糞便微生物叢移植は、TLR4-MyD88-NF-κBシグナル伝達経路を介した炎症の抑制を介して、APP/PS1トランスジェニックマウスのアルツハイマー病症状を減弱させる

哉百名

2024年1月9日 17:07

李翔、丁清勇、王新欣、呉奇龍、葉石青、楼永良

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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3828373/v1

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ステータス
査読中

アルツハイマー研究・治療

バージョン1
2024年01月04日掲載

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要旨
アルツハイマー病（AD）は、認知症の主要な原因である、有病かつ進行性の神経変性疾患である。アルツハイマー病の根本的なメカニズムは、まだ完全には解明されていない。神経炎症は、特定のメディエーターによって媒介される炎症反応であり、ADの病因に重要な役割を果たすことが示されている。さらに、腸内細菌叢の崩壊がADと関連していることが判明しており、便中細菌叢移植（FMT）が潜在的な治療アプローチとして浮上している。しかし、ADの治療におけるFMTの正確な機序は、いまだ解明されていない。本研究では、健康な野生型マウスの糞便微生物叢をAPP/PS1マウス（APPswe, PSEN1dE9）に移植してFMTを行い、ADに関連する炎症を緩和するFMTの有効性を評価するとともに、その正確な作用機序を明らかにした。その結果、FMT投与によりマウスの認知機能が改善し、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路による炎症因子の発現レベルが低下し、腸内細菌異常症の回復が伴っていることが示された。これらの知見は、FMTがAPP/PS1マウスのAD症状を改善し、疾患進行を遅延させる可能性があることを示唆している。

アルツハイマー病

炎症

糞便微生物叢移植

腸内細菌叢

短鎖脂肪酸

微生物叢-腸-脳軸

図表

はじめに
進行性の神経変性疾患であるアルツハイマー病（AD）は、脳の皮質および海馬領域におけるβ-アミロイド（Aβ）斑と、リン酸化が進んだタウタンパク質によって形成される神経原性線維性もつれの存在によって特徴づけられる [1] 。その主な臨床症状は、認知機能の低下、記憶喪失、遂行機能障害である [2]。ADの病因は複雑で、複数の仮説が提唱されており、現在も研究が続けられている。これらの仮説には、Aβプラークとタウタンパク質仮説 [3]、コリン作動性仮説 [4]、神経炎症 [5]、酸化ストレス [6]、ミトコンドリアのオートファジー [7]などがある。中でも、ミクログリアの活性化と神経炎症は、ADの病因における極めて重要な因子として浮上している [8, 9]。腸内細菌叢が脳機能を制御していることを示す証拠は増えており、腸と脳の相互作用を促進する双方向コミュニケーションシステムとしての腸内細菌叢-腸-脳軸（MGBA）の機能が強調されている [10]。MGBAは、免疫系、迷走神経、腸神経系、微生物代謝産物（特に短鎖脂肪酸（SCFA））の変動を含む複数のコミュニケーション経路を包含する[11]。腸内細菌叢によって産生されるSCFAやその他の代謝産物は、直接的または間接的に脳機能に影響を及ぼす可能性がある [12] 。神経炎症および血液脳関門（BBB）透過性の変化は、これらの経路の調節不全をもたらす可能性がある [13] 。

AD患者では、微生物の多様性が低下し、腸内細菌叢の組成が変化していることが多い。これにはバクテロイデーテス（Bacteroidetes）属の増加とファーミキューテス（Firmicutes）属の減少が含まれる [14] 。認知機能障害患者では、抗炎症性腸内細菌叢、特に大腸菌の減少とともに、シゲラ/エシェリヒア比などの炎症性細菌の比率の増加が認められた [15] 。乱れた腸内微生物生態系は、腸内の慢性炎症を誘発する [16] 。この腸の炎症は、腸関門の完全性と透過性を低下させ [17] 、炎症性因子が腸関門を通過して全身循環に移行し、その後MGBAを介して脳に入り、神経炎症につながる [18] 。インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）などの炎症因子のレベルはAD患者で有意に高く、神経炎症におけるこれらの因子の重要な役割を強調している［19, 20］。別の研究では、AD患者の脳では細菌性リポ多糖のレベルが顕著に高いことがわかった [21] 。しかし、Toll様受容体4（TLR4）変異を有するAPP/PS1マウスの脳における炎症性因子の上昇は緩和されたことから、TLR4がAPP/PS1マウスにおける炎症性サイトカインの発現レベルにおいて調節的な役割を果たしていることが示唆された［22］。その結果、ADの発症におけるTLR4関連シグナル伝達経路と腸内細菌叢の特異的な役割は、ADの新規治療技術を提供するために、さらに探求されるべきである。

近年、糞便微生物叢移植（FMT）は、クロストリジウム・ディフィシル感染症、過敏性腸疾患、過敏性腸症候群など、多くの疾患において極めて重要な役割を果たすことが明らかになっている。[23]. 既存の研究は、これらの変化が神経疾患に及ぼす影響を調べることに集中している[24]。ほとんどの疾患に対するFMT治療の正確なメカニズムはまだ解明されていないが、微生物の存在量と多様性の増加、有益な細菌の数の増加、身体の免疫学的機能の強化が関係している可能性がある［25］。5xFADマウスの糞便移植を受けた正常なC57BL/6マウスでは、記憶障害と炎症性サイトカインの高値が認められた［26］。さらに、FMT療法はAPPswe/PSEN1dE9マウスの認知障害を緩和し、Aβ沈着を減少させ、微生物叢とSCFAの変化を逆転させた。しかし、AD治療におけるFMTの具体的なメカニズムや治療効果については、さらなる研究が必要である。

