腸内細菌叢の組成は健康な一親等の親族におけるクローン病の将来の発症と関連する

2023年12月28日 09:00

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原著論文｜全レポート：腸内細菌叢｜165巻3号670-681頁｜2023年9月号

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腸内細菌叢の組成は健康な一親等の親族におけるクローン病の将来の発症と関連する

https://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(23)00805-3/fulltext?referrer=https%3A%2F%2Fpubmed.ncbi.nlm.nih.gov%2F

Juan Antonio Raygoza Garay ∗（フアン・アントニオ・レイゴサ・ガレイ
ウィリアムズ・ターピン
スンホ・リー
ウェイ・シュー
CCC GEMプロジェクト研究コンソーシアム
ケネス・クロイトル
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脚注を表示する発行:2023年5月30日DOI:https://doi.org/10.1053/j.gastro.2023.05.032
PlumXメトリクス

背景と目的
クローン病(CD)の原因は不明であるが、現在の仮説では、微生物または環境因子が遺伝的に感受性の高い人の腸の炎症を誘発し、慢性的な腸の炎症を引き起こすと考えられている。CD患者の症例対照研究では、腸内細菌叢組成の変化がカタログ化されている。しかし、これらの研究では、腸内細菌叢組成の変化がCDの発症と関連しているのか、炎症または薬物治療の結果なのかを区別することができない。
研究方法
この前向きコホート研究では、CD発症に先行する腸内細菌叢組成を同定し、この組成がCD発症リスクをどの程度予測するかを明らかにするために、CD患者の健康な第一度近親者（FDR）3483人を募集した。16SリボソームRNAシーケンスに基づく）腸内細菌叢組成の解析に機械学習アプローチを適用し、将来のCD発症に関連する微生物シグネチャーを定義した。独立した検証コホートにおいてモデルの性能を評価した。
結果
検証コホートにおいて、マイクロバイオームリスクスコア（MRS）モデルは、発見コホートのMRSの中央値を閾値として、2.24（95％信頼区間、1.03-4.84；P = 0.04）のハザード比をもたらした。MRSは、発症の5年前までにCDを発症した個体（曲線下面積＞0.65）を捉えることにより、時間的妥当性を示した。MRSに寄与した最も重要な5つの分類群は、Ruminococcus torques、Blautia、Colidextribacter、Oscillospiraceaeの未培養の属レベルのグループ、およびRoseburiaであった。
結論
本研究は、腸内細菌叢の構成が将来のCD発症と関連することを初めて示したものであり、腸内細菌叢がCDの病因に寄与していることを示唆している。
キーワード
マイクロバイオーム
糞便細菌
糞便カルプロテクチン
ビタミンB
前臨床炎症性腸疾患
本稿で使用した略語：
abs（絶対値）、CCC（Crohn's and Colitis Canada）、CD（クローン病）、CI（信頼区間）、FDR（第一度近親者）、GEM（Genetic Environmental Microbial）、HR（ハザード比）、IBD（炎症性腸疾患）、MRS（マイクロバイオームリスクスコア）、rRNA（リボソームRNA）、RSF（ランダム生存林）、SD（標準偏差）、TMAP（N,N,N-トリメチル-L-アラニル-L-プロリンベタイン）。
知っておくべきこと
クローン病（CD）は炎症性腸疾患（IBD）のひとつで、腸の慢性的な再発性の炎症が特徴である。CDの原因は不明であるが、現在の仮説では、遺伝的感受性の高い人では微生物や環境因子が腸の炎症を誘発し、慢性的な腸の炎症と損傷を引き起こすと考えられている1,2。確立したCD患者の症例対照研究では、腸内細菌叢の組成の変化がカタログ化されている3,4,5,6,7。しかし、これらの研究では、腸内細菌叢の組成の変化がCDの発症と関連しているのか、炎症や薬物治療の結果なのかを区別できていない3。
これらの問題に対処するため、クローン病・大腸炎カナダ遺伝環境微生物（GEM）プロジェクトは、CD患者の健康な第一度近親者（FDR）を対象とした前向きコホート研究であり、CDの発症に関連するパラメータを同定するために計画された。これらのパラメータのうち、CD発症に先行する腸内細菌叢の組成をプロファイリングし、この組成がCD発症リスクをどの程度予測するかに関心があった。具体的には、CD患者の健康なFDRの大規模コホート（N = 3483）における腸内細菌叢組成の解析に機械学習アプローチを適用し、CD発症リスクと関連する微生物シグネチャーを定義した。
材料と方法
被験者募集
GEMプロジェクトは、2008年から2017年の間に募集された健康なFDRの前向きコホート研究である（除外基準については補足方法を参照）。募集施設はカナダ、アメリカ、イスラエル、イギリス、アイルランド、ニュージーランドであった（補足表1）。すべての被験者に6ヵ月ごとに電話で連絡をとった（補注1、2）。被験者がCDと診断されたことを明らかにした場合（本試験のデータ凍結日である2020年2月28日時点）、臨床的、内視鏡的、X線写真的、組織学的報告書に基づいて主治医がこれを確認した（補足注3）。すべての被験者またはその保護者は、本研究への参加について書面によるインフォームド・コンセントを行った。この研究はマウントサイナイ病院研究倫理委員会および地域の募集センターにより承認された。
糞便微生物叢のプロファイリング
登録時の便検体は、便器検体採取器で採取され、現地の研究施設に配送される前に凍結され、-80℃で保存された。QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）を用いて便DNA抽出を行い、515F/806Rプライマーペア8を用いて細菌16SリボソームRNA（16S rRNA）のV4超可変領域を増幅し、ペアエンドモード（2×150塩基対）で塩基配列を決定した。サンプルあたり中央値75,904リードをQIIMEアーティファクトにインポートし、dada2プラグイン9を用いてノイズ除去した（補足方法参照）。インプットされた細菌機能は、PICRUSt210 2.4.1パッケージのpicrust2_pipeline.pyスクリプトを使用して生成した。
糞便カルプロテクチンを用いた腸内炎症の評価
便中カルプロテクチン濃度は、BÜHLMANN fCAL ELISA test（Schöonrenbuch、Switzerland）を用いて、製造元のプロトコールに従って測定し、重複値の平均値をカルプロテクチン濃度とした（補足方法参照）。
便メタボロミクスの評価
便メタボロミクスには、マイクロバイオームリスクスコア（MRS）が利用可能なコホートのネステッド症例対照サブセットから健常FDRの登録時に得られたサンプルと、Crohn's and Colitis Canada（CCC）GEMプロジェクト（補足方法参照）のメタボローム測定値を用いた。便のメタボローム測定は、Metabolon社のDiscoveryHD4 Platformを用い、メーカーの指示に従い、16Sプロファイルと同じ便サンプルから行った。
