抗レトロウイルス療法を継続中のHIV感染女性の膣内細菌叢と高リスクのヒトパピローマウイルス感染との関連性
公開日：2023年1月19日
抗レトロウイルス療法を継続中のHIV感染女性の膣内細菌叢と高リスクのヒトパピローマウイルス感染との関連性
Monserrat Chávez-Torres, Maria Gómez-Palacio-Schjetnan, ...Sandra Pinto-Cardoso 著者を表示する。
BMC Microbiology volume 23, Article number: 21 (2023) Cite this article
詳細
概要
背景
HIVとともに生きる女性（WLWH）は、子宮頸がんを含むHPV関連悪性腫瘍のリスクが高いにもかかわらず、高リスクヒトパピローマウイルス（HR-HPV）感染との関連で膣マイクロバイオータ（VM）を調査した研究はほとんどない。HIVおよびHPV感染がWLWHの子宮頸部に及ぼす影響を調べるため、WLWH44人と血清陰性女性（SNW）39人のコホートにおいてHR-HPV感染の有病率と子宮頸部細胞診異常を測定し、16S配列決定により膣微生物叢を特徴付け、Multiplex bead assayとフローサイトメトリーによりそれぞれ性器炎症と全身性免疫活性を評価した。最後に、細菌の豊富さと多様性、上位20属の細菌、性器炎症および全身性免疫活性化との関係を探った。
結果
HR-HPVの有病率は、WLWHとSNWで同程度であることがわかった。高悪性度扁平上皮内病変（HSIL）は、HR-HPV感染陰性のWLWHでのみ検出された。回帰分析では，危険因子は同定されなかった．HIVとHR-HPVの同時感染者は，全身的な免疫活性化が最も高く，そのレベルはHR-HPV感染のないSNWと比較して有意に異なっていた．Lactobacillus inersはWLWHおよびSNWで同様に優勢なLactobacillus speciesであった。
結論
HIV、HPV、HIVとHPVの感染状況による膣内微生物の豊富さ、多様性、微生物群集構造、性器炎症の違いを示す証拠は見出せなかった。
ピアレビュー報告
背景
膣内細菌叢（VM）は、細菌性膣炎（BV）などの性器感染症、悪性腫瘍（子宮頸がん）、性感染症（STD）の獲得および感染、その他の生理的状態（妊娠、閉経）などの婦人科および産科合併症において広く特徴づけられています［1, 2］. 低い多様性と乳酸菌優位性は、最適な膣内細菌叢の特徴です[3]。ラクトバチルス種（属）は、膣内の酸性pHの維持に重要な役割を果たす強力な殺微生物剤である乳酸を生産します。この微小環境は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）や単純ヘルペスウイルス（HSV）2型などの病原体を不活性化し、嫌気性菌を除くことによって恒常性を促進する役割があります[4]。一方、最適でない（dysbioticとも呼ばれる）膣内細菌叢は、非常に多様で多菌性であり、Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Prevotella biviaなどの嫌気性菌に支配されています [5]．この異生物の微生物叢は、一般に群集状態型（CST）IVa（G. vaginalis優勢）およびIVb（多様性が高く、特定の種の優勢はない [6]）として知られており、性器の炎症 [7]と上皮障害 [8] に強く関連しています。多くの宿主および外的要因が、経口避妊（エストロゲン [9]、性行為および習慣、喫煙、月経、妊娠、閉経、およびより少ない範囲での抗生物質の使用 [5]）を含むVMの構成に影響を及ぼしています。
HIVのリスク獲得におけるVMの役割は実証されています[10, 11]。細菌性膣症関連細菌（BVAB）とも呼ばれる膣内の異種微生物群集がHIV感染リスクを高め、抗レトロウイルス剤をベースにしたマイクロビサイドの有効性を変化させることが研究で示されています[12, 13]。これとは対照的に、HIVとともに生きる女性（WLWH）を対象とした研究は限られている［14、15］。研究によると、WLWHは膣内の微生物相が最適ではなく、膣の炎症、HIVの排泄、男性パートナーへの性感染リスクの上昇と関連しています（ウイルス学的抑制を達成できないWLWH [16,17,18] ）。抗レトロウイルス療法（ART）が膣内細菌叢に与える影響については、現在のところ不明です[19]。ヒトパピローマウイルス（HPV）感染との関連でWLWHのVMを調査した研究は少ないが［14、20、21］、HIVがHPVの病原性を高めることを示す証拠があり［22］、WLWHはARTを受けていても、子宮頸がん［23］などHPV関連悪性腫瘍のリスクが高いことが示唆されている［24、25］。さらに、HPV関連の子宮頸部病理に対するARTの影響もまだ解明されていない[22, 26]。HIV、HR-HPV、VMおよびARTの間の複雑な相互作用を理解することは、この脆弱なアトリスク集団における子宮頸がんの負担を軽減するための適切なスクリーニングプログラムおよびWLWHの臨床管理について政策立案者に知らせるために適切かつ必要である [27]．
本研究の目的は、高リスクHPV感染（HR-HPV）において、ウイルス学的抑制が完全なWLWHのVMを特徴付け、膣炎、全身性免疫活性化、人口動態および臨床データとの関係を探り、それらをSNWと比較することであった。我々の知る限り、本研究は、HR-HPV感染の有無にかかわらず、WLWHとSNWの両方を含む最初の研究の一つである。