ADに対するFMTの潜在的治療効果を調べるため、健康な野生型マウスの糞便微生物叢をAPP/PS1マウスに移植することによりFMTを行った。本研究では、ADに対するFMTの保護効果を評価し、関連するメカニズムを解明することを目的とした。炎症関連タンパク質の発現レベルの変化を検出するために、リポ多糖（LPS）誘発FHC細胞およびBV2ミクログリアの処理に異なる代謝物を利用した。APP/PS1マウスでは、腸内細菌叢のアンバランスが炎症性サイトカインの過剰産生を引き起こし、腸管バリアの破壊と相まって、最終的にMGBAを介してADの進行を悪化させる可能性があるという仮説が立てられた。

材料と方法
動物

本研究では、3ヶ月齢の成体雄性APP/PS1（APPswe, PSEN1dE9）二重トランスジェニックマウスおよび年齢をマッチさせた野生型マウスを杭州紫源実験動物技術有限公司（Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co. (Ltd.（中国、杭州）から購入した。マウスは病原体を含まない特定の環境（22±3℃、湿度55±5%）で、12：12の明暗サイクルで飼育した。餌と水は自由摂取とした。すべての動物プロトコルは温州医科大学実験動物倫理委員会の承認を得た（承認番号：wydy2022-0375）。

実験デザイン

本研究の実験デザインを図1Aに示す。標準的な飼育環境で1ヵ月間飼育した後、実験用マウスを無作為に3群に分けた（各群n = 8匹）： WT群、APP/PS1群、APP/PS1 + FMT群である。すべての実験マウスに4種類の抗生物質（200 mg/Lネオマイシン、200 mg/Lアンピシリン、200 mg/Lメトロニダゾール、100 mg/Lバンコマイシン）[28]を毎日200 μlずつ1週間投与し、初期の腸内微生物を除去した。1週間の抗生物質投与後、APP/PS1 + FMT群のマウスは、WTマウスの新鮮な糞便懸濁液200μLを4週間毎日経口投与された。WT群とAPP/PS1群のマウスには、同量の生理食塩水を投与した。4週間後、すべてのマウスから新鮮な糞便サンプルを採取し、-80℃で保存した。行動実験終了時にマウスを犠牲にし、組織を採取した。

FMTの手順

野生型マウスの新鮮糞便サンプルを毎日採取し、滅菌生理食塩水に1：5（W/V）の割合で溶解した。この混合液を孔径1.0mm、0.5mm、0.25mmのフィルターで順次ろ過した。ろ過後、集めた液体を4000 x gで5分間遠心した。上清をガベージ液として回収した。

モリス水迷路（MWM）試験

マウスの空間学習能力と記憶能力を評価するために、MWM試験を実施した。実験装置は、円形の水槽（直径100cm、高さ50cm、深さ30cm）と、水中1cmに隠された取り外し可能なプラットフォームであった。水温は18～22℃に保たれた。毎日、マウスは4象限内のさまざまなスタート位置からプールに導入された。トレーニングは5日間にわたって毎日4回行われ、各セッションは30分間隔で行われた。トレーニングの目的は、水中プラットフォームの位置を特定することであった。訓練装置は、1分以内に初めてプラットフォームに到達するまでの時間を自動的に計算した。割り当てられた時間内にプラットフォームに到達しなかった場合、マウスは水没したプラットフォームに誘導され、10秒間そこに立たされた。見えないプラットフォームは最終日に撤去された。マウスはターゲット・プラットフォームから最も離れた場所に配置され、60秒間水槽内を自由に泳ぐことができた。プラットフォームの横断回数と経路の長さは、コンピュータのビデオ解析ソフト（上海吉亮軟件科技有限公司、中国・上海）を用いて記録した。

コンゴーレッド染色およびニッスル染色

行動実験後、成体マウスに麻酔をかけ、速やかにリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）を投与し、続いて4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行った。4％パラホルムアルデヒドで固定した組織サンプルは、濃度の異なるエタノールに順次浸した： 70%で12時間、80%で1時間、90%で1時間、95%で1時間、95%で1時間、100%で1時間、100%で1時間。その後、100%キシレンに2サイクル（それぞれ15分間）浸し、ソフトワックスIとソフトワックスIIでそれぞれ1時間インキュベートし、最後にハードワックスに包埋した。組織をパラフィン包埋し、さらに染色実験を行うために5μmの切片に切り出した。スライドを65℃で2時間、キシレンIで5分間、キシレンIIで5分間、エタノール（100%）で2分間を2回、エタノール（100%）で2分間、エタノール（95%）で2分間、エタノール（80%）で2分間、エタノール（70%）で2分間、エタノール（50%）で2分間、蒸留水で2分間脱脂した。

コンゴーレッド染色： Highman Congo red染色液（G1535、Solarbio、北京、中国）を脳組織スライスに10分間塗布した後、アルカリ性分化液を10秒間使用した。切片を水につけて分化を終了し、流水ですすいだ。その後、切片をLillie-Mayerヘマトキシリン染色液に2分間浸し、流水でわずかにすすぎ、蒸留水で洗浄して青色に分化させた。その後、切片をエタノール勾配で脱水し、キシレンで透明にし、最後に樹脂で封をした。アミロイド斑の定量は顕微鏡下で行った。

ニッスル染色：厚さ5µmの脳組織切片を、先に概説したプロトコールに従ってまず脱パラフィンした。その後、クレシルバイオレット染色液（G1430、Solarbio）を用いて56℃で1時間染色した。その後、染色した切片を脱イオン水で洗浄し、分化溶液を用いて約2分間分化を行い、絶対エタノールで急速に脱水し、キシレンで清澄化し、最後に樹脂で封をした。顕微鏡でアミロイド斑とニッスル小体の数を数えた。

