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サルモネラ菌が解放した食餌性L-アラビノースはスーパースプレッダーで拡大を促進する。

哉百名


細胞宿主と微生物
第31巻 第3号 2023年3月8日 405-417.e5ページ
論文
サルモネラ菌が解放した食餌性L-アラビノースはスーパースプレッダーで拡大を促進する。
著者リンクを開く オーバーレイパネルSarah J. Ruddle 1, Liliana M. Massis 1, Alyssa C. Cutter 1, Denise M. Monack 1 2
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https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.01.017Get 権利と内容
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ハイライト

S. Tmスーパースプレッダーマウスは、非スーパースプレッダーと比較して、腸内メタボロームが異なる

S. TmはL-アラビノースを使ってGI管内で展開する

S. Tmはα-N-アラビノフラノシダーゼを介して食物L-アラビノースを獲得する（STM0148）。

S.Tmスーパースプレッダーマウスの出現には、L-アラビノースの獲得が重要である
概要
スーパースプレッダー宿主の消化管（GI）における宿主-病原体相互作用の分子的理解は不完全である。無症状のSalmonella enterica serovar Typhimurium（S.Tm）慢性感染モデルマウスにおいて、マウスの糞便を対象にアンターゲットメタボロミクスを実施し、スーパースプレッダーホストが非スパースプレッダーと比較して、L-アラビノースのレベルの差を含む明確な代謝シグニチャーを有することを明らかにした。スーパースプレッダー糞便サンプルのS. TmのRNA-seqは、in vivoでL-アラビノース異化経路の発現が増加することを示しました。我々は、細菌の遺伝学と食餌操作を組み合わせることで、食餌由来のL-アラビノースがS. Tmに消化管での競争力を与えること、そしてS. Tmが消化管で拡大するには、食餌多糖類からL-アラビノースを遊離するα-N-アラビノフラノシダーゼを必要とすることを証明した。最終的には、食餌から解放されたL-アラビノースが、生体内でS. Tmに競争上の優位性をもたらすことが示された。これらの結果から、L-アラビノースは、スーパー・スプレッダーホストの消化管におけるS. Tmの増殖の重要なドライバーであることが示唆された。

図解抄録
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キーワード
腸内細菌
L-アラビノース
グリコシドヒドロラーゼ
アルファ-N-アラビノフラノシダーゼ
スーパースプレッダ
サルモネラ菌
繊維
はじめに
Salmonella Enterica serovarsは、世界中で何百万もの感染症の原因となっています。病態は、自己制限性胃腸炎から侵襲性腸熱まで多岐にわたり、後者はヒトに適応したS. Enterica serovar Typhi (S. Typhi) によって引き起こされる1。マウス口腔感染モデルでは、S. Enterica serovar Typhimurium (S. Tm) は盲腸と結腸に強固にコロニー形成する2 。S. Tmはこれらの場所から糞便を介して環境に排出され、未経験ホストに感染できる3 。感染効率は、糞便中の細菌量の増加と関連しており、排出量の多い宿主（スーパー・スプレッダーと呼ばれる）がほとんどの感染経路を担っています4。感染者の一部はキャリアとなり、サルモネラを糞便中に持続的に排出し、病原体のリザーバーとして機能しています。最も有名なスーパー・スプレッダーであるMary Mallonは、世紀末にコックとしてS. Typhiに感染させた数十人の人々のために、Typhoid Maryという名で記憶されています5,6。サルモネラは、宿主細胞や競合する腸内細菌にエフェクタータンパク質を送り込む分泌システムをコードするSalmonella pathogenicity islands (SPI-1), SPI-2, SPI-6などのいくつかの主要な病原性因子を利用して、消化管に定着し、高レベルで増殖しながら、同時に常在菌と資源を争うことになります2、7。微生物とサルモネラの相互作用がサルモネラの排出レベルに影響を与えることが示されているが8、スーパースプレッダーと非スプレッダーを区別する特定の特徴は依然として不明である。
腸管に生息する複雑な微生物群集は、コロニー形成抵抗性と呼ばれる直接的および間接的なメカニズムを通じて、病原体の侵入を防ぐ上で重要な役割を担っている9。私たちや他の研究者は、抗生物質の経口投与が病原体の拡大や糞便排出を促進することから、常在細菌群がS. Tm感染に対してコロニー形成抵抗を示すことを実証しました10、11。腸内S. Tm感染に対するコロニー形成抵抗性のメカニズムは、主にマウスを抗生物質で前処理し、高いレベルの炎症を引き起こすマウス大腸炎感染モデルで研究されています。10 また、複数の研究がこの大腸炎モデルを用いて、S. Tmが抗生物質処理したマウスの消化管内で増殖する代謝経路に光を当てています8。例えば、S. Tmは宿主の免疫反応によって生成された硝酸塩を電子受容体として利用し、嫌気性呼吸の燃料とします12。これにより、S. Tmは常在細菌叢を追い出すことができます13、14。炎症が起きた消化管は、S. Tmがその代謝に変化をもたらし、エタノールアミン、フルクトース・アスパラギン、1,2-プロパンジオル、プロピオネートのように呼吸が必要な炭素源の活用を開始するという独自のニッチと言えます15、16、17、18。しかし、この抗生物質投与マウスモデルでは、常在微生物群集の崩壊により、一部の個体が慢性的な無症候性スーパースプレッダーとなるヒトの臨床感染症への機構的知見の一般化には限界があった。そこで、本研究では、抗生物質を前処理しないS. Tm経口感染マウスモデルを用いて、スーパー・スプレッダーの出現を促進するサルモネラ菌のコロニー形成のメカニズムを明らかにすることにした。
従来のマウスモデルでは、サルモネラは常在細菌と栄養ニッチを直接争わなければならない19。食事には食物繊維の主成分である複合炭水化物が含まれており、常在細菌と病原性細菌の両方にとって主要な代謝入力となる20。常在細菌が複合炭水化物を処理できることは、消化管への定着に不可欠である。常在細菌は、特定のグリコシド結合を切断してオリゴ糖や単糖を遊離させ、異化するグリコシドヒドロラーゼによって複合糖質を処理する21。ある細菌は、急速輸入システムのメカニズムによって競合する微生物から遊離糖質を隔離するように進化し22、他の細菌は、いわゆるクロスフィードイベントによって複合糖質の分解に一斉に取り組む23。サルモネラは、宿主由来の粘液から常在菌が解放したフコースとシアル酸を異化して大腸炎モデルに定着させることで、クロスフィーディングに参加できる24。これらの研究により、常在菌による食事性糖質処理に関する理解が進んだが、サルモネラなどの病原体が感染時に複合糖質をどのように利用するか、またこれらの代謝過程がスーパースプレッダーに対してどのように影響するかはほとんど分かっていない。
感染時には宿主、マイクロバイオーム、病原体の代謝ネットワークが相互に関連しており、スーパースプレッダーの背景にある代謝シグネチャーを深く理解することで、感染制御に関連する知見が得られるかもしれません。本研究では、スーパースプレッダーと非スーパースプレッダーマウスでアンターゲットメタボローム解析を行い、スーパースプレッダーに特有の代謝状態を明らかにしました。スーパー・スプレッダー糞便由来のS. Tmの転写プロファイルを解析することで病原体特異的な因子に焦点を絞り、L-アラビノース代謝がGI管におけるサルモネラ菌の拡大に重要な経路であることを明らかにしました。さらに、食事性L-アラビノースを外因的に補充することで、スーパースプレッダーの急速な出現を促進することを明らかにした。L-アラビノース異化作用は、GI管におけるサルモネラ菌に強い競争力を与え、それは微生物相とは無関係であることを実証した。さらに、サルモネラ菌が消化管に定着する際に重要な役割を果たす、これまで知られていなかったα-N-アラビノフラノシダーゼを同定しました。これらの結果から、サルモネラ菌の慢性感染モデルマウスにおいて、代謝物依存的に病原体が拡大するメカニズムが明らかになりました。
研究成果
サルモネラ菌のスーパースプレッダーは、代謝の特徴がはっきりしている
慢性感染マウスの遠位消化管におけるサルモネラ菌の増殖に影響を与える分子機構は不完全にしか解明されていない。病原体拡大のメカニズムについて理解を深めるため、95匹の129X1/SvJマウスに野生型（WT）S. Tm株SL1344を胃内接種し、感染後7、14、21日（DPI）の糞便中の菌量を定量した（図1AおよびS1A）。既報の通り、マウスは時間の経過とともに様々なS. Tmを糞便中に排出し、約20％のマウスが>108コロニー形成単位（CFU）/g糞便を排出し、我々はこれをスーパー・スプレッダー4と定義しました（図1B）。さらに、28DPIに脾臓、肝臓、腸間膜リンパ節（MLN）、便内容物、および糞便を採取し、これらの異なる感染部位におけるS. Tmレベルを定量化して糞便排出量と比較した。糞便中の病原体負荷は、検出レベルから109 CFU/g糞便までマウス間で差があったが、全身組織中のS. Tmレベルには有意差はなかった（図1C）。S. Tmレベルの不均一性は遠位GI管に限定されており25、遠位GI管特異的代謝物が病原体の拡大に影響を与える可能性が示唆された。
