腸内細菌叢がヒトおよびマウスの神経性食欲不振症の病態に寄与していることが明らかに
ヒトの神経性食欲不振症の発症に腸内細菌が寄与している...
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腸内細菌叢がヒトおよびマウスの神経性食欲不振症の病態に寄与していることが明らかに
- Nature Microbiology
で
メディコスであること
2023年4月17日
0
研究参加者
AN患者はすべて経験豊富なコンサルタント精神科医によって診断され、AN1の制限型または暴飲暴食型のサブタイプのDSM-5基準を満たした。ANと診断された人の90～95％は女性であるため、本研究では女性のみを対象とすることにし、民族性が腸内細菌叢に影響を与える可能性があるため、12014年9月1日から2016年7月31日までにデンマークの3つの専門センターから集められたAN症例のデンマーク人白人女性のみを対象としました。そのセンターは以下の通りである： 摂食障害センター（オーデンセ大学病院）、児童・思春期精神医学ユニット（オーフス大学病院）、精神医学研究ユニット（オールボー大学病院）。除外基準は、過去3ヶ月以内に抗生物質または抗真菌剤による治療を受けていること、急性または慢性の身体疾患や感染症があることであった。対象患者はすべて専門センターで治療を受けており、治療開始時に経験豊富な専門の心理学者または精神科医による面接を受けた。インタビューには、有効なEating Disorder Inventory（EDI、詳細はSupplementary Note 2に記載）を使用し、訓練された医療専門家が記入する質問票とした21．年齢を合わせた健康な対照女性の除外基準は、BMIが18.5未満または25kg m-2以上、避妊薬を除くあらゆる種類の常用薬、過去3ヶ月以内の抗生物質だった。対照となる女性は、公共広告および医療スタッフ、医学生、その親族への直接接触によって募集された。健康な対照者のBMIとその他の臨床的特徴は、補足表2に記載されている。
研究プロトコルはClinicalTrials.gov（NCT02217384）に登録され、本研究はヘルシンキ宣言に従って行われ、南デンマークの地域科学倫理委員会（ファイル番号42053 S-20140040）により承認されました。本研究に参加したすべての参加者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。
入院患者。以下に述べるすべての測定は、重度のAN患者の身体的および心理的安定化のための専門ユニットにおける日常的な治療中に行われた。週2.0～3.0％の安全かつ効果的な体重回復が、入院病棟での治療の目標である。ケアは学際的なチームによって行われ、国際的なガイドラインに則っています。個々にカスタマイズされた食事は、訓練を受けた看護師または栄養士の監督のもと、予定された時間に与えられました。食事があらかじめ決められた時間（おやつは15分、主食は30分）内に摂取できない場合は、経口または十二指腸チューブで栄養ドリンクを追加しました。個人の嗜好を考慮し、3種類の食事から選択できるようにした。大栄養素の含有量は一定で、推奨されるエネルギー割合の範囲内であった： 炭水化物40～50％（糖質は最大10％）、脂質30～40％、タンパク質20～25％。1日のエネルギー摂取量は、体重の経過に応じて個別化した。1週間の体重増加率が2％に達しない場合は、1日のメニューのエネルギー含有量を増やしました。食事の後は、座ったままの姿勢で30分から60分の間、監視付きの休息がとられた。休憩の間は、散歩などの軽い運動が可能であったが、運動トレーニングは禁止であった。過剰な運動への衝動や、行動ルールの遵守が不十分な患者には、行動監視を延長し、必要であれば1日24時間体制とした。
外来患者 AN患者は定期的に外来を訪れ、医師、看護師、心理学者、健康行動教育者を含む学際的なチームによるケアが行われました。
彼らは、上記の入院患者と同じマクロ栄養素組成を持つ、個別の食事計画を与えられていた。入院患者と同様に、すべての外来患者も認知行動療法的治療コースに登録された。
身長は壁に取り付けたスタディオメーターで、体重は朝、朝食前に較正済みのプラットフォームスケールで測定した。BMIは、体重を身長の2乗で割った値（＝kg/m2）として算出した。
生化学的分析