ヘマトキシリン-エオシン（HE）染色およびアルシアンブルー-核-ファストレッド染色

HE染色：

パラフィン包埋結腸組織を5μm厚のスライスに切り出し、次のステップにかけた：65℃で2時間脱脂し、キシレンIで5分間処理し、続いてキシレンIIでさらに5分間処理。続いて、切片をエタノール（100％）に2分間（2回繰り返す）、エタノール（100％）に2分間、エタノール（95％）に2分間、エタノール（80％）に2分間、エタノール（70％）に2分間、50％エタノールに2分間浸し、最後に蒸留水に2分間浸した。その後、ヘマトキシリン（C0105S-2；Beyotime, Shanghai, China）で10分間染色し、水道水で10分間、蒸留水で30秒間洗浄した後、塩酸エタノール分画液で30秒間分画した。流水で10分間、蒸留水で30秒間洗浄した後、切片をエタノール（50％）に2分間、エタノール（70％）に2分間、エタノール（80％）に2分間、エタノール（95％）に2分間順次浸漬した。その後、エオシン（C0105S-1；Beyotime）で10秒間染色し、エタノール（95％）で2分間（2回繰り返す）、エタノール（100％）で2分間（同じく2回繰り返す）処理した。その後、切片をキシレンで洗浄し、最後に樹脂で密封した。顕微鏡下で組織形態学的変化を観察し、基準 [29] に従って組織を評価した。

アルシアンブルー-核-ファストレッド染色：厚さ5 µmの切片を、前述のように脱脂処理した後、エタノール（100%）に5分間、エタノール（90%）に2分間、エタノール（80%）に2分間、さらにエタノール（70%）に2分間浸漬した。再水和したスライドをウェットボックスに入れ、100 µLのアルシアンブルー染色液（C0155S、Beyotime）で1時間染色し、蒸留水で3回洗浄した後、100 µLの核ソリッドレッド染色液で10分間染色した。染色液を注意深く除去し、切片を水道水で5分間洗浄した。切片をエタノール（70％）に10秒、エタノール（80％）に10秒、エタノール（90％）に10秒、最後にエタノール（100％）に10秒順次浸した。この後、切片をキシレンに1分間浸して透明にし、樹脂で密封した。結腸のアルシアンブルー陽性領域のデンシトメトリー分析を顕微鏡下で行った。

定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）

RNAiso Plus試薬（9109；TaKaRa、北京、中国）を用いて、マウスの海馬および大腸組織からRNAを抽出した。逆転写にはPrimeScript™ RT kit with gDNA Eraser (RR047A, TaKaRa)を用い、炎症遺伝子の検出にはTB Green ® Premix Ex Taq™ II (RR820A, TaKaRa)を用いた。特異的なペアプライマーはBeijing Qingke Biotechnology Co. (北京、中国）により合成された特異的ペアプライマーは以下のように要約された：腫瘍壊死因子-α（TNF-α）：5′-TGAGATCCATGCCGTTGGC-3′（アンチセンス）、5′-CACGTCGTAGCAAACCACC-3′（センス）；インターロイキン-6（IL-6）： 5′-AAGTGCATCATCGTTCATACA-3′（アンチセンス），5′-AGGATACCACTCCCAACAGACC-3′（センス）；インターロイキン-1β（IL-1β）：インターロイキン-1β（IL-1β）：5′-TGCTGCGGGATTTGAAGCTG-3′（アンチセンス），5′-AATGCCACCTTTTGACAGTGAT-3′（センス）；β-アクチン：5′-CGCTCGTTGCCAATAGTG-3′（アンチセンス），5′-GCTGTGCTATGTTGCTCTAG-3′（センス）。CFX96TMReal-Timeシステム（Bio-Rad Laboratories Inc. RT-qPCRは以下の条件で行った：95℃で30秒間の前変性、95℃で5秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング／伸長を40サイクル。炎症因子mRNAの相対発現は、2-ΔΔCt法により算出した。

サイトカイン検出のための酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）

マウスから眼球を摘出して採血し、分離した血漿を-80℃で保存した。炎症因子、例えばIL-6（Cat#:1210602）、IL-1β（Cat#:1210122）、TNF-α（Cat#:1217202）の検査にはELISAキット（Dakewe Biotech Co.）実験は製造元の指示に従って行った。測定は、多機能酵素マーカー（SpectraMax M5; Molecular Devices Shanghai Co.

ウェスタンブロッティング

海馬および大腸組織を溶解バッファー（Beyotime）で10分間溶解し、回収したタンパク質上清を12,000 gで20分間遠心分離した。BCA Protein Concentration Assay Kit (P0010, Beyotime)を用いて組織中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質サンプルをよく調製したSDS-PAGEゲルから分離し、低温でPVDF膜（Merck Millipore Ltd., Darmstadt, Germany）に電気泳動した。一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートする前に、膜を5％スキムミルク中で2時間振盪した。その後、膜を二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG（H＋L）（1:2500、A0216、Beyotime）および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（H＋L）（1:2500、A0208、Beyotime）と2時間インキュベートした。タンパク質は Ultrasensitive ECL Chemiluminescence kit (P10100, New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd., Beijing, China) を用いて検出し、バンド密度は Chemiluminescent imaging system (Bio-Rad Laboratories Inc.) で解析した。

以下の一次抗体を使用した：抗ZO-1（1:1000, AF5145, Affinity）、抗Occludin（1:1000, R1510-33, HUABIO）、抗Claudin 1（1： 1000、RT1141、HUABIO）、抗TLR4（1:1000、A5258、ABclonal）、抗MyD88（1:1000、AF7524、Beyotime）、抗NF-κB p65（1:5000、CY5034、Abways）、抗COX-2（1： 1000、db8534、Diagbio）、抗IL-6（1:1000、db7166、Diagbio）、抗IL-1β（1:1000、AF5103、Affinity）、抗TNF-α（1:1000、AF7014、Affinity）、抗APP（1： 1000、AF6219、Beyotime）、抗p-タウ（1:1000、ET1611-68、HUABIO）、β-アクチン（1:3000、AB0035、Abways）、GAPDH（1:2000、db106、Diagbio）。