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図1. S. Tmスーパースプレッダーは、明確な代謝景観を共有する
(A) メタボロームプロファイリングのための感染模式図。129X1/SvJマウスに108CFUのS. Tmを感染させ、糞便メタボロミクスを非標的化した。マウスは指示された時点でサンプリングされた： 感染後0日、7日、14日、21日。
(B) 感染後7、14、21日の129X1/SvJのS. Tm CFU/g糞便(n = 95)。黒丸は、糞便代謝物プロファイリングのために各排泄層（低排泄、中排泄、超排泄；n = 5）から選択したマウスを示す。
(C) 感染後28日目に糞便メタボロミクスを実施した15匹のマウスの臓器におけるS. Tm負荷。
(D) 4つの時点における20匹のマウスの糞便メタボロームの主成分分析、CFUによる色分け、感染後日数（0-21 DPI）によるサイズ分け。
(E）多重仮説補正（BenjaminiおよびHochberg補正を用いた尤度比検定）による、14DPIにおける非スーパースプレッダーとスーパースプレッダーとの差分パスウェイ濃縮。
図S1も参照。
S. Tm感染時に腸の代謝ランドスケープがどのように変化するかをよりよく理解するために、GI管内の細胞外代謝物について、不偏的で半定量のプロファイリングを経時的に実施した。具体的には、低レベル（102-104 CFU/g）、中レベル（104-108 CFU/g）、またはスーパースプレッダー（>108 CFU/g）の病原体を排出したマウス（排出グループごとにn = 5、図1A）から糞便サンプルを採取し、超高性能液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（UHPLC/MS）に供した。感染マウスにおいて、糞便中の797種類の代謝物の相対量を経時的に測定し、模擬処置マウスと比較した（Metabolon、米国）。経時的なサンプルの解析により、経時的にスーパースプレッダーで発現する明確な代謝シグネチャーが同定された（データS1）。全データセットの主成分分析（PCA）では、メタボロームに対するS. Tmの負荷（log CFU）の影響はPC1（図1D）でほぼ把握され、最初の2つのPCがデータセットの変動の38.4％を占めていました。PCAでは、シェディング層によるパーティショニングが見られ（図1D）、スーパースプレッダーは低・中等度シェッダーから離れた場所にまとまっており、スーパースプレッダーは低・中等度シェッダーと比較して異なるメタボロームを共有していることが示されました。
経路濃縮分析により、感染期間中、スーパースプレッダーと非スプレッダーマウスで有意に濃縮された代謝経路が特定された（図1E、S1B、S1C、Benjamini & Hochberg補正による尤度比検定）。アシルカルニチン、ペントース、γ-グルタミルアミノ酸、ホスファチジルコリン代謝は、14DPIにスーパースプレッダーと非スーパースプレッダーの糞便で濃縮された経路の一つです（図 1E）。14DPIに採取された非スーパースプレッダー糞の濃縮経路には、二次胆汁酸、ジペプチド、分岐脂肪酸の代謝経路が含まれている（図1E）。各時点での経路の濃縮度を比較すると、感染の時間経過に伴って起こる代謝の流れが明らかになる。例えば、アシル-コリンおよびトコフェラル代謝は、7DPIにおいてのみ、非スーパースプレッダーマウスに対してスーパースプレッダーマウスで濃縮されている（図S1B）。一方、セラミドのような代謝経路は、14DPIと21DPIでスーパースプレッダーと関連する（図1E、S1B、S1C）。これらの結果から、スーパースプレッダーマウスの代謝経路は、S. Tm感染時の管腔栄養供給量の変化を反映している可能性があることが示唆された。
S. スーパー・スプレッダー・マウスの消化管におけるS. Tm遺伝子発現
次に、メタトランスクリプトーム解析を行い、スーパースプレッダーの明確な代謝環境での拡大をサポートするS. Tmの表現型に優先順位を付けました。メタトランスクリプトミクスは、GI微生物群全体のmRNAを定量化し、どの遺伝子がコンテキスト間で異なる発現をしているかを示すことができます。マウスにS. TmのWT株SL1344（S. TmWT）を感染させ、糞便の排出量を経時的にモニターした（図2A）。7、14、21DPI後、マウスを安楽死させ、セカール内容物と糞便を採取して全RNA抽出（宿主、常在微生物、S. TmのRNAを含む）を行った。各時点で3匹のスーパースプレッダーマウスをバルクin vivo RNA-seqに使用した（図2A）。混合微生物群集のin vivo RNA-seqの技術的限界は、低存在量で存在する細菌種を頑健に検出することを妨げる。これまでの研究から、ダウンストリーム解析のために適切な数のリードを回収するためには、対象となる微生物が全コミュニティの約1%存在する必要があることが分かっています。この制限のため、RNA-seqは、108 CFU/g以上のS. Tm（スーパースプレッダー）を保有するマウスでのみ行われました。In vivoサンプルあたり879,396～2,209,413リードが参照S. Tmゲノムにアライメントされました（総リード数0.94～3.05％）。生体内サンプルに加え、好気的および嫌気的にミッドログ期、ログ期、定常期まで増殖させたLB培養のS. TmからRNAを抽出した。すべてのin vitro条件とすべてのin vivo条件のS. Tmトランスクリプトームを比較するPCA分析では、in vivoデータはPC1に沿ってin vitroサンプルと分離することが示された（図S2A）。その結果、in vivo（盲腸と糞）とin vitroで培養したS. Tmの間で1,755個の異なる発現遺伝子が見つかりました（調整p < 0.05, Benjamini & Hochberg修正による尤度比検定）。
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図2. S. Tmスーパースプレッダーのin vivo糞便トランスクリプトミクスにより、炭水化物利用の変化を発見
(A) 129X1/SvJマウスに108 CFUのWT S. Tmを感染させ、in vivo RNA-seqを行った。赤色のデータポイントは、7、14、21DPIの糞便のメタトランスクリプトーム解析のために選択されたスーパースプレッダーマウスを示し、各時点でn = 3。
(B）in vitro（青）およびin vivo（赤）で有意に差次的に発現した遺伝子。有意でない濃縮遺伝子は灰色で、-log10調整p値およびlog2倍率変化。
(C) in vitro (青) と in vivo (赤) で濃縮された代謝物 (調整済み p 値 < 0.05; Benjamini and Hochberg 修正) の log2 fold change。各データポイントは、各サブパスウェイ内の単一代謝物を表す（y軸）。サブパスウェイは、対応する主要パスウェイ（y軸に沿った括弧）で注釈されている。
(D) araB、araA、araDのin vitro（青）およびin vivo（赤）における100万個あたりの転写産物。∗∗Welchの補正を加えたt検定で0.01未満とした。
(E) caiAとcaiTのin vitro（青）とin vivo（赤）での100万回あたりの転写数。∗ウェルチ補正によるp＜0.05のt検定。
図S2も参照。
いくつかの代謝経路に関与する遺伝子は、in vitroサンプルと比較して、スーパースプレッダーマウスのS. Tmで濃縮された（図2B）。ssaV、sifA、pipB2、sseIなどの既知の病原性因子をコードする遺伝子は、in vitroの増殖条件と比較して、消化管では低いレベルで発現した。これは、これらの病原性因子の発現が、腸内腔での増殖よりも、組織でのS. Tmの増殖と生存に重要であることと一致している26, 27。一方、フコース代謝（fucA, fucO, fucK）24,28やフィンブリア遺伝子（stdA, stdB）29,30など、GI管のサルモネラ菌コロニー化に影響を与えることが以前に証明されている遺伝子は、in vitro増殖条件と比較してGI管で高いレベルで発現した（図2B）。また、S. Tmがスーパースプレッダーホストで受ける転写変化の概要をin vitroの増殖条件と比較して可視化するために、有意に濃縮されたすべての遺伝子のlog2倍変化を機能パスウェイでプロットした（図S2B）。トランスクリプトミクスとメタボロミクスから、重複して濃縮されたパスウェイが観察された。例えば、炭水化物およびカルボキシル酸分解経路の遺伝子転写はin vivoで濃縮され（図S2B）、ペントース代謝産物の変化はスーパースプレッダーで濃縮されていた（図1E）。S. Tmの糖質異化ダイナミクスを詳しく見るために、糖質分解経路とカルボキシレート分解経路に関わる遺伝子のlog2倍変化をプロットしたところ、L-アラビノース分解がin vivoで最も濃縮されている経路であることがわかった（図2C）。興味深いことに、グルコース分解遺伝子の転写はin vitroよりもin vivoの方が低く、これはS. TmにおけるL-アラビノースとグルコース利用の相互調節と一致した31。in vivoのS. Tmから分離されたL-アラビノース利用オペロン（araB、araA、araC）の転写はin vitro条件と比較して約100倍高かった（Figure 2D).
