & Hemphill, 2006）、BacillusとConexibacterは窒素を還元し、Bacillusはさらにリン酸を可溶化することができる（Espinosa-de-los-Monteros et al., 2001; Kalayu, 2019）。しかし、25日目には細菌は大きな組成の入れ替わりを経験し、火に適応した形質を持つ親水性細菌が優勢になることができた。Proteobacteria Massiliaが常に優勢であることが示すように、細菌では真菌ほど存在量のトレードオフは顕著ではなかったが、それに続く最も豊富な細菌は、おそらく耐熱性や高速コロニー形成などの生理学的形質によって、他の細菌属に対する優位性のトレードオフを経験している（表1）。

Firmicutesには、最も耐熱性の高い胞子産生細菌（Grady et al., 2016; Kaur et al., 2018; Mandic-Mulec et al., 2015）が含まれ、Bacillus属、Paenibacillus属、Clostridiales属は、火災後の基質を利用することができるProteobacteria門の速い殖民の属（例えば、NoviersparilliumやMassilia）が優位となり存在量は減少している。さらに、ファーミキューテス目のクロストリジウム属は、ストレスに反応して胞子形成を引き起こすことができるため（Paredes-Sabja et al. 耐熱性は火災時の生存に不可欠であるが、開放的なニッチを迅速に支配し、火災後の資源を利用することで、火災後の成長を確保できる可能性がある。Massiliaは、根圏に会合し（Li et al., 2014）、AMFハイファ（Iffis et al., 2014）や様々な植物の根にコロニーを作る（Ofek et al., 2012）高速増殖性細菌である。したがって，本研究や他の火災後の環境（Enright et al., 2022; Whitman et al., 2019）におけるMassiliaの優勢は，その多様な生態と急速な繁殖速度が土壌内での増殖を促進していることを示唆している（Toljander et al., 2005）。さらに、我々の結果は、フィールドにおける現在の知識と相まって、MassiliaとNoviherbaspirilliumの継続的な支配は、火災後の資源を利用する能力に起因する可能性を示している。例えば、Massilia属には、長鎖炭化水素を分解し（Ren et al., 2018）、硝酸塩を還元する（Bailey et al., 2014）ことができる種が含まれています。一方、中期から後期にかけて優勢な細菌属であるNoviherbaspirilliumは、多環芳香族炭化水素を分解する可能性がある（Baldani et al.2014; Grady et al.2016; Woolet & Whitman, 2020）。菌類ほどトレードオフは特徴的ではないが、高資源下での高速増殖や低資源下での資源獲得などの形質間の相互作用による可能性があるが、我々の結果は、火成性細菌が火災を生き延びるためのメカニズムを持ち、時間と共に初期優勢分類群から後期優勢分類群への存在量のトレードオフを促す可能性があるという証拠を提供すると結論付けている。

4.6 バクテリアと菌類で異なる微生物遷移のダイナミクス
つまり、火災後早期に火災前の優占種が再根拠し、これらの種が徐々にそのシステムを支配する（Hanes, 1971）。しかし、細菌や菌類のサクセションはこのような状況にはない。火災後に優勢となった属のほとんどは、火災前には稀であるか存在せず、これらの初期コロニー形成者は、種の置き換えによって時間の経過とともに方向転換を経験した。この結果は、非災害性撹乱の後継者概念と一致する。この概念では、撹乱を生き延びた種や早期に回復した種が初期の後継者動態を支配するが、必然的に後期段階の種が方向性交換メカニズムによって置き換わる（Platt & Connell、2003年）。同様の方向性置換パターンは、氷河前線における菌類の一次遷移後にも明らかにされている（Dong et al.，2016）。少数の属が焼失微生物群集を支配していたが，細菌と真菌は異なる遷移パターンを示した。細菌類の焼失群集は、非焼失群集と比較して、低い同期性と高い安定性を示した。低同期性は、共存する競争相手の存在量のトレードオフによって駆動される代償力学によって安定性が付与される可能性を示している（Tilman, 1999）。逆に、焼失後の群集の安定性が低いのは、種の同調性が高まり、代償ダイナミックスが低下したためである可能性がある。環境変動が大きい系では、種の非同期性を介した代償ダイナミックスが安定性に寄与することが多い (Yachi & Loreau, 1999)。一方、焼失した菌類群集は未焼失の群集よりも低い安定性を示したが、同期性は両者で同様に低かった。この低い安定性は、菌類群集で観察された種の大きな損失により、潜在的に菌類分類群の全体的な変動が増加し（Tilman et al.、2014）、優先効果や支配属の異なる代替群集が生じたことを示すと考えられる（Connell & Slatyer、1977；深見、2015）。しかし、微生物群集は火災後の生態系回復の重要なドライバーであるため、このような微生物の後継者動態を探るための更なる研究が必要である。