微生物群集の多様性シーケンス

新鮮なマウスの糞便サンプルを滅菌EPチューブに無菌的に採取し、Omega Bio-Tek (Norcross, GA, USA)のOMEGA Soil DNA kit (M5636-02)を用いてDNAを抽出した。その後、プライマー（フォワード：ACTCCTACGGGAGGCAGCA、リバース：GGACTACHVGGTWTCTAAT）を用いて、糞便微生物遺伝子のV3-V4領域を増幅した。コミュニティDNA断片のペアエンドシークエンシングは、Shanghai Personalbio Technology Co. (Ltd.（中国、上海）から提供されたIllumina NovaSeqプラットフォームを用いた。デプライミング、クオリティフィルタリング、ノイズ除去、シーケンススプライシング、キメラ除去を含むデータ前処理は、DADA2メソッドを用いて実行した[30]。DADA2による重複除去および品質管理後に得られた各配列は、OTU配列を表すシグネチャー配列として定義された。細菌遺伝子のアノテーションとその後の分類学的解析は、Shanghai Personalbio Technology Co.

代謝物のガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）分析

試料を 1.5 mL の遠沈管に入れ、500 µL の水と 100 mg のガラスビーズを入れた。1 分間撹拌した後、12,000 rpm で 10 分間遠心した。得られた上清を、15%リン酸（100 µL）、375 µg/mL濃度の内部標準物質（4-メチル吉草酸）溶液（20 µL）、およびエーテル（280 µL）からなる溶液と十分に混合した。12,000rpm（4℃）でさらに10分間遠心した後[31]、上清を機械分析用に調製した。分析にはTrace 1300ガスクロマトグラフ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を使用した。Agilent HP-INNOWAX キャピラリーカラム（内径 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm）を使用した。サンプルはスプリットフロー1 µL、スプリット比10:1で注入した。

装置は90℃で開始し、10℃/分の速度で120℃まで昇温し、次に5℃/分の速度で150℃まで昇温し、最後に25℃/分の速度で250℃まで昇温するようにプログラムされ、そこで2分間維持された。キャリアーガスにはヘリウムを用い、流速は1.0 mL/minとした。代謝物分析は、Thermo ISQ 7000質量分析計（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、電子エネルギー70eVの電子衝撃イオン化モードで行った[32, 33]。標準物質の濃度をX軸に、標準物質のピーク面積と内部標準物質の比をY軸にプロットして検量線を作成した。これらの検量線を用いて、全サンプルの代謝物濃度を定量的に測定しました。

細胞培養

FHC細胞およびBV2ミクログリアは、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（100×）を添加したダルベッコ改変イーグル培地中、37℃のCO2インキュベーターで培養した。様々な濃度のプロピオン酸ナトリウム（SP）を細胞に適用し、最終濃度を細胞計数キット-8（CCK-8）アッセイを用いて決定した。その後、LPSによって誘導された細胞にSPを投与し、ウェスタンブロット分析によってNF-κB炎症シグナル伝達経路および炎症因子に関連するタンパク質のレベルを測定した。

統計解析
統計解析にはGraphPad Prism 8.0ソフトウェア（GraphPad Software, Inc. すべてのデータセットについて、Shapiro-Wilk検定により正規分布の検定を行った。正規分布のデータについては、一元配置分散分析（ANOVA）を用いて3群間の有意差を決定し、Tukeyの多重比較検定を行った。一元配置分散分析データセットの1つ以上のグループが正規分布から逸脱している場合は、Kruskal-Wallis検定を実施し、続いてDunnの多重比較を行った。代謝物の群間変動の解析では、両データセットがガウス分布に従う場合、両側対応のないt検定を適用した。さらに、反復測定ANOVAをMWMテストの脱出潜時データに対して実施した。P値が0.05未満を統計的に有意とみなした。マイクロバイオームバイオインフォマティクスは、QIIME2 2019.4システム[34]に若干の修正を加えて実施した。配列データの解析はQIIME2とRパッケージ（ver.3.2.0）を用いて行った。

結果
FMT投与はADモデルマウスの認知・記憶機能障害を減弱させる
認知機能障害と短期記憶障害はADの一般的な症状である[35]。本研究では、一般的なADモデルであるAPP/PS1マウスの学習・記憶能力に対するFMTの影響を評価するために、MWM試験を採用した。隠れプラットフォームの段階では、APP/PS1マウスはWTマウスに比べて有意に長い逃避潜時を示した。一方、FMTを投与したAPP/PS1マウス（APP/PS1 + FMT）は、WTマウスと同程度の逃避潜時を示し、顕著な改善を示した（図1B）。探索期の軌道解析では、APP/PS1マウスに比べてAPP/PS1 + FMTマウスではプラットフォーム横断が増加した（図1C）。さらに、標的四分円内の移動距離は、APP/PS1マウスでは有意に短かったが、APP/PS1 + FMTマウスでは回復した（図1D）。これらの所見は、FMT治療がAPP/PS1マウスの空間認知機能を増強し、記憶障害を緩和しうるという有力な証拠となる。