L-アラビノース異化に加え、カルニチン異化遺伝子転写物（caiA、caiT）のレベルは、in vitroで増殖したS. Tmと比較して、スーパースプレッダー盲腸および糞便から分離したS. Tmで濃縮されていました（図 2E）。また、メタボロミクスデータから、アシルカルニチン経路がスーパースプレッダーで濃縮されていたことから、スーパースプレッダーが独自のカルニチン代謝プロファイルを持つことが示されました（図1E）。これらのデータから、S. TmのL-アラビノースとカルニチンの異化は、スーパースプレッダー消化管のコロニー形成に関与している可能性があることが示唆されました。
スーパースプレッダーマウスにおけるL-アラビノースおよびカルニチン代謝の変化
スーパースプレッダーマウスから分離したS. TmのL-アラビノースおよびカルニチン代謝遺伝子の発現量が増加していたことから、これらの経路の生体内での役割に注目した。その結果、スーパースプレッダーでは、非スーパースプレッダーと比較して、ペントース代謝およびアシルカルニチンサブパスウェイに有意差があることが確認された（図1E）。L-アラビノースの鱗片状レベルは、時間の経過とともにスーパースプレッダーマウスで減少したが、非感染者、低感染者、中等度シェッダーで一定であった（図3A）。14DPIにおける非感染マウスとスーパースプレッダーマウスのL-アラビノース/g糞便を標的LC/MSで定量することにより、L-アラビノースレベルを確認した。鱗片状代謝物レベルと同様に、未感染マウスと比較してスーパースプレッダーマウスの糞便中のL-アラビノースレベルは有意に低かった（図3B）。これらのデータから、S. Tmはスーパースプレッダーマウスの腸管内腔でL-アラビノースを消費しているとの仮説を立てた。腸内細菌科におけるL-アラビノース代謝は比較的よく特徴付けられているが、32,33感染時のL-アラビノース代謝の役割については詳しく研究されていない。細胞内では、リブロキナーゼAraBとL-アラビノースイソメラーゼAraAが、L-アラビノースからL-リブロース-5-リン酸を生成する。そして、L-リブロース-5-リン酸4-エピメラーゼであるAraDは、L-キシルロース-5-リン酸を生成します。L-キシルロース-5-リン酸は、確立された下流経路でさらに処理され、最終的にペントースリン酸経路またはTCAサイクル35に送られる（図3C）。アシルカルニチン経路のほとんどの代謝物は、スーパースプレッダーマウスで経時的に増加したが、低・中等度シェッダーマウスでは一定であった（図3D）。L-カルニチン：γ-ブチロベタインアンチポーターであるCaiTを介して細胞内に取り込まれたS. Tmは、図3Eに示すようにL-カルニチンを分解します36。カルニチン誘導体の代謝物レベルおよび遺伝子発現変化から、GI環境においてS. Tmがその余剰分から利益を得られるかどうかに疑問を持ちました。
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図3. L-アラビノース代謝はスーパースプレッダーマウスにおけるS. Tmの拡大に重要である。
(A) 脱落層を超えてコロニー形成された未感染マウスおよび感染マウスの便から検出されたL-アラビノースの代謝物レベルのスケールアップ。
(B）非感染マウスおよびスーパースプレッダーマウスの糞便（14DPI採取）中に検出されたL-アラビノースレベルを標的LC/MSにより測定した。
(C) Salmonella EntericaにおけるL-アラビノース異化の簡略図。
(D) 全脱落層と4つの時点（0-21DPI）のカルニチン代謝経路の代謝物量をスケーリングして示したヒートマップ。
(E) S. TmにおけるL-カルニチン異化の模式図。
L-アラビノース異化作用はGI管内でS. Tmに競争優位性を与える。
スーパー・スプレッダーにおけるメタボロームデータとトランスクリプトームデータの重複から、S. TmはL-アラビノースやL-カルニチンを利用して遠位GI管で増殖するという仮説が立てられた。これらの経路の重要性を検討するため、過去の齧歯類研究で表現型を付与するのに十分な濃度である1%の外因性L-アラビノースまたは1%のL-カルニチンを感染開始時にマウスの飲料水に添加し、感染期間中、マウスをその飲料水で維持しました。驚くべきことに、S. Tmは、外因性L-アラビノースを与えられたマウスの消化管で急速に増殖し、外因性L-アラビノースを与えられたマウスの平均排菌量は、3DPIまでにコントロールマウスの100倍以上となった（図4A）。一方、外因性L-カルニチンを投与したマウスは、感染期間中、対照（標準）水を投与したマウスと比較して、同レベルのS. Tmを排出した（図4B.） L-アラビノースを添加したマウスではS. Tmが劇的に拡大したことから、外因性のL-アラビノースがマウスに及ぼす間接的な影響に疑問を抱きました。炎症は、外因性の呼吸性電子受容体の使用、発酵産物の摂取、酸化糖など様々なメカニズムにより、消化管におけるS. Tmの増殖を促進することがよく立証されている40。外来性のL-アラビノースによってS. Tmが利用しやすい炎症環境が作られているかどうかを調べるために、非感染マウスとS. TmWT感染マウスの外来性L-アラビノースの有無による糞便中の炎症マーカーLipocalin-2と炎症性サイトカインmRNAレベルのプロファイルを調べた。糞便中のリポカリン-2レベル（図S3A）、または結腸もしくは脾臓中の炎症性サイトカインであるインターフェロンγ、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-1β、もしくはインターロイキン-6のmRNA転写物（図S3BおよびS3C）に有意差はなかった。これらのデータから、S. Tmは炎症とは無関係に、L-アラビノースを用いて消化管内で増殖することがわかった。外来性L-アラビノースの増加による間接的な炎症を除外すると、アラビノースはGI管内でS. Tmにとって重要な炭素源であるとの仮説が導かれました。
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図4. L-アラビノースの利用がS. Tmのin vivoでの競争優位性をもたらす
(A）129X1/SvJマウスにS. TmWT（SL1344）を感染させ、10日間にわたりCFU/g糞便を定量化した。白の点はコントロールマウス（n = 18）、緑の点は飲料水を通じて1％の外因性L-アラビノースを与えたマウス（n = 18）を示す。∗∗p＜0.001、∗∗p＜0.0001 複数回マン・ホイットニー検定。
(B）129X1/SvJマウスにWT S. TmWT（SL1344）を感染させ、10日間のCFU/g糞便を定量化した。白い点はコントロールマウス（n = 20）、オレンジ色の点は飲料水を通じて1％の外因性L-カルニチンを与えたマウス（n = 10）を示す。複数のMann-Whitney検定により、グループ間に有意差はない。
(C）129X1/SvJマウスに、表示菌株の等量混合物を接種した。感染後3、7、14、21日目に糞便中の2株の競合指数を測定した。
(D）129X1/SvJマウス（図4Aより）を21DPIに安楽死させ、臓器収集を行った。脾臓、腸間膜リンパ節、便内容物、および糞をホモジナイズし、CFUおよび競合指数についてプレーティングした。
(E）129X1/SvJマウスに、示された株の等しい混合物を接種した。1群のマウスには1％L-アラビノース飲料水（緑色）を与えた。感染後7日目および14日目に便中の競合指数を測定した。n = 10マウス／群。
(F）無菌マウスには、感染1日前に指示された食餌条件を与えた。マウスは、S. TmorgAssaVとS. TmorgAssaVaraBADの等しい混合物に感染させた。競争指数は、感染後7日目および14日目に測定した。n = 5/グループ。
各ドットは、1匹の動物（生物学的複製）からのデータを表す。スケールバーは±SEMを表す。∗p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001, p < 0.0001. 特に断りのない限り、マン・ホイットニーU検定。
図S3および図S4も参照。
L-アラビノース利用経路またはカルニチン分解経路が消化管におけるS. Tmの適性に優位性を与えるかどうかを調べるために、WT S. Tmと変異体の等しい混合物をマウスに感染させ、感染経過中の複数の時点で競争指数（CI）を算出した。129X1/SvJマウスのグループに、S. TmWT株とL-アラビノース異化作用変異株ΔaraBAD::KanR（S. TmaraBAD）またはカルニチン異化作用変異株ΔcaiTABCD::KanR（S. Tmcai）を等分して経口接種した。ポジティブコントロールとして，WT S. Tmと，S. Tmの3型分泌系（T3SS）の重要な構成要素を欠損し，従来のマウスへのコロニー形成が抑制された株ΔorgAΔssaV::KanR S. Tm（S.TmorgAssaV）を等量混合して経口投与した11．予想通り、S. TmWTはS. TmorgAssaVに勝り、14DPI時のCIは約100となった（図4C）。一方、S. TmWT株とS. Tmcai株は、21日間の感染期間中、同様に適合していた（図4C）。L-カルニチン欠損変異体はマウスの消化管に異常を認めなかったので、その後の競合実験では、この変異体をカナマイシン耐性遺伝子の染色体挿入のコントロールとして利用した。その結果、S. TmaraBAD株はS. TmWT株と比較して14DPI後に競争上の不利益を被り、マウスのGI管におけるCIは1,000を超え（図4C）、これは対照のT3SS欠損株で見られた体力障害よりもさらに高いものだった。これらの結果から、L-アラビノース代謝はS. TmのGI管内における競争優位性を示すことがわかった。
