全球空中細菌群集-地球のマイクロバイオームおよび人為的活動との相互作用

全球空中細菌群集-地球のマイクロバイオームおよび人為的活動との相互作用
Jue Zhao, Ling Jin https://orcid.org/0000-0003-1267-7396, Dong Wu https://orcid.org/0000-0003-3059-0593, +10, and Xiang-dong Li https://orcid.org/0000-0002-4044-2888 cexdli@polyu.edu.hkAuthors Info & Affiliations
Contributed by James M. Tiedje; received April 14, 2022; accepted September 12, 2022; reviewed by Anne Perring and Brajesh Singh.
2022年10月10日
119 (42) e2204465119
https://doi.org/10.1073/pnas.2204465119
4,979
メトリクス
4,979
過去12ヶ月間
4,979
Vol.119｜第42号
意義
概要
結果および考察
概要
材料と方法
データ、材料、ソフトウェアの入手方法
謝辞
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参考文献
意義
惑星のマイクロバイオームの相互作用とその生態学的・健康的影響を理解するには、地球上で最も手つかずの微生物生息地である大気中の細菌群について深い知識が必要です。我々は、世界の大気中バクテリアの包括的なアトラスを確立することにより、大気中バクテリアの半数は周辺環境に由来し、主に地域の気象条件や大気質条件の影響を受けていることを明らかにした。都市部における空中浮遊細菌の特徴として、ヒトに関連した病原体が占める割合が増加していることが挙げられます。本研究は、気候変動下における空中微生物の世界とその起源を明らかにし、大気環境における健康影響の評価に貢献するものである。
概要
空中細菌は地球のマイクロバイオームにおいて影響力のある構成要素であるが、その群集構造と生物地理学的分布パターンはまだ理解されていない。我々は、世界63地点から収集した370の大気中微粒子サンプルの細菌群集を解析し、2700万以上の非冗長16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子配列を含む大気中細菌リファレンスカタログを構築した。その生物地理学的パターンを提示し、マイクロバイオームの共起ネットワークが地球の表層環境と交錯していることを読み解く。対流圏における大気中バクテリアの総量（1.72×1024個）は他の生息環境より1〜3桁少ないが、大気中のバクテリア分類数（＝豊富さ）は水圏のそれと同程度であり、他の生態系で見られるように、中緯度で最大となった。空気中の細菌群集は、24種というユニークな優占種を有しているが、その構造は、群集形成における確率的プロセスの役割が大きいため、より容易に乱されるようである。このことは、大気中の細菌が表面微生物群に大きく寄与していること（平均46.3%）からも裏付けられるが、気象要因や大気質などの大気条件も重要な役割を担っている。特に都市部では、人為的な影響により、浮遊細菌の植物由来の相対的な重要性が弱まり、人為的な原因による潜在的な病原体の発生が増加する。これらの知見は、将来の環境変化に伴う惑星マイクロバイオームの反応や吸入可能なマイクロバイオームの健康への影響を予測するための重要な参考資料となる。
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空気中の細菌はバイオエアロゾルの重要な構成要素であり、大気、生物圏、地球表面の人間圏にまたがる微生物の伝達を流す上で重要な役割を担っています（1）。バイオエアロゾルは、大気圏、生物圏、地表の人間圏を横断する微生物の伝播に重要な役割を果たしている（1）。そのため、微生物の拡散、そのプロセス、そして人間を含む植物や動物の健康にとって重要である（2）。
