低温は長寿を延ばし、PA28γ誘導プロテアソームを通して疾患関連タンパク質の凝集を防ぐ
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掲載：2023年4月3日
低温は長寿を延ばし、PA28γ誘導プロテアソームを通して疾患関連タンパク質の凝集を防ぐ
https://www.nature.com/articles/s43587-023-00383-4
ヒョンジュ・リー、ハフィザ・アリルザエワ、...デイヴィッド・ヴィルチェス 著者一覧を見る
Nature Aging 3巻 546-566ページ (2023)この記事を引用する
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要旨
加齢は、タンパク質の凝集を伴う神経変性疾患の主要な危険因子である。体温を低下させることは、恒温動物でも恒温動物でも寿命を延ばす最も効果的なメカニズムの一つであるため、寒冷による変化をよりよく理解することは、病的なタンパク質凝集の修飾因子を収束させることにつながる。ここで我々は、線虫の低温（15℃）が、ヒトPA28γ/PSME3の線虫オルソログであるPSME-3を通して、プロテアソームのトリプシン様活性を選択的に誘導することを発見した。このプロテアソーム活性化因子は寒冷誘導性長寿に必要であり、加齢に伴うタンパク質分解の欠損を改善する。さらに、寒冷誘導されたPA28γ/PSME-3は、ハンチントン病や筋萎縮性側索硬化症などの加齢関連疾患の線虫モデルにおいて、タンパク質の凝集を減少させる。注目すべきことに、ヒト細胞を適度な低温（36℃）にさらすと、PA28γ/PSME3を介してトリプシン様活性も活性化され、疾患に関連したタンパク質の凝集や神経変性が抑制される。これらの知見を総合すると、進化的な境界を越えた低温の有益な役割が明らかになり、複数の疾患の予防につながる可能性がある。
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メイン
極端な低温は有害であるが、適度な体温低下は生物にとって有益な効果をもたらす1。実際、線虫2,3,4、キイロショウジョウバエ5、魚類6,7などの恒温動物でも、げっ歯類8などの恒温動物でも、体温を下げると寿命が延びる。例えば、線虫は標準的な温度（20℃）から高温に移行すると寿命が短くなるが、低温（15℃）に暴露すると寿命が著しく延長する9,10,11,12。げっ歯類を高温の環境温度にさらすと、体温が0.5℃高くなり、寿命が短くなる13,14。対照的に、マウスでは体温を0.5℃下げると寿命が延び、長寿における体温低下の役割が保存されていることを裏付けている8。体温と寿命の相関はヒトでも報告されている15,16,17。ヒトの正常体温は36.5～37℃である18。体温が35℃以下に急低下すると低体温症になるが、ヒトの体温は日中わずかに変化し、睡眠中にも中程度の低温（36℃）に達する19。興味深いことに、産業革命以降、ヒトの体温は10年ごとに0.03℃ずつ単調に低下しており、過去160年間におけるヒトの長寿化の進行と関連する可能性がある15。
低温による長寿効果は100年以上前に報告されているが20、低温が寿命や健康にどのように影響するかについてはほとんど知られていない。従来の見解では、低温による長寿は、化学反応や代謝の速度が低下し、エネルギー消費や生活ペースが遅くなることに起因すると考えられていた21。しかし、線虫における蓄積された証拠から、寒冷による長寿は、化学反応の受動的変化だけでは説明できない制御されたプロセスであることが明らかになっている9,11,22。例えば、寒冷感受性チャネルTRPA-1は、神経系や腸などの非感作性組織で低温を検知し、線虫の寿命延長に積極的に関与している11,12。さらに、低温は線虫において、シャペロニンTRiC/CCTやコシャペロンDAF-41/p23など、タンパク質の恒常性（プロテオスタシス）や細胞機能を維持する分子シャペロンを誘導する（文献9,23）。
加齢は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）24,25など、タンパク質の凝集に関連する神経変性疾患の主要な危険因子である。ここでわれわれは、寒冷誘導作用の理解を深めることで、病的タンパク質凝集を収束的に修飾する因子が発見され、複数の疾患の予防につながる治療的意義があるのではないかと考えている。この目的のために、低温が細胞の機能と生存性を決定するプロテアソーム活性に影響を及ぼすかどうかを調べた25。プロテアソームは、疾患関連変異タンパク質を含む、凝集しやすい不要なタンパク質、損傷タンパク質、ミスフォールドタンパク質を分解することで、老化や病的状態を防ぐことができる24,26。プロテアソームの構造は、真核生物間で高度に保存されている27,28。プロテアソームコア（20S）には、切断特異性の異なる3つの触媒サブユニット（β1、β2、β5）があり、それぞれカスパーゼ様活性（酸性アミノ酸後の加水分解）、トリプシン様活性（塩基性アミノ酸後の加水分解）、キモトリプシン様活性（疎水性アミノ酸後の切断）を示す29。タンパク質分解部位の活性化は、20Sが制御粒子と会合することで起こる25,28。主要な制御複合体は19Sで、複数の異なるサブユニットから構成されている。20Sが19S制御複合体と会合することで、活性型26Sプロテアソームが形成され、ユビキチンでタグ付けされたタンパク質を認識して分解する。19S複合体に加えて、20SはPA200/PSME4やPA28（11Sとしても知られる）30などの他の制御粒子によっても活性化される。PA28は、免疫系に特徴的な28kDaタンパク質（PA28α/PSME1、PA28β/PSME2）のヘテロ七量体リングか、生物全体に発現するPA28γ/PSME3サブユニットのホモ七量体リングによって形成される30,31,32。19Sとは対照的に、PA28γはユビキチン非依存的にタンパク質の分解を促進する31。PA28γ活性化プロテアソームの機能や基質については、26Sプロテアソームよりも理解が進んでいないが、その活性と進化的保存から、生物学的に重要な役割を担っていることが示唆されている30,31,32。
ここで我々は、PA28γ/PSME3のワムシオルソログが寒冷誘導性長寿に必要であり、26Sプロテアソームによるタンパク質分解の加齢性欠損を減弱させることを発見した。さらに、寒冷誘導されたPA28γは、ハンチントン病やALSの線虫モデルにおける疾患関連タンパク質の凝集を防ぐ。注目すべきことに、培養ヒト細胞においても、適度な温度低下（36℃）により、PA28γ/PSME3を介したトリプシン様プロテアソーム活性が誘発され、疾患関連の変化が緩和された。これらの結果は、プロテアソーム制御における低温の進化的に保存された効果を示しており、老化や加齢に関連した疾患への影響を示唆している。
研究結果
寒冷誘導性PA28γ/PSME-3はトリプシン様活性を誘発する
線虫を発生後に低温（15℃）にさらすと寿命延長が誘導されることから9,12、低温が成体期のプロテアソーム活性に影響を与えるかどうかを検討した。子孫の発生を防ぐため、発生時に制限温度（25℃）で飼育すると不妊になるfer-15(b26);fem-1(hc17)変異ワームを用いた9,33。野生型と同様に、発育後の低温も対照不妊虫の寿命を延ばす9。そこで、対照不妊虫を成虫1日目まで25℃で飼育し、その後異なる温度に移した。成虫6日目に、低温（15℃）では20℃や25℃に比べてトリプシン様プロテアソーム活性が劇的に上昇した（図1a）。しかし、対照の無菌成虫は、どの温度でもカスパーゼ様プロテアソーム活性とキモトリプシン様プロテアソーム活性が同程度であった（図1b,c）。トリプシン様活性に対する低温誘発の影響は、不稔性とは無関係であった。野生型ワムシもまた、成虫期に20℃から15℃にシフトすると、同様の増加を示したからである（図1d）。一方、カスパーゼ様活性とキモトリプシン様活性は、それぞれ野生型では低温下でも同程度か減少した（図1e,f）。
図1：線虫において低温はPA28γ/PSME-3を介して選択的にトリプシン様プロテアソーム活性を誘導する。
図1
a-c, 成虫期6日目の線虫fer-15(b26);fem-1(hc17)におけるトリプシン様プロテアソーム活性、カスパーゼ様プロテアソーム活性、キモトリプシン様プロテアソーム活性（平均値±平均値の標準誤差（s.e.m.））。d-f, 成虫6日目の野生型ワムシにおけるトリプシン様(d)、カスパーゼ様(e)、キモトリプシン様(f)プロテアソーム活性（20℃に対する相対勾配の平均±s.e.m.、n = 5独立実験）。 g, 成虫6日目の対照無菌ワムシにおけるPA28γ/PSME-3、19S RPN-6.1、20S α6/PAS-6のウェスタンブロット。グラフは、プロテアソームサブユニットの25℃に対する相対パーセンテージ値（α-チューブリンローディングコントロールで補正）を表す（平均±s.e.m.、 h, 成虫6日目の対照不妊虫におけるmRNAレベル（20℃に対する相対発現の平均値±s.e.m.、n = 4つの独立した実験）。 i, 成虫1日目に開始したpsme-3 RNAiの成虫6日目の対照不妊虫におけるノックダウンレベル（20℃ベクターRNAiに対する相対発現の平均値±s.e.m.、n = 4つの独立した実験）。k, psme-3の体細胞過剰発現（OE）は15℃で成虫のトリプシン様活性を増加させる（コントロールGFP(OE)に対する平均±s.e.m.の相対勾配、n = 4独立実験）。2つの独立したpsme-3,GFP(OE)系統を試験した。 l, psme-3の過剰発現は20℃でトリプシン様活性を増加させない（コントロールGFP(OE)に対する平均±s.e.m.の相対的傾き、n = 4独立した実験） m, psme-3の過剰発現は25℃でトリプシン様活性を増加させる（コントロールGFP(OE)に対する平均±s.e.m.の相対的傾き、n = 4独立した実験）。対照の無菌ミミズは、発育中は25℃で飼育し、その後成虫6日目まで指示した温度で生育させた。野生型およびpsme-3,GFP(OE)ワームは発育中20℃で飼育し、その後成虫6日目まで示した温度で飼育した。統計的比較は、一対標本に対する両側Studentのt検定によって行った。P値： P値：*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, NS, 有意ではない（P > 0.05）。すべての有意な変化は、偽発見率（FDR）アプローチによる多重検定の補正後でも有意であった（FDR補正後のP値（q値）＜0.05を有意とみなした）。出典データは正確なP値とq値を含む。
ソースデータ
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低温がプロテアソームサブユニットのレベルを変化させるかどうかを評価するために、入手可能な定量プロテオミクスデータを用いた9。トリプシン様活性を持つβ2/PBS-2を含め、成虫を低温（15℃）と標準温度（20℃）で比較した結果、20Sサブユニットに大きな違いは見られなかった（Extended Data Fig.） さらにプロテオーム解析では、19Sサブユニットには有意な変化は検出されなかった。PA28サブユニットのうち、線虫はヒトPA28γ/PSME3のオルソログであるpsme-3のみを発現している（参考文献34,35）。注目すべきことに、定量的プロテオミクスにより、低温でPSME-3のレベルが増加することが明らかになった（Extended Data Fig.） ウェスタンブロットにより、ワムシは20℃や25℃と比較して、15℃でより高いレベルのPSME-3を示すことが確認された（図1g）。PSME-3タンパク質レベルの増加は、低温でのmRNA量のアップレギュレーションと相関していた（図1h）。PA28γ/PSME3はin vitroで選択的にトリプシン様活性を活性化することから31,36、PSME-3が15℃におけるトリプシン様活性の上昇に必要であるかどうかを検討した。実際、発生後にPSME-3をノックダウンすると、低温でのトリプシン様活性は低下したが、標準温度では低下しなかった（Extended Data Fig.）