S.TmがL-アラビノースを利用することで、他の組織でも競争上の優位性があるかどうかを調べるため、21DPI時にセカール内容物、MLN、脾臓のS.Tmレベルを測定した。その結果、S. TmWT株はS. TmaraBAD株に比べ、セカール内容物中で優位に立った（図4D）。一方、S. TmWT株とS. TmaraBAD株はMLNと脾臓で同等の適合性を示した（図4D）。このことから、L-アラビノース代謝はGI管において特にS. Tmに競争優位性を付与することがわかった。
これらの結果から、食餌性L-アラビノース補給により、WT株とL-アラビノース異化欠損S. Tm変異株との間の競合がより大きくなるとの仮説を立てた。この仮説を検証するため、2群の129x1/SvJマウスにS. TmWT株とS. TmaraBAD株の1：1混合物を感染させた。この2群のうち1群には、感染時および感染期間中、飲料水中に1%の外因性L-アラビノースを投与した。その結果、WT S.Tm株がS.TmaraBAD株を上回るキネティクスは、飲料水にL-アラビノースを添加したマウスで有意に速いことが判明した（図4E）。特に、S. TmWT株はS. TmaraBAD株よりも早く7DPIでCI約1,000を獲得し、2週間後にはCIが約10,000となった（図4E）。これらの結果は、L-アラビノースがS. Tmにとって利用可能な炭素源であり、AraBADを介したその異化がGI管のコロニー形成と拡大に寄与するというモデルと一致する。
これと並行して、外因性L-カルニチンがS. Tmcaiと比較してWT S. Tmの競争優位性につながるかどうかを評価した。マウスには、感染期間中、標準的な水または1%L-カルニチン水を与えた。マウスが1%L-カルニチン水を摂取していることを確認するため、追加グループのマウスに毎日200μLの標準水または1%L-カルニチン水をガブ飲みさせた。いずれの試験条件においても、WT S. Tmに対する競争優位性は見られなかった（図S4A）。これらのデータを総合すると、S. Tmはマウス慢性感染時にL-カルニチン分解から直接利益を得ることはないことが示唆された。CIが約1であることから、S. Tmcaiはカナマイシン耐性遺伝子の染色体挿入のコントロールとして機能し続ける。今後は、S. Tm感染時のL-アラビノース代謝のメカニズムを解明していくことを選択した。
S. TmのL-アラビノース代謝のGI管における競争優位性は、常在菌に依存しない。
S.Tmが腸管に定着する際にL-アラビノースの利用が重要な役割を果たすことを踏まえ、次にS.Tmがスーパースプレッダーマウスの腸管内腔でどのようにL-アラビノースを獲得するのかを明らかにしようと考えた。マウスでは、L-アラビノースは繊維状の食物成分の植物性多糖類に含まれており、遊離のL-アラビノースを遊離させるために微生物特異的な酵素であるグリコシドヒドロラーゼが必要となる41。S.Tmが感染時に使用する遊離L-アラビノースを消化管内腔で遊離させるのは微生物相であるかどうかを調べるため、我々は無菌マウスで一連のCI実験を実施した。感染1日前に、無菌マウスに標準食と標準水、アラビノースフリー食と標準水、または1％L-アラビノースを含む標準食と水のいずれかを与えた。WTのS. Tmは無菌マウスに致死的であり42、S. Tmが宿主の生存率を維持しながらマウス消化管に定着するためには、両方のT3SSが機能的に不活性でなければならない43。そこで、他の常在微生物がない場合のS. Tmの体力と代謝を評価するために、無菌マウスに1：1混合株のS. TmorgAssaVとS. TmorgAssaVaraBAD株を経口感染した。アラビノースを含まない飼料を与えたマウスでは、S. TmorgAssaV株はL-アラビノース利用変異株であるS. TmorgAssaVaraBAD株と比較して競争優位性を示さなかった（図4F）。一方、粗製植物原料（食物繊維）の形でL-アラビノースを含む標準飼料と標準水を与えたマウスでは、S. TmorgAssaV株はS. TmorgAssaVaraBAD株よりも著しく適合性が高かった（図4F）。さらに、標準食と1％L-アラビノース水を与えたマウスでは、S. TmorgAssaV株がS. TmorgAssaVaraBAD株をより迅速かつ有意に凌駕することを見出した（図4F）。また、LC/MSにより、従来の129X1/SvJマウスモデルで得られた知見と同様に、gnotobiotic（ex-germ-free）においてS. Tmのコロニー形成中にL-アラビノースのレベルが低下することを確認した（図S4B）。これらのデータを総合すると、常在細菌叢が存在しない場合でも、L-アラビノースを異化できるS. Tmは競争上有利であることが明らかになった。
S. Tm arabinofuranosidaseは、GI管においてS. Tmに競争上の優位性を与える。
L-アラビノース異化によってもたらされるS. Tmの体力向上は微生物相に依存しないことから、S. Tmは生体内で植物多糖類から遊離L-アラビノースを解放し、自ら利用する機能能力を有すると仮定した。この仮説を検証するために、まずS. Tmのアラビノース解放酵素の候補を特定するためにNCBIデータベースを用いた塩基配列BLAST検索を行ったところ、多くのSalmonella Entericaゲノムに、特徴あるα -N- arabinofuranosidaseと高い配列相同性を有する未特定の遺伝子がコードされていることがわかった。Carbohydrate-active enzymes database (CAZy; http://www.cazy.org)では、S. Tm SL1344で予測される全48種類のグリコシドハイドロラーゼのうち、S. Tmが単一のアラビノフラノシダーゼをコードしていると予測された（表 S1）。Phyreを用いてこの未知のハイドロラーゼの構造を予測したところ、基質との結合と酵素活性を司る重要な残基は、このタンパク質とこれまでに特徴付けられたα-N-アラビノフラノシダーゼとの間で保存されていた（図S5A）44）。重要なことは、トランスクリプトームデータから、この推定ヒドロラーゼ（STM0148）が生体内で異なる発現をしていることが明らかになったことである（図5B）。これは、S. Tmが消化管のコロニー形成時にこの酵素を発現することを強く示唆している。さらに、S. Tm SL1344のα-N-アラビノフラノシダーゼの塩基配列を他のSalmonella serovarsの塩基配列とアライメントしました。その結果、SL1344は、MAFTを用いてアライメントしたところ、ST313分離株のS. Tm D23580およびS. Tm (4, [5],12:i:-) と100%の配列相同性を有することがわかった。SL1344の塩基配列を侵襲性血清であるS. Dublin、S. Paratyphi A、S. Typhi（Ty2）と比較したところ、一塩基多型（SNPs）を確認した。また、言及したすべての血清群のアミノ酸配列をSL1344のアミノ酸配列に整列させたところ、侵襲性血清群のアミノ酸配列に違いが認められました。しかし、α-N-アラビノフラノシダーゼの機能に重要な残基には変化が見られませんでした（図S5B）。
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図5. S. Tmは機能的に保存されたアラビノフラノシダーゼを使用してGI管にコロニーを形成する
(A) Phyreで作成したSTM0148の予測構造。紫色でハイライトされた重要な残基がL-アラビノースを囲んでいる。コールアウトは、S. Tmの重要な残基（紫色）と、Cellvibrio japonicus（PDBアクセッション3QEE）のアラビノフラノシダーゼ酵素（ティール色）、Bacillus subtilis（PDBアクセッション3C7G）、Streptomyces avermitilis（PDBアクセッション3AKH）オレンジ色の構造アライメントを示します。L-アラビノース分子はS. avermitilis構造(3AKH)に由来している。
(B) Salmonella Typhimurium putative arabinofuranosidase (STM0148)はin vitroと比較してin vivoでは異なる発現を示した。
(C）129X1/SvJマウスに標記菌株を等量混合して接種した。感染後7日目および14日目に糞便からの競合指数を測定した。各ドットは1匹の動物（生物学的複製）のデータを表す。スケールバーは±SEMを表す。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001。Mann-Whitney U.