FMT治療は、APP/PS1マウスにおいて調節不全に陥った腸内細菌叢を回復させる。
腸内細菌叢は、ADなどの神経変性疾患において重要な役割を果たしている[36]。FMTがAPP/PS1マウスの腸内細菌叢組成の変化を誘導できるかどうかを調べるため、全群のマウスの糞便サンプルを16S rDNA配列決定に供した。微生物群集のα-多様性をより包括的に評価するために、種の豊富さと多様性を特徴付けるためにChao1指数、Shannon指数、Simpson指数を採用した。α-多様性の分析では、図2Aに示すように、グループ間に有意差は見られなかった。β多様性はBray-Curtis距離アルゴリズムを用いて計算され、主座標分析（PCoA）の結果は、グループ間で腸内細菌叢の分布が異なる明確な分離を示した（図2B）。ADの進行に寄与する主要な細菌の探索を拡大するために、種の分類学的組成の調査が行われた。門レベルでは、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属、テネリキューテス属、アクチノバクテリア属などの主要細菌に有意差はなかった（図2C）。科レベルでは、APP/PS1マウスはWTマウスに比べてLachnospiraceae、Ruminococcaceae、Rikenellaceaeの存在量が少なく、炎症性細菌であるPrevotellaceaeの存在量が多かったが、FMT療法によってこの差は回復した（図2D）。LachnospiraceaceaeとRuminococcaceaeは炎症性サイトカインの産生を抑制することが証明されている[37]。属レベルでは、WTマウスはAPP/PS1マウスよりもOscillospira、Ruminococcus、[Ruminococcus]、Odoribacter、Rikenellaの存在量が多く、APP/PS1マウスはPrevotellaの存在量が多かった。APP/PS1 + FMT群の分散はWT群と同様であり、オシロスピラなどいくつかの生物はAPP/PS1と比較してより有意に濃縮されていた（図2E）。上位20属の存在量データを用いてヒートマップを作成し、サンプル間の種組成の違いを評価するために、種組成分析を採用した。図2Fに示すように、WTマウスではアロバクラム属、コプロコッカス属、ルミノコッカス属、クロストリジウム属が豊富で、APP/PS1マウスではデスルホビブリオ属とプレボテラ属がより豊富であった。さらに、Roseburia、Rikenella、Odoribacter、Adlercreutzia、[Ruminococcus]、Oscillospira、Butyricoccus、Dehalobacteriumの存在量は、APP/PS1 + FMTマウスで顕著に増加した。これらの知見を総合すると、APP/PS1マウスの腸内細菌叢に有意な変化が認められ、FMT治療により、調節不全に陥った腸内細菌叢が効果的に回復し、ADの進行が緩和されることが判明した。

FMT治療は、大腸のTLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路を阻害することにより、炎症を抑制し、腸管バリアの完全性を維持する

FMTがAPP/PS1マウスの認知機能と記憶を改善する可能性があることから、FMTの作用機序がさらに検討された。炎症が神経変性痴呆と複雑に関連していることが実証されている。腸内細菌叢のアンバランスは、炎症性因子の過剰発現を引き起こす可能性があり、それによって神経炎症が誘発され、ADの発症・進展の一因となる可能性がある［19, 36］。数多くの炎症状態はNF-κBに起因しており、TLR4によるMyD88とNF-κBの活性化は、最終的に炎症性サイトカインの産生を増強する可能性がある [38] 。この理論を検証するため、腸の炎症経路に関連するタンパク質の発現レベルを測定した。TLR4（P＜0.01）、NF-κB（P＜0.001）、COX2（P＜0.05）、MyD88（P＜0.05）の発現レベルは、APP/PS1マウスではWTマウスよりも高かったが、TLR4（P＜0. 05）、NF-κB（P < 0.01）、COX2（P < 0.05）、MyD88（P < 0.05）の発現レベルは、FMT処理後に有意に低下した（図3A-E）。続いて、種々の炎症性サイトカインの発現レベルを調べた。ウェスタンブロット分析の結果、FMT治療はAPP/PS1マウスの炎症因子IL-6（P < 0.05）、IL-1β（P < 0.05）、TNF-α（P < 0.05）の発現レベルを有意に減少させた（図3A、F-H）。同様に、炎症因子IL-6（P < 0.001）、IL-1β（P < 0.05）、TNF-α（P < 0.01）のmRNA発現レベルは、APP/PS1マウスではWTマウスに比べて有意に上昇したが、APP/PS1 + FMTマウスでは低下した（図3I-K）。腸関門を破壊することにより、炎症性細菌が循環を介して血流や脳に炎症性因子を放出する可能性が推測された。その結果、APP/PS1マウスでは、タイトジャンクション（TJ）タンパク質であるZO-1（P < 0.05）、Occludin（P < 0.001）、Claudin-1（P < 0.01）の発現レベルが、WTマウスに比べて有意に低下していた。しかし、FMT治療後、ZO-1（P < 0.05）とClaudin-1（P < 0.05）のタンパク質レベルは大幅に増加した。オクルディンの発現レベルも上昇したが、その変化は統計的に有意ではなかった（図4A-D）。

さらに、大腸組織のヘマトキシリン・エオジン染色から、WTマウスはAPP/PS1マウスに比べて組織学的スコアが顕著に高いことが明らかになった。逆に、APP/PS1マウスでは、上皮が著しく過形成され、炎症細胞がかなり浸潤していた。対照的に、APP/PS1 + FMTマウスの腸壁は、炎症細胞の浸潤の有意な緩和を伴って、厚さの減少を示した（図4E, F）。アルシアンブルー染色によると、FMT投与により、APP/PS1マウスの大腸における粘液層の破壊が緩和されたことが示された（図4G）。WTマウスおよびAPP/PS1＋FMTマウスのアルシアンブルー染色の陽性領域は、APP/PS1マウスのそれよりも有意に大きかった（P < 0.05）（図4H）。これらの結果から、FMT投与は大腸におけるTLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路の活性化を抑制し、腸管バリアの完全性を維持し、腸炎症の進行を改善することが示された。

FMT治療は炎症因子の血漿レベルを低下させる
炎症性因子がMGBAを介して脳に入り込み、ADの進行を促進するかどうかをさらに調べるため、ELISA法を用いて血漿中サイトカイン濃度を検出した。APP/PS1マウスは、WTマウスに比べてIL-6、IL-1β、TNF-αの血漿中濃度が有意に高かった。しかし、FMT治療はこれらのレベルを低下させ、全身的な抗炎症効果を示した（図5A-C）。