低温は寿命を延ばすので、6日目の成体で観察された変化は、PSME-3の直接的な影響ではなく、老化速度の違いから生じたものである可能性も捨てきれない。これらの可能性を区別するために、より若い年齢（つまり成虫になって3日目）のワムシを調べた。重要なことに、発育後の低温は、対照の無菌動物と野生型動物の両方で、成虫3日目にトリプシン様活性を誘導するのに十分であった（Extended Data Fig.） 6日目の成虫と同様に、psme-3のノックダウンは3日目の成虫における低温誘導トリプシン様活性を特異的にブロックしたが、20℃では効果がなかった（Extended Data Fig.） より若い年齢を評価するため、発生期に低温とRNAi処理を開始し、成体1日目でプロテアソーム活性を評価した。実際、成虫1日目のトリプシン様活性は、年齢をマッチさせた20℃のワムシと比較して、15℃でより高いレベルを示した（Extended Data Fig.） 発生過程でpsme-3をノックダウンすると、1日目成虫の20℃での基礎トリプシン様活性はわずかに低下したが、その阻害効果は低温ではるかに強かった（Extended Data Fig.） 従って、これらのデータは、トリプシン様プロテアソーム活性のアップレギュレーションにおける低温誘導PSME-3の直接的効果を支持するものである。
この線に沿って、psme-3の過剰発現は15℃でトリプシン様活性をさらに上昇させるのに十分であった（図1k）。対照的に、psme-3の過剰発現は20℃ではトリプシン様活性を誘導しなかった（図1l）。このことは、PSME-3の機能には、低温で起こる他の因子による活性化が必要であることを示唆している。さらに、ミミズは20℃でPSME-3を不活性化するメカニズムも持っている可能性がある。しかし、ミミズはマイルドな熱ストレスを与えると過剰発現したPSME-3を阻害せず、その結果、25℃でトリプシン様活性が顕著に上昇した（図1m）。以上のことから、線虫の低温で誘導される高レベルのトリプシン様活性には、PA28γ/PSME-3の機能上昇が関与していることがわかった。一方、PSME-3の過剰発現は、標準温度ではなく、暖かい温度でもトリプシン様プロテアソーム活性を促進することがわかった。
TRPA-1は低温で誘導されるトリプシン様活性に必要である
線虫では、低温によって低温感受性チャネルTRPA-1が活性化され、寿命延長が促進される11,12。われわれは、trpa-1を欠損した変異型ワムシは、成虫になって3日目または6日目の低温で、野生型と比較してトリプシン様活性が低いことを見いだした（図2aおよびExtended Data Fig.） 対照的に、trpa-1の欠損は標準温度での基礎トリプシン様活性を低下させなかった（Extended Data Fig.） さらに、trpa-1の欠損は15℃における異なるプロテアソーム活性に影響を与えなかったことから、TRPA-1チャネルの活性化が低温におけるトリプシン様活性の選択的誘導に寄与していることが支持された（Extended Data Fig.） trpa-1の欠損は、psme-3 RNAi処理ワームの15℃における低いトリプシン様活性をさらに低下させなかったことから、これらの結果は、TRPA-1チャネルがPSME-3を介してプロテアソーム活性を調節していることを示している（図2a）。
図2：TRPA-1は低温下において線虫のNHR-49転写因子を介してPSME-3の発現を誘導する。
図2
a, 3日目成虫の野生型およびtrpa-1(ok999)変異体におけるトリプシン様プロテアソーム活性（平均±s.e.m. 15℃ベクターRNAiに対する相対勾配、n = 4独立実験）。 b, 6日目成虫の野生型およびtrpa-1(ok999)変異体におけるPA28γ/PSME-3のウェスタンブロット。グラフは、25℃野生型に対するPSME-3（α-チューブリンローディングコントロールで補正）の相対パーセンテージ値を表す（平均±s.e.m.、n = 3独立実験）。 c, 6日目成虫野生型およびtrpa-1(ok999)変異体ワームにおけるpsme-3 mRNAレベルのqPCR解析。グラフ（25℃野生型に対する相対発現）は7つの独立した実験の平均±s.e.m.を表す。 d, 寒冷誘導性長寿に関与する異なる転写制御因子をノックダウンした6日目の成虫対照不妊虫におけるpsme-3 mRNAレベル。グラフ（20℃ベクターRNAiに対する相対発現）は、9つの独立した実験の平均±s.e.m.を表す。 e, nhr-49のノックダウンは、対照不妊虫における低温誘導トリプシン様プロテアソーム活性を低下させる（20℃ベクターRNAiに対する相対勾配の平均±s.e.m.、n = 3つの独立した実験）。 f, 6日目成虫対照不妊虫におけるpbs-2 mRNAレベル。g, 6日目の野生型およびtrpa-1(ok999)変異体成虫におけるpsme-3 mRNAレベル。グラフ（20℃ベクターRNAiに対する相対発現）は、8つの独立した実験の平均±s.e.m.を表す。すべての実験において、ワムシは成虫の1日目まで20℃で飼育し、その後、成虫の3日目（a）または6日目（b-g）まで示した温度で成長させた。統計的比較は、一対標本に対する両側Studentのt検定によって行った。P値： *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, p > 0.05。すべての有意な変化は、FDRアプローチによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。出典データは正確なP値とq値を含む。
ソースデータ
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実際、trpa-1の欠損は低温でのPSME-3タンパク質レベルのアップレギュレーションを減少させることが観察された（図2b）。同様に、trpa-1の欠損は15℃におけるPSME-3 mRNA量の誘導も減弱させたことから、TRPA-1が転写レベルでPSME-3を調節していることが示唆された（図2c）。低温センサーとして、TRPA-1は単独では転写発現を促進できず、DAF-16/FOXO11のような下流の転写因子の活性化が必要である。しかしながら、DAF-16はpsme-3の発現誘導とトリプシン様活性の誘導には必要ではなかった（図2d,e）。DAF-16以外にも、他の転写因子も寒冷誘導性長寿に関与している3。その中でも、核内受容体daf-1223のノックダウンは、寒冷誘導性のpsme-3レベルを部分的に減少させた（図2d）。しかし、15℃での長寿を促進するもう一つの転写因子である核内ホルモン受容体-49（NHR-49）をノックダウンすると、最も強い抑制効果が見られた22。同様に、NHR-49のコグレギュレーターであるmdt-15/MED15のノックダウンは、15℃でのpsme-3発現のアップレギュレーションを抑制したが、20℃でのpsme-3レベルには影響しなかった（図2d）。続いて、nhr-39を欠損させると、低温で誘導されるトリプシン様プロテアソーム活性が阻害された（図2e）。nhr-49のノックダウンは、触媒プロテアソームサブユニットpbs-2の発現に影響を与えず（図2f）、nhr-49がpsme-3の転写制御を介してトリプシン様活性を誘導することをさらに支持した。注目すべきことに、nhr-49を欠損させても、trpa-1を欠損させた変異虫ではpsme-3の発現はそれ以上低下しなかった（図2g）。したがって、TRPA-1チャネルはNHR-49転写因子を介して低温でpsme-3レベルを誘導する。
PA28γ/PSME-3は低温誘導長寿を促進する
注目すべきことに、発生後のPA28γ/psme-3をノックダウンすると、低温（15℃）で誘導される長寿の表現型は減少したが、20℃でも25℃でも寿命は短縮しなかった（図3a-c）。対照的に、26Sプロテアソームの特異的活性化因子であるrpn-6.1をノックダウンすると33,37、試験したすべての温度で寿命が短くなった（図3d-f）。これらのデータは、26Sプロテアソームがさまざまな温度での生存に必須であること33,38を示し、一方、PA28γ/PSME-3は寒冷による長寿に特に必要であることを示している。
図3：PA28γ/PSME-3は低温における線虫の寿命を延長する。
図3
a, psme-3のノックダウンにより、野生型ワムシの低温誘導寿命（15℃）が短縮した。ベクターRNAiの平均±s.e.m.：28.26日±0.69、psme-3 RNAi：24.19±0.67。 b, psme-3 RNAiは野生型ワームの20℃における寿命を短縮しない。ベクターRNAiの平均±s.e.m.：18.92±0.34、psme-3 RNAi：18.71±0.42。 c, psme-3 RNAiは25℃で野生型ワームの寿命をさらに短縮させない。d, rpn-6.1 RNAiは15℃で野生型ワームの寿命を短縮させた。e, rpn-6.1 RNAiは20℃で野生型ワムシの寿命を短縮した。ベクターRNAi平均±s.e.m.：16.60±0.55、rpn-6.1 RNAi：10.72±0.23。 f, rpn-6.1 RNAiは25℃で野生型ワームの寿命を短縮した。ベクターRNAiの平均±s.e.m.：12.75±0.44、rpn-6.1 RNAi：7.98±0.15。野生型動物（ベクターRNAi平均±s.e.m.：28.83±0.58、psme-3 RNAi：23.03±0.67）または特定の組織でRNAi効率が回復したRNAi欠損動物におけるpsme-3 RNAi処理時の15℃での寿命。生殖細胞系列（ベクターRNAi平均±s.e.m.：28.84±0.68、psme-3 RNAi：23.04±0.58）、神経細胞（ベクターRNAi：26.04±0.67、psme-3 RNAi：22.56±0.59）、神経細胞内におけるpsme-3の組織特異的ノックダウン（KD）。 56±0.59）、腸（ベクターRNAi：26.37±0.62、psme-3 RNAi：22.85±0.62）または筋肉（ベクターRNAi：26.35±1.21、psme-3 RNAi：23.37±1.05）は15℃での寒冷誘導寿命を短縮した。h, sur-5プロモーター下でのpsme-3の体細胞過剰発現は、20℃での寿命をわずかに短縮した。GFP(OE)の平均±s.e.m.：17.19±0.41、psme-3,GFP(OE) #1 ：15.48±0.31、psme-3,GFP(OE) #2 ：16.31±0.31。i, psme-3の体細胞過剰発現は25℃における成体寿命に有害である。GFP(OE)の平均値±s.e.m.：13.83±0.31、psme-3,GFP(OE) #1 ：10.60±0.19、psme-3,GFP(OE) #2 ：10.67±0.19。 j, psme-3の体細胞組織における過剰発現は、15℃で寿命を延長させた。GFP(OE)の平均±s.e.m.：23.26±0.43、psme-3,GFP(OE) #1 ：26.65±0.33、psme-3,GFP(OE) #2 ：26.38±0.31。ワムシは20℃で飼育し、発育後に示した温度に移した。すべての実験において、P値は両側log-rank検定により算出した。NS, P > 0.05）。補足表3は、統計解析と独立した寿命実験の再現データを含む。
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これらの知見に興味を持った我々は、PSME-3がどの組織で生物の寿命を制御しているのかを調べた。TRPA-1は複数の組織で発現しているが、長寿を促進するためには、腸と神経細胞での活性化が特に重要である11。しかし、ニューロンにおけるTRPA-1の活性化は、生殖系列などの遠位組織にもシグナルを送り、生殖老化を遅らせる9。さらに生殖細胞系列は、腸や筋肉などの体組織において、長寿促進遺伝子を誘導する因子を放出する9。寒冷誘導性長寿の細胞非自律的制御におけるpsme-3の重要な役割9によると、生殖細胞系列におけるpsme-3のノックダウンだけで、15℃における寿命が最も強く減少した（図3g）。さらに、神経細胞、腸または筋肉におけるpsme-3の組織特異的ノックダウンも、15℃における寿命を有意に減少させた（図3g）。このように、PSME-3は、寒冷誘導による寿命延長に影響することが知られているすべての組織（生殖細胞、神経細胞、腸、筋肉）において、寿命延長を促進する役割を担っている。これらの組織でPSME-3が発現しているかどうかを評価するために、内在性のPSME-3タンパク質にGFPタグをつけた。その結果、ワムシは標準的な温度でも、組織全体にわたってPSME-3の強固な基礎発現を示すことがわかった（Extended Data Fig.2a）。低温ではPSME-3レベルの中程度の上昇しか誘導されないため（図1g）、レポーター株を用いて15℃でPSME-3が特定の組織で発現上昇するかどうかを評価することはできなかった（拡張データ図2a-c）。しかしながら、PSME-3は生殖細胞や腸だけでなく、筋肉や神経細胞でも発現が高いことが確認された（Extended Data Fig.） 重要なことに、前述の組織でPSME-3を特異的にノックダウンすると、トリプシン様活性が低下した（Extended Data Fig.