血液サンプルは、一晩絶食した後の朝に採取された。血液サンプルは氷上に集められ、血清と血漿を得るために処理され、その後-80℃で保存された。血清中のナトリウム、カリウム、アルブミン、クレアチニンの濃度は、Roche/Hitachi cobas cシステムで酵素アッセイにより測定された。血清中の総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロールの濃度は、リンタングステン酸塩化マグネシウム沈殿法を用いて測定した。血清中の免疫反応性インスリン濃度は酵素結合免疫吸着法を用いて測定し、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ濃度はピリドキサールリン酸活性化を含む酵素的クーロメトリック法を用いて分析した。
血漿中のClpBの分析は、以前に記載された方法で行った55。
糞便サンプル採取とDNA抽出
便は、国際ヒトマイクロバイオーム基準（IHMS）のガイドライン（SOP 03 V1）に従い、AN例とHCが自宅でキットで採取し、ドライアイスで輸送し4-24時間後にバイオバンクでプラスチックチューブに入れて-80℃で凍結するまで直ちに-20℃にて冷凍した。糞便サンプルのアリコートからのDNA抽出は、IHMS SOP P7 V256に従って行われた。
バクテリアの細胞数測定
細菌細胞計数（補足図7）のために、0.08-0.12 gの凍結（-80 ℃）糞便サンプルをpH 7.2 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) (Sigma-Aldrich) で15倍希釈し、組織ライザー（40分、12.5回/秒；QIAGEN）を用いて機械的に均質化したのち2％パラホルムアルデヒド（10分、部屋温度；Biotum）で固定しました。その後、サンプルをろ過した染色バッファー（1 mM EDTA, 0.01% Tween20, pH 7.2 DPBS, 1% BSA (Sigma-Aldrich) ）で120倍希釈した。塊を最小限に抑えるため、サンプルは、染色バッファであらかじめ濡らしたセルストレーナー（孔径5μm；pluriSelect）で濾過した。次に、細菌細胞懸濁液をDMSO（Sigma-Aldrich）中のSYBR Green I（1:200,000; Thermo Fisher）で染色し、暗所で30分間インキュベートした。細菌細胞数を正確に測定するため、分析前に既知濃度の123count eBeads（Invitrogen）をサンプルに添加した。測定はBD Fortessa LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて行い、データはBD FACSDiVaTMソフトウェアで取得した。FITC（530/30nm）チャンネルには200の閾値を適用した。緑（530/30 nm, FITC）、青（450/50 nm, Pacific Blue）、黄（575/26 nm, PE）、赤（695/40 nm, PerCP-Cy5-5 ）蛍光チャンネルの蛍光強度、および前方散乱光と側方散乱光（FSCとSSC）強度を収集しました。測定は、あらかじめ設定した0.5μl s-1の流速で実施した。データは、R（v4.1.2）のflowcoreパッケージ（v1.11.20）57を使用してRで処理された。固定ゲーティング戦略により、微生物の蛍光イベントを糞便サンプルのバックグラウンドから分離した。
ショットガンシーケンス
DNAはQubit蛍光定量法（Thermo Fisher）を用いて定量し、フラグメントアナライザー（Agilent）を用いてDNAサイズプロファイリングで定性した。ライブラリーの構築には、高分子量DNA（>10 kbp; 3 µg）を使用しました。超音波発生装置（Covaris）を用いてDNAを約150 bpの断片に剪断し、Ion Plus Fragment LibraryおよびIon Xpress Barcode Adaptersキット（Thermo Fisher）を用いてDNA断片ライブラリー構築を実施した。精製・増幅したDNAフラグメントライブラリーは、Ion Proton Sequencer（Thermo Fisher）を用いて、1ライブラリあたり150bp（平均）の高品質リードを最低2000万本生成し、塩基配列を決定した。
遺伝子カウントテーブルの構築