FMT投与は、APP/PS1マウスの脳病態を緩和し、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路を阻害し、炎症因子を抑制する。

MGBAの障害は神経炎症を促進し、神経損傷を引き起こし、最終的にADにつながる可能性がある[39]。神経炎症は、ADにおける神経病理学的変化の進行に重要な役割を果たしていることが証明されている [40]。炎症がMGBAによるTLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路の活性化を通じてADの病理学的変化を促進する可能性があるかどうかをさらに調べるために、ADに関連する特徴的な指標を調べた。ウェスタンブロットアッセイの結果、APP/PS1マウスはWTマウスおよびAPP/PS1＋FMTマウスに比べてアミロイド前駆体タンパク質（APP）とリン酸化度の高いタウタンパク質（p-Tau）の濃度が有意に高かったが、FMT投与によりこれらの変化が顕著に逆転した（図6A-C）。一方、脳切片のコンゴーレッド染色の結果、APP/PS1マウスではβ-アミロイド斑が大きく蓄積していたが、FMT処理後は大きさも数も減少し、APP/PS1マウスの病理学的特徴が改善したことが示された（図6D、E）。Nissl染色の結果、APP/PS1マウスの脳内Nissl小体の数は減少し、緩く配列していたのに対し、FMT投与後はNissl小体の数が有意に増加し、整然と配列していたことから、神経細胞によるタンパク質合成機能が強くなったことが示された（図6F, G）。さらに、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路関連タンパク質の発現量を調べた。TLR4（P＜0.05）、NF-κB（P＜0.05）、COX-2（P＜0.05）、MyD88（P＜0.05）の発現レベルは、APP/PS1マウスの脳でWTマウスよりも有意に高かった。FMT治療は、APP/PS1マウスにおける経路関連タンパク質の発現レベルの上昇を顕著に抑制した（図7A-E）。さらに、脳内の炎症性サイトカインレベルを調べた。大腸や血漿の結果と同様に、炎症因子IL-6（P < 0.05）、IL-1β（P < 0.05）、TNF-α（P < 0. 05）はWTマウスよりもAPP/PS1マウスで有意に高かったが、IL-6（P < 0.05）、IL-1β（P < 0.01）、TNF-α（P < 0.05）の発現レベルはAPP/PS1 + FMTマウスで有意に低下した（図7A、F-H）。ウェスタンブロッティングの結果と同様に、RT-qPCRのデータからも、FMT投与によって炎症性サイトカインレベルの上昇が逆転することが示された（図7I-K）。以上の結果から、FMT投与はAPP/PS1マウスの脳における神経病理学的変化を遅延させ、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路の活性化と炎症因子の産生を抑制し、ADの進行を遅らせることが示された。

FMT治療は、APP/PS1マウスの大腸と脳における短鎖脂肪酸レベルを改善する
マウスの大腸糞便および海馬におけるSCFAの発現レベルは、SCFAがMGBA相互作用に関与しているという事実に基づいて評価された[41]。ヒートマップでは、糞便サンプルの中で酪酸、酢酸、プロピオン酸の変動が最も大きかった（図8A）。WT群と比較して、プロピオン酸（P < 0.01）、酢酸（P < 0.05）、酪酸（P < 0.01）、イソ酪酸（P < 0.05）、カプロン酸（P < 0.05）などの主要なSCFAの発現レベルは、APP/PS1群で有意に低下した。しかし、FMTを投与すると、プロピオン酸（P < 0.01）、酢酸（P < 0.01）、酪酸（P < 0.01）の発現レベルの低下は逆転し、吉草酸（P < 0.05）の発現レベルも改善した（図8B）。しかし、脳のヒートマップでは、APP/PS1群とWT群の間でSCFAの発現量に有意差が見られたが、プロピオン酸と酪酸の発現量はFMT処理後に増加した（図8C）。プロピオン酸の発現量は群間で最も高い変動を示し、WT群（P＜0.05）とAPP/PS1＋FMT群（P＜0.05）ではAPP/PS1群よりも高い発現量を示し、酢酸の発現量もWT群とAPP/PS1群で有意差があった（P＜0.01）（図8D）。これらの結果は、FMT治療がSCFAの発現レベルに影響を与えることにより、疾患の進行に影響を与える可能性を示している。

SPはFHC細胞とBV2ミクログリアにおける炎症のアップレギュレーションを抑制する
注目すべきことに、SPは、NF-κB経路のダウンレギュレーションと炎症因子の産生を減少させる抗炎症作用と神経保護作用を有する [42]。ADにおける炎症性変化に影響を及ぼす潜在的な機序をさらに調べるため、FHCおよびBV2ミクログリア細胞の生存率を様々な濃度のSPで調べた（図9A、B）。毒性を最小にするSPの至適濃度は、FHC細胞では5 mM、BV2細胞では500 μMであることが同定された。SPの潜在的な抗炎症作用を調べるため、FHC細胞とBV2ミクログリア細胞をLPSで前処理し、その後SPを5mMと500μM投与した。図9Cは、FHC細胞におけるウェスタンブロット分析の結果を示している。TLR4（P＜0.05）、NF-κB（P＜0.001）、COX2（P＜0.05）、およびMyD88（P＜0.01）の発現レベルは、LPS誘導群では対照群よりも有意に高いことが明らかになった。炎症シグナル伝達経路関連タンパク質および炎症因子であるTLR4（P < 0.05）、NF-κB（P < 0.01）、COX2（P < 0.05）、MyD88（P < 0.05）、IL-6（P < 0.05）、IL-1β（P < 0.01）、TNF-α（P < 0.05）の発現レベルは、SP処理後にすべて低下した（図9D-J）。BV2ミクログリアの結果は、FHC細胞の結果と一致していた。ウェスタンブロット解析では、コントロール群とLPS群との間に有意差が認められた。TLR4（P＜0.05）、NF-κB（P＜0.05）、COX2（P＜0.05）、およびMyD88（P＜0.05）の発現レベル、ならびに炎症性因子IL-6（P＜0.05）、IL-1β（P＜0.05）、およびTNF-α（P＜0.05）は、SP処理後に有意な減少を示した（図9K-R）。結論として、SPはTLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路を阻害し、炎症産生を抑制できることが示された。