次に、体細胞組織におけるPSME-3の過剰発現が、長寿を促進するのに十分であるかどうかを評価した。興味深いことに、PA28γ/PSME-3の過剰発現は、標準温度（20℃）では寿命をわずかに低下させ、より高い温度では強く有害であった（図3h,i）。逆に、PA28γ/psme-3の過剰発現は、15℃で寿命をさらに延長した（図3j）。適度な低温（15℃）は寿命延長に有利であるが、極端な低温（例えば4℃）は線虫にとって有害である39。PA28γ/PSME-3が急性低温ショックに対する抵抗性を付与できるかどうかを調べるため、線虫を極低温（4℃）に12時間暴露した後、20℃に戻した。その結果、PA28γ/PSME-3の過剰発現は、急性低温ショックへの曝露後の生存率を増加させなかった（Extended Data Fig.） 従って、我々のデータは、PA28γ/PSME-3が極端な低温から保護するのではなく、中程度の低温によって誘導される長寿効果に寄与することを示している。しかし、PSME-3の過剰発現は、より高い温度での寿命に悪影響を及ぼす可能性がある。
TRPA-1の活性化が低温誘導性長寿を促進することから、寿命制御におけるPSME-3との機能的関連を評価するためにエピスタシス実験を行った。野生型動物と同様に、psme-3のノックダウンは、標準温度（20℃）およびより高い温度（25℃）において、trpa-1欠損ワームの寿命を短縮しなかった（Extended Data Fig.） 一方、psme-3の欠損は野生型動物の寒冷による長寿命を短縮したが、trpa-1変異体ワームの低温（15℃）での短寿命はそれ以上減少しなかった（Extended Data Fig.） さらに、psme-3の過剰発現もまた、標準温度と温暖温度の両方でtrpa-1変異体の寿命を縮めたが、低温では縮めなかった（Extended Data Fig.） psme-3の過剰発現は、15℃におけるtrpa-1突然変異体ワームの平均寿命をわずかに延長したが、この延長は有意ではなかった（Extended Data Fig.） これらの結果から、TRPA-1はPSME-3の上流で働き、線虫の低温下での寿命延長に必要であることが示唆された。
低温は疾患関連タンパク質の凝集を防ぐ
26Sプロテアソームとは対照的に、PA28γを介した20Sプロテアソームの活性化は、ユビキチン非依存的にタンパク質の分解を誘導する31。線虫では、加齢によってプロテオームを介したユビキチン化が全体的に失われ、26Sプロテアソームによる複数のタンパク質の分解が減少する26。その後、これらの調節不全に陥ったプロテアソーム標的は加齢とともに蓄積し、細胞機能を損なう26。例えば、中間フィラメントであるIFB-2は、加齢とともに26Sプロテアソームによるクリーンアップから逃れ、腸細胞内で凝集するようになる。逆に、成人期にIFB-2をノックダウンすると、加齢動物に特徴的な腸の完全性の低下が遅れ、標準温度での寿命が延びる26。注目すべきことに、野生型成体動物では、加齢に伴うIFB-2の蓄積とそれに続く凝集が、低温によって阻止されることがわかった（Extended Data Fig.4a,b）。しかし、PA28γ/psme-3のノックダウンはIFB-2の分解を減少させ、IFB-2の凝集に対する低温の改善効果を抑制する（Extended Data Fig.） 従って、これらの結果は、低温で誘導されたPA28γ/PSME-3が、加齢に関連したタンパク質分解の欠損を改善できることを示唆している。
In vitroでは、PA28γは、β-カゼインやインスリン様成長因子1（IGF-1）のフォールディングされていない変異体40を含む、構造化されていないタンパク質の分解を優先的に促進する。さらに、in vitroの実験では、PA28γが、ヒトの様々な疾患と関連している、拡大ポリグルタミン反復配列（polyQ）41を含むペプチドの分解を促進することが示された。そこで我々は、寒冷誘導されたPA28γ/PSME-3が、ミスフォールディングや凝集を起こしやすい疾患関連変異タンパク質のレベルを調節するかどうかを調べた。この目的のために、私たちは、神経細胞で拡大ポリQペプチドを特異的に発現する線虫を用いた。タンパク質の凝集と神経毒性は、ポリQペプチドの長さの増加と相関しており、40反復が発症の閾値とされている42,43,44,45。フィルタートラップアッセイでは、対照のpolyQ19ペプチドの凝集はどの温度でも観察されなかった。対照的に、polyQ67発現ワームは標準温度（20℃）で強い凝集表現型を示し、これはマイルドな熱ストレス（25℃）でさらに増加した（図4a）。注目すべきは、低温（15℃）では標準温度に比べてpolyQ67の凝集が抑制されたことであり、これはpolyQ67タンパク質の総量が減少したことと相関している（図4a,b）。対照的に、低温では対照polyQ19のタンパク質量は標準温度と比較して減少しなかった（図4b）。
図4：低温で誘導されたPA28γ/PSME-3は、線虫における展開ポリQ凝集を改善する。
図4
a, 神経細胞でpolyQ67::YFPまたはコントロールのpolyQ19::CFP（抗GFP抗体で検出）を発現する6日目の成虫のフィルタートラップ解析。b,全ポリQ67::YFPおよびポリQ19::CFPレベル（抗GFP抗体により検出）を評価するための6日目成虫のウェスタンブロット。グラフは25℃に対するpolyQ67およびpolyQ19タンパク質レベル（α-チューブリンローディングコントロールで補正）の相対パーセンテージ値（平均±s.e.m.、n = 3独立実験）を表す。 c, psme-3 RNAiによるpolyQ67::YFP凝集のフィルタートラップ。虫は成虫6日目に分析した。d, psme-3 RNAiによるpolyQ67タンパク質総量のウェスタンブロット。グラフは、20℃ベクターRNAiに対するpolyQ67タンパク質レベルの相対割合（α-チューブリンローディングコントロールで補正）を表す（平均±s.e.m.、n = 4独立実験）。e,成虫期3日目における30秒間の突進運動（3つの独立した実験から得られた各条件n = 50匹）。f,筋肉のみでpolyQ40::YFPを発現する線虫のフィルタートラップ解析（抗GFP抗体で検出）。虫は成虫6日目に分析した。g,成虫期3日目の30秒間の突進運動（3つの独立した実験から得られた各条件n = 50匹）。ボックスプロットは25-75パーセンタイル、線は中央値、ひげは最小-最大値を示す。すべての実験において、ワームは発生後、指示された温度でシフトされ、RNAiは成虫の1日目に開始された。統計的比較は、対をなすサンプル（b,d）または対をなしていないサンプル（e,g）について、両側スチューデントのt検定によって行った。P値： *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, p > 0.05）。すべての有意な変化は、FDRアプローチによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。出典データには正確なP値とq値が含まれている。
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PA28γ/psme-3のノックダウンは、polyQ67の低温誘導分解を減少させ、15℃での凝集を増加させた（図4c,d）。神経細胞におけるpolyQ67の凝集は、神経毒性を引き起こし、その結果、疾患様表現型である運動性が損なわれる42,43。その結果、PA28γ/PSME-3を欠損させると、低温での神経細胞性polyQ67発現ワームの運動性が低下するが、対照のpolyQ19ワームには影響がないことがわかった（図4e）。次に、PSME-3が神経細胞における細胞内活性を介して、あるいは他の組織での機能によって引き起こされる細胞非自律的な作用を介して、polyQ67の神経細胞凝集に影響を与えるかどうかを検討した。注目すべきことに、psme-3の神経細胞特異的ノックダウンは、神経細胞におけるpolyQ67タンパク質の凝集を誘導するのに十分であった（Extended Data Fig.） したがって、これらの結果は、PSME-3の細胞内レベルがニューロンにおけるポリQ拡張タンパク質のプロテオスタシスを直接制御できることを示している。psme-3の過剰発現は15℃と25℃の両方でトリプシン様活性を誘導することから（図1k,m）、polyQ67発現ワームにおけるpsme-3過剰発現の効果を評価した。その結果、psme-3の過剰発現は、低温でも高温でも神経細胞polyQ67の総量を減少させることがわかった（Extended Data Fig.） 同時に、psme-3の過剰発現は、凝集したpolyQ67ペプチドの蓄積を減少させ、25℃における運動障害も減少させた（Extended Data Fig.） 低温での凝集したpolyQ67のレベルが低いことを考えると、15℃でpsme-3を過剰発現させても、それ以上の減少は検出できなかった（Extended Data Fig.） それにもかかわらず、psme-3の過剰発現は、15℃における運動性欠損をさらに改善するのに十分であった（Extended Data Fig.） 対照的に、psme-3の過剰発現は、標準温度（図1l）でのプロテアソーム活性に影響を及ぼさないことから、20℃でのpolyQ67のレベル、凝集、神経毒性には影響を及ぼさなかった（Extended Data 図5f-h）。
神経細胞だけでなく、筋肉に特異的にポリQペプチドを発現する線虫においても、低温はポリQレベルと凝集を減少させた（図4fおよびExtended Data図5i）。さらに、PA28γ/psme-3をノックダウンすると、筋肉のポリQペプチドの分解が減少した（Extended Data Fig.） 逆に、psme-3を欠損させると、筋内のポリQ凝集に対する低温の抑制効果が抑制された（図4f）。筋細胞内で拡大したポリQが凝集すると、線虫では細胞内に有害な影響を及ぼし、筋機能と運動性を低下させる46。筋肉内のポリQ凝集体レベルと相関して、低温は協調運動の障害を改善したが、psme-3の欠損はこれらの有益な効果を抑制した（図4g）。従って、低温で誘導されたPA28γ/PSME-3は、異なる組織における膨張ポリQタンパク質の凝集を防ぎ、その病理学的影響を緩和することができる。
膨張したポリQタンパク質に加えて、寒冷誘導PA28γ/PSME-3が他の疾患関連タンパク質の凝集も抑制できるかどうかを検討した。この目的のために、ALSに関連するFUSタンパク質の変異体（FUSP525L）を神経細胞で発現する線虫を調べた47。これらのワームは、タンパク質の凝集や神経変性といったALSの病理学的表現型を再現しており、運動性の低下に反映されている43,47。我々は、低温が変異型FUSタンパク質の総量を減少させ、その結果、20℃や25℃の場合と比較して、疾患に関連した凝集が低下することを見出した（図5a,b）。しかし、PA28γ/psme-3のノックダウンは、変異型FUSの寒冷による分解を減少させ、15℃でFUS凝集体の蓄積を引き起こした（図5c,d）。その後、psme-3をノックダウンすると、ALSに関連した運動障害に対する低温の有益な効果が抑制された（図5e）。変異型FUSに加えて、ALSに関連するTDP-43M331V変異体（凝集しやすいもう一つの変異型タンパク質48）のタンパク質量と凝集も低温によって減少した（図5f,g）。逆に、PA28γ/psme-3のノックダウンは、変異型TDP-43の寒冷による分解を減少させ、15℃での凝集を促進した（図5h,i）。これらのデータを総合すると、線虫モデルにおいて、寒冷誘導性PA28γ/PSME-3が、疾患関連タンパク質の病的凝集を抑制できることが示された。
図5：線虫神経細胞において、寒冷誘導PA28γ/PSME-3がALS関連変異タンパク質の凝集を抑制する。
図5
a, 神経細胞でALS関連FUSP525L変異体を発現している6日目の成虫の抗FUS抗体によるウェスタンブロット。グラフは25℃に対するFUSP525Lタンパク質レベル（α-チューブリンローディングコントロールで補正）の相対的パーセンテージを表す（平均±s.e.m.、n = 3独立実験）。 b, 6日目成虫において低温がFUSP525L凝集を減少させる（抗FUS抗体によるフィルタートラップで検出）。c, 異なる温度でのpsme-3 RNAiによるFUSP525Lレベルのウェスタンブロット。d, 6日目の成虫における psme-3 RNAi による FUSP525L 凝集のフィルタートラップ。e,成虫になって3日目の30秒間の突進運動（3つの独立した実験から得られたn = 50匹）。ボックスプロットは25-75パーセンタイル、線は中央値、ひげは最小-最大値を示す。 f, ALSに関連するTDP-433M331V変異体を神経細胞で発現している6日目の成虫の抗TDP-43抗体によるウェスタンブロット。グラフは25℃に対するTDP-433M331Vタンパク質レベル（α-チューブリンで補正）の相対的パーセンテージを表す（平均±s.e.m.、n = 3つの独立した実験）。 g, 6日目の成虫において低温がTDP-433M331V凝集を減少させる（抗TDP-43抗体を用いたフィルタートラップにより検出）。h,異なる温度でPA28γ/psme-3をノックダウンしたときのTDP-433M331Vレベルのウェスタンブロット。i, 6日目の成虫におけるpsme-3 RNAiによるTDP-433M331V凝集のフィルタートラップ解析。つの独立した実験の代表。すべての実験において、成虫は発育後に指示された温度に移され、RNAiは発育後に開始された。統計的比較は、対になったサンプル（a,c,f,h）または対になっていないサンプル（e）について、両側スチューデントのt検定によって行った。P値： *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001; ns, p > 0.05）。有意な変化は、FDRによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。出典データには正確なP値とq値を含む。
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低温はヒト細胞のPA28γプロテアソームを誘導する
ヒトの身体は、睡眠中に生理的に適度な低温（36℃）に達することができるが、病的な急性の体温低下（35℃以下）は低体温につながる19。適度な冷却がヒト細胞のプロテアソーム活性にも影響を及ぼすかどうかを評価するため、HEK293ヒト細胞を標準温度（37℃）から適度な低温（36℃）に24時間変化させた。線虫と同様に、適度な低温はヒト細胞のトリプシン様活性を増加させたが、プロテアソームの他の2つの活性は同程度であった（図6a-c）。しかし、温度を35℃まで下げると、37℃と比較して、トリプシン様活性だけでなくカスパーゼ様活性も低下した（Extended Data Fig.） 従って、これらの結果は、中程度の低温（36℃）はヒト細胞のトリプシン様活性を選択的に誘導できるが、より低い温度はプロテアソーム活性に全般的に悪影響を及ぼすことを示している。HEK293細胞は内因性レベルのTRPA1を発現していたので（Extended Data Fig. 実際、TRPA1をノックダウンするか、TRPA149,50の選択的アンタゴニストであるHC-030031で処理すると、HEK293細胞において低温で誘導されるトリプシン様活性がブロックされた（Extended Data図6e,fおよび図6d）。
図6：適度な冷却は、ヒト細胞においてトリプシン様プロテアソーム活性を誘導する。
図6