研究結果
研究参加者の特徴
合計83人の女性が含まれ、44人がWLWH、39人がSNWであった。特徴は表1、Additional Files 1と2にまとめられている。年齢の中央値は42歳（21-69歳）で、WLWHはSNWよりも高齢であった（中央値44歳対39歳、p=0.029）。年齢以外では、性的デビューの年齢、性病の既往、性病の種類、膣内pH、喫煙、飲酒に関して差は見られなかった。SNWはWLWHと比較して、性的パートナーの総数が多く（p=0.002）、コンドームを使用する割合が低かった（p=0.001）。リプロダクティブ・ヘルスと性行為に関するデータは、Additional File 1にまとめた。SNWとWLWHを問わず、半数以上の女性が婦人科系の症状を呈し（59.04％）、それらは月経間出血（16.87％）、膣分泌物（44.58％）、性交障害（24.1％）、骨盤痛（30.12％）、性交後出血（9.64％）であった。HIV感染状況による差はなかった。本研究では、経口ホルモン避妊薬を使用していると報告した女性はいなかった。
表1 コホート概要
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WLWHの免疫状態およびART曝露量
HIV臨床パラメータのデータは、Additional file 2に要約されている。CD4＋T細胞数の中央値は529.5［307.3-728.8］cells/mm3であった。23人のWLWHはCD4>500cells/mm3（52.27％）、17人（38.64％）は200<CD4<500、4人（9.09％）だけがCD4>200以下であった。すべてのWLWHはウイルスが検出されなかった（< 40 copies/mL）．40人は抗レトロウイルス治療（ART）を受けており，4人はエリートコントローラー（ARTを受けていない状態でHIV-1ウイルス量が検出されないWLWHと定義）であった．最も頻度の高いARTレジメンは，非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（NNRTI，n＝24，54.55％）であり，プロテアーゼ阻害薬（PI，n＝12，27.27％）がそれに続いた．WLHWはCD4 nadir（中央値105.5［29.25-240］細胞/mm3）によりHIV感染の後期と診断された．すべての女性がB型およびC型肝炎ウイルスに対して陰性であった．
高リスクHPV感染の有病率
表2にまとめたように、26名（31.33％）がHR-HPV陽性で、そのうち2名がHPV16感染陽性であった（SNW：単独感染、WLHW：共感染1名）。HPV18は本コホートでは検出されなかった。子宮頸部細胞診の結果，5名（6.02％）に低悪性度上皮内扁平上皮病変（LSIL），2名（2.41％）に高悪性度上皮内扁平上皮病変（HSIL）が検出された．HSILはWLWHにのみ認められ，LSILはSNW4名とWLWH1名に認められた。HSILまたはLSILを有するWLWHはHR-HPV陰性であったが、LSILを有するSNW2人はHPV陽性であった。HR-HPV感染と子宮頸部細胞診に関して、WLWHとSNWの間に差はなかった。HPV陰性（HPVN）とHPV陽性（HPVP）の女性間で、年齢、性歴、喫煙、HIV、STDの既往、パリティなどHPV感染に関連する周知のリスクファクターの違いを検索した（追加ファイル3）ところ、何も見つからなかった。さらに、ロジスティック回帰分析を行ったところ、リスクファクターは確認されなかった。
表2 高リスクHPV感染と子宮頸部細胞診の関係
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性器の炎症と全身的な免疫活性化
まず、可溶性マーカー（30種類のサイトカイン、ケモカイン、成長因子のパネル）の定量により、局所的（サイトブラシ上清）および全身的（血漿）な炎症レベルを測定した。HIVの有無やHPVの有無で層別化しても、性器の炎症に差は見られなかった（追加ファイル4）。IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIG、Eotaxinの血漿レベルはSNWと比較してWLWHで上昇した（Additional file 5）。HPV感染で層別化すると、HR-HPV感染女性ではIL-6だけが上昇した。興味深いことに、HR-HPVに感染したWLWH（WLWH HPVP）はIL-6の血漿レベルが最も高く、この後者はHPV感染陰性SNWと比較して有意に異なっていた（p = 0.0127, Fig. 1A and Additional file 6）。次に、末梢血CD4 + T細胞およびCD8 + T細胞について、T細胞活性化の古典的マーカーであるHLADRおよびCD38の共発現をフローサイトメトリーで解析した（Additional file 7）。CD8 + T細胞の活性化の頻度は、SNWと比較してWLWHで高く（p = 0.0012）、一方CD4 + T細胞の活性化の頻度は低かった（p < 0.0001）。HPV感染による層別化では、全身的な免疫活性化の差は認められなかった。HR-HPV感染者のWLWHはCD8 + T細胞の活性化レベルが最も高く、このレベルはHPV感染陰性者のSNWと比較して有意差があった（p = 0.017, 図1BおよびAdditional file 8）。
Fig.