土壌（3）、海洋（4）、人間の排泄物（廃水処理場など）（5）における微生物の特徴を記録する大規模な研究が系統的に実施されている。その結果、それぞれの生態学的生息環境における固有のマイクロバイオームが示され、また、表面環境におけるマイクロバイオーム間の相互関係も示唆されている。しかし、空気は通常、純粋に陸上および水中の微生物生命の導管とみなされてきた(6)。しかし、空気は微生物の生息地でもあり(7)、1×104以上の細菌細胞/m3 (2) と数百の固有の分類群 (8) を有する。空気中のマイクロバイオームについては、特にその群集構造、生物地理学、人為的影響、地球の他のマイクロバイオームとの相互作用に関して、これまでほとんど世界的に文書化されてこなかった。大規模な系統的研究により、地球の微生物生息環境に寄与する大気の中心的な役割を明らかにし、例えば、気候、大気質、土地利用、人間活動などの環境変化に対する生態系の応答を予測することが容易になります(9)。
環境細菌(3)の構造分布は、環境の変化に応じて変化する。例えば、土壌中の微生物多様性はpHと温度に大きく影響され（3, 10）、海洋系では塩分濃度が支配的な要因となっている（4, 11）。しかし、空気中の細菌群集の動態を駆動する基本的なメカニズムは、まだ世界的に特徴付けられていない。したがって、地球規模での微生物群集構造、生物地理学的パターン、駆動機構に関する研究が、大気中マイクロバイオームの理解のために必要である。
環境内（大気）でも環境間（媒体間）でも、微生物は孤立して生きているのではなく、相互作用から競争まで、複数の生態的関係を持っています。これらの相互作用は、理論と超大規模サンプルサイズに基づいて、土壌(15)、植物(16)、海洋(17)の生態系やヒトのマイクロバイオーム(18)について、ネットワーク構造などの隣接行列として数学的にモデル化(12-14)されている。しかし、重要な伝達媒体である大気環境については未解明であった。さらに、地球上の細菌の共起ネットワークの研究において、地球上の微生物界における空気中の細菌群集の役割や、異なるマイクロバイオームとの相互作用に関する理解にもギャップが残っています。
空気中の細菌群集に対する人為的な影響を示す証拠は増えつつあるが（1, 2, 19）、都市化による変化とその寄与メカニズムに関するグローバルな視点は不完全である。しかし、人間活動と自然界の空気中のマイクロバイオームとの相互作用を特定し、人間と自然の相互作用を理解するためには、これらを理解することが不可欠である。
このような知識のギャップを埋めるため、我々は新たに収集した76の大気サンプル（毎週803サンプル）からグローバルな大気中細菌データセットを取得し、整理しました。サンプリング地点は、地上（1.5〜2m）から屋上（5〜25m）、高山（海抜5380m）、人口密度の高い都心から北極圏までと、高度や地域の点でこれまでよりも多様な範囲に及んでいます。私たちの目的は、マクロ生態系におけるバクテリアの生物地理学的パターンを包括的に理解し、それらの共通性と相互関係を評価することであった。そして、地球マイクロバイオームプロジェクト（EMP）(20)のデータを用いて、23種類の異なる地表環境から採取した5,000以上のサンプルから、空気中のバクテリアと他の地表のマイクロバイオームとの相互関係を調査した。空気中の細菌群に影響を与えうる他の要因を考慮し、環境フィルタリング効果だけでなく、空気中の細菌群間の相互作用、外部からの寄与、地球上の他の生息地の細菌との関連にも注目した。
結果および考察
地球上の空中細菌群集の構造と分布。
地球上の空中細菌群集の構造。
370の空気サンプルから10,897の分類群が検出され（図1A）、ほとんどの細菌配列は、Firmicutes（24.8%）、Alphaproteobacteria（19.7%）、Gammaproteobacteria（18.4%）、Actinobacteria（18.1%）、Bacteroidetes（8.6%）の系統（および亜門）に属していました（SI Appendix、図S1）。ある細菌分類群が占めるサンプル数とその平均存在量との間の存在量-占有率関係（AOR）は、野生動植物で広く観察されるパターンと同様のシグモイド曲線に従うことが示された。ここでは、AORの概念を応用して、大気中のコアサブセット（高存在量と高占有率の両方で示される豊富で広範な細菌）を決定した（21）（SI Appendix、Fig.S2）。正のAORは、24の操作的分類単位（OTU、微生物生態学におけるDNA配列の類似性によってグループ化された分析単位）（OTU総数の0.22%）が検出された全配列の18.5%を占めており、世界中で超ドミナントパターンを示した（22）（図1 B、CおよびSI Appendix, Table S1）。さらに、世界的なデータセット(3, 4)に基づいて、海洋および表土の生息域におけるコアコミュニティも決定した。しかし、3大生態系内での重複は見られず、各生態系に固有のコアコミュニティが存在することが明らかとなった（SI Appendix, Table S2）。

図1.