マイクロバイオームリスクスコアの構築
腸内細菌叢は、群集として機能する多くの異なる分類群から構成される生態学的ニッチとして認識されつつある11,12。この文脈において、特定の細菌分類群の存在量の変化は、与えられた環境で他の分類群が増殖する能力に影響を与える可能性がある。マイクロバイオームにおけるこのような複雑性に対処するため、われわれはランダム生存林（RSF）の手法を適用して、ベースラインの腸内細菌叢と将来のCD発症リスクとの関係を評価した13。
この手法を用いて、便の16S rRNAシーケンスによって定義された細菌属の相対的存在量の影響を非線形、ノンパラメトリックな方法で組み合わせたリスクスコアを開発し、個人のCD発症リスクを定量化した（補足方法参照）。RSFモデルは、高次元のマイクロバイオーム組成データを組み合わせ、CD発症リスクを定量化するスコアを生成することができる。13,14 RSFモデルは、リサンプリング技術を用いて、多数の非イベントに比べて比較的少数のイベントを効率的に扱うことができる。最後に、RSFモデルは、リスクスコアに寄与する変数の高次相互作用を検出し、組み入れる。13,14 細菌分類群の相対存在量に加えて、RSFモデルは、年齢、性別、シャノンアルファ多様性、およびシーケンシングリード数を共変量に含めた（補足方法参照）。
リスクスコアモデルを開発し、その予測能力を保証するために、まず、元のコホートの3分の2を発見コホートに、3分の1を独立した検証コホートに無作為に割り付けた。より正確には、検証コホートの被験者がモデル構築に使用されることはなかった。発見コホートはRSF法を用いてリスクスコアを作成するために用いられた（補足方法参照）。作成されたMRSは、CD発症のリスクに応じて個人をランク付けする。次に、独立した検証コホートにMRSを適用し、その性能を評価した。ここでは、Coxの比例ハザードモデルを用いて、連続変数としてのMRSの予測能力を評価した。
結果
微生物組成リスクスコアは将来のクローン病発症リスクと関連する
ベースラインのマイクロバイオームデータを有する3483人の健康なFDRを解析した（補足図1-5および補足表1-3）。被験者は中央値で5.4年間モニターされた。募集時の年齢中央値は17.0歳（範囲、6～35歳）で、48％が18歳未満であった。このコホートでは73人がCDを発症しており（pre-CD）（補足表2）、登録からCD診断までの期間の中央値は3.1年、新規CD発症年齢の中央値は17.7年であった（表1）。
表1発見コホートと検証コホートのデモグラフィック
変数発見セット

(n = 2321) 検証セット

(n = 1162） P値
CD前a,b,c 43 30 .16
女性 1252 (53.9) 587 (50.5) 0.06
リクルート時の年齢
中央値 17.0 17.0 .88
平均値 18.1 18.1
SD 7.8 7.6
国名
カナダ 1395 (60.1) 705 (60.7) .76
米国 289 (12.5) 148 (12.7) .82
イスラエル 354 (15.3) 175 (15.1) .92
イギリス 245 (10.6) 118 (10.2) .76
ニュージーランド 30 (1.3) 10 (0.9) .31
アイルランド 8 (0.3) 6 (0.5) .57
研究参加期間、年
中央値 5.5 5.3 .42
平均値 3.1 5.8
SD 2.1 3.0
注特に断りのない限り、データは数（％）で示した。すべてのパーセンテージは、それぞれのコホートにおける総個体数の関数である。国は、その人が採用された国を示す。
a P値はFisherの正確検定を用いて計算した。
b 研究参加期間は、健常者では検便採取日と最終追跡調査日の差、後にCDを発症した人では検便採取日と診断日の差と定義した。
c 採用時に健康で、後にCDを発症した個体。
d P値は、両側Kruskal-Wallis順位検定を用いて算出した。
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MRSを開発し、その予測能力を保証するために、まず、元のコホートの3分の2を発見コホート（n＝2321）に、3分の1を独立した検証コホート（n＝1162）に無作為に割り付けた（表1、補足方法参照）。発見コホートでRSFを用いて開発されたMRSは、その後検証コホートに適用された。その結果、発見コホートに基づくMRSの標準偏差（SD）あたりのハザード比（HR）は1.58（95％信頼区間[CI]、1.14-2.18）、一致指数（C指数）は0.67、P = 0.0057であった（補足表4）。
発見コホートのMRSの中央値に相当する値を閾値として用いると（補足方法参照）、検証コホートでは2.24（95％CI、1.03-4.84；P＝0.04）のHRが得られた（図1および補足図6）。このモデルはまた、生存データに適用されたNeural NetworksやeXtreme Gradient Boostingを含む他の機械学習手法とも比較され（補足表5）、RSFモデルはすべてのモデルの中で最も高い一致指数（C index = 0.67）を示した。
図サムネイルgr1
図1Kaplan-Meierプロットは、検証コホートにおけるリスクスコアのパフォーマンスを示す。説明したように、検証コホート個体（n = 1162）を発見コホートに基づくMRSの中央値で定義された2群のいずれかに割り付け、これら2群間の相対生存率を比較した。用語の定義については、補足的方法を参照のこと。
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微生物組成リスクスコアは発症5年前までのクローン病を予測する
MRSは、後にCDを発症する健康な無症候性アットリスク者で異なる時期に測定されたので、MRSとCD発症までの時間との関係を評価した。そのために、ベースライン便サンプル採取後1.5年、3年、5年以内にMRSを測定した場合のCD発症リスクを予測する検証コホートのMRSの性能を、健康なままで同じ期間モニターを受けた人と比較して検討した。その結果、MRS測定後1.5年以内にCDを発症した被験者に対するモデルの予測精度は、曲線下面積が0.70であった（補足図7；補足方法参照）。MRS測定後3年以内と5年以内にCDを発症した被験者については、曲線下面積はそれぞれ0.71と0.67であった（補足図7）。
微生物組成リスクスコアに寄与する微生物分類群
将来のCD発症を予測するためのMRSの一部として、（腸内微生物群集における）個々の分類群の具体的な寄与を評価するために、発見コホートについてモデルベースと並べ替えベースの両方のアプローチを用いて、RSFモデルで定義された各分類群の重要度を算出した（補足方法および補足表6～9参照）。その結果、最も重要な5つの分類群には、Ruminococcus torques属、Blautia属、Colidextribacter属、Oscillospiraceaeの未培養の属レベルのグループ、およびRoseburia属が含まれることがわかった（図2A）。
図サムネイルgr2