考察
MGBAを通じて、FMTは腸内細菌叢に影響を与え、神経変性疾患の治療に重要な役割を果たす可能性がある[43]。Kim MSら[44]は、WTマウスの糞便微生物叢がADLPAPTマウスの病理学的特性を改善する可能性を見出した。Zhao Zらの研究[45]によると、FMT治療は腸内細菌叢異常を是正し、PD症状を軽減し、炎症を緩和する可能性がある。MWM試験の結果によると、FMT治療によりAPP/PS1マウスの認知能力が向上し、空間学習能力や記憶能力も向上したことが示された（図1）。さらに、FMT投与は、AD病態の極めて重要なマーカーであるAPP/PS1マウスの脳におけるAPPおよびp-Tauタンパク質の発現レベルを低下させた（図6A-C）[1]。脳の組織学的切片からも、APP/PS1マウスの疾患進行の改善が確認された（図6D-G）。これらの所見は、FMT治療がADにおいてますます重要になってきており、有望な治療選択肢となることを示唆している。FMT治療がADの症状を改善するという事実にもかかわらず、その正確な作用機序はまだ十分に解明されていない[27]。したがって、FMTがMGBAに作用することでどのような治療上の利点があるのかをさらに解明することが不可欠である。

その結果、マウスの腸内容物について16S rDNA配列決定が行われた。その結果、APP/PS1マウスではPrevotellaceaeがファミリーレベルでより多く存在し、FMT投与後に存在量が有意に減少することが明らかになった（図2D）。Prevotellaceaeは典型的なディスバイオシスの徴候であり、炎症性サイトカインの産生に関連することがわかっている[46]。さらに、FMT処理後、APP/PS1マウスではLachnospiraceae、Ruminococcaceae、Rikenellaceaeの存在量がファミリーレベルで増加した（図2D）。炎症性サイトカインは、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、およびRikenellaceaeと負の関係を持ち、これらはすべて生体に有益なSCFAの産生に寄与している[37, 47, 48]。本研究では、APP/PS1マウスにおいて、FMT投与後にPrevotellaおよびDesulfovibrioの存在量が属レベルで有意に減少し、Oscillospira、Odoribacter、RikenellaおよびRoseburiaの存在量が増加した（図2E、F）。プレボテラは、TLR-2やTLR-4を活性化し、上皮細胞を刺激してIL-8やIL-6などの炎症因子を産生させるなど、炎症特性を有することが示されており、プレボテラが慢性炎症を促進する重要な病原体である可能性が示唆されている[49, 50]。LPSなどの内毒素を産生することができる炎症性細菌と考えられているデスルホビブリオは、腸の炎症と正の関係があるかもしれない [51] 。海馬体積の萎縮は認知症と関連している。オドリバクターは、認知障害に対する保護効果や海馬容積との関連で知られているが、抗炎症作用や免疫調節作用も示した [52, 53]。オシロスピラ（Oscillospira）、ロゼブリア（Roseburia）、リケネラ（Rikenella）などの有用細菌は、ADの改善に関与しており、ADの潜在的な治療アプローチとして期待されている［54-56］。仮説では、FMTは細菌の代謝産物（SCFAなど）を調節し、炎症を抑えることによって、健康全般を増進させる可能性がある。

慢性炎症は神経系に深刻なダメージを与え、神経変性疾患の主要な症状であり [57]、認知障害、不安、うつ病と関連している [58]。本研究では、APP/PS1＋FMTマウスの結腸および海馬における炎症因子のmRNAレベルおよびタンパク質発現レベルが有意に低下していることが明らかになった（図3、7F-K）。一方、FMT処理により、血漿中の炎症性因子の発現レベルが低下した（図5）。これらの知見は、ADの発症における炎症の極めて重要な役割を強調するものであり、FMTの介入によって神経炎症の増悪を抑制し、最終的に炎症の進行を緩和して病気の進行を遅らせることができることを強調するものである。

腸管炎症は腸管バリア機能障害に重要な役割を果たしている可能性がある [46] 。腸関門の完全性は、身体の健康を維持し、病原体の侵入を防ぐために重要である。腸管バリアが損傷すると、腸管透過性が変化し、ウイルスや潜在的に有害な物質が血流に入り込む [59] 。これは、APP/PS1マウスで炎症性因子の発現レベルが上昇し、FMT投与後に発現レベルが低下したことを示す、本研究の血漿ELISA結果と一致する（図5）。粘液層、上皮、固有層が腸関門の大部分を形成しており、タイトジャンクションタンパク質が上皮細胞をつないでいる[59]。腸管透過性はタイトジャンクションタンパク質の完全性によって決定され、これは細菌や有害化学物質の侵入に対する腸管バリア機能に必要である [46]。本研究では、FMT投与後、ZO-1、Occludin、Claudin-1の発現レベルがAPP/PS1マウスよりも著しく高いことが明らかになり、FMT投与によりタイトジャンクションタンパク質の発現レベルを回復させることで、腸管バリア透過性障害が改善されることが示された（図4A-D）。さらに、大腸切片の染色から、FMT投与により炎症性細胞の浸潤と粘液層の破壊が減少することが示された（図4E-H）。これはわれわれのこれまでの知見と一致しており、腸の炎症を抑え、腸関門を修復し、結果として血中の炎症性因子のレベルを低下させることによって、腸関門に対するFMTの保護効果を強調している。