地球規模で分布する空気中の細菌群集の構造。(A) 世界中で空気サンプルと環境データが収集された場所。(B) グローバルコアOTUの数、割合、および相対的存在度を残りの細菌OTUのそれと比較した。(C) グローバルコア細菌の分類学的構成（門・綱レベル）。(D) グローバルな空気中の細菌群集の共起ネットワーク。接続（エッジ）は、強い（スピアマンのρ＞0.6）かつ有意な（p＜0.01）相関を表す。ノードは、データセット中の属レベルのユニークなアノテーションを持つ結合OTUを表しています。各ノードの大きさは、370サンプルにわたる平均相対存在量に比例した。ノードは細菌の系統によって色分けされた。(E) "smallworldness "インデックスと、大気・海洋・土壌環境におけるグローバルな細菌群集ネットワークの平均最短経路長に基づく "Small-network "識別。(F) 共起ネットワークにおける各ノードの度数-間中心性プロット。赤色のノードは、キーストーン種と見なされている。ノードの大きさは、全マイクロバイオームにおけるOTUの相対的な割合を示している。
482のOTU（ノードあたり約21エッジ、SI Appendix、表S3）間で5,038の有意な相関関係（スピアマンのρ＞0.6、p＜0.01）を包含するグローバル大気中コミュニティ共起ネットワークが構築された（図1D）。注目すべきは、表土や海洋環境での対応と比較して、空気中の細菌は密接に相互接続しておらず、平均最短パス（ノード内接続）長が5.24であったことである。彼らのクラスタリング手法は、よりランダムであるように見えた。このトポロジーは、ノード（細菌種）の消失など、変化に対する耐性が低い（"smallworldness" index = 0.51, Fig. 1E and SI Appendix, section S2.1）。したがって、観察されたネットワークの遠隔関係や緩やかなクラスターは、通常、細菌組成の劇的な変化をもたらす環境条件の機能として、空気中の細菌群集がより擾乱されやすいことを示唆するものであった。しかし、これらの緩やかに交錯するノードのうち、冪乗次数分布ネットワークの根として機能する（次数が多いほどリンクする確率が高くなる）クラスタリングハブノードを同定した（SI Appendix, Fig.S3）(23). これらのハブノードは、その接続効率（図1F）（24）から、微生物群集の構造を維持する上で、その存在量に比してキーストーンとなる種であることが示唆された（25）。これらは集中的に分布していた（平均相関係数=0.903）。具体的には、それぞれがネットワーク全体の15～18%のOTUと有意に相関していた（SI Appendix, Fig.） この緊密なコミュニティは、全体のトポロジー特性をほぼキーストーン種が支配していた（24）グローバルネットワークにおいて、重要なモジュールであると考えられる（SI Appendix, 図S4）。大気中のキーストーン分類群の機能は、先行研究でまとめられているように、その遺伝情報または他の生息地での実績に基づいて推測された。さらに、主要な細菌群には、その組成と推定される機能に関して、大気、水生、陸上生態系との類似性が見出された（SI Appendix, Section S2.2.2 and Table S5）。このことは、空気中の細菌群集と他の地表微生物生息地との間に関連性がある可能性を示唆している。
世界の空中細菌の生物地理学的分布。
最大の微生物多様性は、中間緯度地域で観察された（図2A、R2 = 0.25、p < 10-15）。これは、地球上の他の2つの主要なタイプの生態系、すなわち土壌（3）と水（4）と一致し、巨視的生物による典型的な多様性の緯度勾配（LGD）パターンとは根本的に異なっていた(26)。緯度方向の多様性パターンの支配的な駆動因子は、pH と土壌温度 (3, 10) と水中の塩分と温度 (11) であることはよく知られている。大気中の細菌分類群の数（すなわち細菌の豊富さ）にはかなり多くの環境変数が影響するが（SI Appendix, 図S5）、緯度と有意に関連するのは気温だけであった（SI Appendix, 図S6）。したがって、気温は緯度方向の多様性分布を駆動する重要な因子とみなすことができ（R2 = 0.064, p < 0.005）、これは空気中の微生物の垂直成層研究（11）で報告された多様性における気温の果たす役割と一致する。したがって、我々は、地球上の3つの大きな生態系（すなわち、大気、海洋、陸上システム）における微生物世界の均一な放物線状の緯度方向の多様性パターンを、温度が支配しているかもしれないと仮定し、強風、浸食性表面、重汚染により中緯度ではより高いソース強度かもしれないと考えた（SI Appendix, Section S2.2.3）。大気中総細菌濃度の環境変数との地域的相関については、以前のレビューで多く取り上げられているが（2）、地球規模での相関はほとんど否定された（SI Appendix、図 S7）。さらに、地球上の空気中細菌群集の類似性に関して、地域環境は距離-減衰関係（DDR）を生成した（R2 = 0.13, p < 10-9, 図2B）。これらのデータを総合すると、他の生態系でも観察されている大気中微生物の顕著な生物地理学的パターンが裏付けられる（3, 5）。

図2.

図2: 全世界に分布する大気中バクテリア群集の生物地理学的パターン。(A) 空気中バクテリアの多様性の緯度分布（n = 455 生物学的に独立したサンプル）。本研究で与えられたデータセットに対して、補正された赤池情報量規準（AIC）に基づいて最適な多項式適合度を決定した。線は通常の最小二乗回帰に基づく2次多項式フィットを示す（R2 = 0.246, p < 10-15）。色のグラデーションは、各サンプルに対応する気温を示す。記号の形は北半球産（丸）か南半球産（四角）かを示す。(B) 相対OTU量に基づく一対の微生物群集類似度（Bray-Curtis）は、サンプリング地点間の地理的距離が離れるにつれて増加する。赤線は最小二乗直線回帰を示す（R2 = 0.13, p < 10-9, AIC = -1,063）。
地球全体の微生物世界における空中細菌群集の役割の重要性
他の生息環境と連動する地球規模の空中細菌。
様々な地球規模の生態系における種数を推定することで、分類群間の共通性や希少性、空間・時間・存在量のスケールを越えた相互関係を示すことができる（27, 28）。対数正規モデルは、既知のすべてのデータに従って、個体の総存在量（N）と最も支配的な分類単位の量（Nmax）を使用して、微生物の豊かさを予測するために使用されました（28）。大気中バクテリアの総存在量（1.72×1024個）は、土壌（9.36×1028個）、淡水（4.70×1025個）、海洋（4.68×1028個）など他の生息域に比べて1〜3桁低いものの、大気のバクテリアの豊富さ（4.71×108〜3.08×109）は水圏のものと同等である（図3A）と推定された。大気圏は地表に比べて微生物にとって不利な環境であるため、空中微生物の世界の多様性と複雑性が比較的に高いということは、周辺の生息地からの寄与、ひいては地表生態系のマイクロバイオームとの相互関係があることが推測される。

図3.