図2CD発症リスクスコアと関連する分類群の説明。(A) 発見コホートを用いたRSFによって定義された分類群の相対的重要度。重要度の値は、発見コホートからのブートストラップサンプルを用いて構築されたすべての回帰木の根に対する平均位置によって計算された。個々の棒の色は、その分類群が属する科に対応している（補足方法と補足表6を参照）。X軸は与えられた分類群の重要度を表す。Y軸はMRSに貢献した分類群を表す。図のファミリーレベルの分類群は図の右側に示すように色分けされている。(B）RFSモデルによる最重要6分類群（x軸）の対数10相対存在量分布と、リスクスコアが増加する各十分位との関連。(1y軸、対数変換は可視化のため）。この情報は、生成されたリスクスコアモデルに対する各分類群の寄与の方向を示している。log(相対存在量中央値)と十分位群間のスピアマン相関： Ruminococcus torquesグループ（ρ = 0.96; P < 2e-16）、Blautia（ρ = 0.98; P < 2e-16）、Colidextriacter（ρ = -0.86; P = 0.003）、UCG.002（ρ = -0.90; P = 9e-4）、Roseburia（ρ = 0.91; P = 5e-4）、Eubacterium ventriosumグループ（ρ = -0.80; P = 0.008）。各分類群の相対的な存在量と、結果として得られたリスクスコアとの間には、非線形的な関係があることがわかる（補足表10）。(C）上位20の重要な分類群のRSFモデルによる相互作用のネットワーク表現。相互作用は補遺方法に概説されているように定義されている。ノードのサイズはノードの次数（すなわち、各ノードのエッジの数）に比例する。任意の2つの分類群間にエッジが存在する場合は、相互作用スコアが0以上であることを示す。エッジの色と線の太さは、与えられた分類群のペアに対する相互作用スコアの値を表す。(すべての分類群ペアの相互作用スコアの値の範囲は0から0.067である。
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RSFモデルによると、最も重要な分類群はRトルクス属であった。この分類群はMRSの増加と正の相関があった（発見：スピアマンのρ = 0.96; P < 2e-16; 検証： Spearman's ρ = 0.95; P <2e-16）（補足方法-増加するMRS十分位数と分類群の相対的存在量との関連；および図2Bを参照）。2番目に重要な分類群はBlautia属であった。この分類群もMRSと正の相関があった（発見：スピアマンのρ = 0.98; P < 2e-16; 検証： Spearman's ρ = 0.98; P < 2e-16）。もう1つの重要な分類群はRoseburia属で、これはリスクスコアと負の相関があった（発見：スピアマンのρ = 0.91; P = 5e-4; 検証： Spearman's ρ = -0.61; P = 0.066）（図2B）。最後に、Faecalibacterium属（8番目に重要な分類群）の存在量の増加は、MRSの増加と逆相関することがわかった（発見：発見：スピアマンのρ＝-1、P＜2e-16；検証：スピアマンのρ＝-1、P＜2e-16： Spearman's ρ = -0.79, P = 0.009）（補足方法、補足表10、補足図8参照）。
最後に、健康であった個体とCDを発症した個体とを比較した上位10分類群の相対存在量分布は、RSFによって規定されたのと同様のパターンをたどった（図3、補足表10、補足図9）。上位20分類群では、重要度の低い特徴と比較して、RSFモデルによってMRSを規定する相互作用の数が多いことがわかった（図2C；補足図10、補足表11）。
図サムネイルgr3
図3発見コホートおよび検証コホートの個体における、RSFモデルによる重要度上位10分類群の相対存在量分布。紺色の点と紺色の箱のプロットは、対応するコホート内のすべての健常個体における特定の分類群の相対存在量を表す。赤い点と赤い枠のプロットは、対応するコホートにおいて後にCDを発症したすべての個体における特定の分類群についての相対存在量を表す。Y軸は、各個体および分類群の相対存在量をlog10変換したものである（可視化のため）。RSFにおける最も重要な分類群の相対存在量の分布は、解析時の健康状態別に分けたコホート全体でも（例外はあるが）同様のパターンを示している。人口統計学的情報は表1に示されている。この図は、発見セットと検証セットにおける差異の方向性と、個々の分類群とMRSとの関連性の方向性の整合性を単に示したものである。個々に評価した場合、Cox比例法で評価すると、分類群はCD発症と統計的に有意な関連はない（q値＞0.05）。この結果は、微生物組成と将来のCD発症との関連性の非線形性と多次元性を潜在的に示唆している。
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クローン病発症を予測するための微生物リスクスコアとマイクロバイオームの生態学的分割との比較
次に、コホート全体のMRSが、以前に腸型15として記述されたマイクロバイオームの特定の生態学的パーティショニングと関連しているかどうかを評価した（補足方法参照）。その結果、MRSはファーミキューテス属の腸型と有意かつ正の相関があることがわかった（一般化推定方程式線形モデルを使用、P = 2.0 × 10-16）（補足方法および補足図11参照）。RSFモデルで重要な分類群の多くがファーミキューテス門に属しているので、この発見は驚くべきことではない（図3）。しかし、Firmicutesの生態学的分類自体や他の腸型群は、CD発症前の個体では濃縮されていなかった（χ2 P = 0.1）ことから、CD発症リスクのある個体を同定するためには、このような分類では限界があることが示された。
マイクロバイオームリスクスコアと推定マイクロバイオーム機能
リスクスコアは腸内細菌叢の構成を用いて構築され、CDの発症に関与する可能性のある分類群についての初期的な理解を提供するものであるが、CDの発症に関連する可能性のある特定の機能的プロセスについての情報は不足している。どの微生物機能がCD発症の微生物シグネチャーに関連しているかを理解するため、PICRUSt2を用いてマイクロバイオームデータの微生物機能インピュテーションを行った（補足方法参照）。
インピュテーション後、我々のコホート全体（N = 3483）について、予測されたMRSに対するパスウェイレベルでの相関解析を行った（図4および補足表12）。この解析により、相関係数abs(ρ) > 0.25、偽発見率調整P < 0.05の微生物機能409個中46個が見つかった。最も相関の高い上位10経路はすべてMRSと負の相関があり、還元的アセチルコエンザイムA経路I、マイコレート生合成、パルミトレイン酸生合成I、オレイン酸生合成IV、ステアリン酸生合成IVが含まれた、ステアリン酸生合成II、脂肪酸生合成開始スーパー経路、(5z)-ドデセン酸生合成I、パルミチン酸生合成、8-アミノ-7-オキソノナン酸生合成I、ビオチン生合成I。
図サムネイルgr4