図1
血漿中IL-6とCD8 + T細胞活性化は、HR-HPV感染を有するHIV感染女性で最も高い。凡例。A. log10血漿中IL-6濃度の中央値と四分位範囲を示す散布図、B. HPV感染の有無にかかわらず血清陰性女性（SNW）とHIVとともに生きる女性（WLWH）におけるCD8 + HLADR + CD38 +の頻度（%）を示す散布図。群の比較にはKruskal-Wallis検定を用い、p値はDunnの多重比較検定を用いて多重比較のために調整した。*p＜0.05（統計的有意差）。有意な調整済みp値のみを示す。統計解析とグラフはGraphPad Prism 9で行った。略号は以下の通り。CD: cluster of differentiation, HLA: human leukocyte antigen, HIV: human immunodeficiency virus, HPV: human papillomavirus, HPVP: HPV positive, HPVN: HPV negative, KWp = Kruskal-Wallis p, ml = milliliter, pg = picogram, SNW: seronegative women, WLWH: women living with HIV, %: frequency（頻度）。
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HIVおよびHR-HPV感染における膣内細菌叢の特徴
16S rDNA配列決定を用いて、膣内細菌叢の特徴を明らかにした。6人の女性の膣スワブが入手できず、37人のSNWと40人のWLWHがその後の分析に残った。アルファ多様性を推定するために、シャノン（豊かさと均等性）およびリッチネス（観察された種の数）の2つの指標を算出した。HIV、HPV、またはHIVとHPVの両方のステータスで層別化した場合、アルファ多様性（図2Aおよび追加ファイル9）に差は見られなかった。微生物群集のクラスタリングは主座標分析（PCoA、Bray-Curtis非類似度）を用いて可視化し、分散の均質性の検定後にPERMANOVAによって差を評価した（図2B、Additional file 10）。HIVの有無（R2 = 0.010, p = 0.626）、HPVの有無（R2 = 0.021, p = 0.104）、または両方（R2 = 0.047, p = 0.235）を考慮しても有意差は見つからなかった。一対比較の結果、HPVに感染したWLWH（WLWH HPVP）の微生物群集は、HPVに感染していないWLWH（WLWH HPVN、R2 = 0.049, p = 0. 047）と僅かに異なることが判明した。 047）、それ以外の差は認められなかった（SNW HPVN vs SNW HPVP, R2 = 0.024, p = 0.472; WLWH HPVN vs SNW HPVN R2 = 0.026, p = 0.162; WLWH HPVP vs SNW HPVP, R2 = 0.029, p = 0.678)．最も多く存在する20属の相対量を図2Cおよび追加ファイル11に示す。全体として、最も豊富な属は、Lactobacillus (60.83%), Gardnerella (14.49%), Prevotella (6.92%), Atopobium (2.58%), Sneathia (1.97%), Bifidobacterium (1.76%), Shuttleworthia (1.64%), Mycoplasma (1.05%) で、全ての属の97.62%を占めていました。興味深いことに、HPV16に感染した女性（SNW 1名、WLHW 1名）には、GardnerellaとAtopobium（WLHW）、Gardnerella、Atopobium、Plevotella、Sneathia（SNW）に支配され、Lactobacillusが減少した多菌社会を認めた（付加ファイル11）。種レベルでは、Lactobacillus iners, L. jensenii, L. gasseri, L. reuteriが確認されたが、L. crispatusは確認されなかった。また、G. vaginalis、P. bivia、A. vaginae、S. amnii、B. breveなどを同定できた（表3および追加ファイル12にまとめている）。
図2
図2
HIVとともに生きる女性およびHR-HPV感染の有無にかかわらず血清陰性の女性の膣内細菌叢。凡例。A. 2つのアルファ多様性メトリックの中央値と四分位範囲を示す箱ひげ図：豊かさ（観察された種の数）およびシャノン（豊かさと均等性）。グループはクラスカル・ワリス検定と多重比較で調整したp値を用いて比較した（リッチネスについてはKWp = 0.933、シャノンについてはKWp = 0.936）。HIV感染状況、HPV感染状況、またはその両方で層別した場合、α多様性に差は見られなかった。B .微生物群集のクラスタリングは主座標分析（PCoA、Bray-Curtis非類似度）を用いて可視化し、分散の均質性（betadisper）の検定後にPERMANOVAによって差異を評価した。一対比較の結果、HPV感染を有するWLWH（WLWH HPVP）の微生物群集は、HPV感染を有しないWLWH（WLWH HPVN、R2 = 0.049, p = 0. 047）と僅かに異なることが明らかになった。 047）、それ以外の差は認められなかった（SNW HPVN vs SNW HPVP、R2 = 0.024, p = 0.472; WLWH HPVN vs SNW HPVN R2 = 0.026, p = 0.162; WLWH HPVP vs SNW HPVP, R2 = 0.029, p = 0.678)．C. HIVとHPVの感染状況によって層別した上位20属を示すヒートマップ。ヒートマップはRのampvis2を用いて作成した。相対的な存在量は中心対数比変換した。略号 HIV: human immunodeficiency virus, HPV: human papillomavirus, HPVN: HPV negative, HPVP: HPV negative, PCoA: principal coordinate analysis, PERMANOVA: Permutational multivariate analysis of variance, R2 = R squared, SNW: seronegative women, WLWH: women living with HIV。
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表3 HR-HPV感染の有無にかかわらず、HIVとともに生きる女性および血清陰性女性における上位20属の平均相対存在量（％）および各属内で最も多い種