(D) 129X1/SvJ マウスに S. TmWT と S. Tm0148 の等量混合物を接種した。緑色で示した指示グループの飲料水に外因性L-アラビノースを供給し、紫色で示した指示グループにはアラビノースフリー食を与えた。競合指数は7DPIで決定した。各ドットは1匹（生物学的複製）のデータを表す。スケールバーは±SEMを表す。∗p < 0.05, ∗p < 0.01. Kruskal-Wallis。
この推定アラビノフラノシダーゼの機能がGI管のコロニー形成に寄与するかどうかを調べるために、この遺伝子を欠く株（STM0148）を操作し、Δ0148：：KanR（S. Tm0148）とし、マウスでの競合実験に用いた。マウスは、L-アラビノース含有植物多糖類を粗植物体の形で含む標準的な餌で維持された。S. TmWTは、感染の時間経過とともにS. Tm0148株よりも有意に高いレベルで消化管から回収され（図5C）、この推定アラビノフラノシダーゼが生体内でS. Tmに競争優位性を付与していることが明らかになりました。S.Tm0148株は、カナマイシン耐性カセットに代えて全長の0148遺伝子をネイティブ遺伝子座に挿入して補完し、S. Tm株Δ0148::0148 (S. Tm0148::0148) を作成した。S.TmcaiとS.Tm0148::0148の1:1混合物をマウスに感染させたところ、相補株はS.Tm0148 KanR株のWT表現型をうまく復元した。このことから、S. Tm0148株の表現型は無傷の0148を失ったことによるものでこの座位の外にあるオフタッチ変異によるものではないとわかった（図5c）。
S.Tmの推定アラビノフラノシダーゼがin vivoでのL-アラビノースの獲得と利用において果たす役割をさらに調べるために、L-アラビノースを含む糖類を含まない多糖類定義食を与えた129X1/SvJマウスに、1：1比率のS. TmWT株とS. Tm0148株を接種した。S. TmWT株、S. Tm0148株は7DPIでL-アラビノース欠乏GI管に同レベルで回収され、マウスにL-アラビノース含有多糖を含まない飼料を与えた場合、アラビノフラノシダーゼはS. Tmに対して有利でないことが明らかになった（図5D）。アラビノースを含まない飼料を与えたマウスの体重が著しく減少したため、実験は7DPIで打ち切られた。この結果は、食物繊維を欠いた多糖類定義食が病原体感染時に悪化することを示した以前の研究と同様であった45。さらに生体内でのアラビノフラノシダーゼの機能を調べるために、標準食を与え、1％のL-アラビノースを添加した水を与えた129X1/SvJマウス群に、同濃度のS. TmWT株とS. Tm0148株の感染を試みた。これらのマウスでは、S. TmWTはS. Tm0148に対して競争優位性を持たず、飼料からL-アラビノースを含む多糖類を除去し、遊離L-アラビノースを補充することは、アラビノフラノシダーゼが付与する競争優位性を消失させるのに十分であることを示していた（図5d）。
スーパースプレッダーの出現は、S. TmがL-アラビノースを獲得し利用することに依存している。
S. Tmがスーパースプレッダーレベル（>108 CFU/g feces）まで消化管内で増殖するのにL-アラビノースが必要かどうかを調べるため、129X1/SvJマウスにS. TmWTまたは変異体のS. TmaraBADまたはS. Tm0148を接種した。S. TmWTに感染したマウスの20％が14DPIまでに超拡散体となり、21DPIでも超拡散体を維持した（図6Aおよび図6B）。臭いことに、S. TmaraBADに感染したマウスのうち、14DPIまでにスーパースプレッダーとなったのは4％だけであった。感染マウスが排出したS. Tm0148のレベルは、7DPIと14DPIにおいてS. TmWT株より有意に低かった（図6A）。S. Tm0148に感染した25匹のマウスのうち、14DPIまでにスーパースプレッダーとして出現したものはなく、21DPIまでにスーパースプレッダーとなったマウスはわずか4%だった（図6B）。これらのデータを総合すると、S. Tmは生体内で機能的なα-N-アラビノフラノシダーゼを使用しており、この酵素が複雑な植物多糖類から遊離L-アラビノースを解放し、S. TmがGI管内でスーパースプレッダーレベルまで拡大できることが示された（図6C).