遺伝子数表を作成するために、METEORソフトウェアを使用した58：まず、AlienTrimmer59でリードを低品質にフィルタリングした。低品質リードとヒトDNAリードを除去した後、糞便DNAの75.7%±2.7%の高品質メタゲノミクスシーケンスリードを、Bowtie2（文献61）を用いて、1040万遺伝子からなる統合腸カタログ2（IGC2）60にマップした。カタログのユニークな遺伝子にマッピングされたリードは、その対応する遺伝子に帰属させた。次に、カタログの複数の遺伝子に同じアライメントスコアでマッピングされたリードは、捕捉された遺伝子に対するそのユニークなマッピングカウントの比率に従って帰属された。得られたカウント表は、RパッケージMetaOMineR v1.3162を用いてさらに処理した。サンプル間のシーケンスの深さとマッピング率の違いを考慮し、1400万マッピングリードでダウンサイジングされました。次に、ダウンサイジングしたマトリックスを遺伝子長で正規化し、100万フラグメントマップあたりの転写物のキロベースあたりのフラグメントで正規化して頻度マトリックスに変換した。遺伝子数は、頻度マトリックスに存在する（アバンダンスが厳密に正）遺伝子の数として計算された。
MSPと腸管タイプのプロファイリングとアノテーション
IGC2は、公開されている最新のMSPデータセット64を用い、MSPminer63で1,990個のMSPに整理されたことがある。MSPの相対的な存在量は、その100個の「マーカー」遺伝子（つまり、最も高度な相関を持つ遺伝子）の平均存在量として計算されました。この方法はMetaHIT62とMetacardis65のコンソーシアムで使用されたもので、サンプルに含まれる「マーカー」遺伝子が10%未満の場合、MSPの存在量は0に設定された。コア遺伝子が100個未満の4つのMSPについては、利用可能なすべてのコア遺伝子を使用した。
より高い分類学的ランクでの存在量は、与えられた分類群に属するMSPの合計として計算された。MSP数は、サンプルに存在するMSPの数（すなわち、その存在量が厳密に正である）として評価した。Enterotypesプロファイリングは、以前に実証されたように実施された66。
腸内細菌叢の機能モジュールの推定
IGC2カタログの遺伝子をdiamond67でKEGGデータベース68（v8.9）のKEGG orthologue（KO）にマッピングした。各遺伝子は、e-value < 10 × 10-5、bit score >60のヒットのうち、最もランクの高いKOに割り当てられた。次に、メタゲノムサンプル中のGMMs28とGBMs29の存在と存在量を、既述のようにRパッケージomixerRpm（v0.3.2）に実装したパイプラインによって評価した28, 29。
メタゲノミックサンプルからの細菌の動的増殖速度の見積もり
メタゲノミックサンプルから腸内細菌の増殖ダイナミクスを推測するために、既述の通り計算パイプラインを使用した27。シーケンスリードは、1,509の微生物種に属する2,991株の完全ゲノムリファレンスを含むデータベースにマッピングされた。各細菌種について、サンプル全体で100％の有病率を持つ参照株が選択された。次に、参照ゲノムにアラインされたリードに基づいて、カバレッジマップを作成した。ゲノムセグメントは10kbpの領域にビニングされ、得られたビンのカバレッジが計算され、平滑化されました。複製の起点と終点の位置は、複数のサンプルにわたる同一株のフィットによって予測された。最後に、PTRは、予測されたピーク位置における代表株の平滑化されたシーケンスカバレッジを、予測されたトラフ位置におけるカバレッジで割ったものとして、すべてのサンプルの各細菌種について計算されました。
細菌の構造的変異の研究
SVs分類の前に、反復カバレッジベースのリード割り当てアルゴリズムによるパイプラインを実行し、曖昧なリードを最も可能性の高い参照に高精度で再割り当てした31,32。proGenomesデータベース（http://progenomes1.embl.de/）で提供される参照ゲノムを連結した後、ゲノム1kbpビンに分割し、高変動ゲノムセグメントの検出に適用しました。SGV-Finderパイプライン31を使用して、(1)集団全体のゲノムセグメントの欠失率が25%未満（可変SV、vSV）、(2)欠失率が25%から75%の間（欠失SV、dSV；この特定のゲノムセグメントの欠如または存在を保持）または(3)欠失率が75%以上（このゲノムセグメントは分析から除外）のいずれかのSVを検出しました。SVを呼び出したすべての細菌種は、全サンプルの少なくとも10%に存在し、その後の解析に使用された。
メディエーション解析