a, 低温（36 °C）で24時間培養したHEK293細胞におけるトリプシン様活性（37 °Cに対する相対勾配の平均±s.e.m., n = 12個の独立した実験）。 b, HEK293細胞におけるカスパーゼ様活性（37 °Cに対する相対勾配の平均±s.e.m., n = 18個の独立した実験）。 c, HEK293細胞におけるキモトリプシン様活性（37 °Cに対する相対勾配の平均±s.e.m., n = 9個の独立した実験）。d, 25 µM HC-030031を24時間作用させたHEK293細胞におけるトリプシン様活性（37 °C＋DMSOビヒクルコントロールに対する平均±s.e.m.、n = 7つの独立した実験）。 e, HEK293細胞におけるプロテアソームサブユニットのmRNAレベル（37 °Cに対する平均±s.e.m.、n = 8つの独立した実験）。 f, HEK293細胞におけるPA28γ/PSME3、19S PSMD11、および20S α6/PSMA1のウェスタンブロット。グラフは、プロテアソームサブユニットの37℃に対する相対的なパーセンテージ値（β-アクチンのローディングコントロールで補正）を表す（平均±s.e.m.、n = 5つの独立した実験）。 g, HEK293細胞のネイティブゲル電気泳動と抗PSME3抗体による免疫ブロッティング。h、PSME3 shRNAを発現するHEK293細胞におけるノックダウンレベル（非標的（NT）shRNAに対する平均±s.e.m.、n = 4つの独立した実験）。 i、PSME3 shRNA-HEK293細胞におけるPSME3タンパク質レベル。β-アクチンローディングコントロール。j,PSME3-shRNA-HEK293細胞におけるトリプシン様活性（37℃NT shRNAに対する平均±s.e.m.、n = 5つの独立した実験）。k,37℃でPSME3を過剰発現（OE）したHEK293細胞におけるPSME3 mRNAレベル（空ベクターに対する平均±s.e.m.、n = 3生物学的複製） l,37℃でPSME3(OE)-HEK293細胞におけるPSME3タンパク質レベル。m,PSME3の過剰発現は、37℃および36℃におけるトリプシン様活性を増加させる（37℃+空ベクターに対する平均±s.e.m.、n = 4つの独立した実験）。すべての実験において、細胞は37℃で培養した後、低温（36℃）に移行させるか、37℃で24時間維持してから解析した。統計的比較は、図6k（無対t検定）を除き、対のサンプルについて両側スチューデントのt検定によって行った。P値： *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, ns, p > 0.05）。すべての有意な変化は、FDRによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。出典データは正確なP値とq値を含む。
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適度な低温（36℃）により、PA28γのヒトオルソログであるPSME3の転写産物およびタンパク質レベルが増加した（図6e,f）。さらに、36℃でプロテアソーム活性化因子11S/PA28γ7複合体へのPSME3サブユニットの集合が増加することがわかった（図6g）。PSME3が適度な低温によって引き起こされるトリプシン様活性のアップレギュレーションに関与しているかどうかをさらに決定するために、安定なPSME3-shRNA発現HEK293株を作製した。これらの細胞は、標準温度でも低温でもPSME3の強固なノックダウンを示した（図6h,i）。驚くべきことに、PSME3の欠損は、中程度の低温で誘導されるトリプシン様活性のアップレギュレーションを阻止したが、標準温度では強い影響を及ぼさなかった（図6j）。さらに、PSME3を過剰発現させると、中程度の低温でトリプシン様活性がさらに上昇した（図6k-m）。線虫とは対照的に、PSME3の過剰発現は37℃でもトリプシン様活性を誘導するのに十分であった（図6k-m）ことから、PSME3はヒト細胞において常温でも貴重な効果を発揮する可能性がある。
PA28γプロテアソームはヒト疾患関連タンパク質を分解する
線虫における低温の有益な影響を考慮し、ヒト細胞においても低温が疾患関連タンパク質の凝集を防ぐかどうかを検討した。この目的のために、ハンチントン病の基礎となる変異タンパク質であるハンチンチン（HTT）を、コントロール（Q23）またはポリQ拡張（Q100）のいずれかで発現するHEK293細胞モデルを作製した51,52。これらの細胞において、変異型Q100-HTTの発現はポリQ凝集体の蓄積をもたらしたが、対照のQ23-HTTは凝集体を形成しなかった（図7a,b）。適度な低温（36℃）は、Q100-HTTタンパク質の量とその凝集を大幅に減少させたが、対照のQ23-HTTレベルには影響を与えなかった（図7a,b）。我々は、TRPA1チャネルのノックダウンまたは阻害のいずれかが、変異型HTTの寒冷誘導分解をブロックするのに十分であり、36℃での凝集につながることを見出した（図7c-f）。同様に、PSME3 を安定にノックダウンした HEK293 細胞は、変異型 HTT の分解を促進する寒冷誘導能を失い、その結果、寒冷および標準温度で同程度のレベルのポリ Q 拡張凝集体が生じた（図 7g,h）。一方、PSME3 を欠損させても、標準温度（37 ℃）における変異型 HTT のタンパク質量と凝集は増加しなかった（図 7g,h）。さらに、PSME3 のノックダウンは、標準温度でも低温でも対照の Q23-HTT レベルに影響を与えなかったことから、低温で誘導される PA28γ/PSME3 が変異型 HTT の分解を優先的に促進することが裏付けられた（図 7g,h）。PSME3 の過剰発現は、常温でもトリプシン様活性を誘導することから、PSME3 レベルを増加させることで、37 ℃での変異型 HTT の凝集が阻害されるかどうかを評価した。実際、PSME3 の過剰発現は、変異型 HTT の分解を促進し、常温での凝集を減少させるのに十分であった（図 7i,j）。変異型 HTT の凝集量は 36 ℃では非常に少なかったため、PSME3 の過剰発現が低温での凝集をさらに減少させるかどうかを解釈することは困難であった（図 7j）。
図7：ヒト細胞におけるpolyQ-expanded変異型ハンチンチンの低温誘導分解。
図7
a, コントロールQ23-HTT-GFPまたは凝集を起こしやすいQ100-HTT-GFPを発現させたHEK293細胞における抗HTT抗体によるウェスタンブロット。グラフ：37℃に対するQ23-HTTまたはQ100-HTTレベルの平均±s.e.m.相対パーセンテージ（β-アクチンローディングコントロールで補正）、n＝5つの独立した実験。 b, Q23-HTT-GFPまたはQ100-HTT-GFPを発現するHEK293細胞の抗GFP抗体によるフィルタートラップ。c, TRPA1 shRNAを導入したQ100-HTT-GFP HEK293細胞における抗HTT抗体によるウェスタンブロット。d, TRPA1 shRNAを用いたQ100-HTT-GFP HEK293細胞の抗GFPによるフィルタートラップ。e, 25 µM HC-030031で処理したQ100-HTT-GFP HEK293細胞の抗HTTによるウェスタンブロット（24時間）。f, 25 µM HC-030031で処理したHEK293細胞（24時間）におけるQ100-HTT-GFP凝集体の抗GFPによるフィルタートラップ。コントロールQ23-HTT-GFPまたはQ100-HTT-GFPをPSME3 shRNAで発現させたHEK293細胞における抗HTT抗体によるウェスタンブロット。グラフ：対応する37℃＋NT shRNAに対するQ23-HTT（n＝4）またはQ100-HTT（n＝5）レベルの平均±s.e.m.相対パーセンテージ（β-アクチンで補正）。 h, PSME3 shRNAでQ23-HTT-GFPまたはQ100-HTT-GFPを発現するHEK293細胞の抗GFPによるフィルタートラップ。i, Q100-HTT-GFPを発現するPSME3(OE)-HEK293細胞の抗HTTによるウェスタンブロット。j, Q100-HTT-GFP を発現する PSME3(OE)-HEK293 細胞の抗 GFP によるフィルタートラップ。4回の独立した実験の代表。すべての実験において、細胞は37℃で培養した後、低温（36℃）に移すか、37℃で24時間維持してから解析した。比較は対のサンプルについて両側スチューデントのt検定で行った。P値： *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; ns, p > 0.05）。すべての有意な変化は、FDR（q値＜0.05）による多重検定の補正後も有意であった。出典データは正確なP値とq値を含む。
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HETK293ヒト細胞では、ポリQを伸長したHTTの他に、低温でもALS関連変異型FUSP525Lバリアントのレベルと凝集が減少した（図8a,b）。PSME3をノックダウンすると、凝集しやすいFUSP525Lの低温誘導分解が抑制され、その結果、HEK293細胞では低温でFUS凝集体が蓄積した（図8a,b）。対照的に、低温で誘導されたPA28γ/PSME3は、野生型FUSレベルを変化させなかった（図8a,b）。重要なことに、TRPA1のノックダウンまたは薬理学的阻害も、低温での変異型FUSの凝集を誘発した（Extended Data Fig.） TRPA1の阻害は、PSME3ノックダウンHEK293細胞における変異型FUS凝集をそれ以上増加させなかったことから、これらの結果は、低温におけるPSME3の作用におけるTRPA1の役割をさらに裏付けている（拡張データ図7c）。しかしながら、PSME3の過剰発現は、TRPA1の必要性を回避し、37℃でFUSP525Lの分解を促進し、ヒト細胞において常温での変異型FUS凝集体を減少させることができた（図8c,d）。
図8：低温はALS iPSCs由来運動ニューロンの神経変性を防ぐ。
図8
a, 野生型FUS（WT）またはALS関連変異体FUSP525Lを発現させたHEK293細胞における抗FUS抗体によるウェスタンブロット。グラフは、対応する37℃＋ノンターゲッティング（NT）shRNAに対するFUSレベルの相対的パーセンテージ（β-アクチンローディングコントロールで補正）を表す（平均±s.e.m, FUS(WT): n = 3; FUS(P525L): n = 4）。 b, 野生型または変異型FUSを発現するHEK293細胞の抗FUSによるフィルタートラップ。c, 変異型 FUS を発現する PSME3(OE)-HEK293 細胞の抗 FUS によるウェスタンブロット。d, 変異型 FUS(P525L)を発現した PSME3(OE)-HEK293 細胞の抗 FUS によるフィルタートラップ。e、ALS（FUSP525L/P525L）および同系コントロール（FUSWT/WT）iPSC由来運動ニューロンの免疫細胞化学。アポトーシス、ニューロン、核のマーカーとして、それぞれ切断型カスパーゼ-3（赤）、MAP2（緑）、ヘキスト（青）染色を用いた。スケールバー：20μm。グラフは、切断されたカスパーゼ-3陽性細胞／全核の割合を示す（8生物学的複製の平均±s.e.m.、FUS(WT) 37℃： 998 個の全核；FUS(WT) 36℃： 661；FUS(P525L)37℃： 331、FUS(P525L) 36 °C： f, PSME3 shRNAを発現させたALS-iPSCの抗PSME3を用いたウェスタンブロット。g、PSME3ノックダウンALS iPSC由来運動ニューロンにおけるトリプシン様活性（37℃NT shRNAに対する平均±s.e.m.の相対勾配、n = 3独立実験）。 h、抗壊死カスパーゼ-3（赤）、抗MAP2（緑）およびヘキスト（青）を用いたALS iPSC由来運動ニューロンの免疫細胞化学。スケールバー：20μm。グラフは、切断カスパーゼ-3陽性細胞／全核の割合を示す（9生物学的反復の平均±s.e.m.、37℃＋NT shRNA：全核822個、37℃＋psme-3 shRNA：669個、36℃＋NT shRNA：803個、36℃＋psme-3 shRNA：567個）。全ての実験において、細胞は37℃で培養され、その後低温（36℃）に移されるか、解析前に24時間37℃で維持された。ペアサンプル（a,c,g）または非ペアサンプル（e,h）に対する両側スチューデントのt検定。P値： *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, p > 0.05。すべての有意な変化は、FDRによる多重検定の補正後でも有意であった（q値< 0.05）。出典データは正確なP値とq値を含む。
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これらの知見に促されて、我々は低温が疾患に関連した神経変性を改善できるかどうかを検討した。ALSは運動ニューロンの選択的変性によって特徴づけられる53。したがって、患者由来の人工多能性幹細胞（iPSC）から分化した運動ニューロンは、細胞死の表現型が増加する54,55,56,57。実際、重篤なALSに関連するFUSP525L変異58を持つiPSC由来の運動ニューロンは、アイソジェニック対照（FUSWT/WT）と比べてアポトーシス率が上昇していた（図8e）。特に、低温（36℃）はALS運動ニューロンのアポトーシス率の上昇を抑制した（図8e）。これらの効果がPA28γ/PSME3によって媒介されているかどうかを評価するために、安定なPSME3-shRNA ALS-iPSCを作製し、運動ニューロンへと分化させた（図8f）。神経系は他の組織と比較して、PA28γ/PSME3を最も多く発現している32。これと同様に、iPSC由来の運動ニューロンは、標準温度でHEK293細胞よりも高い（3倍以上）トリプシン様活性を示すが、他のプロテアソーム活性は低下していた（Extended Data Fig.） iPSC由来の運動ニューロンは、標準状態ですでにトリプシン様活性の上昇を示したが、低温では、キモトリプシン様活性とカスパーゼ様活性に影響を与えることなく、この特異的活性をさらに上昇させることができた（図8gおよびExtended Data図8d,e）。PA28γ/PSME3をノックダウンすると、標準温度でも低温でも運動ニューロンのトリプシン様活性が低下したが、その低下は低温で有意に強かった（図8g）。このトリプシン様活性の低下と相関して、PSME3をノックダウンすると、ALS運動ニューロンの神経変性表現型における低温の改善効果が低下した（図8h）。これらの結果は、低温がタンパク質の凝集や神経変性といった病的な表現型を防ぐことを示唆しており、このプロセスはPA28γ依存的なトリプシン様活性の誘導によって媒介される。
PA28γは核と細胞質でのタンパク質分解を促進する
プロテアソームは細胞質と核の両方で活性を持つことから59、PA28γ/PSME3がどの細胞内コンパートメントで疾患関連タンパク質の分解を促進するのかを調べた。PA28γ/PSME3は、ヒト細胞株60,61では主に核に存在するが、条件や細胞タイプによっては、PSME3が細胞質でも顕著になることを示す証拠が蓄積されている62,63。実際、細胞内分布は細胞の種類によって異なることがわかった。線虫の生殖細胞や筋肉では、PSME-3はほとんどが核に蓄積していた（Extended Data Fig.） 腸細胞では、PSME-3はほとんどが細胞質に存在したが、核にも検出された。同様に、PSME-3は線虫の神経細胞の細胞体と核の両方に存在したが、神経細胞の伸長部ではPSME-3は検出されなかった（Extended Data Fig.） ヒトiPSC由来運動ニューロンのソーマと核においても、PSME3の同様の分布が観察された（Extended Data図9a）。対照的に、PSME3はHEK293細胞の核にほとんど蓄積していたが、細胞質PSME3もわずかに観察された（拡張データ図9b）。重要なことに、線虫やヒトの細胞では、低温でもPSME3の細胞内分布は変化しなかった（Extended Data図2a-cおよびExtended Data図9b）。