地球の微生物世界における空中浮遊菌の役割。(A) 様々な生息環境における地球上の微生物の存在量と富栄養度の推定。地球規模の豊かさ（S）と対応する生息域の総豊かさ（N）は、スケーリング関係を示している（オレンジの破線は95%予測区間）。豊かさは、シーケンスデータから推定されたNmax（塗りつぶされた円）または優位性スケーリング則から予測されたNmax（開いた円）を用いて対数正規モデルから予測されたものであった。各生息地のSとNの推定値は、それ自体がグローバルな合計である。一部のSとNは先行研究(5, 28)から導かれたものである。(B) Bray-Curtis-based nonmetric multidimensional scaling (NMDS) プロットは、地球上の異なる微生物生息地が異なる細菌群集を保持していることを示す (n = 5,189)．ブレイ・カーティス距離を計算し、細菌群集の組成の非類似性を表現した。(C) 23の主要な微生物生息地間の相互接続の関係を示す地球の細菌共起ネットワーク。つながり（エッジ）は強い（スピアマンのρ＞0.7）かつ有意な（p＜0.01）相関を表している。線の太さはスピアマンのρの値を表す。環境はモジュール化により色の異なる3つのグループに分類された。(D) グローバルな空気中のバクテリアの発生源の分析。都市部、陸域背景、海域の空気中細菌群集に対する様々な環境からの潜在的細菌属の寄与率をそれぞれ地球規模で示したもの。
大気，海洋，土壌の各生態系における均一な生物地理学的パターンと類似した基幹細菌群から，様々な生息環境における細菌群集の相互関係が示唆された（図2AおよびSI Appendix，Table S5）．地球上の23の主要な生息地（EMPから5,166サンプル）(20)のうち、地上の空気は人間や動物に関連した環境との類似性が高く、沖合の空気は海洋系との関係が深かった（図3B）。空気中の細菌と他の生息域の細菌の相互作用をさらに分析するために、階層的凝集アルゴリズム(29)を用いて地球細菌共起ネットワークを構築した。図3Cに示すように、23の生息地は、人間や動物に関連した環境（グループI）、陸域の自然環境（グループII）、海洋環境（グループIII）の3つのグループに分類された。このネットワークは、海洋-淡水-土壌、根圏-人間・動物関連生息地というように、明確な漸進的な移行とつながりを示していた。空気中の細菌群集は、周囲の環境と密接に関連しているように見え、その影響は、海水 (ρ = 0.70, p < 0.01) 、動物の表面 (ρ = 0.72, p < 0.01) 、人間の表面（鼻咽頭：ρ = 0.71, p < 0.01; 皮膚：ρ = 0.75, p < 0.01) など、空気と接触する部分がより大きい環境でより顕著であると観察されています（図3C）。
世界の空気中浮遊菌の発生源の解析
様々な地域の空気中細菌群集の潜在的な発生源を属レベルでSourceTracker2により予測した（30）。このプログラムは、ベイズ法を用いて、シンク配列（この場合、空気サンプル中の16S rRNAマーカー遺伝子配列）の、発生源不明を含むすべての発生源サンプルへの割り当てをすべて評価し、それらの割り当ての結合分布を作成する。ここでは、ソースデータセットをEarth Microbiome Project (ftp.microbio.me/emp/) から取得した(24)。この分布をサンプリングして、空気サンプル中のある配列が特定の発生源に由来する尤度を推定した(31)。我々の結果は、表面生態系におけるエアロゾルのモデリングの結果のみに基づいて、空気中の細菌は主に草地、低木、作物に由来するという従来の見解を修正することにつながった(32)。むしろ、空気中のバクテリアの主な発生源は、対応する地表環境の特性によって決まることがわかった。沖合の地点での主な発生源は海洋性（56.3 ± 36.3%）であった。陸上地点のうち、都市部では人為的な発生源（23.2 ± 31.5%）が空気中の細菌に大きく寄与しており、人為的影響の少ない地域で優勢だった植物関連の発生源（22.6 ± 25.2%）を圧倒していた（図 3D、SI Appendix、図 S8A）。陸上浮遊細菌に対する人為的発生源と陸上植物の寄与の大きな変動は、それぞれ主に地域住民の人口密度と植生被覆率に起因している（SI Appendix, 図 S8）。注目すべきは、土壌は地球上で最も微生物が豊富（約1029）で多様（約1011）な環境であるにもかかわらず（28）、表土と大気との交換が限られているためか、その寄与はわずか（1％未満）であることが明らかになったことである。世界の土壌表面積（1.21 × 108 km2）(33) は、海面（3.62 × 108 km2）(34) や葉面（5.09 × 108 km2）(35) より小さく、波の衝突（36）や葉の揺れ（32）とあいまって、空気中の細菌と他の細菌生息地のマイクロバイオームとは土壌以上に交換されていることが判明したのです。人間や動物は、空気との相互作用がある表面積に利点はないかもしれないが、頻繁に活動し、常に呼吸しているため、空気との接触が大幅に増え、その結果、空気中のバクテリアの主な発生源が人間や動物に関連した生息地からになり（37）、特に都市部では、以前の排出モデル研究（32）では無視されていた状況であった。