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次に、LEfSeを用いて判別可能な分類群を同定した（線形判別分析の閾値が3.0以上、図3）。4群（SNW HPVN、SNW HPVP、WLWH HPVN、WLWH HPVP）すべてを考慮した場合、識別可能なtaxaは同定されなかった。WLWHとSWNをHPVの有無にかかわらず考慮した場合（図3A）、WLWHではBifidobacterium（LDA = 3.93, p = 0.011） とAlloscardovia（LDA = 3.90, p = 0.049）という2属が異なって発現していることが明らかにされた。HPVNとHPVPをHIV感染状況に関係なく検討したところ、HPVNではVeillonellaが確認された（(LDA 3.19, p = 0.043, 図3B)）。WLWHのみを対象とした場合、HPVに感染しているWLWHでは3属が同定された。Gemella属（LDA = 3.32, p = 0.006）, Megasphaera属（LDA = 3.59, p = 0.013）, Shuttleworthia属（LDA = 4.55, p = 0.03）, Veillonella属（LDA -3.39, p = 0.042 ）が、HPV非感染WLWHで確認されました（Fig. 3C）。最後に、BifidobacteriumはHPV感染のないWLWHとHPV感染のないSNWを識別することがわかった（LDA = 4.044, p = 0.006, Fig. 3D）。SNWのみ、HPVPの女性のみでは判別機能は確認されなかった。
図3
図3
線形判別分析効果量（LEfSe）によって決定された、HIVとともに生きる女性とHPV感染の有無にかかわらず血清陰性の女性における差次的に発現した分類群。凡例 A. HPV感染に関係なくWLWHとSNW、B. HIV感染に関係なくHPVNとHPVP女性、C. WLWHのみ、D. HPVN女性のみにおいて識別された差別的分類群を示す線形判別分析プロット。LEfSe解析は、https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/、以下のパラメータで行った。LDAの閾値は3以上、要因別クラスカル・ワリス検定のアルファ値は0.05、ペアワイズ・ウィルコクソン検定のアルファ値は0.05である。ASV表はLEfSe解析の前にフィルタリングされ、少なくとも5%のサンプルで5回以上見られなかったASVを削除し、小さな平均や外れ値を持つASVが含まれないようにしている。略語 ASVs: アンプリコン配列バリアント、LDA: 線形判別分析、HIV：human immunodeficiency virus、HPV：human papillomavirus、HPVP：HPV positive、HPVN：HPV negative、SNW：血清陰性女性、WLWH：HIVとともに生きる女性
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細菌分類と炎症および免疫活性化の可溶性および細胞性マーカーとの関係
最後に、VMと炎症および免疫活性化の可溶性および細胞性マーカー、ならびに人口統計学的および臨床的データとの関係を検討した。Spearman rhoが±0.6以上、p＜0.01の相関関係のみを考慮した。全体として、乳酸菌とGardnerella、Prevotella、Dialister、Atopobiumの間には予想通り逆相関が見られ、Additional file 13に示すように通性嫌気性菌の間には正相関が見られた。また、膣内pHやその他の臨床データ、炎症の可溶性マーカーや細胞性マーカーとの相関は認められなかった。
考察
HIVとHPVに感染している女性における膣内圧に関するデータは限られている。本研究では、HIVとHPVの両感染がVMに及ぼす影響を理解し、これらを性器の炎症および全身性免疫活性化と関連付けることを目的とした。
我々の結果は、HIV陽性女性とHIV血清反応陰性女性のVMに差がないとした先行研究［14、20、21、28］と一致する。正確には、膣内微生物の多様性（アルファ多様性）、微生物群集構造（ベータ多様性）のいずれにも差は見られませんでした。興味深いことに、2つの属がWLWHとSNWを識別することが判明した（LEfSeを使用）。BifidobacteriumとAlloscardiaである。Alloscardia omnincolensは、Prevotella biviaとStreptococcus anginousとともに、臨床的に明らかな炎症を伴う膣内の異生物状態である好気性膣炎に関与すると考えられている病原菌である [29]（Prevotella biviaは、膣内の異生物状態である好気性膣炎、Streptococcus anginousは、臨床的に明らかな炎症を伴う膣内の異生物状態）。ビフィズス菌は、3人の女性（1人のSNWと2人のWLWH）のVMで見つかり、これら3人の女性はHPV陰性であった。これら3人の女性のVMは多菌性で、ラクトバチルスが減少していた。興味深いことに、ビフィズス菌は膣に定着して乳酸を産生することができるため、乳酸菌が果たす役割と同様の保護的役割が示唆されている[30, 31]。ビフィズス菌種はプロバイオティクスと考えられている。我々の研究では、HPV感染女性でBifidobacteriumにコロニー形成された女性はいなかった。このことは、BifidobacteriumがHPV感染に対して保護的役割を果たす可能性を示していると考えられるが、我々の研究においてBifidobacteriumを有する女性の数が非常に少なく、結論を出すことが困難であることは承知している。また、ビフィズス菌はHPV感染のないWLWHとHPV感染のないSNWを識別することも明らかになった。興味深いことに、BifidobacteriumはLactobacillusと逆相関、Alloscardovia、Anaerococcus、Prevotella、Dialisterと正相関であった。WLWHの膣内細菌叢がBifidobacteriumの増殖に適した微小環境を提供しているのか、あるいはBifidobacteriumの存在がLactobacillus不在の代償機構であるのかは、まだ明らかにされていない。健康な女性の膣スワブから分離されたビフィズス菌が、泌尿器系および腸系の病原菌に対して強い抗菌活性を示すことがin vitroの研究で示されていることは言及に値する[32]。膣内細菌叢におけるビフィドバクテリウムの臨床的意義を明らかにするために、さらなる研究が必要である。また、A. omnincolensについてはほとんど知られていない。A. omnincolensの役割を明らかにする研究が始まっており、A. omnincolensは切迫性尿失禁に寄与していないようだという事実が言及されている[33, 34]。
我々のコホートでは、L. inersが優勢な乳酸菌種であったが、HPV感染のあるWLWHがL. inersの平均相対存在度が最も高かったにもかかわらず、その優勢はHIVまたはHPV感染のいずれか、あるいは両方と関連づけられることはなかった。L. inersは、膣の微小環境が乱れた後に膣に定着する移行種であることが示されているため、最適な膣内環境を維持するためのL. inersの役割については議論がある［35］。L. inersはL. crispatusよりも防御力が低いと考えられており [36]、STDの高い有病率と関連している [17, 37]。同時に、L. inersは異なる民族の女性（白人以外）のVMに見出されている[6, 38]。我々のコホートは、メキシコのメスティーソの女性で構成されていた。L. inersの優勢と高い膣内pH（5以上）を認めたことは、これまでの観察結果と一致する[6]。また、L. inersは、HPVを持つヒスパニック系および非ヒスパニック系女性で発見されている[39]。メキシコでは、子宮頸癌が女性の間で最も一般的な癌であるため、L. inersが優勢でL. crispatusが存在しないことは、メキシコのWLWHおよびSNWにとって同様に臨床的に適切な意味を持つ可能性がある[40]。さらに、L. inersは、STDのリスクの増加[17, 37]およびVMの不安定性[41]と関連している。