図4コホート全体におけるインプットされた微生物機能の解析結果。微生物リスクスコアに対するPICRUSt2を用いた推定微生物機能のスピアマン相関値（ρ）対P値のボルケーノプロット。赤い点は、相関が統計的に有意（q-value < 0.05）でabs(ρ) > 0.25である機能を表す。青い点は、相関係数が統計的に有意（q-value < 0.05）で、abs(ρ) < 0.25である微生物機能。黒い点は、相関係数が統計的に有意ではなく（q-value > 0.05）、abs(ρ) < 0.25である機能を表す。有意なq値とabs(ρ) > 0.25の両方を持つ上位10関数にラベルを付けた。(X軸はabs(ρ)、Y軸はlog10(q-value)を表す。）
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マイクロバイオームリスクスコアの便メタボローム評価
以前の研究では、PICRUSt2のインプットされたメタゲノミックデータと対応するショットガンシークエンスデータの間に高い一致性が示されたが10、PICRUSt2はインプットバイアスに苦しんでいる可能性がある。さらに、PICRUSt2とショットガンシークエンスデータは、コミュニティ内に存在するゲノムポテンシャルに関する情報を提供するだけであり、コミュニティ内のプロテオミクスやメタボロミクスプロファイルと必ずしも相関しない可能性がある16。このため、またCD発症前の腸内細菌叢シグネチャーがどのように機能的役割を果たすかをさらに理解するために、コホートのサブセット（n = 122）から入手可能なベースライン便メタボロミクスデータセットを調査した。後にCDを発症した人（n = 56）は、健康なままの対照FDR（n = 66）と年齢、性別、追跡期間、地理的位置で1:1に密接にマッチした（補足表13）。この探索的解析により、MRSとの相関係数abs(ρ) > 0.25で公称有意性（P < .05）を持つ代謝物が1029便中24代謝物同定された（補足表14および15、補足図12～14）。相関の高い上位10代謝物はすべてMRSと負の相関を示し、シトシン、N,N,N-トリメチル-L-アラニル-L-プロリンベタイン（TMAP）、シチジン、2,3-ジヒドロキシイソバレレート、ゲンチ酸、ニコチン酸、グアニン、キシロース、8-ヒドロキシグアニン、β-アラニンが含まれる。
マイクロバイオームリスクスコアは便中カルプロテクチンとは無関係にクローン病と関連する
不顕性腸内炎症は腸内微生物の組成に影響を及ぼす可能性があるため、腸内炎症のマーカーとMRSの成績との関係の可能性を評価した。16Sプロファイルを測定したのと同じ便検体から測定した糞便カルプロテクチン値を、潜在性腸内炎症の代用として用いた。マイクロバイオーム組成と便中カルプロテクチンが測定された個体からなる検証コホートのサブセット（n＝1109）において、MRSを用いてCox比例ハザードモデルを実施した。便中カルプロテクチンのデータが利用可能な検証セットにおいて、連続MRSのみを用いたCoxの比例モデルでは、1SDあたり1.51のHRが得られた（95％CI、1.10-2.08/SD；P = 0.011）。同じデータセットを用いて便中カルプロテクチン指標をモデルに含めると、連続MRSのHRは1SDあたり1.42（95％CI、1SDあたり1.02-1.98；P = 0.041）となった（補足表16および補足図15）。
注目すべきは、ベースラインの便中カルプロテクチンが120μg/g以上上昇した非罹患FDRの93％（555人中515人）が、平均追跡期間6.0年、最大追跡期間11.4年まで無症状のままであったことである（補足図16）。感度分析として、検証コホートにおいてベースラインの糞便カルプロテクチンが低い（120μg/g未満）FDRのサブグループにMRSを適用した。このサブグループのMRSのHR（1.29/SD；95％CI、0.72-2.31/SD）は、統計的に有意ではなかったが、検証コホート全体のHR（1.51/SD；95％CI、1.10-2.08/SD）と比較して、一貫した効果の方向を示した（補足図17）。最後に、50μg/gまたは100μg/gのカットオフ値に基づいて便中カルプロテクチンを二分して調整する感度分析を追加したところ、一貫した結果が得られた（補足図18および19）。
考察
これまで、CDにおけるマイクロバイオームの関与を示唆する研究のほとんどは、確立したCD患者を対象とした横断的症例対照研究であった。しかし、CDの炎症活動や関連治療が、微生物組成に交絡効果をもたらす可能性がある。前向き前臨床コホート研究を用いれば、このような交絡因子を最小限に抑えることができ、CD発症に対するマイクロバイオームの寄与を明らかにする上でより強力なアプローチとなる20,21。しかし、CDの発症率は稀であるため、前向き研究では意味のある数の発症例を観察するために多大な時間とリソースを必要とする。このような問題に対処するため、CD発症者の健康なFDRを対象とした前向きコホート研究であるCCC GEMプロジェクトが、CD発症に関連するパラメータを同定するために計画された。
GEMコホートから収集したデータを用いて、我々はオリジナルコホートのサブセットから、後にCDを発症する個人を分類できるMRSモデルを開発した。われわれは、後にCDを発症する健常者と、健常のままCDを発症する健常者とのベースラインの腸内細菌叢組成の違いから、CD発症の微生物決定因子に関する知見が得られるという仮説を立てた。
現在までのところ、マイクロバイオーム研究のほとんどは、個々の分類群の関連を明らかにすることに焦点が当てられている。マイクロバイオームにおけるこの複雑性に対処するため、ベースラインの腸内細菌叢コミュニティと将来のCD発症リスクとの関係を評価するためにRSF手法を適用した13。これらの微生物の特徴は、単変量解析や従来の統計モデルでは容易に解釈できない、非線形でノンパラメトリックな関数を表している可能性がある。個々に評価した場合、いずれの分類群も発見コホートおよび全コホートにおいて統計的有意性（多重検定補正後；Coxの比例モデルによるq値＞0.05）に達しなかったことは注目すべきことであり、微生物組成の非線形かつ多次元的な性質がCDのリスクに寄与していることを示唆している。
MRSに最も寄与した分類群のうち、R torquesとBlautiaの存在量の増加がMRSと正の相関を示したことから、これらの分類群がCD発症に重要な寄与をしている可能性が示唆された。実際、Rトルクスはムチン分解菌であり、CD発症患者において増加することが示されている25。Rトルクスは他のムチン使用菌の増加を誘導し、おそらく腸上皮におけるこの保護バリアを損なう一助となるようであり26、一方、ブラウチアは健常対照群と比較してIBDや原発性硬化性胆管炎で増加することが観察されている別のムチン分解菌である27。対照的に、Roseburia属の存在量はMRSと負の相関を示し、この属がCD発症に対する保護機能を持つ可能性が示唆された。Roseburia属の種は、新たにCD6と診断され、IBDが確立した患者を対象とした研究で減少した分類群の1つであることが確認されている28。マウス大腸炎モデルにおいて、この分類群は制御性T細胞の割合を増加させ、インターロイキン17を減少させることが示された28。