世界の空気中細菌群集に対する人為的影響。
空気中の細菌群集に対する人間の痕跡。
都市化が進んだ地点と人為的影響の少ない地点とで、空気中の細菌群集の構造が異なっていることは、空気中の細菌群集に対する人為的影響の重要性を示している（図 3B）。それにもかかわらず、都市部とバックグラウンド地域（すなわち、人里離れた山間部や沖合環境、北極圏にある我々の研究対象地のように、人為的影響がはるかに少ない地域）の間では、同じ緯度範囲内で豊かさに大きな格差は認められなかった（SI Appendix、図S9A）。このことから、空気中の細菌の豊富さは、人為的な影響よりも、主に地理的な位置によって支配されていることが示唆された。都市部と自然部の両方で、ヒトは同程度の数の細菌種を吸い込んでいたが（図4A）、細菌群集の均等性は都市部の空気中でずっと低く（図4B）、これは一部の種類の細菌の存在量が大きく増加していることに反映されている。例えば、いくつかの病原性種を持つ代表的な常在菌であるBurkholderiaとPseudomonasの相対存在度は、都市部ではそれぞれ5.56と2.50%で、バックグラウンドエリア（1.44と1.11%）よりはるかに高かった。群集組成の観点からは、都市部とバックグラウンド部には、それぞれ専用の細菌（713と2,835）が生息していたが、その種類（4,352）は全体の半分を超えていた（SI Appendix, 図S9B）。さらに、粒子状物質（PM）質量に対する細菌の寄与は、都市部では自然部よりもはるかに低く（図4C）、都市化によって大気中のPM中の非生物的粒子、例えば、塵や煤の割合が増加したことが示された。

図4.

空気中の細菌群集に見られる人為的な痕跡。(A-E）都市部、陸域背景、沖合における多様性指標（豊かさと均一性）、PM量に対する細菌量の寄与、総飛行細菌負荷量、病原体の相対存在度の比較。(F と G) それぞれ都市部とバックグラウンド部（陸上バックグラウンドと沖合エリア）の空気中細菌群集の共起ネットワーク．(H) 都市部、バックグラウンドエリア、全球データセットにおけるネットワークのトポロジー特性の比較。
都市部とバックグラウンドの空気中の潜在的な病原体を比較するために、臨床サンプル用に設計されたが多様な環境サンプルにも適用可能な包括的パイプラインである16SPIP (16S Pathogenic Identification Process) (38) を使用した (39, 40)。これは、表現型に基づく従来の培養法では感度と精度が低いため、使用されました (41)。都市部の大気中では、細菌の総量は少ないものの (Fig. 4D)、潜在的な病原体の相対量は有意に高かった (Fig. 4E)。特に、死亡リスクが最も高いESKAPE病原体（Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter species）については、この傾向が顕著であった(42)。これらの病原体は、他の病原体よりも都市大気中に顕著に多く存在していた（SI Appendix、図S9D）。ヒトは空気中の細菌をそれほど多く吸い込んでいない。それでも、同定された空気中の病原体（n = 37）の22.4％が都市部でのみ発生しており、様々な病原体感染が都市部で増加するリスクがある（SI Appendix、図S9C）。追加のメタゲノム解析により、潜在的な病原体の構成と存在量が確認されたが（SI Appendix、図S9D）、今後の研究ではより正確な定量診断法、例えば病原体特異的リアルタイムPCR解析が推奨される（43）。我々は、都市部における空気中の病原体の存在量と多様性の上昇は、人間に関連したソースに由来している可能性があると仮定した。都市化による空気中細菌の分類学的構成の変化は、いくつかの表現型にも対応する変化をもたらした（SI Appendix, section S2.3）。さらに、都市部の空気中細菌群集の共起ネットワークにおける交差性の低下と平均最短パス長の増加は、人為的な影響によってネットワーク構造が不安定になったことを示していた（図4 F-H）。
高移動度かつ人為的な影響を受けた環境における微生物群集の形成に対する決定論的プロセスの重要性が弱まっていること。