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図6. スーパースプレッダーの出現は、S. TmによるL-アラビノースの獲得と利用によって決まる。
(A) 129X1/SvJマウスにWT S. Tm、S. TmaraBAD、またはS. Tm0148を感染させた。S. TmのCFU/g糞を21日間にわたり定量化した。WT SL1344感染マウス（n = 25）を白、S. TmaraBAD（n = 25）を青、S. Tm0148（n = 25）をピンクで表す。∗p < 0.05, ∗p < 0.01 Multiple Mann-Whitney検定。
(B) 7、14、21DPIにおける超拡散体の割合の棒グラフによる定量化。WT感染マウスはグレーバー、S. TmaraBADはブルー、S. Tm0148感染マウスはピンクで表した。
考察
スーパー・スプレッダーはサルモネラ感染症の原因となっているが、スーパー・スプレッダーの発生に関わる分子メカニズムは未解明である。スーパー・スプレッダーの出現は、宿主、マイクロバイオーム、病原体の間の多くの複雑な相互作用に依存していると考えられ、それらは腸の代謝的微小環境によって駆動されていると考えられる4、11、46。ここでは、抗生物質によって腸の生態系が乱されないサルモネラ慢性感染モデルマウスを利用した。このモデルを用いて、S. Tmに感染したマウスでスーパースプレッダーが発生するメカニズムを明らかにした。4,47,48 S. Tmを長期間にわたり異種レベルで保有するマウスの糞便メタボロームマッピングを使用することにより、サルモネラ スーパースプレッダー マウスの代謝表現型を明らかにすることができた。並行して、superspreaderマウスの糞便から回収したS. Tmのトランスクリプトミクスを実施しました。この2つのデータを同時に解析した結果、L-アラビノース代謝がスーパースプレッダーマウスの重要な特徴であることが判明し、この五炭糖の摂取がGI管でのS. Tmの増殖に有利であることが明らかとなりました。また、L-アラビノースのような食事由来の因子が、スーパースプレッダー宿主の出現に果たす役割を明らかにした。
サルモネラ菌が消化管に定着するためには、定着抵抗性を克服する必要があり、同時に増殖機構を利用する必要がある。炭水化物源をめぐってサルモネラと競合することに加え、常在菌は短鎖脂肪酸や抗菌ペプチドの産生を通じて、サルモネラの増殖を妨害することができる9、46。また、サルモネラは、発酵の最終産物である水素を電子供与体として利用することで、常在菌を利用することができる。50 ここで、我々は、食事性糖質であるL-アラビノースの選択的摂取に依存する病原体拡大の新たなメカニズムを提案する。
Rolf Freterの栄養ニッチ理論では、病原体は、競合他社よりも特定の制限栄養素の利用効率が高い場合にのみ、生態系ニッチを植民地化することができると主張している51。食餌または宿主粘液由来の炭水化物を分解する能力が、消化管のコロニー形成微生物に競争上の優位性をもたらすことはよく知られている21,23。複合糖質の分解に関与する糖質活性酵素（CAZymes）には、グリコシド水解酵素、多糖類溶解酵素、糖質エステラーゼがある。CAZymesは、GI管常在菌のゲノムに大きな割合を占める傾向にある。例えば、一般的な消化管常在菌であるBacteroides thetaiotaomicronは、ゲノムの約7％をグリコシド加水分解酵素に依存している52。CAZymesは、様々な常在菌や海洋生態系において詳細に研究されているが、53, 54病原細菌におけるこれらの酵素の役割はまだ不明である。興味深いことに、キチンを加水分解してN-アセチルグルコサミンオリゴマーにするキチナーゼは、病原体におけるグリコシド加水分解酵素としてよく研究されているファミリーである。最近の研究では、Salmonella GH18ファミリーのキチナーゼが上皮の接着と浸潤に重要であることが示されている55,56。キチナーゼは、Legionella pneumophila、57 Listeria monocytogenes、58 Vibrio cholerae、59 Adherent-invasive Escherichia coliなどの病原細菌種の重要な病原性因子として特定されてきた60。キチナーゼが病原因子として感染を媒介するのとは対照的に、我々は、サルモネラが未同定のα-N-アラビノフラノシダーゼを用いて食物性L-アラビノースを獲得し、選択的優位性を獲得するメカニズムを提案する。また、サルモネラ菌のα-N-アラビノフラノシダーゼが生体内で機能的に活性化し、GI管においてサルモネラ菌の競争優位性をもたらすという証拠も得た（図5）44）。
微生物叢のメンバー間の代謝的相互摂食は、複雑な食物連鎖をもたらし、種が部分的な糖鎖分解を他の種に依存することがある61。例えば、Bacteroides種は複合糖質の第一分解者として働き、第二分解者が処理・消費するオリゴ糖を放出する62。S. Tmは、フコースのような消費しやすい単糖の遊離を常在菌に依存することが知られている24。S. Tmがアラビノフラノシダーゼを用いてL-アラビノースを獲得することは、そのような自律的な経路の一例である可能性がある。本研究は、GI管で起こる代謝的相互摂食網におけるサルモネラのアラビノフラノシダーゼの役割について、今後の研究のための基礎となるものです。
今後の研究で興味深いのは、サルモネラがGI管でL-アラビノースを獲得する際の制御を理解すること、そして低・中排泄マウスにおいてサルモネラがこの栄養ニッチを利用することを妨げるものは何かということである。興味深いことに、メタボロミクス研究のデータから、胆汁の代謝が換毛期グループ間で変化していることが示されました（図1E）。現在進行中の実験では、排出群間の胆汁組成の変化が、Salmonellaのアラビノース獲得・利用遺伝子の発現にどのような影響を与えるかを調べています。
我々は、サルモネラ感染スーパー・スプレッダー・マウスのメタボロームとトランスクリプトームの両方を活用し、消化管内での病原体拡大の重要な分子機構を明らかにしました。これらの結果は、スーパー・スプレッダー内のメタボローム・ランドスケープに光を当て、GI管内で起こる複雑な宿主と病原体の相互作用を、単一代謝物の分解能で全体的に把握することを可能にしました。本研究で得られたメタボロームおよびトランスクリプトームデータセットは、今後、スーパースプレッダー形成の根底にある新たなメカニズムの研究を可能にすると思われます。最終的には、本研究は、疾患伝播制御のために必要な研究領域である、スーパースプレッダー宿主内での病原体の拡大に関する理解に貢献するものです。
STAR★メソッド
キーリソース表
REAGENT or RESOURCEIDENTIFIERBacterial and virus strainsSalmonella enterica serovar Typhimurium strain SL1344Monack lab strain collectionN/AS. Typhimurium ΔorgAΔssaV:： KanRMonack lab strain collectionN/AS. Typhimurium ΔcaiTABCD：：KanRT本論文N/AS. Typhimurium ΔaraBAD:: KanRMonack lab strain collectionN/AS. Typhimurium ΔorgAΔsaVΔaraBAD：：KanRThis論文N/AS.Typhimurium ΔorgAΔsaVΔaraBAD：：KanRThis論文N/AS．Typhimurium Δ0148：．KanRThis paperN/AS. ティフィムリウム ΔorgAΔssaVΔ0148：．KanRThis paperN/AChemicals, peptides, and recombinant proteinsLB Agar, MillerFischer ScientificCat# BP9724-2LB Broth、 MillerFischer ScientificCat# BP1426-500Carbenicillin disodium saltGoldBioCat# C-103-5Penicillin- streptomycinThermo Fisher ScientificCat# 15-140-122Kanamycin monosulfateGoldBioCat# K-120-5ChloramphenicolGoldBioCat# C-105-5L- (+)-． アラビノースMillipore SigmaCat# C973P47NdeINew England BioloabsCat# R0111SXhoINew England BiolabsCat# R0146SCritical commercial assaysPhusion® High-. Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabsCat# M0530MinElute PCR Purification KitQiagenCat# 28004RNeasy PowerMicrobiome KitQiagenCat# 26000-50Rneasy Mini KitQiagenCat# 74106Illumina® Stranded Total RNA Prep、 Ribo-Zero PlusIlluminaCat# 20040525IDT® for Illumina® RNA UDIndexes Set Aとのライゲーション、 LigationIlluminaCat# 20040553SuperScript III First-Strand Synthesis KitThermo Fisher ScientificCat #18080051FastStart Universal SYBR Green Master MixSigma AldrichCat #4913850001Lipocalin -2 (LCN2) Mouse ELISA KitInvitrogenCat# EMLCN2Qubit™ RNA High Sensitivity (HS) 、 Broad Range (BR), and Extended Range (XR) Assay KitsThermo Fisher ScientificCat# Q10210Experimental models： 生物/菌株129SvJ/X1Jackson LaboratoryCat# 000691GF Swiss-WebsterSonnenburg LabN/ARodent dietStandard dietEnvigo-TekladTD.2018Polysaccharide-defined (arabinose-free) dietEnvigo-TekladTD.150689 オリゴヌクレオチド表S2参照本研究組換えDNApKD4Monack lab plasmid collectionN/ApKD46Monack lab plasmid collectionN/ApCP20Monack lab plasmid collectionN/ApFOGDirk Bumann labN/ASソフトウェアとアルゴリズムGraphPad Prism version 8. 