さらに、FMTがMGBAを介して脳を保護するためにどのように炎症の伝達を媒介するかを調べるために、GC-MSを用いて大腸と海馬におけるSCFAの発現レベルを検出した。SCFAは腸関門やBBBの透過性を低下させ、それによって抗炎症作用を発揮し、LPSの生体内への侵入を減少させることが長い間認識されてきた[53, 60]。本研究では、APP/PS1マウスにFMTを施したところ、大腸ではプロピオン酸、酪酸、酢酸などの主要なSCFAの発現量が有意に増加し、海馬でもプロピオン酸の発現量が増加した（図8）。プロピオン酸は抗炎症作用や抗がん作用を示す。これまでの研究で、プロピオン酸はTLR4経路をダウンレギュレートし、NF-κBの発現レベルを阻害し、その結果、炎症性サイトカインの産生を減少させることが実証されている [61]。また、高用量のプロピオン酸塩は、TLR-4依存的に、マウスにおけるLPS誘発炎症反応を軽減する [62]。本研究では、結腸および脳組織におけるTLR4/MyD88/NF-κB炎症シグナル伝達経路に関連するタンパク質の発現レベルを調べるために、ウェスタンブロットアッセイを採用した（図3,7A-E）。その結果、APP/PS1マウスの大腸および脳組織では、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路が活性化されており、FMT投与により抑制されることが明らかになった。一方、関連する細胞実験では、SP処理は細胞質因子NF-κBの核内転位を阻害し、TLR4/MyD88/NF-κB炎症シグナル伝達経路の活性化を抑制し、IL-6、IL-1β、TNF-αなどの炎症性メディエーターやCOX-2の産生を減少させた（図9）。これは、TLR4/MyD88/NF-κB炎症シグナル経路がADの発症に重要であることを示したin vivoマウス実験の知見と一致する。これらの知見は、FMT治療がAPP/PS1マウスのSCFAの発現レベルを高め、炎症因子の産生を減少させ、生体の恒常性を回復させ、ADに対する大きな治療効果を達成できることを強調している。

この仮説では、腸内細菌叢の異常がプレボテラやデスルホビブリオなどのグラム陰性菌の過剰増殖を引き起こし、LPSの産生増加につながると仮定している。その結果、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路が活性化され、IL-6、IL-1β、TNF-αなどの炎症性分子の合成が促進される。腸管バリアが損なわれると、LPSと炎症因子の両方が血流に入り、全身性の炎症を引き起こす。その後、これらの炎症因子とLPSは循環系を介して脳に到達し、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路の活性化とさらなる炎症因子の合成を刺激し、最終的にADの進行を悪化させる。逆に、FMT療法は、MGBAの調節を介してAPP/PS1マウスの炎症レベルを低下させることにより、病気を軽減することができる（図10）。

とはいえ、この研究には複数の限界がある。横隔膜下迷走神経は、MGBA内の重要な制御経路であり、腸内細菌叢と脳との間のコミュニケーション導管として確立されている[63]。Wang Sら[64]は、ラクトバチルス・インテスティナリス（Lactobacillus intestinalis）とラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）が迷走神経によってマウスの抑うつ行動を誘導することを示し、この効果は迷走神経を切断したマウスでは観察されなかった。別の研究では、FMTがT1Dマウスの認知障害を改善し、この効果は迷走神経切開または迷走神経抑制によって抑制されることがわかった [65] 。したがって、横隔膜下の迷走神経は、腸内細菌叢をモニタリングし、炎症性細菌の増殖を抑制することによって体内の炎症を抑え、それによって認知障害を改善し、MGBAを通じて記憶を増強することによってマウスの老化を遅らせる可能性がある。横隔膜下迷走神経の影響を調べることは、この分野における今後の研究の有望な方向性を示している。

結論
結論として、APP/PS1マウスにおけるADの進行には炎症が重要な役割を果たしていることが明らかになった。FMT治療は、腸内マイクロエコロジーを回復させ、TLR4/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路によって媒介される炎症を抑制することにより、腸組織と脳組織の両方において疾患の進行を遅延させた。

宣言
倫理的承認と参加同意

すべての動物実験は、温州医科大学実験動物倫理委員会の承認を得た（承認番号：wydy2022-0375）。

論文発表の同意

該当なし。

データおよび資料の入手可能性

本研究のデータセットはオンラインリポジトリで利用可能である。具体的には、National Center for Biotechnology Information (NCBI) BioProject (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject, Accession No. PRJNA1025129)、およびNational Center for Biotechnology Information (NCBI) SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra, Accession No. PRJNA1025129)で利用可能である。さらに、これらのデータセットは、National Genomics Data Center (NGDC) China National Center for Bioinformation (CNCB)/Beijing Institute of Genomics (BIG), Chinese Academy of Sciences (CAS) Open Archive for Miscellaneous Data (OMIX) (https://ngdc.cncb.ac.cn/omix/, Accession No. PRJCA020313 and PRJCA020312)にも掲載されている。

競合利益

著者らは利益相反がないことを宣言する。

資金提供

本研究は、浙江省医療技術重点分野（一等、カテゴリーA）および温州市科学技術部健康プロジェクト（助成金番号Y20220029）の支援を受けた。

著者の貢献

Xiang Li：資金獲得、構想、監修、執筆・校閲・編集、プロジェクト管理。

Qingyong Ding：データキュレーション、調査、概念化、方法論、原案作成。

Xinxin Wan：調査、データキュレーション、方法論。

Qilong Wu：調査、データ管理。

Shiqing Ye：データキュレーション、調査、概念化。

楼永良：資金獲得、監督、プロジェクト管理。

謝辞

該当なし

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