Rパッケージ「mediation」69（v4.5.0）を用いて、腸内微生物の特徴、極性代謝物・微生物関連代謝物、代謝形質と摂食障害スコアの因果関係を推論した。検定数を減らすため、互いに強く関連する変数からなる候補群のみを残した。つまり、微生物特徴-メタボライト-表現型変数の因果関係候補群では、腸内微生物特徴と血清代謝物の関連が有意（Padj＜0.1）、代謝物と表現型変数の関連が有意（Padj＜0.1）、微生物特徴と表現型変数の関連が有意（Padj＜0.1）、だった。媒介分析を行った後、方向1で有意な候補グループのみを残し、サンケイ図法で可視化した。
ウイルス性腸内細菌叢のプロファイリングと解析
MiCoP70は、メタゲノミクスのバルクシーケンスリードから直接ウイルスを呼び出し、ビロームデータセット内の相対存在量を計算するために最適化された手法であるため、我々はMiCoPを使用してウイルス腸内細菌叢をプロファイリングしました。MiCoPは、参照データセットとして、NCBIのRefSeq Viralデータベース71を利用しています。データセットに含まれる147人（AN77人対HC70人）において、有病率が10%以上、相対存在率が0.01%以上のウイルス209種を同定しました。Rパッケージ「fossil」72および「vegan」73を用いて、豊かさ、アルファおよびベータ多様性を計算した。両側Wilcoxonの順位和検定は、グループ間のリッチネスとアルファ多様性指数の統計的有意差の判定に使用した。キャンベラ距離については、n = 999での順列多変量分散分析（PERMANOVA）を実施した。AN-RSとAN-BPの両方のマイクロバイオームデータにおけるウイルス-細菌相互作用は、Sparse Correlations for Compositional（SparCC）74アルゴリズムを用いて計算された。SparCC解析の前に、AN細菌とウイルスのマイクロバイオームデータセットをAN-RSとAN-BPデータセットにサブセットし、それらを別々にSparCC解析に提出した。
ガスクロマトグラフ飛行時間型質量分析計による血清極性代謝物の分析
腸内細菌関連代謝物として挙げた代謝物は、文献マイニング75,76に基づくものである。血清サンプルはランダム化し、サンプル調製は既述の通り行った43,77。簡単に言うと、内部標準物質（ヘプタデカン酸、重水素標識dl-バリン、重水素標識コハク酸、重水素標識グルタミン酸、1μg ml-1）を含むメタノール（MeOH）400μlを血清サンプル30μlに加え、ボルテックス混合して氷上に30分インキュベートした。その後、サンプルを遠心分離（9,400×g、3分）し、遠心分離後の上清を350μl採取した。溶媒を蒸発乾固し、25μlのMOX試薬を加え、サンプルを45℃で60分間インキュベートした。N-メチル-N-（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（25μl）を加え、45℃で60分間インキュベートした後、保持指標標準混合物（n-アルカン、10μg ml-1）25μlを添加した。
分析は、Agilent 7200四重極飛行時間型質量分析計に結合したAgilent 7890Bガスクロマトグラフを使用して行いました。以下のパラメータを使用した：注入量は1μlで、70℃のPTVで100：1分割し、120℃min-1で300℃まで加熱；カラム： 長さ20m、内径0.18mm、膜厚0.18μmのZebron ZB-SemiVolatiles、初期ヘリウム流量1.2ml min-1で、16分後に2.4ml min-1に増加した。オーブン温度プログラム： 50 ℃（5分）、その後20 ℃ min-1で270 ℃、40 ℃ min-1で300 ℃（5分）まで昇温。EI源：250℃、70eV電子エネルギー、35μAエミッション、溶媒遅延3分。質量範囲55～650amu、取得速度5スペクトル/秒、取得時間200ms/スペクトル。クアッド温度150℃、N2コリジョンフロー1.5 ml min-1、Aux-2温度280 °C。