最後に、我々は、Faecalibacterium属（8番目に重要な分類群）の存在量の増加が、MRSの増加と逆相関することを見出した。これは、CD患者では健常対照群と比較してF prausnitziiが枯渇していることを報告した先行研究と一致している29、 30, 31 炎症の発症に対するF prausnitziiの保護効果は、F prausnitziiの培養上清に見出される抗炎症因子に起因するという仮説が立てられている。30,32 このように、本研究は、Faecalibacteriumの減少がCD発症の何年も前から観察されるCDの前臨床徴候である可能性を示した初めての研究である。前臨床段階でFaecalibacteriumの存在量を回復させることで、CDの発症を遅らせたり予防したりできるかどうかは、まだわからない。
また、この研究はCDを対象としているが、後に潰瘍性大腸炎を発症した人もいる33。今回の結果から、MRSに最も多く寄与した10分類群のいずれもが潰瘍性大腸炎の発症とは関連していないことが示された。現時点では、CDあるいは潰瘍性大腸炎の発症に関与する生物に違いがあるのではないかと推測したくなる。
我々はさらに、PICRUSt2によるマイクロバイオームの推定機能とMRSとの関連を評価した。MRSと負の相関を示した微生物経路のひとつは、ビオチン生合成経路であった（ρ = -0.32、偽発見率調整後P = 3.1×10-84）。ビオチン（ビタミンB7またはビタミンH）は、ヒトが食事から摂取する微量栄養素であり、腸内細菌によっても産生される。IBD患者では、ビタミンB7の欠乏を含む微量栄養素の欠乏が報告されている34。また、ビオチンの補給がマウスモデルにおける大腸炎様の表現型を緩和するという実験的証拠もある34。
2番目に同定された興味深い機能は、β-(1,4)-マンナン分解（ρ = -0.31、偽発見率調整P = 2.3×10-78）であり、これもMRSと負の相関を示した。β-(1,4)-マンナンは、ヘミセルロースや増粘添加物の一部として、ヒトの食事に広く含まれている。β-(1,4)-マンナンは、ヒトの酵素による分解を受けにくく、ほぼ完全に腸内細菌叢によって処理される。35 β-(1,4)-マンナンは、腸上皮の保護粘液層を破壊する可能性のあるムチン分解物質の作用に対抗するため、人気のあるプレバイオティクスとして登場した。このことは、食生活の変化によりβ-(1,4)-マンナンの摂取量が増加したにもかかわらず、その減少が強い影響を及ぼす可能性のある必須機能を指摘している。
また、コホートの一部で、MRSに関連する便のメタボロミクスを検出することができた。特に、シトシンは健常対照群と比較してCDで減少していることが以前に示されており36、その誘導体であるシチジンとともに、MRSと最も強い負の相関を示した（ρ＝-0.39、P＝1.2×10-5、ρ＝-0.35、P＝8.2×10-5）。さらに、MRSのpre-CDシグネチャーは、抗炎症活性や抗酸化活性を持つ代謝産物の減少と関連していた。特に、ゲンチサートとニコチネートはMRSと負の相関があった（ρ = -0.26 to -0.31、P = 3.2 × 10-4-2.3 × 10-3）。以前、ナイアシンやビタミンB3として知られるニコチン酸塩は炎症を抑制し、抗酸化作用を示すことが報告され、一方、ゲンチジン酸塩は抗炎症作用、抗酸化作用37、抗菌作用38,39など幅広い作用を示すことが報告されている。両代謝物は、健常対照群と比較してIBD患者で減少していた40, 41, 42, 43。
これらの知見は、腸内細菌由来の抗炎症代謝産物の減少がCDの発症に先行する可能性を示唆している。興味深いことに、これらの保護代謝産物は、FaecalibateriumとLachnospira（CD発症前のマイクロバイオームシグネチャーの上位を占める）の存在量とも正の相関があり、これらの代謝産物の存在量と微生物組成の間に生物学的相互作用がある可能性が示された（補足図10）。(補足図10）。
一方、メタボロミクスデータでは、MRSで(12または13)-メチルミリスチン酸(A15:0またはI15:0)と(14または15)-メチルパルミチン酸A17:0またはI17:0)の存在量が高いことが示された(ρ = 0.27, P = 3.0 × 10-3 and ρ = 0.26, P = 4.3 × 10-3)。これらの代謝産物はスフィンゴ脂質に属し、細菌が宿主とコミュニケーションをとるために合成するシグナル伝達代謝産物として機能する。これらのリスク代謝物はRトルク（MRSで最も重要な分類群）と正の相関があり、代謝物量と疾患リスクの両方に微生物が影響していることが示唆された（補足図14）。
最後に、アンターゲットメタボロミクス解析ではTMAPも同定され、これはMRSと負の相関を示した（ρ = -0.35、P = 7.9×10-5）。TMAPの構造は最近同定されたが、その生物学的活性についてはほとんど知られていない49。注目すべき点として、79の代謝物はCD発症との関連がわずかであった（P < 0.05）。これらの結果を検証するためには、より大きなサンプルを用いた研究が必要であろう。
注目すべきことに、健康なFDRの一部は、募集時にすでに潜在性腸炎を有している可能性がある。しかし、便中カルプロテクチン指標をモデルに含めると、MRSのHRは1SDあたり1.42（95％CI、1SDあたり1.02-1.98；P = 0.041）となった（補足表16および補足図15）。HRのわずかな低下は、便中カルプロテクチンの上昇によって反映されるような不顕性腸内炎症の有無によってMRSが大きく交絡されないことを示唆している。注目すべきは、便中カルプロテクチンの連続値で調整すると、CDリスクに対する便中カルプロテクチンの非線形効果の証拠が得られたことである（補足図20）。連続便中カルプロテクチンの非線形成分と線形成分の両方を調整することは、この非線形効果を説明するために適切な検出力を有する今後の研究でさらに検討されるべきである。
本研究のもう一つの潜在的な限界は、本研究の結果が健康なFDR集団の代表的なものであり、一般集団には当てはまらない可能性があることである。さらに、MRSは将来のCD発症と統計的に関連していたが、MRSの予測性能は比較的控えめなままであり、マイクロバイオームと遺伝的リスクや食事パターンなどの他の因子との組み合わせにより、健常なFDRにおけるCD発症のリスク層別化が改善される可能性があることを示している。
最後に、われわれは単一の時点にしかアクセスできないため、疾患につながる可能性のある個体の動的な変化が捉えられない可能性がある。多大なリソースを必要とするにもかかわらず、発症に至る一連の出来事を捉えるために、縦断的サンプルを含めることを推奨する。本研究で示された関連性がCD発症の原因なのか結果なのかを評価するためには、実験的研究が必要である。とはいえ、本研究は、微生物組成とCDのような慢性免疫介在性疾患の発症リスクとの関係を検討するための、将来の前向きコホート研究の枠組みを示したと考えられる。
結論
本研究は、腸内細菌叢の組成が将来のCD発症と関連することを初めて示したものであり、腸内細菌叢がCDの病因に寄与する可能性を示唆している。我々はさらに、マイクロバイオーム組成が我々の予測モデルに従って個人のCD発症リスクを規定できることを示した。発症におけるマイクロバイオームの関与は、独立したコホートで検証され、便中カルプロテクチンによって測定される炎症で調整しても関連性が維持された。リスク層別化を改善するためにMRSを他のバイオマーカーと統合することは、今後の研究で検討される必要がある。CDのリスクに関連するバイオマーカーと、これらのバイオマーカーが病態に関連する生物学を理解することは、高リスク集団における疾患予防のための新規戦略や、確立した疾患を有する患者における治療の改善に必要である。