4.3 for MacOSGraphPad Software Inchttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/R(v4.0.2)R Core Teamhttps://www.r-project.org/RStudio(v1.3)RStudio Teamhttps://www.rstudio.com/tidyverse(v1.3.0)Wickham et al、 201967https://www.tidyverse.org/ggplot2(v3.3.2)Wickham, 201668https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.htmlNfcore/rnaseq pipeline development branchEwels et al.69https://nf-co.re/rnaseqDESeq2 v1.28.0Love et al.70https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.htmlXNomial v1.0.4William R. Engels, University of Wisconsin, Madison - Genetics Departmenthttps://cran.r-project.org/web/packages/XNomial/vignettes/XNomial.html#useDeposited and generated dataMetabolomicsこの論文データS1生RNA seqデータのアクセッション番号です： GSE20776471本論文https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE207764
リソースの確保
リードコンタクト
さらなる情報、リソースや試薬のリクエストは、リードコンタクトのDenise M. Monack (dmonack@stanford.edu)までお願いします。
材料の入手方法
本研究では、新たなユニークな試薬は生成していない。
実験モデルおよび被験者の詳細
倫理観の表明
動物を用いた実験は、NIHガイドライン、動物福祉法、および米国連邦法に従って行われました。すべての動物実験は、スタンフォード大学実験動物飼育管理委員会（APLAC）の承認を受け、プロトコルID 12826のもと、施設動物飼育使用委員会（IACUC）によって監督された。動物は、Association of Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) Internationalに認定された集中型研究用動物施設に収容された。
マウス系統と飼育方法
129X1/SvJマウスはJackson Laboratoriesから入手した。雌のマウス（6〜7週齢）は、獣医または研究者により隔月で交換されるフィルタートップケージ内の特定の病原体のない条件下で収容された。滅菌された水と餌は、自由摂取で提供された。マウスは、実験前にスタンフォード動物バイオハザード研究施設に慣れるために、少なくとも1週間与えられた。マウスの年齢、性別、系統、供給元施設はすべての実験で追跡され、感染結果との相関はなかった。
Swiss-Websterマウスはgnotobiotic実験に使用され、無菌マウスの無菌性は、gnotobiotic施設のスタッフによる16S PCR増幅と糞便の嫌気性培養によって確認された。マウスは、周囲湿度20.5℃で12時間の明暗サイクルで維持し、自由食を与え、すべての実験期間中、フレキシブルフィルムのgnotobioticアイソレーターで維持された。マウスは、実験期間中、性別と年齢をコントロールした。
細菌株と生育条件
Salmonella Enterica serovar Typhimurium SL1344株を、200g/mL streptomycin（LB-strep）、200g/mL streptomycin + 15g/mL tetracycline（LB-strep-tet）、または 200g/mL streptomycin + 40g/mL kanamycin（LB-strep-kan) で補充したLB寒天培地上で好気的に保ち、37℃で通気しながら一夜培養した。
メソッドの詳細
マウス感染症
雌マウスに108 CFU S. Typhimuriumを飲用により感染させた。投与針による有害な傷害を避けるため、前述したように、20μlの接種物を口内に排出し、培養物が飲み込まれたことを確認する間、マウスを掻爬した。72 脱落をモニターしたところ、前出の研究と同様の糞便および全身臓器における脱落動態が観察された。1-2個の糞便ペレットを集め、500μlのPBSに再懸濁した。CFU/g糞便を測定するため、糞便ペレットを計量し、連続希釈し、適切な抗生物質を添加したLBプレートにプレーティングした。競合指数（CI）値は、以前に説明したように計算した74。
終末実験では、指示された時点でマウスを犠牲にした。マウスは炭酸ガスで安楽死させた。脾臓、肝臓、腸間膜リンパ節（MLN）、小腸、盲腸、および結腸の採取には、滅菌解剖器具を利用した。組織は1-3mLのPBSに集められ、ホモジナイズされた。ホモジネートを、200 mg/mL の適切な抗生物質を添加した LB 寒天培地に連続希釈してプレーティングし、CFU/g 組織を計数した。各実験は、図の凡例に特に記載がない限り、再現性を確保するために最低3回実施された。
非標的メタボロミクス
サンプル採取
Metabolon Inc. (Morrisville, USA)による超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法を用いて、糞便サンプルの非標的メタボロームプロファイリングが実施された。要約すると、感染前と感染後7,14,21日目に糞便サンプル（糞便ペレット2〜3個）を採取した（108 CFU S. Typhimuriumを使用）。糞便ペレット採取のため、マウスは一匹飼いした。サンプルは直ちにドライアイスに移され、その後、処理と分析のためにMetabolon, Incに送られるまで-80℃で保存されました。
超高性能液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（UPLC-MS/MS）（Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectroscopy
すべてのメソッドは、Waters ACQUITY超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）とThermo Scientific Q-Exactive高分解能/高精度質量分析計（加熱エレクトロスプレーイオン化（HESI-II）ソースとOrbitrap質量分析器をインターフェースとして、35000質量分解能で運用）を使用しました。サンプル抽出物を乾燥させた後、4つの方法のそれぞれに適合する溶媒に再構成した。各再構成溶媒には、注入とクロマトグラフィーの一貫性を確保するため、一定濃度の一連の標準物質が含まれていました。1つのアリコートを、より親水性の高い化合物に対してクロマトグラフィー的に最適化された酸性ポジティブイオン条件で分析しました。この方法では、抽出物をC18カラム（Waters UPLC BEH C18-2.1x100 mm, 1.7 μm）から水とメタノールを用いてグラジエント溶出し、0.05%のパーフルオロペンタン酸（PFPA）と0.1%のギ酸（FA）を含む。別のアリコートも酸性の正イオン条件で分析したが、より疎水性の化合物用にクロマトグラフィー的に最適化されていた。この方法では、メタノール、アセトニトリル、水、0.05% PFPA、0.01% FAを使用して、同じ前述のC18カラムから抽出物を勾配溶出し、全体的に高い有機含量で操作した。別のアリコートは、別の専用C18カラムを使用して、塩基性マイナスイオン最適化条件を用いて分析しました。塩基性抽出物は、メタノールと水、ただしpH8で6.5mM重炭酸アンモニウムを用いたグラジエント溶出でカラムから溶出した。4番目のアリコートは、水とアセトニトリルに10mMギ酸アンモニウム、pH10.8を加えたグラジエントを用いたHILICカラム（Waters UPLC BEH Amide 2.1x150mm, 1.7 μm）から、ネガティブイオン化で分析しました。
データ抽出と化合物の同定
Metabolon社のハードウェアとソフトウェアを使用して、生データの抽出、ピーク同定、QC処理を行った。化合物は、精製された標準物質または再発した未知の物質のライブラリエントリとの比較によって同定されました。Metabolonは、ライブラリーに存在するすべての分子の保持時間/インデックス（RI）、質量電荷比（m/z）、およびクロマトグラフィーデータ（MS/MSスペクトルデータを含む）を含む認証標準に基づくライブラリーを維持しています。さらに、生化学的同定は、同定を提案する狭いRIウィンドウ内の保持インデックス、ライブラリとの正確な質量一致±10ppm、実験データと真正標準との間のMS/MSフォワードおよびリバーススコアの3つの基準に基づいています。MS/MSスコアは、実験スペクトルに存在するイオンとライブラリスペクトルに存在するイオンの比較に基づきます。これらの分子の間には、これらの要因の1つに基づく類似性があるかもしれませんが、3つのデータポイントすべてを利用することで、生化学物質を区別して区別することができます。3300種類以上の市販の精製標準化合物を取得し、LIMSに登録し、すべてのプラットフォームで分析特性を決定しています。また、構造的に名前の知られていない生化学物質については、クロマトグラフィーとマススペクトルの両方が繰り返されることから、マススペクトルエントリーが追加作成されています。
メタボロームデータの統計解析
Metabolon, USAは、サンプル量に対する正規化、対数変換、欠損値がある場合は、各化合物の最小観測値で置換を行った。反復測定による二元配置のANOVAによる解析では、排菌レベル、時点、感染状態などの実験パラメータに対して有意な相互作用および主効果を示す生化学物質が同定された。標準的な統計解析は、Metabolon社（米国）のArrayStudioで対数変換されたデータに対して行われた。PCAは、対数変換された代謝物レベルを用いて作成した。パスウェイ解析は、R v4.0.2 の XNomial package v1.0.4 を用いて、Benjamini & Hochberg 補正による尤度比検定で実施しました。
RNAの単離。