4.7 降水量と燃焼の厳しさが細菌・真菌群に異なる影響を与える
火災は微生物変化の最も有力なドライバーであったが、時間と降水量の相互作用も微生物のバイオマスやリッチネスに異なる影響を与え、後継者ダイナミクスを駆動することが分かった。降水量は火災発生からの時間と相互作用し、バクテリアのリッチネスとは負の相関、真菌のリッチネスとは正の相関を示し、降雨イベントの後にバクテリアのリッチネスは減少し、真菌のリッチネスは増加した。3年間の降水量操作実験を行った少なくとも1件の研究では、降水量の増加によって細菌性リッチネスが減少することが示された（Yang et al.、2021）。豊かさとは対照的に、降水は火災と相互作用して細菌バイオマスに正の影響を及ぼし、真菌バイオマスは降水の影響を受けないままであった。降水に対する異なる反応は、微生物の生理学的および形態学的な違いによる可能性がある（Blazewicz et al.、2014；Placella et al.、2012；Selbmann et al.、2013）。例えば、真菌は、低栄養条件では菌糸体、高栄養条件では単細胞体といったように、環境条件に応じて成長形態を交代する能力など、高い形態的可塑性を持っており（Selbmann et al., 2013）、これにより真菌は水分量の小さな変化に耐え、長期にわたって成長を続けることができる可能性がある。さらに、菌類は乾燥に対する抵抗力を活性化または強化することもできるため（Evans & Wallenstein, 2012; Guhr & Kircher, 2020）、外部環境条件にかかわらず一定の繁殖率を維持することができ、菌類の豊富さにプラスの影響を与えることが説明できる。一方、細菌は急激な湿潤化によって細胞死を経験することがあり、他の細菌群は休眠状態に入り、成長を抑制する（Schimel, 2018）。したがって、進化的に成功するために、一部の細菌は好ましい条件（例えば、雨；Leizeagaら、2022）に迅速に反応し、急速に複製して、降雨イベント中に放出された栄養分のパルスをめぐって他の微生物と競合する可能性があり（Homyakら、2014）、したがって、131日目に著しい降雨後に観測された豊かさのピークを説明できる可能性がある。

これまでの研究で、灰の深さは火災の強度（Rice, 1993）および重大性（Bodí et al.、2014；Parson et al.、2010）と相関することが示されている。ここでは、最初の雨や大きな風によって灰が除去される前に灰の深さを測定し、灰の深さが土壌微生物に関連するスケールで土壌の燃焼の深刻さの代理として機能することを発見しました。BAERマップでは、すべてのプロットが中程度の燃焼度であると分類されていますが、私たちはサブプロット間で土壌の燃焼度の大きなばらつきを確認しました（図S7）。山火事が不均質な景観をもたらすことはよく知られている（Jain et al.2008）。したがって、BAERマップにおける土壌火傷の深刻度の不一致は、地上での検証不足が原因である可能性がある。我々の厳しさの影響は他の研究で見つかったものと同様であったため、灰の深さが土壌火傷の厳しさの代理として機能することに自信を持つことができる。厳しさは細菌および真菌の豊富さに負の影響を与えるが、バイオマスには影響を与えないことが明らかになった。北方林（Whitman et al., 2019）、オーク（Pourreza et al., 2014）、地中海沿岸の森林（Lucas-Borja et al., 2019）における研究と同様に、細菌および真菌の豊富さは土壌燃焼の深刻さとともに減少した。しかし，メタ分析（Dooley & Treseder, 2012）に反して，細菌および真菌のバイオマスは土壌燃焼の厳しさに直接影響されず，おそらく，チャパラルにおける自然の高烈火体制に対する微生物の適応によるものであった。しかし、我々は微生物の豊かさに対する火災からの時間と厳しさの相互作用を観察したので、空間が時間に置き換えられ、平均して火災から2年後に発生するクロノシークエンス研究（Presslerら、2019）から得られた、以前に観察された厳しさ効果は、時間と厳しさの相互作用を表す可能性があり、土壌燃焼の厳しさの直接的効果ではないことがある。