謝辞
Kevin Ow、Heather MacAulayをはじめとするCCC GEM Global Project Officeのメンバーの貢献に感謝する。
CCC GEMプロジェクト研究コンソーシアムには、Maria Abreu、1 Paul Beck、2 Charles Bernstein、3 Kenneth Croitoru、4,5 Levinus A. Dieleman、6 Brian Feagan、7 Anne Griffiths、8 David Guttman、9 Kevan Jacobson、10 Gilaad Kaplan、2 Denis O. Krause、11 † Karen O. Krause,11 † Karen Madsen,12 John Marshall,13 Paul Moayyedi,13 Mark Ropeleski,14 Ernest Seidman,15 † Mark Silverberg,4 Scott Snapper,16 Andy Stadnyk,17 Hillary Steinhart,4 Michael Surette,18 Dan Turner、 19 Thomas Walters,20 Bruce Vallance,21 Guy Aumais,22 Alain Bitton,15 Maria Cino,4 Jeff Critch,23 Lee Denson,24 Colette Deslandres,25 Wael El-Matary,26 Hans Herfarth,27 Peter Higgins,28 Hien Huynh,29 Jeffrey S. Hyams、30 David Mack、31 Jerry McGrath、32 Anthony Otley、33 Remo Panaccione34；1マイアミ大学ミラー医学部消化器内科（フロリダ州マイアミ）、2カルガリー大学医学部（カナダ、アルバータ州カルガリー）； 3カナダ、マニトバ州ウィニペグ、マニトバ大学、レディ健康科学部、マックス・レディ医科大学、炎症性腸疾患臨床・研究センターおよび内科、4カナダ、オンタリオ州トロント、トロント大学、テマティ医学部、消化器・肝臓学部門、5カナダ、オンタリオ州トロント、マウントサイナイ病院、消化器疾患ゼイン・コーエン・センター； 6カナダ、アルバータ州エドモントン、アルバータ大学医学部消化器内科、7カナダ、オンタリオ州ロンドン、ウェスタンオンタリオ大学疫学・生物統計学科、8カナダ、オンタリオ州トロント、シックチルドレン病院消化器内科； 9トロント大学ゲノム進化・機能解析センター（カナダ、オンタリオ州トロント）、10ブリティッシュ・コロンビア小児病院研究所（カナダ、ブリティッシュ・コロンビア州バンクーバー）、11マニトバ大学医学微生物学・感染症学科（カナダ、マニトバ州ウィニペグ）； 12カナダ、アルバータ州エドモントン、アルバータ大学医学部医学科、消化器病学、13カナダ、オンタリオ州ハミルトン、マクマスター大学医学部、ファーンコム・ファミリー消化器健康研究所、14カナダ、オンタリオ州キングストン、クイーンズ大学医学部消化器病研究ユニット； 15カナダ、ケベック州モントリオール、マギル大学ヘルスセンター、消化器・肝臓学部門、16マサチューセッツ州ボストン、ボストン小児病院・ハーバード大学医学部、消化器・肝臓・栄養学部門、17カナダ、ハリファックス、ダルハウジー大学、微生物学・免疫学部門； 18カナダ・オンタリオ州ハミルトン、マクマスター大学生化学・生物医学部、19イスラエル・エルサレム、エルサレム・ヘブライ大学シャーレ・ゼデク医療センター、ジュリエット・ケイダン小児消化器・栄養学研究所、20カナダ・オンタリオ州トロント、ホスピタル・フォー・シック・チルドレン消化器・肝臓・栄養学部門； 21BC小児病院研究所、ブリティッシュコロンビア大学、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ；22プリンセス・マーガレットがんセンター生物統計部、ユニバーシティ・ヘルス・ネットワーク、トロント、オンタリオ州、カナダ；23Janeway小児保健リハビリテーションセンターおよび小児科、メモリアル大学、St. John's, Newfoundland, Canada; 24Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio; 25Centre Hospitalier Universitaire Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada; 26Pediatric Gastroenterology, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, Manitoba, Winnipeg, Canada; 27Division of Gastroenterology and Hepatology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina； 28ミシガン大学消化器・肝臓学部門（ミシガン州アナーバー）；29アルバータ大学小児科（カナダ・アルバータ州エドモントン）；30コネチカット小児医療センター消化器・肝臓・栄養部門（コネチカット州ハートフォード）； 31カナダ・オンタリオ州オタワ、イースタンオンタリオ小児病院およびオタワ大学、消化器・肝臓・栄養部門；32ニューファンドランド州セントジョンズ、イースタンヘルス、州医療遺伝学プログラム。John's, Newfoundland, Canada; 33Division of Gastroenterology, Izaak Walton Killam Hospital, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada; 34Inflammatory Bowel Disease Unit, University of Calgary, Calgary, Alberta, Canada。
CCC GEMプロジェクトのリクルートサイト責任者は、Maria Abreu、Guy Aumais、Robert Baldassano、Charles Bernstein、Maria Cino、Lee Denson、Colette Deslandres、Wael El-Matary、Anne M. グリフィス、シャーロット・ヘディン、ハンス・ハーファース、ピーター・ヒギンズ、シェイマス・ハッセー、ヒエン・フイン、ケヴァン・ヤコブソン、デイヴィッド・ケルジョ、デイヴィッド・ケヴァンズ、チャーリー・リーズ、デイヴィッド・マック、ジョン・マーシャル、ジェリー・マクグラス Sanjay Murthy, Anthony Otley, Remo Panaccione, Nimisha Parekh, Sophie Plamondon, Graham Radford-Smith, Mark Ropeleski, Joel Rosh, David Rubin, Michael Schultz, Ernest Seidman, †.