アラニン、クエン酸、フマル酸、グルタミン酸、グリシン、乳酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシ酪酸、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、コレステロール、フルクトース、グルタミンを用いて検量線を作成した、 インドール-3-プロピオン酸、イソロイシン、ロイシン、プロリン、コハク酸、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸、アラキドン酸、グリセロール-3-リン酸、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、セリンおよびスレオニンSigma-Aldrichから濃度範囲0.で購入。 1-80μg ml-1である。各サンプルのアリコートを採取し、プールして、社内プール血清サンプルであるNational Institute of Standards and Technology (NIST) CRM1950血清サンプルとともに、品質管理サンプルとして使用した。濃度の相対標準偏差は、プールされた品質管理サンプルで平均16％、NISTサンプルで10％であった。
血清胆汁酸および血清半極性代謝産物の分析
サンプル調製手順は、以前に説明したように実施した78。プレートを450 μlのアセトニトリルで前処理した後、100 μlのサンプルと10 μlのポリフルオロアルキル物質（PFAS）と胆汁酸（BAs）の内部標準混合物（それぞれ200 ng ml-1と1000 ng ml-1）を添加しました。その後、1%ギ酸を含むアセトニトリル450μlを各ウェルに加え、10″真空マニホールドを使用してサンプルを抽出した。溶出液を窒素ガスフロー下で蒸発乾固し、80μlのMeOH/2mM水性エタン酸アンモニウムに再沈殿させた。
クロマトグラフィー分離は、C18プレカラム（Waters）を装着したAcquity UPLC BEH C18カラム（内径100 mm×2.1 mm、粒径1.7 µm）を用いて行った。移動相AはH2O：MeOH（v/v 70：30）、移動相BはMeOHからなり、両相ともイオン化剤として2mM酢酸アンモニウムを含む。流速は0.4ml min-1に設定し、溶出勾配は次のようにした： 0-1.5分、移動相Bを5%から30%に増加、1.5-4.5分、移動相Bを70%に増加、4.5-7.5分、移動相Bを100%に増加、5.5分間保持した。ポストタイム5分で、次の分析のための初期条件に戻した。1サンプルあたりの総実行時間は18分であった。デュアルエレクトロスプレーイオン化源の設定は、キャピラリー電圧4.5kV、ノズル電圧1,500V、ネブライザー内のN2圧力21psi、シースガスとしてのN2流量と温度はそれぞれ11l min-1と379℃であった。質量分析（MS）スキャンで正確なマススペクトルを得るため、マイナスイオンモードでm/z範囲を100〜1,700に設定した。すべてのデータ取得には、MassHunter B.06.01 ソフトウェア (Agilent) を使用しました。
化合物の同定は、MS（およびリテンションタイム）、タンデム質量分析情報を用いた社内スペクトルライブラリで行いました。定量は、ネイティブ化合物をスパイクしたマトリックスマッチの検量線に基づいて行われました。検量線は、BAsについて0〜1,600 ng ml-1の範囲の濃度から構成されていた。BAsの相対標準偏差は、品質管理サンプルで平均17.8%、NISTサンプルで19.4%でした。
動物実験
動物プロトコルは、デンマーク・コペンハーゲン首都圏の科学倫理委員会の承認を得ている。雌の無菌スイス・ウェブスターマウスを繁殖させ、コペンハーゲン大学実験医学部で実験開始までフレキシブルフィルムのgnotobioticアイソレーターで維持した。マウスは、12時間明暗サイクル（午前7時30分点灯）、温度（21〜22℃）と湿度（55±5％）を一定にした状態で、オートクレーブドチャウ食（単糖7%、脂肪3%、多糖類50%、タンパク質15%（w/w）、エネルギー 3.5 kcal g-1 ）と水を自由摂取させました。
症例と対照の代表であるAN患者3人（女性20歳、22歳、20年、BMIがそれぞれ10.3、11.5、11.7 kg m-2）およびHC3人（女性20歳、22歳、21年、BMIがそれぞれ22.6、21.1、21.2 kg m-2） からランダムに選んだ部分集合から糞便試料を用いて6週齢雌GF子実体にコロナリングした。簡単に説明すると、250mgの糞便サンプルを、20%グリセロールで希釈したLYBHI培地（還元剤として0.05%システインと0.2%ヘミンを添加）5ml（糞便の20ml g-1）に嫌気性クライオバイアルで懸濁し、これらの接種サンプルを5分間ボルテックスし、その後5分間放置して粒子を沈澱させた。その後、糞便スラリーを1mlクライオバイアルに移し、直ちに-80℃で凍結した。日目に、マウスの両グループをオートクレーブ処理した個別換気ケージに収容し、そこで糞便スラリーの最初の投与量（200μl）を受けた。その後、マウスにオートクレーブ処理したチョウ飼料と水を2日間自由摂取させ、摂餌量を記録した。3日目に、マウスに、前回と同じマッチしたANおよびHCドナーからの糞便物質の2回目の投与を行った。その後、両群のマウスを単独飼育し、30％エネルギー制限オートクレーブドチャウ食（与える餌の量は各マウスの自力摂取量の70％とした）を3週間与え、水は自由摂取させた。食欲不振移植マウス（AN-T）および正常対照移植マウス（HC-T）は、エネルギー制限食開始後5日ごとに体重を測定した。