5 結論（CONCLUSION
高解像度の時間的サンプリングにより、細菌および菌類群集の急速な二次継承と、親水性微生物間の存在量の顕著なトレードオフを経時的に検出することができた。温帯林や北方林、地中海沿岸の低木林で火災に反応する親水性細菌と真菌が、カリフォルニアのシャパラルでも優勢であることを発見し、火災後のマイクロバイオームに関する知識を、気候変動によって急速に増加している乾燥地の生息地に一般化できるようになった（Feng & Fu, 2013）。親火性微生物は他のシステムでも記載されているが、火災後のサンプリングが限られているため、その回転率は不明であった（Fox et al.）我々は、火災に適応した形質間のトレードオフが、最初に耐熱性微生物が優勢になり、次に高速コロニー形成者、最後に火災後の資源獲得に資本参加できる競争相手が、火災後の微生物後継者ダイナミクスを駆動すると仮定している。親水性微生物は植物と類似した形質を多く持つため、植物で開発された後継者理論を微生物に適用することが可能であると思われる一方、バクテリアや菌類はその生理機能によって火災に対する反応が異なることを認識している。我々は、火災後の細菌と菌類は火災後に急速な後継者交代を経験すると結論付け、これらのダイナミクスは、気候変動に伴いますます広まる攪乱である山火事後に生態系が回復するかどうか、どのように回復するかを予測する我々の能力を高めるのに役立つと示唆するものであった。

著者による貢献
Sydney I. Glassman は研究の構想と許可を取得し、Loralee Larios、Sydney I. Glassman、Peter M. Homyak は実験デザインを考え、Sydney I. Glassman、Loralee Larios、 Peter M. Homyak、M. Fabiola Pulido-Chavez および James W. J. Randolph は野外調査を実施し、 M. Fabiola Pulido-Chavez と J. Homyak は野外調査を行った。Fabiola Pulido-ChavezとJames W. J. Randolphはすべての分子生物学的研究を行った。M. Fabiola Pulido-Chavezはすべてのバイオインフォマティクス、統計解析、図の作成、最初の原稿を書き、すべての著者は原稿の執筆と編集に協力した。

謝辞
Cleveland National Forest と Trabuco Ranger District の District Ranger Darrel Vance と Emily Fudge, Jeffrey Heys, Lauren Quon, Jacob Rodriguez, Victoria Stempniewicz には、許可や場所の選定について指導と助力をいただいたことに感謝したい。また、Judy A. Chungにはフィールドワークと分子生物学的研究に、Aral C. Greene、Dylan Enright、Sameer S. Saroaにはフィールドワークの手伝いに感謝する。Amelia Nelson、Elizah Stephens、Kaleigh A. Russell、および匿名の査読者の方々には、原稿に対して有益なコメントをいただいた。

利益相反
著者は利益相反を宣言しない。

資金情報
本研究は、カリフォルニア大学リバーサイド校、BLM JFSP Award #012641 -002 および Shipley Skinner Award から MFPC および SIG、USDA-NIFA Award 2022-67014-36675 から SIG および PMH、DOE BER Award DE-SC0023127 から SIG および PMH による支援を受けて実施された。

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