故人
Corey Siegel、Scott Snapper、Hillary Steinhart、Dan Turner。
CRediTの執筆協力
Juan Antonio Raygoza Garay, PhD（概念化：リード；形式分析：リード; 方法論：リード；視覚化：執筆-原案：執筆-原案：リード、執筆-校閲・編集：リード：リード）。
Williams Turpin, PhD（概念化：主導；形式分析：同等；調査：同等、方法論：同等：同等、視覚化：サポート; 執筆 - 原案：同等；執筆-校閲・編集：均等)。
Sun-Ho Lee, MD, PhD（概念化：同等、形式的分析：均等：同等；方法論：リード；検証：同等、視覚化：同等；執筆-原案：同等；執筆-校閲・編集：同等）。
Michelle I. Smith, PhD (プロジェクト管理: 助成; リソース: 均等)。
Ashleigh Goethel, PhD (プロジェクト管理: 助成; 執筆 - 原案: 助成)。
Anne M. Griffiths, MD（概念化：リード；方法論：同等：執筆-校閲・編集：執筆-校閲・編集：支持）。
Paul Moayyedi, MB, PhD（概念化：リード；調査：同等：同等；執筆-校閲・編集：執筆-校閲・編集：リード）。
オスバルド・エスピン・ガルシア博士（形式分析：支持；方法論：執筆 - 査読と編集：同等）。
Maria Abreu, MD（リソース：同等、執筆-レビューおよび編集：支持）。
Guy L. Aumais, MD（概念化：支持；資源：支持）。
Charles N. Bernstein, MD (構想: 助成; 資料: 助成)。
Irit A. Biron, MD（リソース：支持）。
Maria Cino, MD（リソース：支援）。
Colette Deslandres, MD（リソース：支持）。
Iris Dotan, MD（リソース：支援）。
Wael El-Matary、MD（概念化：支持、資源：支持）。
Brian Feagan, MD（概念化：同等）。
David S. Guttman, PhD（概念化：同等、方法論：支持）。
Hien Huynh医学博士（概念化：同等）。
Levinus A. Dieleman医学博士（概念化：同等）。
Jeffrey S. Hyams医学博士（概念化：同等）。
Kevan Jacobson医学博士（概念化：同等、リソース：同等）。
David R. Mack医学博士（概念化：同等：同等：執筆-校閲・編集：執筆-校閲および編集：支持）。
John K. Marshall, MD（構想：同等：同等：同等、執筆-レビューと編集：執筆-校閲・編集：支援）。
Anthony Otley, MD（概念化：同等：同等、執筆-レビューと編集：執筆-校閲・編集：支援）。
Remo Panaccione, MD（概念化：同等：同等、執筆-校閲・編集：レモ・パナッチョーネ医学博士（概念：同等、資源：同等、執筆-校閲・編集：支持）。
Mark Ropeleski, MD（構想：同等、資源：同等）。
Mark S. Silverberg, MD, PhD（構想：同等）。
A. A. Hillary Steinhart, MD（概念化：同等、リソース：同等）。
Dan Turner医学博士（概念化：同等：同等：執筆-校閲・編集：執筆-校閲・編集：協力）。
Baruch Yerushalmi, MD (リソース：均等)。
Andrew D. Paterson医学博士（概念化：方法論：主導；監督：執筆-原案：執筆-原案：支持）。
Wei Xu, PhD（概念化：構想：リード、方法論：リード：リード、監修：同等：執筆-校閲・編集：査読および編集：支持）。
Ken Croitoru, MDCM（資金獲得：プロジェクト管理：リード；資源：リード；監督：執筆-原案：執筆-原案：リード；執筆-校閲・編集：リード)。
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補足表15
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補足表16
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スコープス (51)
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グーグル奨学生
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共生微生物由来のスフィンゴ糖脂質が、宿主腸管ナチュラルキラーT細胞のホメオスタシスを制御する。
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スコパス (432)
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概要
全文
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グーグル・スカラー
ジョンソン E.L.
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ウォーターズ J.L.
ら
腸内細菌が産生するスフィンゴ糖脂質は、宿主の代謝経路に入り込み、セラミドレベルに影響を与える。
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スコープス (133)
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クロス
グーグル奨学生
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モノメチル分岐鎖脂肪酸は線虫の発生に必須の役割を果たす。
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スコパス (157)
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グーグル奨学生
フランゾーザ E.A.
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炎症性腸疾患における腸内細菌叢の構造と代謝活性（Published correction appears in Nat Microbiol 2019;4:898）.