TDP-43とFUSは核と細胞質の間をシャトルするが、ほとんどは核に局在する64,65,66。しかし、TDP-43とFUSの家族性ALS変異は、それらの細胞質局在を増加させる67,68。従って、ALSに関連したFUSP525L変異体は線虫やヒトの細胞では核と細胞質の両方に局在しているが、野生型FUSは基本的に核に局在している44,47,58。従って、ヒト運動ニューロンとHEK293細胞の両方で、変異型FUSP525Lの細胞質局在の増加が観察されたが、変異型FUSの一部は核に留まっていた（Extended Data Fig.） ヒトHEK293細胞では、低温でも変異型FUSP525Lの細胞内分布は変化しないことがわかった（Extended Data Fig.） 同様に、PSME3の細胞内分布も低温では変化せず、その大部分は核内に存在したままであった（Extended Data 図9b）。そこで、低温で誘導されたPSME3が、細胞質または核での分解を誘導することによって変異型FUSの凝集を防ぐかどうかを評価した。この目的のために、核輸出69の阻害剤であるレプトマイシンBでHEK293細胞を処理した。注目すべきことに、6時間のレプトマイシンB処理で、変異型FUSP525Lの核内蓄積を誘導するのに十分であった（Extended Data Fig.） その後、レプトマイシンB処理によって、変異型FUSP525Lタンパク質の低温誘導分解がさらに増加した（Extended Data Fig.） レプトマイシンBは常温（37℃）でもFUSP525Lを核内に蓄積したが、この条件下ではFUSの分解を促進しなかった（Extended Data Fig.） 従って、PSME3は核におけるFUSP525Lの低温誘導分解を優先的に促進し、このプロセスは最終的に変異型FUSの細胞質へのローディングとその後の凝集を減少させる可能性がある。FUSとは対照的に、変異型HTTは主に細胞質70に存在し、レプトマイシンB処理後も細胞質に留まっていた（Extended Data Fig.10c）。同時に、レプトマイシン B は、低温による変異型 HTT の分解をそれ以上増加させなかった（Extended Data 図 10d）。冷温は、レプトマイシン B を処理しなくても HTT の分解を促進するのに十分であったことから（Extended Data 図 10d）、これらのデータは、HEK293 細胞の細胞質に存在する相対的に少量の PSME3 でも HTT を消去できることを示唆している。したがって、寒冷誘導PSME3は、疾患関連タンパク質の主な細胞内局在に依存して、核または細胞質のいずれかで凝集しやすいタンパク質の分解を促進する可能性がある。
考察
線虫のこれまでの研究から、寒冷による長寿は受動的な熱力学的プロセスではなく、寒冷感受性のTRPA-1チャネルを通して低温を感知する能力に依存していることが明らかになった11,12,71。今回我々は、線虫においてTRPA-1が低温（15℃）で特異的にプロテアソーム活性化因子PA28γ/PSME-3の発現を誘導し、長寿に寄与することを発見した。線虫では、温度が〜20℃に下がるとTRPA-1チャネルが開く72。従って、TRPA-1を欠損した変異型ワムシは、野生型ワムシに比べて、15℃でも20℃でも寿命が短く、暖かい温度では寿命が短い11。しかし、PSME-3の発現は15℃でのみ誘導されることがわかった。TRPA-1は15℃でも20℃でも機能するが、ワムシは15℃の方がはるかに長生きする。したがって、TRPA-1は、温度が15℃まで下がると、さらなる寿命延長メカニズムを引き起こす可能性がある。例えば、DAF-16は15℃と20℃の両方でTRPA-1の寿命調節の役割に必要である11。一方、NHR-49のような他の転写因子は15℃でのみ寿命延長に必要である22。これらのことから、PSME-3レベルはNHR-49/TRPA-1の活性化によって上昇するが、DAF-16はこの表現型には必要ないことがわかった。NHR-49がpsme-3の転写を直接制御しているのか、あるいはpsme-3の発現を制御する他の因子を制御することによって間接的に作用しているのかについては、さらなる研究が必要であるが、これらのデータは、TRPA-1が15℃でさらなるメカニズムを活性化することを支持している。さらに、TRPA-1の神経細胞活性化は、低温では生殖細胞の老化を遅らせるが、20℃では遅れない9。一方、生殖細胞は15℃で体細胞適合性を促進するシグナルを放出する9。体細胞内におけるPSME-3の細胞内効果に加えて、生殖細胞系単独でpsme-3をノックダウンすると、低温誘導寿命が最も強く低下することが観察された。PA28γ/PSME-3が寿命延長に必要なのは15℃のみで、20℃では必要ないことから、これらの結果は、TRPA-1の活性化が15℃でより長い寿命を誘導する理由を説明できる可能性がある。
PA28γ活性化プロテアソームの生物学的役割は、19S活性化プロテアソーム（26S）と比べてあまりよく分かっていない。19Sがプロテアソームの3つのタンパク質分解活性を誘導するのに対し、PA28γはトリプシン様活性を優先的に促進する。もう一つの重要な違いは、19S活性化プロテアソームがユビキチン化タンパク質を選択的に認識して分解するのに対し、PA28γはユビキチン非依存的に分解を促進することである31。加齢に伴い、ユビキチンリガーゼや脱ユビキチン化酵素が変化すると、26Sプロテアソームでは分解できない凝集しやすいタンパク質が蓄積するようになる25,26。したがって、PA28γ活性化プロテアソームが、ユビキチン化状態に関係なく標的タンパク質を分解できることは、加齢に伴うこれらのタンパク質の蓄積を防ぐのに有利であると考えられる。この仮説を裏付けるように、寒冷誘導されたPA28γは、加齢に伴うIFB-2の分解不全を抑制した。IFB-2は加齢に伴いユビキチン化されにくくなり、26Sプロテアソームによって分解されるタンパク質である26。線虫の長寿に対する効果だけでなく、寒冷誘導 PA28γ/PSME-3 は、ハンチントン病や ALS のような加齢関連疾患に関与する明確な変異タンパク質の凝集も防ぐ。
PA28γ/PSME3レベルはアップレギュレートされ、寒冷誘導による有益な効果に必要であるが、PSME-3の過剰発現は線虫の標準温度（20℃）でのトリプシン様活性を増加させないことに注意することが重要である。従って、これらのデータは、線虫においてトリプシン様活性を促進するにはPSME-3のアップレギュレーションだけでは不十分であり、PSME-3を活性化するにはさらに寒冷誘導因子が必要であることを示唆している。さらに、線虫は標準温度でPSME-3の活性を阻害するメカニズムも誘導する可能性がある。寒冷および標準温度によって誘導されるPA28γ/PSME-3の活性化因子および/または阻害因子がそれぞれ何であるかを明らかにすることは興味深い。興味深い疑問は、なぜミミズは常温でPSME-3を不活性化するのかということである。PA28γ/PSME-3は低温下で線虫の長寿を誘導するが、psme-3の過剰発現は標準温度（20℃）、特に軽度な熱ストレス（25℃）下では生存率に有害な影響を及ぼす。PA28γはユビキチン非依存的にタンパク質の分解を促進することから、PA28γと19S誘導プロテアソームのバランスが変化すると、ユビキチン化状態に関係なく、異なる制御タンパク質の分解が促進される可能性がある。この特性は、加齢に伴って蓄積する凝集しやすいタンパク質（例えばIFB-2）を減少させるのに有効かもしれないが、他のプロテアソーム標的タンパク質を高レベルに維持することは、20℃や25℃の環境下で若い動物を生存させるのに必要かもしれない。対照的に、低温のような有利な環境では、これらの制御タンパク質の高レベルの要求が回避される可能性がある。われわれは、ワムシが20℃でPSME-3の機能を阻害するのは、標準的な温度下での生存率に対するPSME-3の有害な影響を減らすためであり、その一方で、最終的に蓄積され、高年齢での生物の老化に寄与する凝集しやすいタンパク質を終結させるPSME-3の能力を犠牲にするためではないかと推測している。実際、psme-3を過剰発現させても、標準的な温度ではpolyQ展開タンパク質の凝集は減少しない。対照的に、ミミズは軽度の熱ストレス（25℃）下ではpsme-3過剰発現を不活性化せず、低温と同様のトリプシン様活性の上昇をもたらした。PSME-3の過剰発現は、25℃での野生型ワームの生存に有害な影響を及ぼすが、この温度でのポリQ発現タンパク質の凝集と神経毒性を防ぐ。これらの結果は、温度が15℃以上になると、PSME-3の寿命に対する効果とタンパク質の凝集に対する効果がトレードオフになり、低温によって中和されることを示唆している。
線虫に加え、ヒト細胞でも中程度の低温（36℃）でPA28γ/PSME3が誘導される。注目すべきことに、TRPA1チャネルの阻害は、ヒト細胞のプロテアソーム活性に対する低温の影響をブロックすることから、TRPA1は種を超えてプロテオスタシスに影響を及ぼすことが示唆された。TRPA1の低温誘導活性化は、低温でのヒト細胞のPSME3の機能にも必要であるが、PSME3の過剰発現は、この制限を回避し、常温（37℃）でもトリプシン様活性をアップレギュレートすることができる。線虫とヒト細胞のこのミスマッチの根底にある理由は不明であるが、種間の違いから生じたものであろう。さらに、常温も線虫とヒトでは大きく異なっており（それぞれ20℃と37℃）、このことがPSME3の制御に影響を及ぼしている可能性がある。最後に、線虫では生物レベルでさらなる制御メカニズムが関与している可能性がある。このような臓器間プロセスは脊椎動物では保存されているかもしれないが、培養細胞では失われている。
重要なことは、タンパク質の凝集を減少させるPSME3の寒冷誘導性の役割は、ヒトの細胞でも保存されていることである。このことは、寒冷が加齢に伴うヒトの明確な障害を予防する収束メカニズムになり得ることを示している。PSME3の過剰発現は、37℃でもヒト細胞のトリプシン様プロテアソーム活性を増加させ、疾患に関連した凝集を防ぐのに十分であることから、これらの知見は、PSME3を常温で治療標的とできる可能性を開くものである。しかしながら、常温におけるPSME3の基礎レベルの活性化メカニズムを明らかにし、その治療可能性を理解するためには、さらなる研究が必要である。これらの知見を総合すると、プロテオスタシスを維持するために、進化の境界を越えて低温が有益な役割を果たしていることが明らかになった。
研究方法
線虫
線虫は、OP50大腸菌73を播種した標準的な線虫増殖培地上で、20℃で維持した。実験はすべて雌雄同体のワムシを用いて行った。野生型(N2)、AM141(rmIs133[unc-54p::Q40::黄色蛍光タンパク質(YFP)])、TQ233(trpa-1(ok999)IV)はNIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)の支援を受けているCaenorhabditis Genetics Center (CGC) (University of Minnesota)から提供された。CF512（fer-15(b26)II;fem-1(hc17)IV）はC. Kenyonから提供された。CK423（Psnb-1::TDP-43M337V、myo-2p::dsRED）48およびZM5844（hpIs233[rgef-1p::FUSP525L::GFP]）47は、それぞれB.C. KramerおよびP. St George-Hyslopから提供された。AM23（rmIs298[F25B3.3p::Q19::CFP]）とAM716（rmIs284[F25B3.3p::Q67::YFP]）はR.I.Morimoto42から贈られた。
組織特異的RNAiには、野生型sid-1またはrde-1遺伝子をそれぞれ組織特異的プロモーターでレスキューしたsid-1またはrde-1変異ワームを用いた。DCL569株（生殖細胞特異的RNAi、mkcSi13[sun-1p::rde-1::sun-1 3'UTR + unc-119(+)]II;rde-1(mkc36)V)74, VP303株（腸特異的RNAi、rde-1(ne219)V;kbIs7[nhx-2p:： rde-1 + rol-6(su1006)]）75、WM118（筋肉特異的RNAi、rde-1(ne300)V;neIs9[myo-3p::HA::RDE-1 + rol-6(su1006)]）76、TU3401（神経細胞特異的RNAi、sid-1(pk3321)V;uIs69[pCFJ90(myo-2p::mCherry)+unc-119p::sid-1]）77はCGCから提供された。polyQ67発現ワームの神経細胞特異的ノックダウンには、AM716とTU340143を交配して作製したDVG196株（rmIs284[F25B3.3p::Q67::YFP];sid-1(pk3321)V;uIs69[pCFJ90(myo-2p::mCherry) + unc-119p::sid-1]）を用いた。
DVG7（N2、ocbEx7[sur-5p::psme-3, myo-3p::GFP]）およびDVG8（N2、ocbEx8[sur-5p::psme-3, myo-3p::GFP]）の作製には、70 ng μl-1 pDV060（sur5-p： psme-3）と20 ng μl-1 pPD93_97 (myo3-p::GFP)を含むDNAプラスミド混合物をN2雌雄成体78の生殖腺に注入した。対応する対照DVG9株（N2、ocbEx9[myo3p::GFP]）は、N2ワームに20 ng μl-1 pPD93_9745をマイクロインジェクションして作製した。同じプロトコールに従って、AM716株に前述のプラスミドを注入し、DVG329（rmIs284[F25B3.3p::Q67::YFP]、ocbEx164[sur-5p::psme-3、myo-3p::GFP]）およびDVG330（rmIs284[F25B3.3p::Q67::YFP]、ocbEx165[myo-3p::GFP]）を作製した。同様に、TQ233株を用いてDVG337(trpa-1(ok999)IV, ocbEx275[sur-5p::psme-3, myo-3p::GFP])とDVG338(trpa-1(ok999)IV, ocbEx276[myo-3p::GFP]) を作製した。
編集は、GFPに融合したpsme-3遺伝子を双方向に配列決定することによって確認した（プライマー： プライマー：5′-AAAAGAAAACCAGAACTCAA-3′、5′-TTTCAGCCAACACTTGTCAC-3′、5′-GGAAGCGTTCAACTAGCAGA-3′および5′-AAAGGCAATTTCTCCAGA-3′）。
線虫のRNAi構築物
mdt-15、nhr-49、daf-12およびrpn-6.1 RNAiはVidal RNAiライブラリーから得た。(daf-16 RNAiコンストラクト（pAD43）は、以前の研究79で作製された。psme-3 RNAiコンストラクトを作製するために、Gentra Puregene Tissue Kit（Qiagen）を用いて線虫のgDNAを単離した。ゲノム断片は、psme-3の第2エキソンをカバーし、5'SacIおよび3'XbaI制限部位を含むようにPCR増幅した（プライマー：5′-TAATCGAGCTCTTTTTGCAGAACGGCACCAC-3′および5′-TGTCATCTAGATCGCTATTTCGCTCCAACCT-3′）。次いで、このアンプリコンをTimmons and Fire給餌ベクター（L4440）にクローニングした。得られたpDV059プラスミドを化学的にコンピテントなHT115大腸菌株に形質転換した。すべてのRNAi構築物は、プライマーとして5′-TGTAAAACGACGGCCAGTを用いて配列確認した。
線虫psme-3過剰発現プラスミド
線虫psme-3過剰発現プラスミドを構築するために、Fire LabキットのpPD95.77をSphIとXmaIで消化し、3.6kbのsur-5プロモーターを挿入した。得られたベクターをKpnIとEcoRIで消化し、GFPを切り出し、KpnI、NheI、NotI、XbaI、EcoRIを含むマルチクローニングサイトを挿入した。psme-3は、5′NheIおよび3′NotI制限部位を含むようにcDNAからPCR増幅し、ベクターにクローニングした（プライマー：5′-TTGGCTAGCATGGTCAAGAAGCAAAGTATGCCGG-3′および5′-CAAGCGGCCGCTTAATAAAGATGTTCGGTGTTGG-3′）。
寿命試験