群集形成を制御する生態学的ドライバーを解明することは中心的な課題である。すなわち、ニッチベースの決定論的メカニズム（pH、温度、水分、塩分などの環境フィルタリング、競争、促進、相互作用、捕食などの様々な生物的相互作用）と中立ベースの確率論的メカニズム（誕生/死、種分化/絶滅、移民など）である(44)。これらのメカニズムが空気中生物群集形成に果たす役割を解明するため、最近確立された定量的枠組み（phylogenetic bin-based null model analysis [iCAMP]）（45）を用いて、各生態プロセスの相対的な寄与度を評価した。これにより、微生物群集の構造や生物地理学的パターンを形成するメカニズムのさらなる探索に貢献した。図5Aに示すように、世界の細菌群集の変動は、分散制限の影響を強く受けており、群集形成プロセスにおける相対的な重要度は55.4～86.5％を占めた。本研究では，表土（26.0%）から海洋（16.2%），大気（10.9%）へと，決定論的プロセスの重要性が減少する勾配が見られた．一方では、バイオエアロゾルが広く拡散し、大きな粒子が短時間しか空中に残らないことと相まって、細菌細胞が環境中の要素（多環芳香族炭化水素、重金属など）や空気中の他の微生物細胞と接触している期間が短くなった(1)。これは、他の生息環境と比較して、環境因子や種の相互作用による空気中バクテリアへの影響が少なく、結果として空気中バクテリア群集の形成における決定論的プロセスからの影響があまり大きくないことのさらなる原因である。大気中の環境勾配が一定の気流によって目立たないため、環境変数が空気中細菌に与える選択圧が減少した(32)。したがって、決定論的プロセスは、他の生態系に比べて、空気中の細菌群集の形成にあまり影響を与えなかった。

図5.

空気中細菌群集を形成するメカニズム。(A）iCAMPによって推定された微生物群集の形成における生態学的プロセス。空気中細菌群集（n = 370）、海洋細菌群集（n = 62）、表土細菌群集（n = 65）の形成において、それぞれ支配的な異なる生態学的プロセスの相対的重要度を示す。DL：分散制限、DR：ドリフト、HD：均一化分散、HeS：異質な選択、HoS：同質な選択。(B) 異なる生態系における決定論的過程と確率論的過程の相対的重要性。(C) 大気中の細菌群集の変動に対する大気の質、気象条件、発生源の寄与の相対的な寄与を示すVPA。重なりは2つまたは3つの因子グループによって一緒に説明される共同効果を表し、各グループ名の下のパーセント数は1つのグループのみによって説明される分散を表す。"説明不能 "は、これら3つのグループのどれでも説明できなかった分散を示す。
さらに、大気圏（都市＜沖合⇔陸域）および表土（農地＜草地＜森林）の生態系で見られたように、人為的影響を受けた地域では、自然地域よりも決定論的プロセスによる微生物群集の形成の制御度が低かった（図5B）。頻繁な人間活動は自然環境を乱し、自然の環境勾配を減少させ（46）、それによって環境要因の選択と微生物への影響を弱めている可能性がある。さらに、ネットワーク化された微生物構造が不安定になると、大気（図4H）や生息環境（図1E）の種類に関係なく、確率的な群集形成が増加することになる。陸上大気での結果と一致するように、沿岸部の空中微生物群は、海洋部よりも環境フィルタリングや細菌間相互作用の影響を受けにくいのかもしれない。
空気中の細菌群集を形成するメカニズム
多様性、バイオマス、基幹細菌セット、コア細菌セット、さらには各OTUの存在量など、20種類の環境要因が細菌群に与える直接的な影響についての広範な解析を通じて（SI Appendix、図S7、S10、S11、S12、セクションS2.4）、地理位置、気象パラメータ、大気質状態が世界の空中細菌の分布に影響を与えている可能性を明らかにしました。しかし、これらの変数間の直接的・間接的な関係や因果関係、各要因の全体的な貢献度は不明なままである。微生物群集を駆動するメカニズムの探索に広く適用されている構造方程式モデリング（SEM）により（3、5）、細菌群集は複数の要因に影響されていることが示された（SI Appendix、図S6B）。地理的な位置は、空気中の細菌に直接、またはいくつかの典型的な環境因子への影響を通じて間接的に影響を与えた。また、生物学的相互作用も微生物群集に影響を与え、キーストーン群集、コア群集、細菌の豊かさが有意に相互作用した。最後に、環境フィルタリング（β=3.06）と細菌間相互作用（β=0.25）が群集形成に与える影響を総合して算出した。したがって、決定論的プロセスにおいては、様々な生物的・非生物的要因が共に微生物群集の構造と分布に寄与しており、環境フィルタリングが主要な決定要因であることが示された。
その結果、世界の細菌群集は確率的プロセスによって強く駆動されており、その相対的重要度は、大気、海洋、土壌の生態系でそれぞれ89.1、83.8、74.0％であることが明らかになった（図5A、5B）。また、大気中バクテリアの半数近く（平均46.3%）が他の環境から寄与されており（図3D）、群集形成において確率的プロセスが重要な役割を担っていることが示唆された(47)。環境フィルタリング（決定論的プロセス）だけでなく、発生源の寄与（確率的プロセス）も考慮し、変動パーティション分析（VPA）を行って、世界の空気中細菌群集を形成する統合的メカニズムを調査した（図5C）。その結果、空気中の細菌源プロファイルが最も群集に影響を与え、構造的変動の43.7%を説明した。これは、大気質（29.4%）や気象条件（25.8%）よりもかなり高い割合であった。大気中の生態系は非常に動的であるため、いくつかの主要な環境変数には大きな不確実性があり、大気中細菌群集の駆動における中立的プロセスの重要性を高めている(1)。大気質と空気中細菌の発生源プロファイルが人間活動の影響を大きく受け、群集構造の変動の約 60% を説明しているという発見は、人間が主に環境ろ過効果の低下と人間関連の発生源の寄与の増加を通じて空気中細菌に影響を与えているという見解を裏付けるものであった。特に、3つの主要な因子群は、群集全体に大きな影響を与え、変動の80%以上を説明した。このように、世界の空気中細菌群集は、主に大気環境とその周辺の生態系における細菌群集の影響を受けていることがわかった。