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スコープス (859)
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グーグル奨学生
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炎症性腸疾患におけるCD4+ T細胞が産生するIL-2およびIL-21レベルの上昇。
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グーグル奨学生
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質量分析データの解釈による代謝物x17299の構造解明。
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スコープ (18)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
オンライン公開 2023年5月30日
受理済み受理：2023年5月8日
受理：2023年3月16日受理：2023年3月16日
脚注
利益相反著者らは利益相反を公表していない。

資金提供この研究は、Crohn's and Colitis Canada Grant #CCCC -GEMIII、Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Grant #CMF108031 、Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trustからの助成金により行われた。ウィリアムズ・ターピンは、CIHRフェローシップ／カナダ消化器病学会（CAG）／フェリング・ファーマシューティカルズ・インクから博士研究員研究賞を授与されたことがある。スン・ホー・リーは、Imagine/CIHR/CAGフェローシップ賞の元受賞者。Williams Turpin、Sun-Ho Lee、Juan Antonio Raygoza Garayは、トロントのマウントサイナイ病院内科のフェローシップ受賞者。Kenneth CroitoruはCanada Research Chair in Inflammatory Bowel Diseasesの受賞者。

データの利用可能性生データおよび解析済みデータのリクエストは、http://www.gemproject.ca/data-access/ の指示に従ってください。生マイクロバイオームデータはAccession： PRJNA685746で公開されている。提出された全てのデータは、カナダCrohn's and Colitis Canada Genetic Environmental Microbial (GEM)プロジェクト運営委員会により審査され、依頼されたサンプル/データが、当初のGEMプロジェクト研究デザインに従ったネステッドコホートのGEMプロジェクトの意図した解析に何ら支障をきたさないこと、また既に進行中の解析と重複しないことが確認されます。この評価を満たした提案は、GEM プロジェクト運営委員会（GPSC）の全メンバーに配布され、レビューと公開討論が行われる。この審査では、提案のグローバルな科学的メリットに焦点が当てられる。この審査では、基本的な科学的メリットと、要求されたサンプルやデータの利用可能性が評価され、GEMプロジェクトの本来の意図に妥協がないことが確認されます。あなたの申請書のスポンサーになってくれるGPSCのメンバーに連絡を取ることは価値があるでしょう。GPSCで過半数の賛成を得たプロジェクトには、独立した査読プロセスを適用する助成機関から申請者が資金提供を受けた時点で、要求されたサンプルやデータが申請者に提供されることを明記した支援レターをGEMプロジェクトが提供することが通知されます。すべての申請書の審査基準には、提案の「科学的妥当性」と、申請された生物試料が利用可能かどうかの判断が含まれる。資金提供機関に要求する予算は、サンプルの処理またはデータベースの適切なクエリーの設定にかかるすべての費用を許容しなければならない。この意図は、申請者が資金提供の機会への申請を検討するための十分な時間を確保することである。なお、マイクロバイオームに基づくリスクスコアのソースコードファイルは、以下のリンクから入手できる。https://github.com/raygozag/GEM-microbiome-gastroenterology-paper。

太字の著者名は共同筆頭著者であることを示す。

同定
DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2023.05.032

著作権
© 2023 AGA Institute. エルゼビア社発行。
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図
図サムネイルgr1
図1Kaplan-Meier plotは検証コホートにおけるリスクスコアのパフォーマンスを示す。前述のように、検証コホート（n=1162）を発見コホートに基づくMRSの中央値で定義される2群のいずれかに割り付け、これら2群間の相対生存率を比較した。用語の定義についてはSupplementary Methodsを参照のこと。
図サムネイルgr2
図2CD発症リスクスコアと分類群との関連。(A) 発見コホートを用いたRSFによって定義された分類群の相対的重要度。重要度の値は、発見コホートのブートストラップサンプルを用いて構築されたすべての回帰木の根に対する平均位置によって計算された。個々の棒の色は、その分類群が属する科に対応している（補足方法と補足表6を参照）。X軸は与えられた分類群の重要度を表す。Y軸はMRSに貢献した分類群を表す。図のファミリーレベルの分類群は図の右側に示すように色分けされている。(B）RFSモデルによる最重要6分類群（x軸）の対数10相対存在量分布と、リスクスコアが増加する各十分位との関連。(1y軸、対数変換は可視化のため）。この情報は、生成されたリスクスコアモデルに対する各分類群の寄与の方向を示している。log(相対存在量中央値)と十分位群間のスピアマン相関： Ruminococcus torquesグループ（ρ = 0.96; P < 2e-16）、Blautia（ρ = 0.98; P < 2e-16）、Colidextriacter（ρ = -0.86; P = 0.003）、UCG.002（ρ = -0.90; P = 9e-4）、Roseburia（ρ = 0.91; P = 5e-4）、Eubacterium ventriosumグループ（ρ = -0.80; P = 0.008）。各分類群の相対的な存在量と、結果として得られたリスクスコアとの間には、非線形的な関係があることがわかる（補足表10）。(C）上位20の重要な分類群のRSFモデルによる相互作用のネットワーク表現。相互作用は補遺方法に概説されているように定義されている。ノードのサイズはノードの次数（すなわち、各ノードのエッジの数）に比例する。任意の2つの分類群間にエッジが存在する場合は、相互作用スコアが0以上であることを示す。エッジの色と線の太さは、与えられた分類群のペアに対する相互作用スコアの値を表す。(すべての分類群ペアの相互作用スコアの値の範囲は0から0.067である。
図サムネイルgr3
図3発見コホートおよび検証コホートの個体における、RSFモデルからの上位10重要分類群の相対存在量分布。紺色の点と紺色のボックスプロットは、対応するコホート内のすべての健常個体における特定の分類群の相対存在量を表す。赤い点と赤い枠のプロットは、対応するコホートにおいて後にCDを発症したすべての個体における特定の分類群についての相対存在量を表す。Y軸は、各個体および分類群の相対存在量をlog10変換したものである（可視化のため）。RSFにおける最も重要な分類群の相対存在量の分布は、解析時の健康状態別に分けたコホート全体でも（例外はあるが）同様のパターンを示している。人口統計学的情報は表1に示されている。この図は、発見セットと検証セットにおける差異の方向性と、個々の分類群とMRSとの関連性の方向性の整合性を単に示したものである。個々に評価した場合、Cox比例法で評価すると、分類群はCD発症と統計的に有意な関連はない（q値＞0.05）。この結果は、微生物組成と将来のCD発症との関連性の非線形性と多次元性を潜在的に示唆している。
図サムネイルgr4
図4全コホートにおけるインプットされた微生物機能の解析結果。微生物リスクスコアに対するPICRUSt2を用いたインプットされた微生物機能のスピアマン相関値（ρ）とP値のボルケーノプロット。赤い点は、相関が統計的に有意（q-value < 0.05）でabs(ρ) > 0.25である機能を表す。青い点は、相関係数が統計的に有意（q-value < 0.05）で、abs(ρ) < 0.25である微生物機能。黒い点は、相関係数が統計的に有意ではなく（q-value > 0.05）、abs(ρ) < 0.25である機能を表す。有意なq値とabs(ρ) > 0.25の両方を持つ上位10関数にラベルを付けた。(X軸はabs(ρ)、Y軸はlog10(q-value)を表す。）
表
表1発見コホートと検証コホートのデモグラフィック
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腸内細菌叢とクローン病の因果関係の調査：メンデルランダム化研究
消化器病学
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クローン病における腸内細菌叢の変化の理解に向けて：原因か結果か
消化器病学
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