WLWHにおけるHR-HPVの有病率は、SNWと同等であった。メキシコの女性におけるHPVの有病率を報告した研究はほとんどなく、WLWHではさらに少なかった[42]。本研究におけるHR-HPVの全有病率は31.33％であり、Torresら［40］やLópez Riveraら［42］の報告より高い。Torresらは、Institute of Security and Social Services for State Workers (ISSSTE) に所属する女性ユーザーを調査し、全体の有病率は13％であった[40]。Lópezたちは、HPVの有病率は9.1％であると報告した[42]。我々の結果とこれら2つの研究の不一致は、それぞれの研究で使用されたHPV検出アッセイが異なることに起因している可能性がある。また、HPV有病率は、特にHPV関連危険因子（年齢、喫煙、ホルモン避妊の使用など）の違いが観察される場合、人口のサブグループ内で変化する。興味深いことに、喫煙のようなHR-HPV感染に関連する従来の危険因子は、本研究のコホートでは観察されなかった。本研究では、9.59％の女性に子宮頸部細胞診の異常が認められた（LSIL 5例、HSIL 2例）。子宮頸部細胞診の異常はHPV陽性女性2名（LSILを有するSNW2名）のみに認められた。我々の研究で見つかった高いHR-HPV有病率を考えると、これらの女性は子宮頸がんのリスクが高い可能性があり、子宮頸がんの早期発見のための国家プログラム（パパニコロウ検査による早期発見と、検出された病変の適切な治療との組み合わせによる予防）[43]に従うよう奨励されている。前述のように、この研究のWLWHは、子宮頸部細胞診で異常があり、主にLSILであった。WLWHのほぼ半数（n＝21）は、抑制的ARTを行ってもCD4 T細胞数が正常化しなかった（CD4＜500細胞）。また、WLWHはART開始前から慢性的にHIVに感染していた（CD4中央値は105cells/mm3、追加ファイル2））。CD4 T細胞数はHPV感染のリスクファクターであり，免疫不全のWLWHでは子宮頸部新生物の再発・進行率が高いことから，警戒とスクリーニングの強化が必要である[27]．また、免疫不全のWLWHは、免疫不全のWLWHと比較して、より積極的な臨床管理が有益であるかもしれない［44］。HPV関連の子宮頸部病理学に対するARTの影響はまだ不明である［22, 26］。HIV、HR-HPV、VM、ARTの間の複雑な相互作用を理解するための継続的な努力は、この脆弱なリスク集団における子宮頸がんの負担を軽減するために関連した必要な情報を生成するために正当化される[27]。
LEfSe解析の結果、Shuttleworthia、Megasphaera、GemellaはHPV陽性のWLWHを識別し、VeillonellaはHR-HPV陽性のWLWHを識別することが示された。また，Veillonellaは，HIV感染の有無にかかわらず，HPV非感染者とHPV感染者を識別することがわかった．この後者の結果は，HR-HPV陰性のHIV陰性女性でVeillonella（V. montpellierensis）の過剰発現を認めたDarengらによる最近の研究［21］と一致する．Veillonellaは、細菌性膣炎を有する女性 [45]、pH異常を有する女性 [39]、および無症状の健康な女性 [46]で発見されている。種レベルでは、バイオフィルム形成に寄与することが示されているV. montpellierensisが同定された[47]。Veillonellaの正確な役割は現在のところ不明であり、他の細菌種の存在に依存している可能性がある[21]。興味深いことに、ShuttleworthiaはPrevotellaおよびStreptococcaceaeとともにHSILと関連していた [48]。また、MegasphaeraはHR-HPVを持つ女性におけるHSILおよび子宮頸癌のリスク上昇と関連している[49]。VM、HIV、HPV感染間の複雑な相互作用を解読するだけでなく、ARTがこの相互作用にどのように影響するかを理解するために、より大規模な縦断的コホートが必要である。このことは、WLWHの臨床管理にとって重要な意味を持つ可能性がある [22, 26, 27]。最終的な目標は、この脆弱なリスク集団におけるHPVの負担と子宮頸がんの世界的なリスクを軽減することを目的とした介入を改善することである。また、子宮頸管とその異なるCST型が、HPV感染とコルポサイトーシス異常の臨床管理にとって適切かつ有用なマーカーとなり得るのか、また、治療法は異なる子宮頸管組成に応じて調整されるべきなのかを明らかにするために、さらなる研究が必要である（子宮体部に基づいて個別化したスクリーニングや臨床管理）。
驚いたことに、膣内pHとLactobacillus属、および性器可溶性炎症マーカーと上位20属の間に相関がないことが分かりました。膣内pHとLactobacillus属の間に相関がないのは、16Sシーケンスを用いることの限界と我々のプライマー選択（V3V4）を反映しているのかもしれない。膣の炎症と上位20属の間に相関がないことは、使用した収集方法によって説明できるかもしれない；ほとんどの研究が子宮頸部膣洗浄液（CVL）を使用するのに対し、我々は頸部サイトブラシの上清を使用した［7、50、51］。女性性器分泌物の収集技術は重要であり[52]、CVLはサイトカインアッセイの再現性において優れた方法であることが示されている[53]。しかし、我々の研究ではCVLの採取は不可能であった。また、HPV感染のあるWLWHおよびSNWでは、HPV感染のないWLWHおよびSNWと比較して性器の炎症が増加している証拠は見出せず、Shannonらと一致したが［54］、Liebenbergら［50］とは異なり、これらの違いは、我々のコホートのWLWHが数年間ARTを受けており、したがって彼女らはHIV獲得のリスクのある女性ではなかったことに起因している可能性がある。また、他の研究で報告されているような乳酸菌とHR-HPV感染との関連も見いだせなかった。しかし、HPV感染のあるWLWHは、HPV感染のないSNWと比較して、IL-6およびCD8 +免疫活性化のレベルが最も高く、がん発生の危険因子であることが示されている慢性炎症の一般的な状態を反映していることが分かった[55]。
我々は、本研究にはいくつかの限界があることを認識している。第一に、比較的小規模のコホートであるため、研究グループ間の差異を検出する統計的検出力が低下している。本研究に参加した女性が細菌性膣炎（BV）であるかどうかについての情報が不足しており、女性はAmsel´s基準やNugentスコアリングを使用してBVと診断されていない。また、月経周期の時点など、いくつかの共変量に関する情報が欠落しており、性行為に関する情報も不完全であった。また、子宮頸部サイトブラシサンプリングでは、細胞収量が低すぎたため、フローサイトメトリーを実施することができなかった。また、V3-V4 16S領域の使用は属レベルの同定に最も適しており、Lactobacillusの種レベルの同定は、我々のプライマーの選択によって妨げられた可能性があることを認識している。