まとめ
大気中の微生物群集は、土壌や海洋環境の細菌群集と同様に複雑かつ動的である。本研究では、23の主要な地表生息地の細菌との密接な相互作用と、空気中細菌のほぼ半数に対する他の生態系からの寄与に基づいて、地球の微生物世界における空気中細菌の重要な役割を概ね確認することができた。大気は、地理的な障壁を越えて長距離輸送とダイナミックなプロセスを可能にする自由な流れの生態系であるにもかかわらず、その細菌群構造は、特に人間活動に起因する潜在的な供給源の寄与や大気質条件の観点から、地域環境と十分に関連していると思われる。空気中の細菌に対する人為的影響は、主に、バイオマス負荷量の減少、潜在的病原性量の増加、ネットワーク構造の不安定化に反映され、環境フィルター効果の低下と人為的原因による寄与の増加という駆動メカニズムから生じるものであった。本研究は、地球マイクロバイオームの交換を促進する空気の重要性を示すとともに、地域または地球レベルでの環境変化、大気汚染、その他の人間活動との関係における空気中細菌の動的変動を予測するための理論的根拠を提供するものであった。
材料と方法
サンプルの収集
我々は、アジアにおいて、都市部や陸域のバックグラウンド地域のものを含め、主に週単位で803個の大気サブサンプルを1年周期で収集した（サイトごとの頻度と数はSI Appendix, Table S6）。石英マイクロファイバーフィルターは、炭素質物質による汚染を除去するために、500℃で5時間プリベークした。ほとんどの PM2.5 サンプルは大容量 (1,000 L/min) サンプラー (TH-1000C II, Wuhan Tianhong Instruments) で 24 時間採取したが、エベレスト山の PM2.5 サンプルは流速 100 L/min の環境大気サンプリング装置で 23.5 時間採取された。タイとマレーシアの総浮遊性PM（TSP）も石英マイクロファイバーフィルターでハイボリュームサンプラーを使用して採取し、サンプリング作業は300 L/minの気流で24時間行った。すべてのフィルターサンプルを76の季節別サンプルにまとめ、さらなる分析前に-20℃で保存した（Dataset S1のNo.1-76）。
DNA 抽出。
DNAの量が少ないため、同じ場所で採取した同じ季節に属するフィルターサンプル（フィールドサブサンプル）を組み合わせて、さらに分析を行った。各フィルターサンプルは、その後の処理のためにおおよそ8×10cmの大きさに切断し、50mL遠心チューブに入れた1×リン酸緩衝生理食塩水で超音波をかけながら断片を抽出した。前処理に用いたすべての道具と1×リン酸緩衝生理食塩水を120℃で20分間滅菌した後、各抽出液を0.2μmのポリエーテルスルホン（PES）メンブランディスクフィルター（47mm、Pall社）で濾過した。空気中の微生物が濃縮されたPESメンブレンディスクフィルターは、直ちに次の通常のDNA抽出作業に使用した。残りのステップは、カラム精製ステップを収率向上のために磁気ビーズ精製（Agencourt AMPure XP、Beckman Coulter）に変更した以外は、標準の土壌用 FastDNAスピンキット（MP Biomedicals）の分離プロトコルに従って実施された。上記の全てのステップはクリーンベンチで行った。一旦作製した抽出DNA溶液サンプルは、さらに使用するまで-80℃で保存した。
ライブラリーの作製と塩基配列の決定
16S rRNA 遺伝子は、細菌の分類・同定に広く用いられているマーカー遺伝子である。16S rRNAの増幅、バーコーディング、プーリング、およびシークエンスライブラリーの調製は、イルミナのプロトコル（48）に従って実施された。16S rRNA遺伝子のV3からV4超可変領域は、KAPA HiFi HotStart ReadyMix（Kapa Biosystems）を用いて、341F（5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′）、および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）の変性PCRプライマーによって増幅された（49）。フォワードプライマーとリバースプライマーの両方には、イルミナのアダプター、パッド、およびリンカー配列のタグが付けられた。PCR濃縮は、30ngのテンプレート、融合PCRプライマー、およびPCRマスターミックスを含む50μLの混合液で行われた。サーマルサイクリングは、94 ℃で3分間の初期変性、94 ℃で30秒、56 ℃で45秒のアニーリング、72 ℃で45秒の伸長を30サイクル行い、最後に72 ℃で10分間伸長させるものであった。PCR産物はAMPure XPビーズで精製し、溶出バッファーで溶出した。ライブラリーはAgilent 2100 Bioanalyzerで定性した。検証されたライブラリーは、Illumina MiSeqプラットフォームでの配列決定に使用され、2 × 300-bp ペアエンドリードを生成した。