産卵プロトコールによる同調幼虫を飼育し、成虫1日目まで20℃でOP50大腸菌を与えた。雌雄同体のワムシが成虫に達すると、空のベクターまたはRNAiコンストラクトを導入したHT115大腸菌のプレート上で所定の温度（すなわち、15℃、20℃または25℃）に移した。成虫（各条件につきn = 96）は、毎日または1日おきに採点した80。初期個体群から、成虫が消失したもの、培地に潜り込んだもの、「外陰部が突出」したもの、または袋詰めされたものを除外した。
コールドショック生存アッセイ
同調した幼虫を成虫1日目まで20℃で飼育し、OP50大腸菌を与えた。その後、ワムシを新鮮なプレートに移し、4℃で12時間曝露した。
運動性アッセイ
成虫になって3日目に、ワムシをM9緩衝液に移した。30秒間の順応の後、30秒間の体曲げ回数を数えた。体曲げとは、体の中間部で曲がる方向が変わることと定義した42。
ヒト細胞株
HEK293T/17細胞（ATCC, CRL-11268）を0.1%ゼラチンコートしたプレートにプレーティングし、10%ウシ胎児血清（ThermoFisher, 10500064）および1%MEM非必須アミノ酸（ThermoFisher, 11140035）を添加したDMEM（ThermoFisher, 11966025）中で、標準37℃、5%CO2条件下で維持した。アイソジェニックコントロールiPSC（FUSwt/wt）とALS-iPSC（FUSP525L/P525L）は、I. BozzoniとA. Rosa（Sapienza University of Rome）から提供された。両iPSC株は、Lenziら58. 簡単に説明すると、コントロールiPSCはドナー由来で、FUS58に変異がないことを確認した。ALS-iPSCは、TALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）-指向性突然変異誘発58によってコントロールiPSCから作製された。これらの細胞は、重篤なALSに関連するFUS P525L変異をホモ接合体で持っている。iPS細胞は、mTeSR1（Stem Cell Technologies, 85850）を用いて、Geltrex（ThermoFisher, A1413302）上で37℃、5％CO2条件下で維持した。未分化のiPSCコロニーは、2 mg ml-1 ディスパーゼ（Stem Cell Technologies, 07913）を用いて継代し、ガラスピペットでコロニーを掻き取った。全ての細胞株は、少なくとも3週間に1回、マイコプラズマ汚染について検査された。マイコプラズマ汚染は検出されなかった。
運動ニューロンの分化
運動ニューロンは、単層ベースの分化プロトコールに従って、iPSC株から誘導した81。iPSCをGeltrex上にプレーティングし、コンフルエントになるまでmTeSR1培地で培養した。その後、非必須アミノ酸、グルタミン酸（ThermoFisher, 35050038）、B27（ThermoFisher, 12587010）、N2（ThermoFisher, 17502048）を添加したニューロン分化培地（DMEM/F12:Neurobasal 1:1 (ThermoFisher, 11330057 and 21103049)）で分化誘導を開始した。0日目から6日目まで、ニューロン分化培地に1μMのレチノイン酸（Sigma-Aldrich、R2625）、1μMのスムースアゴニスト（Sigma-Aldrich、566661）、0.1μMのLDN-193189（Miltenyi Biotech、130-103-925）、および10μMのSB-431542（Miltenyi Biotech、130-105-336）を添加した。7日目から14日目まで、ニューロン分化培地に1μMのレチノイン酸、1μMのスムースアゴニスト、4μMのSU-5402（Sigma-Aldrich、SML0443）、および5μMのDAPT（Sigma-Aldrich、D5942）を添加した。運動ニューロンを分割し、非必須アミノ酸、グルタミン酸、N2、B27、および神経栄養因子10 ng ml-1 BDNF（Biozol、450-02）および10 ng ml-1 GDNF（Biozol、450-10）を添加したニューロベース培地を含むポリ-L-オルニチン（Sigma-Aldrich、P3655）およびラミニンコート（ThermoFisher、23017015）プレートにプレーティングした。
安定shRNA細胞株の作製
pLKO.1-puroベクター中のレンチウイルス（LV）-非標的shRNA、LV-PSME3 shRNA #1 （TRCN0000290094）、LV-PSME3 shRNA #2 （TRCN0000290025）82、LV-TRPA1 shRNA #1 （TRCN0000434290）、およびLV-TRPA1 shRNA #2 （TRCN0000428619）は、Mission shRNA（Sigma-Aldrich）から入手した。補足表1にshRNA構築物の標的配列を示す。安定なshRNA-HEK293株を樹立するために、HEK293T/17細胞（ATCC、CRL-11268）を5μlの濃縮レンチウイルスで形質導入し、2μg ml-1の濃度でピューロマイシンを添加して選択した。安定なshRNA iPSCs株を作製するため、iPSCを10μM ROCK阻害剤（Abcam、ab120129）を添加したmTesR1培地で1時間インキュベートし、1 unit ml-1 Accutase（ThermoFisher、A1110501）を用いて個体化した。その後、100,000個の細胞をGeltrexコートプレートにプレーティングし、mTesR1培地＋10μM ROCK阻害剤でインキュベートした。翌日、10μM ROCK阻害剤存在下、10μlの濃縮レンチウイルスを細胞に感染させた。iPS細胞は翌日、新鮮な培地で培養し、ウイルスを除去した。その後、2μg ml-1ピューロマイシン（ThermoFisher、A1113803）を用いて2日間、iPS細胞をレンチウイルス組み込み用に選択した。
PSME3過剰発現のためのレンチウイルス構築物を作製するために、ヒトPSME3相補的DNAをPCR増幅し、NheIおよびNotI制限酵素を用いてpCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV cDNA Cloning Lentivector（System Biosciences、CD522A-1）にクローニングした（プライマー： プライマー：5′-GTGCTAGCGGCAGTTTCCGGCGTGAGCGGCG-3′および5′-GTGCGCCGCTTGCAAGGTGGAAGATGAGGAAAC-3′）。構築物の配列を確認した後（プライマー：5′-GGGGTACAGTGCAGGGAAAGAAT-3′および5′-GTGAGGAAGAGTTCTTGCAGC-3′）、高力価レンチウイルスを産生するためにパッケージング細胞にトランスフェクトした。次に、HEK293細胞にPSME3過剰発現レンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシン（2μg ml-1）を添加して選択した。PSME3は、プラスミドの3′HIV LTRに組み込まれたMSCV CpG欠損プロモーター下で過剰発現させた。MSCVはマウス幹細胞ウイルスの5′-LTRプロモーターであり、ヒト細胞で標的遺伝子を持続的に過剰発現させることができる83。さらに、MSCVのCpG変異はヒト細胞での転写抑制を妨げる84。
HEK293T細胞のトランスフェクション
HEK293T細胞が50-60%のコンフルエントに達した時点で、Fugene HD（Promega、E2311）を用いて1μgのpARIS-mCherry-httQ23-GFP、pARIS-mCherry-httQ100-GFP、pcDNA3.1-FUS-HA-WTまたはpcDNA3.1-FUS-HA-P525Lでトランスフェクトした。37℃で24時間インキュベートした後、対応する図に示すように、細胞を37℃で維持するか、36℃に24時間シフトさせた。その後、実験用に細胞を回収した。pARIS-mCherry-httQ23-GFPおよびpARIS-mCherry-httQ100-GFPプラスミドはF. Saudou85から贈られた。FUS-HA-WTおよびFUS-HA-P525LプラスミドはD. Dormann86から贈られた。
プロテアソーム活性
虫をプロテアソーム活性測定用緩衝液（50 mM Tris-HCl、pH 7.5、10%グリセロール、0.5 mM EDTA、5 mM MgCl2、2 mM ATP、1 mMジチオスレイトール）中でPrecellys 24ホモジナイザー（Bertin technologies）を用いて溶解した。ヒト細胞はプロテアソーム活性アッセイバッファーに集め、1mlシリンジに取り付けた27Gの針に10回通して溶解した。線虫とヒトの細胞溶解液を10,000×g、4℃で10分間遠心した。各サンプルについて、総タンパク質25μgを96ウェルマイクロタイタープレート（BD Falcon）に移し、発蛍光プロテアソーム基質とともにインキュベートした。トリプシン様プロテアソーム活性の測定には、Ac-Arg-Leu-Arg-AMC（Enzo, BWL-AW9785-0005）を用いた。キモトリプシン様プロテアソーム活性およびカスパーゼ様プロテアソーム活性には、それぞれZ-Gly-Gly-Leu-AMC（Enzo, BML-ZW8505-0005）およびZ-Leu-Leu-Glu-AMC（Enzo, BWL-ZW9345-0005）を用いた。マイクロプレート蛍光光度計（EnSpire、Perkin Elmer社製）を用いて、蛍光基質（励起380 nm、発光460 nm）のプロテアソーム分解に伴う蛍光蓄積を5分ごとに1時間測定し、経時的な蛍光蓄積の傾きを算出した。独立した反復実験を平均化し、統計解析を行うために、試験条件からの傾きを、同じ反復実験のそれぞれの対照条件に対して正規化した。
ウェスタンブロット
線虫をタンパク質溶解バッファー（50 mM Tris-HCl at pH 7.8, 150 mM NaCl, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA and protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, 11836153001) ）中でPrecellys 24ホモジナイザーを用いて溶解した。ヒト細胞を培養プレートから掻き出し、タンパク質細胞溶解バッファー（10 mM Tris-HCl at pH 7.4, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 10 mM EDTA, 0. 1％SDS、1％Triton X-100に20μg ml-1 Aprotinin、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加したもの）を用いて氷上で10分間インキュベートし、注射針（27ゲージ）でホモジナイズした。その後、ワムシまたはヒト細胞の溶解液を10,000g、10分間、4℃で遠心し、上清を回収した。Pierce BCA protein assay (ThermoScientific, 23225)を用いてタンパク質濃度を測定した。総タンパク質30μgをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に移し、イムノブロッティングに供した。ウェスタンブロット分析は、抗PSME3（Abcam, ab97576 1:1,000）、抗プロテアソーム20S/C2（Abcam, ab3325, 1:5,000）、抗PSMD11（Abcam, ab99413, 1： 1,000）、抗TRPA1（Proteintech, 19124-1-AP, 1:500）、抗α-チューブリン（Sigma-Aldrich, T6199, clone DM1A, 1:5,000）およびβ-アクチン（Abcam, ab8226, clone mAbcam 8226, 1:1,000）抗体を用いた。ウェスタンブロットはImageJソフトウェア（バージョン1.51 s）を用いて定量し、各サンプルはまず対応するローディングコントロール（すなわち、ワームサンプルではα-チューブリン、ヒトサンプルではβ-アクチン）に対して正規化した。次に、各独立した実験について、コントロール条件に対する相対タンパク質レベルのパーセンテージ（ローディングコントロールで補正）を計算した。すべてのウェスタンブロットの非切抜き画像をSource Dataに示す。
11S/PA28γ複合体のブルーネイティブゲル免疫ブロッティング
HEK293細胞を溶解バッファー（50mM Tris-HCl、pH7.5、1mMジチオスレイトール、10%グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテル）に集め、1mlシリンジに取り付けた27ゲージの針に10回通すことで溶解した。溶解液を16,000g、4℃で10分間遠心した後、上清を回収し、タンパク質濃度を測定した。全タンパク質50μgを3-13%ゲル上で、ディープブルーカソードバッファー（50mM Tricine、7.5mM Imidazole、0.02% Coomassie G250）中、4℃、100Vで3時間反応させた。その後、ディープブルーカソードバッファーをわずかにブルーカソードバッファー（50mM Tricine、7.5mM Imidazole、0.002% Coomassie G250）に交換し、100Vで一晩反応させた。セミドライブロッティングにより、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に400mVで3時間転写した。抗PSME3抗体（Abcam, ab97576 1:1,000）を用いてイムノブロット解析を行った。
凝集しやすいタンパク質のフィルタートラップとウェスタンブロット
線虫成虫を M9 バッファーで回収し、液体 N2 で凍結した。凍結したワムシペレットを氷上で融解し、プロテアーゼインヒビターカクテルを添加した非変性溶解バッファー（50 mM Hepes at pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100）中で、氷上でガラスビーズ破砕して抽出物を得た。4℃で5分間、8,000gスピンでワームの残骸を除去した。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイで測定した。100μgのタンパク質抽出物に最終濃度0.5%のSDSを添加し、スロットブロット装置（Bio-Rad）で組み立てたセルロースアセテートメンブレンにロードした。その後、メンブレンを0.2% SDSで洗浄し、IFB-2（Developmental Studies Hybridoma Bank, MH33, 1:1,000）、GFP（AMSBIO, TP401, 1:5,000）、FUS（Abcam, ab154141, clone CL0190, 1:1,000）、TDP43（Abcam, ab225710, 1:1,000）に対する抗体を用いたイムノブロットにより、SDS耐性タンパク質凝集体を評価した。抽出物はまた、抗GFP、抗FUS、抗TDP43、および抗α-チューブリン（Sigma-Aldrich、T6199、1:5,000）を用いたSDS-PAGE/ウェスタンブロットによって分析され、対応するタンパク質の総レベルが定量された。