結論
L. inersの優勢は、HR-HPVの高い有病率と相まって、WLWHおよびSNWにとって臨床的に重要な意味を持つ可能性がある。したがって、WLWHはより綿密なフォローアップから利益を得ることができ、マイクロバイオームベースの介入策の候補となりうる。ART中のWLWHを含むHIVとHR-HPVの同時感染女性における宿主、VM、HPVの間の複雑な相互作用を理解するために、さらなる研究が必要である。
方法
倫理に関する声明
この研究プロトコルは、国立呼吸器病研究所（INER）の倫理委員会および研究倫理委員会によって承認された。参加者はすべて成人（18歳以上）であり、ヘルシンキ宣言に基づき、書面によるインフォームドコンセントを行った。サンプル採取と実験室での検査は、いずれも国立呼吸器病研究所（INER）の感染症研究センター（CIENI）で行われた。
被験者の登録
2016年4月から2017年1月にかけて、83名の女性を横断研究に登録した。研究参加者は、HIVの状態によってグループ分けされた。HIV非感染者（SNW、n＝39）およびHIV感染者（WLWH、n＝44）。WLWHは、すでにHPVサーベイランスプロトコルに参加しており、CIENIクリニックに定期的に通院しており（HPVフォローアップ検査のため6ヶ月から1年ごと）、自分のHIVの状態を認識していたため、便宜上登録した。SNWは、研究対象者を募集するための直接広告（募集ポスター、口コミ、口頭でのコミュニケーション）により登録された。すべての女性は、訓練を受けた女性医師により、社会人口統計学的特徴および性行動を網羅した構造化質問票を与えられた。
血漿中ウイルス量とCD4 + T細胞数
HIVの状態は、VIDAS® HIV Duo Ultra（VIDAS, BioMérieux）とGenscreen™ Ultra HIV Ag-Ab enzyme immunoassay（Evolis, Bio-Rad）による2回の連続測定によって確認された。この研究に参加したSWNは、いずれもHIV陽性と判定されなかった。HIV血漿中ウイルス量は、m2000システム（Abbott, Abbott Park, IL, USA）を用いた自動リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、40 HIV-1 RNA copies/mL を検出限界として測定した。リンパ球の集団 CD45、CD3、CD4、CD8（絶対数および％）およびCD4/CD8比は、FACScalibur装置（BD Biosciences, San Jose, CA）でMultitest CD45/CD4/CD8/CD3キットを用いたフローサイトメトリにより取得した。
HPV検出
女性は、CIENI, INERの医療従事者によって行われた骨盤内検査を受けた。まず、滅菌綿棒（Dacron Swab）を膣に挿入し、膣内pHを測定した。その後、湿らせた綿棒をpHインジケーターストリップ（N-Labstix, Siemens, Erlangen, Germany）の上に貼り付けました。pHストリップの色をカラーチャートと比較することでpH数値を決定し、記録した。次に、子宮頸部細胞診とHPV検査のために、それぞれ子宮頸部と膣の試料を採取した。子宮頸部細胞診は従来の細胞診で評価し、ベセスダ分類に従って報告した。HPV検査は、HPV16、HPV18および他の12の高リスクHPV遺伝子型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68）を検出するm2000システム（Abbott、Abbott Park、IL、米国）のAbbott Real-time High-Risk HPV assayを用いてリアルタイムPCRにより実施された。
検体採取
研究用サンプルは、訓練を受けた医療従事者によって収集され、子宮頸部サイトブラシ（Cervex Brush）1本と膣中部スワブ（Dacron Swab）3本が含まれました。また、骨盤検査時に18mLの末梢血液をエチレンジアミン四酢酸（EDTA）チューブを用いて静脈穿刺により採取した。研究用サンプル（子宮頸部サイトブラシおよび膣スワブ）は氷上に保管し、サンプリング後30分以内に研究室に輸送し、直ちに処理（子宮頸部サイトブラシ、EDTA血液）するか、必要時まで-80℃に保管（中膣スワブ）した。
サンプル処理
末梢血（18 mL）は、直ちに遠心分離で処理した。血漿サンプルは、使用するまで直ちに-80℃で凍結した。末梢血単核細胞（PBMC）は、製造者の指示に従って、lymphoprep（Axis-Shield、オスロ、ノルウェー）を用いた密度勾配遠心分離によって全血から精製された。PBMCは90％ウシ胎児血清（FBS, Gibco by Life Technologies, Washington, DC, USA）と10％ジメチルスルホキシド（DMSO, Sigma-Aldrich, California, USA）中で凍結保存された。子宮頸部細胞ブラシは、2mLのRPMI 1640培地を含む15mLコニカルチューブに入れ、直ちに氷上に置き、サンプリングから30分以内に実験室に輸送した。子宮頸部細胞は、振盪によってサイトブラシから除去し、さらにRPMI 1640培地1mLをサイトブラシに直接加えることによって、サイトブラシから細胞を洗い落とした。1,900 rpm、6分間の遠心分離により子宮頸部細胞を回収した。サイトブラシ上清を1mLずつ3本のチューブに分注し、直ちに-80℃で凍結した。回収した子宮頸部細胞はフローサイトメトリーに用いるには数が少なすぎたため、使用しなかった。
膣スワブからのDNA抽出
PureLink Microbiome DNA purification kit（ThermoFisher Scientific, Carlsbad, CA, USA）を用いて、製造者の説明書に従って、最初の膣スワブから細菌性DNAを抽出した。簡単に言うと、膣スワブを-80℃から実験室にドライアイスで移し、800 µlのS1-Lysis Bufferを含む1.5 mLのエッペンドルフ低粘性チューブに入れた。各チューブに100 µlのS2-Lysis Enhancerを加えてボルテックスした後、65℃で10分間インキュベートし、水平アダプター付きボルテックスで10分間ビーズビートを行った。DNA抽出を最大化するために、インキュベーションとビーズビートのステップでは綿棒を取り除かなかった。チューブを14,000×gで1分間遠心分離し、上清500μlを新しいチューブに移し、900μlのS4-Binding bufferを加えた。その後、スピンカラム-チューブアセンブリ（2×700 µl）に全混合物をロードし、14,000 ×g で1分間遠心分離した。500 µl の S5-Wash バッファーで遠心分離してスピンカラムを洗浄し、50 µl の S6-Elution バッファーで全 DNA を溶出させた。DNAの純度と品質は、Nanodrop N1000 (ThermoFisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) でA260/A280比を測定し、吸光度によって評価した。
16S rRNA 標的配列決定、処理および解析