メタデータの収集
空気中の細菌群集をグローバルな視点に拡張するため、空気サンプルの選択を、フィルターベースのフローサンプラー、全DNA抽出、Illuminaプラットフォームでのハイスループット配列決定、および16S rRNA遺伝子配列データを使用する研究に限定した。その結果、我々の品質基準を満たした文献中の294の空気サンプル（データセットS1の77-370番）がダウンロードされ、一様に処理された。流量やサンプリング時間の違いはあるものの、各サンプルの単位体積あたりの定量値を参照しました。合計で、緯度 (65.53°S から 81.57°N) 、高度 (0 から 5,380 m a.s.l.) 、気候 (Köppen-Geiger climate classification system による15の気候タイプ) (47) 、人為的影響 (ex.g...) の広い範囲を含む世界 63 地点の異なる粒子サイズ (68 PM2.5, 171 PM10, 131 TSP) の大気サンプル 370 の全球空中細菌データセットが作成されました。また、世界的な表土の分布も調査した（SI Appendix, Table S7）。
また、大気中の微生物群集と比較するために、National Center for Biotechnology Information (NCBI) からグローバルな表土の 16S rRNA 遺伝子配列データセット (3) (n = 65, PRJEB19856) および表層海水層のグローバルメタゲノムデータセット (4) (n = 62, PRJEB7988) を入手した。
配列の処理
配列処理に伴うばらつきを最小限に抑えるため、370個の大気サンプルを組み合わせた16S rRNA遺伝子アンプリコンリードのV3からV4超可変領域27,719,673個を含むグローバル大気に関するすべての収集データを、mothur (v1.42) を用いて以前に説明したように均一に処理した (50)．簡単に言うと、品質管理のためのUCHIMEアルゴリズムに基づくVSEARCHツールを用いて、あらゆるキメラ配列を除去した(51)。配列は、UPARSEパイプラインを使用して、97％の類似性の閾値でOTUに分割された。OTUは、SILVA（v123）を参照データベースとして使用し、80％の信頼度カットオフで分類学的に注釈付けられた（52）。種レベルでマッピングされた細菌性病原体の可能性を評価するために、各サンプルの生配列は、99%以上の類似性の基準で、16SPIPパイプラインを通じて病原体配列に対しても処理された(38)。16S 遺伝子の V3 から V4 領域のペアリードに基づく病原体の同定の信頼性は、培養と全ゲノムショットガンメタゲノム解析を組み合わせて特定した北京の病院サンプルを用いて検証されました (38)。表現型情報はMETAGENassistによる多変量データ解析によって作成された(53)。また、グローバルな表土の16S rRNA遺伝子配列も、上記の手順で再解析した。
その他の方法
本研究で用いたその他の方法の詳細は、1）環境データの取得、2）標的遺伝子の定量、3）メタゲノムに基づく病原体の同定、4）化学分析、5）各種統計解析など、SI Appendix, SI Materials and Methodsに記載されている。
データ、材料、ソフトウェアの利用可能性
DNA配列データは、Sequence Read Archive of the NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA757592)に寄託されている(54)。その他の研究データは、論文およびSI Appendixに含まれている。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（92043302）、中国科学院戦略的重点研究プログラム（XDB40020102）、香港研究助成委員会（15210618,15203920、T21-705/20-N）の助成を受けたことに感謝の意を表する。ミシガン州立大学での研究は、米国国立科学財団賞（DBI-1759892）の支援を受けている。香港理工大学のUniversity Facility on Chemical and Environmental Analysis (UCEA)には、データ解析のプラットフォームを提供していただき、感謝いたします。
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