同様に、HEK293T細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した非変性溶解バッファーで溶解した。細胞溶解液は、27ゲージの針に10回通すことでホモジナイズした。pARIS-mCherry-httQ23-GFPまたはpARIS-mCherry-httQ100-GFPを発現するHEK293T細胞からの溶解物を、4℃で5分間、8,000gで遠心分離した。FUS-HA-WTまたはFUS-HA-P525Lを発現しているHEK293T細胞のライセートを1,000 gで5分間、4℃で遠心した。その後、上清を回収し、BCA protein assayでタンパク質濃度を測定した。100μgのHEK293Tタンパク質抽出物に最終濃度0.5%のSDSを添加し、スロットブロット装置で組み立てたセルロースアセテートメンブレンにロードした。膜を0.2% SDSで洗浄し、抗GFP抗体（AMSBIO、TP401、1:5000）および抗FUS抗体（Abcam、ab154141、1:1,000）を用いた免疫ブロッティングにより凝集体を評価した。タンパク質の総量を定量するために、細胞抽出物を抗HTT（Cell Signaling社、5656、クローンD7F7、1:1,000）、抗FUS（Abcam社、ab154141、1:1,000）、抗β-アクチン（Abcam社、ab8226、1:5,000）を用いたSDS-PAGE/ウェスタンブロットでも分析した。すべてのウェスタンブロットの非切抜き画像をSource Dataに示す。
免疫細胞化学
ニューロンを4%パラホルムアルデヒド/PBSで20分間固定し、その後0.2% Triton X-100/PBSで透過化（10分間）し、3%ウシ血清アルブミン/0.2% Triton X-100/PBSでブロッキング（10分間）した。神経細胞を一次抗体中で室温で1時間インキュベートした（ウサギ抗切断カスパーゼ-3（Cell Signaling社、9661 S、1:400）、マウス抗MAP2（2a + 2b）（Sigma-Aldrich社、M1406、クローンAP-20、1： 500）、ウサギ抗PSME3（Proteintech、14907-1-AP、1:200）、マウス抗FUS（Abcam、ab154141、1:200）、およびマウス抗HAタグ（ThermoFisher、26183、クローン2-2. 2.14, 1:200)). 次に、細胞をPBSで洗浄し、二次抗体（Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG (H + L) (ThermoFisher, A-11029, 1:500), Alexa Fluor 568 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (ThermoFisher, A-21069, 1:500)) およびHoechst 33342 (ThermoFisher, H3570)と共に室温で1時間インキュベートした。細胞をPBSと蒸留水で洗浄し、カバースリップをProLong Diamond Antifade Mountant (ThermoFisher, P36961)にマウントした。
リアルタイム定量PCR
線虫実験では、RNAbee (Tel-Test Inc., CS501-B)を用いて、同期化した6日目の成虫200匹から全RNAを単離した。ヒト細胞サンプルについても、RNAbeeを用いて全RNAを抽出した。次に、qScript Flex cDNA合成キット（Quantabio社製）を用いて単離したRNAからcDNAを作成した。SYBR greenリアルタイム定量PCR（qPCR）アッセイは、CFC384 Real-Time System（Bio-Rad）を用いて、cDNAを1:20に希釈して行った。線虫とヒト細胞のデータは、それぞれcdc-42とY45F10D.4（文献87）、またはハウスキーピング遺伝子としてβ-アクチンとGADPH83の幾何平均値で正規化した。データは、比較2ΔΔCt法を用いて解析した。この方法は、ハウスキーピング遺伝子で補正した後の対照条件に対する遺伝子発現の相対的変化を提供する88。2ΔΔCt法は、qPCRアッセイにおける異なる条件間の相対発現データの比較を可能にする。補足表2にqPCRに使用したプライマーの詳細を示す。
統計と再現性
プロテアソーム活性、タンパク質レベル、mRNAレベルについては、対応する対照条件に対する相対的変化としてデータを示した。独立した実験を平均化するために、各反復実験において同時刻に測定した対応する対照サンプルに対して試験条件を正規化した。従って、プロテアソーム活性、タンパク質レベル、mRNAレベルの変化の統計解析は、対のサンプルについて両側スチューデントのt検定で行った。運動性データについては、各反復実験について正規化することなく、異なる実験間で複数の対照ワームのスラッシング運動を別の条件と比較したため、対にならないサンプルについて両側スチューデントのt検定を用いた。つ以上の統計的比較を含むグラフでは、Benjamini, Krieger and Yekutieli89の2段階ステップアップ法を用いてFDRをコントロールし、多重検定の補正を行った。図では、Studentのt検定から得られたP値によって変化が有意かどうかを示しているが、示された有意な変化はすべて、FDR法による多重検定の補正後でも有意であった（FDR補正後のP値（q値）＜0.05を有意とみなした）。データ分布は正規分布と仮定したが、正式な検定は行わなかった。出典データには、図に示した各統計比較の正確なP値とq値だけでなく、個々のデータポイントが含まれている。前述の統計解析はすべてGraphPad Prism（バージョン9.4.1）を用いて行った。
寿命および低温ショック生存データ解析には、GraphPad Prism（バージョン6.0）を用い、寿命の中央値を決定し、寿命グラフを作成した。平均寿命の決定にはOASISソフトウェア（バージョン1）90を用いた。P値はGraphPad Prism（6.0）を用いて計算した。P値は1回の寿命実験における実験動物および対照動物を指す。各グラフは代表的な実験を示す。補足表3は、各レプリケート寿命実験における総/打ち切りワームの数および統計解析を含む。
サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、我々のサンプルサイズは同じ手順を用いた過去の論文で報告されたものと同様である9,26,44,80,82,91,92。分析から除外された動物やデータポイントはなかった。ワムシと細胞は、すべての実験において、単一のプルから様々なグループに分配された。データ収集は無作為に行わなかった。データ収集と解析は実験条件に対して盲検化されていない。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
著者らは、本研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文およびその補足情報ファイル内で利用可能であることを宣言する。ソースデータは本論文とともに提供される。
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論文
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参考文献ダウンロード
謝辞
本研究はNorn Group（D.V.）およびDeutsche Forschungsgemeinschaft（DFG）のLongevity Impetus Grant（D.V.へのVI742/4-1およびドイツのExcellence Strategy-CECAD、EXC 2030-390661388）の支援を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集・分析、出版決定、原稿作成には関与していない。アレッサンドロ・ローザとI.ボッツォーニには、iPSC株を提供していただいた。
資金提供
Universityität zu Kölnよりオープンアクセスファンドの提供を受けた。
著者情報
著者および所属
統合ストレス応答シグナル研究所、ケルン大学医学部、ケルン、ドイツ
ヒョンジュ・リー、ハフィザ・アリルザエヴァ、セダ・コユンク、ダヴィド・ヴィルチェス
ケルン大学加齢関連疾患細胞ストレス応答エクセレンスクラスター（CECAD）、ケルン、ドイツ
Hyun Ju Lee、Hafiza Alirzayeva、Seda Koyuncu、Amirabbas Rueber、Alireza Noormohammadi & David Vilchez
ケルン大学遺伝学研究所（ドイツ・ケルン
ダヴィッド・ヴィルチェス
ケルン分子医学センター（CMMC）、ケルン大学、ドイツ・ケルン
デヴィッド・ヴィルチェス
貢献
H.J.L.は線虫とHEK293細胞を用いた実験のほとんどを行った。H.A.はiPS細胞由来の神経細胞を用いた実験を行い、その他のアッセイを手伝った。S.K.は、線虫IFB-2およびヒト変異HTTとFUSの凝集をモニターした。A.N.とD.V.は、反復寿命実験の一部を行った。A.R. が線虫 psme-3(OE) 株および psme-3 RNAi コンストラクトを作製した。H.J.L.、H.A.、S.K.、A.N.およびD.V.はデータ解析と解釈を行った。原稿はD.V.が執筆した。
共著者
David Vilchez宛。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Aging誌は、Shawn Xu氏、Seung-Jae V Lee氏、およびこの論文の査読に貢献した匿名の査読者に感謝する。
追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data Fig. 1 寒冷誘導PSME-3は線虫若齢成体においてトリプシン様プロテアソーム活性を誘発する。
a, 6日目の成虫対照fer-15(b26);fem-1(hc17)ワームを15℃と20℃で比較したプロテアソームサブユニットのラベルフリー定量（LFQ）の対数変換した倍数変化（n = 3）。データはref. 9, P値は両側スチューデントのt検定で計算。ヒトプロテアソームサブユニットのワームオルソログは、InParanoid8プログラム34,35に従ってOrtholist2を用いて同定した。 b, psme-3 RNAiを投与した6日目の対照不妊成虫の抗PSME3抗体によるウェスタンブロット。対照の不稔性成虫は発育中25℃で飼育し、その後成虫6日目まで示した温度で生育させた。α-チューブリン負荷対照。c, 成虫3日目の対照不妊虫におけるトリプシン様活性（平均±s.e.m. 20℃ベクターRNAiに対する相対勾配、n = 4独立実験）。d, 成虫3日目の野生型ワムシにおけるトリプシン様活性（20℃に対する平均±s.e.m.の相対勾配 Vector RNAi, n = 4独立実験）。e,1日目成虫の野生型ワムシにおけるトリプシン様活性（20℃に対する平均±s.e.m.の相対勾配 Vector RNAi、n = 4独立実験）。f,6日目成虫の野生型およびtrpa-1(ok999)変異体における15℃でのトリプシン様活性（野生型に対する平均±s.e.m.の相対勾配、n = 7独立実験）。g, 20℃における6日目成虫のトリプシン様活性（野生型に対する平均±s.e.m.の相対的傾き、n = 7独立実験） h, 15℃における6日目成虫のキモトリプシン様活性（野生型に対する平均±s.e.m.の相対的傾き、n = 7独立実験）。c-hにおいて、統計的比較は対の標本に対する両側Studentのt検定によって行った。P値： P 値： *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, NS = 有意ではない（P > 0.05）。c-eでは、すべての有意な変化はFDRによる多重検定の補正後も有意であった（q値< 0.05）。出典データは正確なP値とq値を含む。
ソースデータ
Extended Data 図2 PSME-3は線虫の生殖細胞、筋肉、腸、神経細胞で発現している。
a, 異なる温度でGFPでタグ付けされた内因性PSME-3を発現する5日目の成虫の画像。スケールバー： b, 異なる温度でPSME-3::GFPを発現させた5日目成虫の頭部の高倍率画像。c, 異なる温度でPSME-3::GFPを発現させた5日目成虫の体の高倍率画像。d, PSME-3の細胞内局在は細胞の種類によって異なる。生殖細胞および筋肉細胞では、PSME-3はほとんどが核に局在している。腸では、PSME-3は細胞質と核に局在している。同様に、PSME-3はニューロンのソーマと核の両方に存在する。しかし、神経細胞の伸長部ではPSME-3を検出できなかった。画像は15℃で内因性PSME-3::GFPを発現させた5日目の成虫から得られた。スケールバー 10 µm。e, 生殖細胞系列におけるpsme-3のノックダウン（KD）は、15℃でトリプシン様プロテアソーム活性を低下させる（Vector RNAiに対する相対的傾きの平均±s.e.m.、n = 4つの独立した実験）。 f, 筋肉におけるpsme-3のノックダウン（KD）は、15℃でトリプシン様プロテアソーム活性を低下させる（Vector RNAiに対する相対的傾きの平均±s.e.m.、n = 4つの独立した実験）。g, 腸単独でのpsme-3のノックダウン（KD）は、15℃でトリプシン様プロテアソーム活性を低下させる（Vector RNAiに対する相対的傾きの平均±s.e.m.、n = 4独立実験）。 h, 神経細胞でのpsme-3のノックダウン（KD）は、15℃でトリプシン様プロテアソーム活性を低下させる（Vector RNAiに対する相対的傾きの平均±s.e.m.、n = 4独立実験）。統計的比較はすべて、対の標本に対する両側スチューデントのt検定によって行った。P値： *p < 0.05、**p < 0.01。すべての実験において、ワムシは成虫1日目まで20℃で飼育され、その後成虫5日目まで指示された温度で飼育された。正確なP値とq値についてはSource Dataを参照。
出典データ
Extended Data Fig. 3 PSME-3のノックダウンは、15℃におけるtrpa-1突然変異体ワームの短寿命をそれ以上減少させない。
a, 成虫1日目に4℃の低温ショック（12時間）に暴露した後、20℃に戻した線虫の生存率。PSME-3の過剰発現は極低温（4℃）に対する抵抗性を増加させない。GFP(OE) 平均±s.e.m.: 5.65日±0.31、PSME-3, GFP(OE) #1 : 5.49±0.26。 b, psme-3 RNAiは野生型またはtrpa-1(ok999)ワームの20℃における寿命を減少させない。野生型ベクターRNAi平均±s.e.m.：18.35±0.43、野生型psme-3 RNAi平均±s.e.m.：19.23±0.41、trpa-1ベクターRNAi平均±s.e.m.：16.08±0.30、trpa-1 psme-3 RNAi平均±s.e.m.：16.73±0.39。c, psme-3 RNAiは25℃で野生型またはtrpa-1(ok999)ワームの寿命を減少させない。野生型ベクターRNAiの平均値±s.e.m.：13.33±0.39、野生型psme-3 RNAi：13.60±0.33、trpa-1ベクターRNAiの平均値±s.e.m.：12.84±0.33、trpa-1 psme-3 RNAi：13.35±0.30。d, psme-3 RNAiは15℃で野生型ワームの寿命を減少させる。trpa-1(ok999)変異体ワームは15℃で野生型動物より短命であるが、psme-3 RNAiはtrpa-1変異体の短命をさらに減少させない。野生型ベクターRNAi平均±s.e.m.：27.92±0.64、野生型psme-3 RNAi：26.19±0.61、trpa-1ベクターRNAi平均±s.e.m.：24.31±0.80、trpa-1 psme-3 RNAi：24.30±0.85。e, sur-5プロモーター下でのpsme-3の体細胞過剰発現は20℃におけるtrpa-1(ok999)変異体ワームの寿命を短縮した： 10.79±0.41。 f, psme-3の体細胞過剰発現は25℃におけるtrpa-1(ok999)変異体ワームの寿命を短縮する。trpa-1(ok999);GFP(OE) 平均±s.e.m.: 8.51±0.15、trpa-1(ok999);psme-3,GFP(OE)： g, psme-3の過剰発現は15℃におけるtrpa-1(ok999)変異体ワームの寿命をわずかに増加させたが、寿命延長は有意ではなかった。 trpa-1(ok999);GFP(OE) mean ± s.e.m.: 17.16 ± 0.56, trpa-1(ok999);psme-3,GFP(OE)： 18.62 ± 0.68. すべての実験において、P値は両側log-rank検定により算出した。n = 90匹/条件（a）、n = 96匹/条件（b-g）。補足データ3は、独立した生存・寿命実験の統計解析と再現データを含む。