試験終了後、マウスをイソフルランで麻酔し、大静脈からの血液をEDTAを含むチューブに採取した。血液サンプルは4℃で4,032gで6分間遠心分離された。血漿を分離し、その後の生化学的試験のために-80℃で保存した。各マウスの鼠径皮下白色脂肪組織、盲腸および視床下部を正確に解剖し、定量的PCR分析のために収集した。本研究から除外された動物やデータポイントはない。
Trizol試薬（Invitrogen）を用いて、製造者の指示に従って組織から全RNAを抽出し、その後、濃度を測定した。1μgのRNAを、Reverse Transcription System（Promega）を用いて、相補的なDNAに転写した。リアルタイムPCRは、LC480検出システム（Roche Diagnostics）およびSYBR Green I Supermix（Takara）を用いて実施した。すべてのqPCRは、95℃で10分間、その後95℃で0.01秒、60℃で20秒のサイクルを45回繰り返すサーマルサイクルで実行された。データは、脂肪組織のハウスキーピングRpl36遺伝子および視床下部のRplp0遺伝子79に対して正規化し、デルタデルタCT法に従って分析した。本研究で使用したオリゴヌクレオチドの配列は、補足表8に記載した。
マウス実験におけるDNA抽出、16S rRNAの塩基配列決定およびデータ解析
微生物DNAは、NucleoSpin soil mini kit（MACHEREY-NAGEL）を用いて、ヒトドナーおよびマウスレシピエントの便サンプル（〜250 mg）から分離・精製した。次に、Phusion High-Fidelity PCRマスターミックス（New England Biolabs）を用いて、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を標的とするPCRによりDNAを増幅した（プライマー配列は補足表8に記載）。以下のPCRプログラムを使用した： 98℃、30秒、25×（98℃、10秒、55℃、20秒、72℃、20秒）、72℃、5分。増幅は、生成物をアガロースゲルにかけることで確認した。イルミナNexteraキットを使用し、以下のPCRプログラムで、その後のPCRでインデックスを付加した： 98 ℃ 30秒、8×（98 ℃ 10秒、55 ℃ 20秒、72 ℃ 20秒）、72 ℃ 5分。インデックスの付着は、生成物をアガロースゲルにかけることで確認した。ネステッドPCRからの産物をバンド強度に基づいてプールし、得られたライブラリーを磁気ビーズで洗浄した。プールされたライブラリーのDNA濃度は、蛍光法で測定された。配列決定は、イルミナMiSeqデスクトップシーケンサーで、MiSeq試薬キットV3（イルミナ）を用いて2×300bpペアエンドシーケンスで行った。ペアエンドリードはその後、DADA2（v1.16.0）パイプライン80を用いてトリミング、マージ、解析された。
統計解析
本研究では、統計解析前に除外されたデータはない。本研究は観察研究であるため、割り付けや無作為化は含まれていない。本研究では、拒食症患者および健常者の利用可能なすべてのサンプル（n = 147）が含まれています。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、本研究のサンプルサイズは、過去の論文で報告されたものと同様である43,81. サンプルは、メタゲノミクスとメタボロミクスのバッチにランダムに分配されました。メタゲノム解析、生化学解析、メタボロミクス解析のデータ収集中、研究者はグループ分けを盲検化した。ヒトサンプルの解析はすべてR（v4.1.2）を用いて行われた。動物実験の遺伝子発現解析および体重比較は、GraphPad Prism（v9.3.0）を使用して実施した。
(1)
差分解析