便内容物および糞便からのRNAは、QIAGEN RNeasy PowerMicrobiome Kitを使用して、製造者の指示に従って抽出した。液体培養物からのRNAは、QIAGEN RNeasy Mini Kitを用いて、QIAGEN補足プロトコル：細菌からの全RNAの精製に従って抽出された。3ミリリットルの培養液を6,000gで10分間遠心分離し、キットバッファーRLT＋β-メルカプトエタノールに再懸濁し、酸洗浄したガラスビーズを用いて4℃で5分間ビーズビートを行った。RNAはQuibitを用いて定量し、Agilentバイオアナライザーで品質を決定した。
RNAライブラリーの調製とシークエンス
RNAライブラリーは、Illumina stranded total RNA prep ligation with ribo-zero plus kitを使用して調製した。 rRNAはライブラリー構築前に枯渇させ、Agilent Bioanalyzer Prokaryote Total RNA Picoを使用して確認した。RNAの完全性は、Agilent Bioanalyzer Prokaryote Total RNA Picoで確認しました。In vivoおよびin vitroのライブラリーは、Novogene Corporation Inc.による品質管理を受けた。引き上げたin vivoおよびin vitroライブラリをS4フローセルの別々のレーンにロードし、PE150ストラテジーを用いてIllumina NovaSeq 6000でシーケンシングしました。データは不均等に共有され、各in vivoサンプルには10.11Gの生データ（1億40万ペアリード）、各in vitroサンプルには4.5Gの生データ（1500万ペアリード）。
RNA-seq解析
RNA-seq 解析は nf-core RNA-seq pipeline development branch version を用いて行った。69 品質管理は FastQC v0.11.9 を用いて実施した。アダプターおよび低品質リードは、TrimGalore！（デフォルトパラメーターv0.6.5）でフィルタリングした。また、HiSAT2 v2.2.1.75 Stringtie v2.1.4.76 を用いて、S. Tm strain SL1344 ゲノムにアライメントし、転写物のアライメントと定量を行った。結果は、Graph pad prism v8.1.2またはRでggplot2を使ってプロットした。Biocyc Pathway Toolsは、パスウェイ濃縮解析に使用した77。
細菌株の構築
SL1344ゲノムの遺伝子は、ƛ変異誘発プロトコルに従って欠失の標的とした78。簡単に言うと、pKD4のカナマイシン耐性カセットを増幅するプライマーを使用し、PCR生成物を精製した。pKD46を含むS. Tm株14028を30℃、200rpmでログ相中期まで培養し、L-アラビノースを最終濃度50mMまで添加し、さらに1時間細菌を培養した。精製したPCR産物1～5μgを、洗浄・濃縮した細菌に添加した。細菌をエレクトロポレーションし、30 ºC SOCブロスで3時間振盪しながら回収した。培養物を抗生物質選択プレートにプレーティングし、42℃で一晩培養してpKD46プラスミドの細胞を硬化させた。コロニーは、カナマイシン耐性挿入と内因性遺伝子破壊についてPCRで確認した。pKD46プラスミドの除去は、カルベニシリン耐性の喪失によって確認された。P-22ファージ導入により、SL1344に所望の遺伝子ノックアウトを導入した。H-5ファージを用いて、最終的な染色がリソジェンフリーであることを確認した。最終的なSL1344株はPCRにより確認した。S. Tm0148 株を補完するために、最近サルモネラに最適化されたデュエルネガティブセレクションアプローチを使用した79。簡単に言うと、0148 遺伝子をその上流と下流 1000 bp で増幅して S. Tm0148::0148 を生成し、付属の pFOG ベクターにクローニングして大腸菌ドナー株にトランスフォームし、 S. Tm0148 とコンジュゲーションした。
カスタム研究用食事療法
動物は、実験前に少なくとも1週間、標準食（SD、Envigo TD.2018, Teklad Global 2018 rodent diet）で維持した。マウスをアラビノースフリー食（多糖類定義：カスタム食、Envigo TD.150689 すべての炭水化物および繊維源をデキストロース一水和物に置換）に切り替えた場合、これは感染時に生じた。
L-アラビノースの定量化
糞の重量を測定し、10%エタノールでホモジナイズし、14,000gで5分間回転させた。上清はUCSDのGlycoanalytics Coreに送られた。そこで、サンプルを10,000gで5分間遠心分離し、あらかじめ洗浄した3Kスピンフィルトレーションユニット（遠心分離装置、Pall、Life Sciences、部品番号OD003C34）を用いてスピンフィルトレーションした。フロースルーに内部標準として1.0μgのInositolをスパイクし、凍結乾燥した。乾燥した材料は、1M水酸化アンモニウムの存在下で水素化ホウ素ナトリウムを用いて、室温で一晩かけて還元した。過剰な還元剤は、30%酢酸水溶液を使用して氷浴上で中和した。次に、サンプルを窒素フラッシュで乾燥させ、9:1メタノール：酢酸混合液（3回）、無水メタノール（3回）で共蒸発させた。最後に、ピリジンと無水酢酸の混合物（1：1 v/v）を用いてサンプルをアセチル化し、単糖のアルジトールアセチル化物をGCMS（Agilent Technologies, 7820 GC System attached with 5975-MSD）により分析した。カラムはRestek-5ms（30m x 0.25mm x 0.25μm）を使用し、キャリアガスはUltrapure Heを使用し、1.2mL/minの流速でスプリットレスモードで分析しました。単糖の定量は、既知量の標準混合物から得られた応答係数に基づいて行われた。
リポカリン測定法
マウスから糞を採取し、重量を測定し、タンパク質の定量が可能になるまで-80 ºC で保存した。サンプルはビーズビートでホモジナイズし、Lipocalin-2 (LCN2) Mouse ELISA Kit (Invitrogen) を用いて、製造者の指示に従ってタンパク質を評価した。
qRT-PCR
マウスから脾臓と大腸の組織を採取し、RNA抽出を行うまで-80 ºCで保存した。組織はビーズビートでホモジナイズし、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてRNAを単離した。cDNAは、SuperScript III First-Strand Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific)を用いてRNAサンプルから合成し、-20℃で保存した。炎症性遺伝子の発現を評価するために、cDNAと遺伝子特異的プライマーをFastStart Universal SYBR Green Master Mix（Sigma Aldrich）と組み合わせて使用し、転写物を増幅した。
定量化および統計解析
すべての統計解析はRまたはPrism v. 8.1.2 (GraphPad)で行い、ggplot2およびPrism v. 8.1.2 (GraphPad)で可視化した。すべてのCFU数の統計的有意性は、Prism v. 8.1.2 (GraphPad)の2-way ANOVAによって決定された。競合指数感染の時間経過データの統計的有意性は、Prism v. 8.1.2 (GraphPad)のMann-Whitney U testにより決定した。
謝辞
Manuel Amievaをはじめ、MonackおよびAmieva研究室のすべてのメンバーの貴重な議論と原稿のレビューに感謝します。また、Justin Sonnenburg、Steven Higginbottom、およびStanford Universityのgnotobioticグループのすべてのスタッフの専門知識と寛大さに感謝する。本書で報告された研究は、米国National Institute of Allergy and Infectious DiseasesのR01-AI116059およびR01AI095396（D.M.M.）、 Paul Allen Stanford Discovery Center on Systems Modeling of Infection（D.M.M. ）、 Bill & Melinda Gates FoundationのGates Grand Challenge Grant（D.M.M. ）、National Science Foundationが提供する Graduate Research Fellowship Program（S.J.R. ）から支援を受けました。本研究は、NIH Cellular and Molecular Training Grant (NIGMS, grant number 5T32GM007276) (A.C.) からのトレーニンググラントの一部により支援されている。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を示すものではない。
著者貢献
構想、S.J.R.およびD.M.M.、調査、S.J.R.、L.M.およびA.C.、執筆-原案、S.J.R.およびD.M.M.、執筆-レビューおよび編集、すべての著者、資金獲得、S.J.R.およびD.M.M。
利益申告
著者は競合する利害関係はないことを宣言している。
インクルージョンと多様性
本論文の著者の1人または複数が、科学界に存在しない少数民族であることを自認している。本論文の著者の1人または複数が、科学におけるマイノリティの代表性を高めることを目的としたプログラムからの支援を受けている。本作品に科学的に関連する文献を引用する一方で、参考文献リストにおけるジェンダーバランスの促進にも積極的に努めました。
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データおよびコードの利用可能性

なお、非標的メタボロミクスデータは本原稿の補足ファイルとして添付した（データS1）。

本研究で取り上げたRaw RNA-seqデータは、NCBIのGene Expression Omnibusに寄託されており、GEOシリーズのアクセッション番号GSE207764（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE207764）からアクセス可能です。

コードは https://github.com/sruddle/superspreader でご覧いただけます。

本ワークペーパーで報告されたデータの再分析に必要な追加情報は、要請に応じてリードコンタクトから入手できます。
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