Extended Data Fig. 4 寒冷誘導PA28γ/PSME-3は、加齢に伴う腸管IFB-2の凝集を抑制する。
a, 発育後、指示した温度で培養した野生型成体動物におけるIFB-2タンパク質レベルのウェスタンブロット解析。b, 異なる年齢の野生型ワムシのIFB-2に対する抗体を用いたフィルタートラップ解析。c, 低温（15℃）でpsme-3 RNAiを行った10日目の野生型成虫のIFB-2タンパク質レベルのウェスタンブロット解析。d, psme-3 RNAiによる10日目野生型成虫の抗IFB-2抗体によるフィルタートラップ。つの独立した実験の代表。すべての実験において、ワムシは20℃で飼育し、発育後に指示した温度に移した。RNAiは成虫1日目に開始した。すべての統計的比較は、対の標本に対する両側スチューデントのt検定によって行った。P値： *P < 0.05、NS = 有意ではない（P > 0.05）。すべての有意な変化は、FDRアプローチによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。正確なP値とq値については出典データを参照。
ソースデータ
Extended Data 図5 PA28γ/PSME-3は、神経細胞と筋肉におけるポリQ拡張ペプチドのプロテオスタシスを制御する。
a, 神経細胞特異的psme-3ノックダウンによる6日目の成体における抗GFPを用いた神経細胞polyQ67::YFP凝集のフィルタートラップ。b-c、15℃（b）または25℃（c）でのpsme-3過剰発現（OE）によるpolyQ67タンパク質レベルのウェスタンブロット。グラフは、対照Q67に対するPSME-3過剰発現によるpolyQ67タンパク質レベルの相対的な割合（α-チューブリンローディングコントロールで補正）を表す（平均±s.e.m.、n = 3つの独立した実験）。 d, 15℃および25℃でのpsme-3過剰発現によるpolyQ67凝集のフィルタートラップ。e,30秒間のトラッシング運動（2つの独立した実験から得られたn = 100匹のワーム）。f,20℃でのpsme-3過剰発現によるpolyQ67レベルのウェスタンブロット。g, 20℃における神経細胞polyQ67凝集のフィルタートラップ（3つの独立した実験の代表）。h, 30秒間の破砕運動（n = 50匹/条件）。箱ひげ図と折れ線はそれぞれ25～75パーセンタイルと中央値を示す。ひげは最小-最大値を示す。b-hでは、3日目の成虫を分析した。 i, 筋細胞でpolyQ40::YFPを発現している6日目の成虫のウェスタンブロット（抗GFP抗体で検出）。j, psme-3 RNAiによる6日目成虫の15℃におけるpolyQ40タンパク質レベルのウェスタンブロット。グラフは、15℃ベクターRNAiに対するpolyQ40レベルの相対的割合（α-チューブリンについて補正）を表す（平均±s.e.m.、n = 3独立実験）。RNAiは成体1日目に開始した。統計的比較は、対をなすサンプル（b、c、f、i、j）または対をなしていないサンプル（e、h）について、両側スチューデントのt検定によって行った。P値： P値：*P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.0001、NS = 有意ではない（P > 0.05）。すべての有意な変化は、FDRによる多重検定の補正後でも有意であった（q値< 0.05）。出典データは正確なP値とq値を含む。
ソースデータ
Extended Data Fig. 6 TRPA1の欠損は、HEK293ヒト細胞において、中程度の低温（36℃）によって引き起こされるトリプシン様活性の誘導を阻害する。
a,温度を35℃まで24時間下げると、HEK293ヒト細胞におけるトリプシン様プロテアソーム活性が低下する（37℃に対する相対勾配の平均±s.e.m.、n = 4独立実験）。b, ヒトHEK293細胞におけるカスパーゼ様プロテアソーム活性は、温度を35℃に下げる（24時間）ことによっても低下する（37℃に対する相対勾配の平均±s.e.m.、n = 4つの独立した実験）。 c, ヒトHEK293細胞とiPSC由来運動ニューロンを標準温度（37℃）で比較したTRPA1 mRNAレベル。d, 標準温度（37 °C）でヒトHEK293細胞とiPSC由来運動ニューロンを比較した抗TRPA1抗体によるウェスタンブロット解析。e, 指定温度でTRPA1 shRNAを発現させた安定HEK293細胞株におけるノックダウンレベルのqPCR解析（コントロールのノンターゲッティング（NT）shRNAに対する相対発現の平均±s.e.m.、n = 6独立実験）。f, 中等度の低温（36℃、24時間）は、コントロールのHEK293細胞ではトリプシン様プロテアソーム活性を誘導するが、TRPA1 shRNA細胞では誘導しない（37℃NT shRNAに対する相対勾配の平均±s.e.m.、n = 3独立実験）。すべての実験において、細胞は37℃で培養した後、低温に移すか、または解析前に37℃で24時間維持した。統計的比較は、対になったサンプル（a、b、e、f）または対になっていないサンプル（c）について、両側スチューデントのt検定によって行った。P値： **P 値：***P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001、NS = 有意ではない（P > 0.05）。すべての有意な変化は、FDRアプローチによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。正確なP値とq値については出典データを参照。
出典データ
Extended Data Fig. 7 TRPA1のノックダウンまたは薬理学的阻害は、低温での変異型FUS凝集を誘発する。
a, コントロールのノンターゲッティング（NT）と変異型FUS(P525L)を発現するTRPA1 shRNA-HEK293細胞の抗FUS抗体によるウェスタンブロット解析。グラフは、37℃＋NT shRNAに対するFUSタンパク質レベル（β-アクチンローディングコントロールで補正）の相対パーセンテージ値を表す（平均±s.e.m.、n = 3独立実験）。統計的比較は、一対のサンプルについて両側Studentのt検定によって行った。P値： *P < 0.05、NS = 有意ではない（P > 0.05）。すべての有意な変化は、FDRアプローチによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。正確なP値およびq値については出典データを参照。 b, 変異型FUS(P525L)を発現するNT細胞およびTRPA1 shRNA-HEK293細胞の抗FUS抗体によるフィルタートラップ解析。TRPA1のノックダウンは、FUS(P525L)の凝集レベルに対する低温の改善効果を減弱させる。c, 変異型 FUS(P525L)を発現する NT 細胞および PSME3 shRNA-HEK293 細胞を 25 µM HC-030031（TRPA1アンタゴニスト）または DMSO ビヒクルコントロールで 24 時間処理した細胞の抗 FUS 抗体を用いたフィルタートラップ解析。
出典データ
Extended Data Fig. 8 iPSC由来運動ニューロンは、標準温度におけるHEK293細胞と比較して、基礎トリプシン様活性レベルが高い。
a, 標準温度（37℃）におけるヒトHEK293細胞とiPSC由来運動ニューロンのトリプシン様プロテアソーム活性の比較。棒グラフは平均値±s.e.m.を表す（HEK293に対する相対勾配、n = 3独立実験）。 b, 標準温度（37℃）におけるカスパーゼ様プロテアソーム活性。c,標準温度（37℃）におけるキモトリプシン様プロテアソーム活性。グラフは平均値±s.e.m.（HEK293に対する相対勾配、n = 3つの独立した実験）を表す。 d, 低温（36℃）ではALS iPSC由来運動ニューロンのカスパーゼ様プロテアソーム活性の変化は誘導されない（平均値±s.e.m. e, ALS iPSC由来運動ニューロンのキモトリプシン様プロテアソーム活性は低温では変化しない（37℃に対する相対勾配の平均±s.e.m.、n = 3独立実験）。統計学的比較はすべて、一対標本に対する両側Studentのt検定で行った。P値： **P 値：***P < 0.01、***P < 0.0001、NS = 有意ではない（P > 0.05）。正確なP値とq値については出典データを参照。
出典データ
Extended Data 図9 細胞タイプによって異なるPSME3の細胞内分布。
a, コントロール（FUSWT/WT）およびALS（FUSP525L/P525L）iPSC由来運動ニューロンの抗PSME3抗体および抗FUS抗体による免疫細胞化学。核マーカーとしてヘキスト染色を用いた。PSME3はヒト運動ニューロンのソーマと核の両方に存在するが、神経細胞の伸長部にはPSME3は検出されなかった。スケールバー：20μm。b, 標準温度（37℃）および低温（36℃）におけるHEK293細胞の抗PSME3抗体による免疫細胞化学。PSME3は主にHEK293細胞の核に蓄積している。高露光画像は、少量のPSME3が細胞質にも存在することを示している。スケールバー： 10 µm。c, FUS(WT)-HAまたはFUS(P525L)-HAを発現したHEK293細胞の抗HAタグ抗体による免疫細胞化学。野生型FUSは基本的に核に存在するが、ALSに関連したFUSP525L変異体は核と細胞質の両方に存在する。低温では変異型FUSP525Lの細胞内分布は変化しない。核マーカーとしてヘキスト染色を用いた。スケールバー： 10 µm。つの独立した実験の代表。すべての実験において、細胞は37℃で培養した後、36℃にシフトするか、37℃で24時間維持してから解析した。
Extended Data Fig. 10 レプトマイシンB処理により、変異型FUSP525Lの核への蓄積が増加し、さらに寒冷による分解が促進される。
a, 変異型FUS(P525L)-HAを発現するHEK293細胞をビヒクルコントロール（EtOH）または20 nMレプトマイシンBで6時間処理した際の抗HAタグ抗体による免疫細胞化学。核外輸送阻害剤である20 nMのレプトマイシンBによる処理（6時間）は、標準温度（37℃）および低温（36℃）の両方で変異型FUSP525Lの核への蓄積を増加させた。スケールバー： 10 µm。b, ビヒクルコントロール（EtOH）または20nMレプトマイシンBで6時間処理した変異型FUS(P525L)-HAを発現するHEK293細胞の抗FUS抗体によるウェスタンブロット解析。棒グラフは、37℃+EtOHビヒクルコントロールに対するFUSタンパク質レベルの相対的パーセンテージ値（β-アクチンローディングコントロールで補正）の平均±s.e.m.を表し、n = 4つの独立した実験。統計的比較は、対のサンプルについて両側スチューデントのt検定によって行った。P値： **P < 0.01, ***P < 0.001, NS = 有意ではない（P > 0.05）。すべての有意な変化は、FDRアプローチによる多重検定の補正後でも有意であった（q値 < 0.05）。c, mCherryでタグ付けされたQ100-HTTを発現するHEK293細胞をビヒクルコントロール（EtOH）または20nMレプトマイシンBで6時間処理した画像。核マーカーとしてヘキスト染色を用いた。スケールバー： 10 µm。d, mCherry-Q100-HTTを発現させたHEK293を用いた抗HTT抗体によるウェスタンブロット解析。β-アクチンはローディングコントロール。2回の独立した実験の代表。
出典データ
補足情報
報告概要
補足表1
補足表1. 線虫およびヒト細胞でのノックダウンアッセイに用いたRNAiおよびshRNA構築物の塩基配列。
補足表2
補足表2. qPCRアッセイに使用したプライマーのリスト。
補足表3
補足表3. 寿命実験の統計解析と再現データ。
出典データ
ソースデータ Fig.
統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
資料データ Fig.
統計資料
ソースデータ Fig.
統計的出典データ。
ソースデータ Fig.
統計的出典データ。
ソースデータ Fig.
統計的出典データ。
ソースデータ Fig.
統計的ソースデータ。
ソースデータ 拡張データ 図1
統計的ソースデータ。
ソースデータ 拡張データ Fig.
統計的ソースデータ。
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統計的ソースデータ。
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統計的ソースデータ。
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未処理のウェスタンブロット。
ソースデータ Fig.
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未処理のウェスタンブロット。
出典データ Fig.
未処理のウェスタンブロット。
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未処理のウェスタンブロット。
出典データ Fig.
未処理のウェスタンブロット。
出典データ Fig.
未処理のウェスタンブロット。
ソースデータ 拡張データ Fig.
未処理のウェスタンブロット。
出典データ 拡張データ 図4
未処理のウェスタンブロット。
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未処理のウェスタンブロット。
出典データ 拡張データ 図6
未処理のウェスタンブロット。
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未処理のウェスタンブロット。
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未処理のウェスタンブロット。
権利と許可
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転載と許可
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アップデートの確認 CrossMarkで通貨と真正性を確認する
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Lee,H.J.、Alirzayeva,H.、Koyuncu,S.他。低温は長寿を延ばし、PA28γ誘導プロテアソームを通して疾患関連タンパク質の凝集を防ぐ。Nat Aging 3, 546-566 (2023). https://doi.org/10.1038/s43587-023-00383-4
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受領
2022年4月21日
受理
2023年2月17日
発行
2023年04月03日
発行日
2023年5月
DOI
https://doi.org/10.1038/s43587-023-00383-4
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テーマ
老化
プロテアソーム
この論文の引用元
ヒトのハンチンチン断片を植物体内で発現させると、疾患関連タンパク質の凝集を防ぐメカニズムが明らかになる
Ernesto LlamasSeda KoyuncuDavid Vilchez
ネイチャー・エイジング (2023)
プロテアソーム増強による寒冷誘導長寿
エイタン・ズロトリスキー
ネイチャー・レビュー 分子細胞生物学 (2023)
ネイチャーエイジング (Nat Aging) ISSN 2662-8465 (オンライン)
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