各DNAサンプルについて、16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, San Diego, CA, USA)の指示に従い、若干の修正を加えて16Sアンプリコンライブラリーを調製した。PCR増幅は、V3-V4領域について公表されているプライマーを用いて行った：フォワード、5'-CCTACGGNGGCWGCAG-3´；およびリバース、5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3´[56]。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域は、3重のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。3 回の PCR 反応をサンプルごとにプールし、AgenCourt AMPure XP ビーズ (Beckman Dickson, Atlanta, Georgia) を用いて精製した。Nextera XT Index Kit (Illumina)を用いてデュアルインデックスを取り付けた。インデックスPCRクリーンアップステップを繰り返し、定量化、正規化、プーリングの前にインデックスライブラリーの完全な精製を確認した。ライブラリーは、Illumina MiSeq™プラットフォームで2×300サイクルのペアエンドシーケンスを行い、25％のPhiXを含む14 pMの最終濃度を設定した。試薬の汚染を考慮し、各DNA抽出およびライブラリー調製バッチのコントロールを並行して行った。Qiime2（Quantitative Insights into Microbial Ecology 2、バージョン2019.4）を使用して、高品質の配列を抽出した[57]。アンプリコンバリアント配列（ASV）の選択は、dada2 を用いて行った。総数1,422のASVが同定され、中央値172,046（IQR = 113,868.5-240,004.5） の配列がdada2の後に保持された。分類は、SILVA 99%データベースの参照配列（リリース132）に対してclassify-sklearn naïve Bayes taxonomy classifierを用い、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域に対して学習させてq2-feature classifierで割り当てました。系統樹は、すべてのASVをmafftで整列させた後、fasttree2（q2-phylogeny経由）で構築しました。Qiime2で生成されたアーティファクトは、Phyloseqパッケージを通してRソフトウェア（バージョン4.0.5）にインポートし、さらなる操作とグラフの視覚化を行った。Rarefactionは36,034配列/サンプルのサンプリング深度で行った（最も少ない配列を持つサンプルの90%に相当）。主座標分析（PCoA）を用いて微生物群集を可視化し、順列多変量分散分析（PERMANOVA）を用いてベータ多様性の違いを評価した（デフォルトパラメータ：順列999）。β多様性にはBray-Curtis非類似度を使用した。グループ間の微生物組成（タクサ）の有意差を確認するため、LDA閾値3以上で線形判別分析効果量（LEfSe）を行い、要因クラスカル-ウォリス検定のα値 0.05、ペアワイズウィルコクソン検定のα値 0.05 [58] とした。事前に、少なくとも5%のサンプルで5回以上見られなかったASVは、平均値の小さいASVや外れ値が含まれるのを避けるために、削除した。Spearman相関はrcorr()関数を用いて行い、corrplot()関数を用いて可視化した。
フローサイトメトリー
凍結保存したPBMCを解凍、洗浄、染色し、バッチテストを行った。活性化されたCD4およびCD8 T細胞は、以下の細胞外染色パネルを用いて同定した。Biolegend（米国カリフォルニア州サンディエゴ）のBV570-CD3（クローン：UCHT1）、BV605-CD8（クローン：RPA-T8）、BV711-CD38（クローン：HIT2）およびBV785-HLADR（クローン：UCHT1）、Invitrogen（ThermoFisher scientific, CA）のPE-Cy5.5-CD4（クローン：MHCD0418およびLIVE/ DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit）を使用した。染色は、LSR Fortessa FACS サイトメーター（Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA）上で取得された。品質管理は、BD cytometer Setup & Tracking Beads (BD biosciences, San Jose, California, USA)を用いて各実験で実施された。補正コントロールとして、個別に染色したビーズ（BD Comp Beads, eBiosciences, San Diego, CA, USA）を使用した。ゲーティングコントロールとしてFMO（fluorescence minus one）を使用した。データ解析はFlowJo V10 software (Tree Star, Ashland, OR, USA)を用いて行った。FlowAIを使用して、すべてのFCSファイルの品質管理を行った。合計で、記録されたイベントの中央値は、サンプルあたり185,909 [118026-302792]であった。ゲーティング戦略は、Additional file 14に示されている。
マルチプレックスビーズアレイキットによる可溶性マーカーの定量化
19種類のサイトカイン（G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40/p70) の濃度を測定した。IL-13, IL-15, IL-17, TNF-α）、7種類のケモカイン（Eotaxin, IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, RANTES）、4種類の成長因子（EGF, FGF-basic, Human cytokine Magnetic 30-Plex Panel (ThermoFisher Scientific, Vienna, Austria) を用いて、細胞破砕物の上清および血漿試料中の4つの成長因子（EGF、FGF-basic、HGFおよびVEGF）を測定し、Luminex™ 100™/200™ detection systemで読み取り、xPONENT™ software (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA) で分析しました。すべての標準品とサンプルは二重測定した。血漿および細胞ブラッシュ上清のサンプルは1:2に希釈した。すべての手順は、製造元の指示に従い、同じオペレーターが行った。凍結乾燥標準品は指示通りに再構成し、標準曲線を作成するために連続濃度で希釈した。標準曲線からサンプル濃度（pg/mL）を算出するために、5パラメータロジスティック回帰式を使用しました。その後の解析に含めるために、各分析物について以下の基準を用いた：60%以上のサンプルで検出限界内（検出下限以上、検出上限以下）に定量された、標準曲線を超えて外挿された値は決定値を割り当てた。成長因子、ケモカイン、サイトカインの濃度はlog10変換した（Shapiro-Wilk正規性検定で検証）。