RパッケージmetadeconfoundR（v0.1.8；https://github.com/TillBirkner/ metadeconfoundRまたはhttps://doi.org/10.5281/zenodo.4721078参照）に実装されているmetadeconfoundRパイプラインを用いて差分解析を実施し、マイクロバイオームまたはメタボローム解析においてANとHC参加者の間で観察された差が、年齢、BMI、喫煙、投薬などの共変量によってどの程度交絡されているかを評価しました。このパイプラインは、まず単変量統計を使ってマイクロバイオームの特徴と病気の状態との関連を見つけ、次に入れ子線形モデル比較ポストホックテストで潜在的な共変量の交絡効果をチェックし、最後に状態ラベルを返します。
(2)
アソシエーション解析
AN群におけるオミックス機能と食行動・心理特性との関連・媒介分析については、まずシャピロ・ウィルク正規性検定で連続変数の正規性を確認したところ、ほとんどの変数が正規分布していないことがわかった。そこで、関連性分析の前に、経験的正規分位変換を用いて連続変数を標準化し、標準正規分布（N〜（0，1））に従わせた。そして、交絡因子を共変量として加えた以下の式を用いて、オミックス機能と食行動および心理的特徴との関連を評価するために、線形回帰モデルを実装した。
begin{array}{l}{{mathrm{Eating}},{mathrm{behavior}}。– {\mathrm{and}},{\mathrm{psychological}},{\mathrm{traits}}\sim {\mathrm{omics}},{\mathrm{features}} \ Ъ ( {mathrm{for}}, {mathm{example,}}, {mathrm{metabolite/msp/SV}}) Ъ + {mathrm{Age}}. + {mathrm{BMI}}。+ {mathrm{Smoking}}。+ {mathrm{Medication}}end{array}$$.
薬物療法では、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、抗精神病薬、ベンゾジアゼピン系薬剤を使用しました。
(3)
オミックス機能と宿主代謝特性との関連解析では、線形回帰分析の前に、正規性チェックとデータの標準化も実施した。線形回帰モデルでは、BMIを除く上記の交絡因子を共変数として含めたが、BMIはAN患者においてHC患者と比較して極端に低いことが最も顕著な表現型の変化であるためである。
$$\begin{array}{l}{\mathrm{Metabolic}},{\mathrm{traits}}( {\mathrm{for}},{\mathrm{example,}}, {\mathrm{BMI/plasma}},{\mathrm{glucose}} ) \sim { {mathrm{omics}},{mathrm{features}} ( {mathrm{for}},{mathrm{example,}}, {mathrm{metabolite/msp/SV}}) + {mathrm{Age}} . + {mathrm{Smoking}}。+ {mathrm{Medication}}end{array}$$.
ANとHCの腸内微生物の多様性（遺伝子リッチ、種数、分類学的組成）の差はWilcoxon検定で算出し、複数群間の差の有意性の評価にはKruskal-Wallis検定が用いられた。特に断りのない限り、すべてのP値はBenjamini-Hochberg法を用いて補正し、Padj < 0.05を統計的に有意とみなした。
報告書の要約
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」にてご確認いただけます。
出典リンク
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食事、微生物叢、メンタルヘルスとの関連性を研究者が確認
2023年3月10日
"医療ニュース "で
腸内細菌叢、アルツハイマー病、中枢神経系
2023年4月10日
"医療ニュース "で
幼少期の腸内細菌異常は大腸炎を悪化させる
2023年4月13日
"医療ニュース "で
前の記事より多くの人が腸の病気を隠している可能性があります。
次の記事表現型に合わせた生活習慣への介入は、肥満成人において有望な体重減少効果を示す
メディコであること
https://news.beingmedicos.com
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