統計解析
人口統計学的および行動学的データは、記述統計学を用いて報告した。連続変数の比較にはWilcoxon Rank Sum testを、カテゴリー変数にはchi square testまたはFisher's exact testを使用した。2群以上の比較にはKruskal-Wallis検定を用い、p値はDunn´s多重比較検定を用いて多重比較のために調整した。統計解析は、STATA/SE 14 (STATA Corp. LP, College Station, Texas, USA) および GraphPad Prism v8 (San Diego, California, USA) を用いて実施した。相関係数（rho）およびp値は，Spearmanの相関検定を用いて求めた．HPV感染と関連する危険因子を特定するためにロジスティック回帰分析を行った（予測因子：年齢、喫煙、初回性交年齢、総性的パートナー数、膣内pH、HIV、パリティ、コンドーム使用、STDの既往、子宮頸細胞診異常、乳酸菌の相対存在度）。すべての分析において、p値＜0.05は統計的に有意であるとみなした。
データおよび資料の利用可能性
16S rRNAの配列は、BioProject PRJNA814210の下、Sequence Read Archive (SRA)で入手可能である。本研究で使用・解析した他のすべてのデータセットは、対応する著者から入手可能であり、合理的な要求があれば利用できる。
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論文
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謝辞
本研究に参加されたすべての女性に感謝します。著者らは、QC. Ramón Hernández（Laboratorio de Diagnóstico Viral, CIENI-INER）およびQC. Edna Rodríguez（採血チーム、CIENI-INER）。また、査読者の方々からは、洞察に富んだコメントをいただきました。
資金提供
本研究は、メキシコ政府（Programa Presupuestal P016, Anexo 13 del Decreto del Presupuesto de Egresos de la Federación）からの資金援助により実施されたものである。
著者情報
著者名および所属
国立呼吸器疾患研究所感染症研究部 イスマエル・コジオ・ビレガス、Calzada de Tlalpan 4502, Colonia Sección XVI, Tlalpan, 14080, Ciudad de México, México
Monserrat Chávez-Torres、Maria Gómez-Palacio-Schjetnan、Olivia Briceño、Santiago Ávila-Ríos、Karla Alejandra Romero-Mora & Sandra Pinto-Cardoso
メキシコ、シウダッド・デ・メヒコ保健省、国立衛生研究所・高度専門病院調整委員会
Gustavo Reyes-Terán (グスタボ・レイエス＝テラン)
寄稿
データ取得。データ取得：MCT（DNA抽出、16Sターゲットシークエンス）、OB（フローサイトメトリー）、SPC（Luminex）、MG、KARM（サンプル収集、インタビュー、データベース）。データ解析。MCT、SPC。データ解釈。データ解釈：MCT、SPC。原稿作成。MCT、SPC。原稿の修正と承認。全著者。研究デザイン。研究デザイン：MG、KARM、SPC。説明責任。全著者。資金獲得。GRT、SAR。
著者情報
該当事項はありません。
対応する著者
Sandra Pinto-Cardoso に連絡すること。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
この研究計画は、国立呼吸器病研究所（INER）の倫理委員会および研究倫理委員会により承認され、参照番号 C46-12 が付与された。この研究は、1964年のヘルシンキ宣言とその後の修正に準拠して実施された。参加者はすべて成人（18歳以上）であり、本研究への登録前に書面によるインフォームド・コンセントを提供した。
出版に関する同意
該当なし
競合する利益
著者らは、競合する利益（金銭的、非金銭的）はないことを宣言している。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。
補足情報
追加ファイル1.
リプロダクティブ・ヘルスと性行為に関するデータ。
追加ファイル2.
WLWHのHIV臨床パラメータ（n=44）。
追加ファイル3.
HPV感染に関連するリスクファクター。
追加ファイル4.
サイトブラシ上清中のサイトカイン、ケモカイン、成長因子のLog10濃度（HIV/HPVの有無による層別
追加ファイル5.
血漿中のサイトカイン、ケモカイン、成長因子のLog10濃度（pg/mL）、HIV/HPV感染の有無による区分。
追加ファイル6.
血漿中IL-6濃度のLog10（pg/mL）、HIVおよびHPVの感染状況による層別化。
追加ファイル7.
HLADR+ CD38+ CD4+およびCD8+ T細胞の頻度、HIVおよびHPVの感染状況による層別化。
追加ファイル8.
HIVおよびHPVの感染状況別に層別したHLADR+ CD38+ CD4+およびCD8+ T細胞の頻度。
追加ファイル9.
アルファ多様性は、HIVの状態やHPVの状態によって異なることはない。
追加ファイル10.
ベータ多様性は、HIVの有無やHPVの有無による差はない。
追加ファイル11.
血清反応陰性女性およびHPV感染の有無にかかわらずHIVとともに生きる女性における膣内細菌叢の属レベルの分類学的プロファイル。
追加ファイル12.
HR-HPV感染の有無にかかわらず、HIV感染者と血清反応陰性女性の膣内細菌叢を種レベルで示した（上位20種）。
追加ファイル13.
LactobacillusとGardnerella、Prevotella、Dialister、Atopobiumの間に逆相関が見られた。
追加ファイル14.
代表的なゲーティング戦略。
権利と許可
この記事は、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。
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この記事の引用
Chávez-Torres, M., Gómez-Palacio-Schjetnan, M., Reyes-Terán, G. et al. HIVとともに生き、抗レトロウイルス療法を抑制中の女性の膣マイクロバイオータと高リスクのヒトパピローマウイルス感染との関連性. BMC Microbiol 23, 21 (2023)。https://doi.org/10.1186/s12866-023-02769-1。
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受付終了
2022年5月31日
受理済
2023年1月11日
公開
2023年1月19日発行
DOI
https://doi.org/10.1186/s12866-023-02769-1
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